miR-148b-3p通过抑制Dock6/Rac1/Cdc42轴抑制胃癌转移

摘要

背景

我们之前的研究表明，一些Rho GTPases，包括Rho、Rac1和Cdc42，在胃癌（GC）中起着关键作用；然而，它们在GC中是如何调节的，这在很大程度上仍然是未知的。在本研究中，我们旨在研究Dock6（一种非典型的Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子，GEF）在GC转移中的作用和分子机制。

方法

分别用免疫组织化学（IHC）和原位杂交（ISH）检测Dock6和miR-148b-3p在GC组织和配对非肿瘤组织中的表达水平。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验计算Dock6/miR-148b-3p表达与GC患者总生存期的相关性。通过体外和体内功能研究，研究Dock6和miR-148b-3p在GC中的作用。通过GST下拉分析研究Rac1和Cdc42的激活。通过荧光素酶报告子分析测定miR-148b-3p对Dock6转录的抑制。

结果

与非肿瘤组织相比，GC组织中Dock6的表达显著增加，其阳性表达与淋巴结转移和较高的TNM分期有关。Dock6阳性表达患者的总生存期短于Dock6阴性表达患者。Dock6通过增加Rac1和Cdc42的活化促进GC迁移和入侵。miR-148b-3p的表达与胃癌中Dock6的表达呈负相关，它通过抑制Dock6/Rac1/Cdc42轴来降低胃癌细胞的运动性。

结论

Dock6在胃癌组织中过度表达，其阳性表达与胃癌转移有关，表明胃癌患者预后不良。miR-148b-3p靶向Dock6可激活Rac1和Cdc42，直接影响GC细胞的运动。靶向Dock6-Rac1/Cdc42轴可以作为GC治疗的一种新的治疗策略。

背景

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因[1,2]. 大多数GC相关死亡可归因于癌症复发和转移，但其潜在机制仍不清楚[三,4].

在人类中，Rho-GTPase家族包含20种Rho小G蛋白，可分为Cdc42亚组（Cdc42、RhoJ和RhoQ）、Rac亚组（Rac1、Rac2、Rac3和RhoG）、Rho亚组（RhoA、RhoB和RhoC）和其他特征较低的亚组[5,6]. 它们在细胞增殖、细胞运动、肿瘤细胞恶性转化、癌症转移和侵袭中发挥关键作用[7]. Rho GTP酶具有GTP结合的活性状态和GDP结合的非活性状态[8]. Rho-GTP酶激活蛋白（GAP）通过刺激GTP的水解使Rho-GTPase失活，鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）通过促进GDP与GTP的交换“开启”Rho-GTPase，以及Rho-Ganine核苷酸解离抑制剂（GDIs）通过抑制非活性鸟嘌呤核苷酸的离解，将Rho GTPases隔离在非活性状态[9]. 我们以前的研究表明，Rho、Rac1和Cdc42是GC恶性转化和转移的重要效应器[10,11,12,13,14]. 然而，GC中Rho GTPases的调控尚不完全清楚。

Rho GEF包括与Dbl相关的经典GEF和Dock家族的非典型Rho GE。自从1984年报道第一个GEF-Dbl/MCF2以来，已经鉴定出大约81个GEF，据报道它们涉及各种癌症和病理学[15,16]. Dock家族蛋白包含11个GEF，分为四个亚家族[17,18]. Dock-A子系列包括Dock1/Dock180、Dock2和Dock5[19,20]. Dock-B子家族包含Dock3和Dock4[15,21]. Dock-C子系列包括Dock6、Dock7和Dock8[16,17,18,22]. Dock-D子家族由Dock9、Dock10和Dock11组成[15,23,24]. 作为Dock-C家族的成员，Dock7据报道可促进包括GBM肿瘤细胞、食管鳞癌（ESCC）和胶质母细胞瘤在内的肿瘤的转移[25,26,27]; 据报道，Dock6参与了极化轴突的生长；Dock8可以增强免疫细胞的运动能力[28,29]; 然而，Dock6和Dock8的表达谱及其在肿瘤中的作用尚不清楚。

微RNA是一类小的非编码RNA，与靶基因的3'-UTR结合并在转录后调节靶mRNA，导致靶基因表达的改变[30]. MiR-148b抑制鼻咽癌转移[31]，肺癌[32]，肝细胞癌[33]和胰腺癌[34]. 据报道，miR-148b在GC中下调并抑制其增殖[35,36,37]; 然而，它是否在GC转移中起作用尚不清楚。

在本研究中，我们发现Dock6在GC组织中高度表达，其过度表达与淋巴结转移和不良预后呈正相关。作为Rho GEF，Dock6通过增加Rac1和Cdc42的活化促进GC迁移和入侵。miR-148b-3p在GC组织中表达较低，它通过抑制Dock6/Rac1/Cdc42信号通路抑制GC转移。Dock6-Rac1/Cdc42轴可能是GC治疗的理想靶点。

方法

细胞培养

人正常胃上皮细胞系GES-1和GC细胞系AGS、HGC-27、MGC-803、SGC-7901和BGC-823购自Genechem（中国上海）。如前所述，分别从人类GC细胞系MKN28和SGC-7901构建高转移潜能的GC细胞系（MKN-28 M和SGC-79 01 M）和相应的低转移潜能细胞系（M KN-28 NM和SGC-79 01NM）[三,4]. 所有细胞在37°C的RPMI-1640培养基（GIBCO，Carlsbad，CA，USA）中培养，该培养基补充有10%FBS、100 U/ml青霉素钠和100μg/ml链霉素，培养温度为5%CO2培养箱。

纸巾收集

本研究得到西安西京医院医学伦理委员会的批准。从2015年至2016年间在西京医院接受手术的患者中获得30对原发性GC组织和邻近非肿瘤组织。所有使用的组织均由西京医院病理科进行临床和病理验证。所有患者均获得知情同意。从患者身上取出组织后，将其冷冻在液氮中，用于提取总RNA。

RNA提取和实时PCR

根据制造商的说明，使用Takara MiniBEST通用RNA提取试剂盒（Takara，大连，中国）提取总RNA。使用Takara PrimeScript RT试剂盒和Takara SYBR Green PCR试剂盒进行逆转录和实时PCR分析。Takara设计并合成了Dock6、ACTIN、miR-148b-3p和U6的PCR引物。引物序列列在附加文件中1：表S6。实时PCR协议如前所述[38,39]. GAPDH和小核RNA U6分别用作mRNA和微小RNA分析的内部对照。所有反应均一式三份。

GC组织芯片的IHC和ISH

本研究中使用的所有组织微阵列均购自上海欧多生物科技有限公司（中国上海）。HStm-Ade180Sur-03 GC组织微阵列包含90对初级GC组织和成对非肿瘤组织，并用于Dock6（Sigma，HPA049423）和miR-148b-3p染色。HStm-Ade120lym-01 GC组织芯片包含32对非肿瘤组织、成对的原发GC组织和淋巴结转移，该芯片用于Dock6染色。miR-148b-3p探针购自Exiqon，探针（50 nM）用地高辛抗体检测（Roche，11093274，1:1000）。如前所述进行IHC和ISH分析[38]. IHC和ISH结果由两位对该研究一无所知的病理学家独立分析。根据染色强度和程度对结果进行评分。染色强度分为0（阴性染色）、1（弱染色）、2（中度染色）和3（强染色）。根据阳性细胞的百分比对染色程度进行评分，分为0（阴性）、1（0.01–25%）、2（25.01–50%）、3（50.01–75%）和4（75.01–100%）。每个部分的组织学评分（H评分）采用以下公式计算：组织学评分=比例评分×强度评分。因此，总分可以是0、1、2、3、4、6、8、9或12，染色可以分为阴性（0、1，2、3，4）或阳性（6、8，9，12）。

Kaplan-Meier绘图仪数据库中GC患者的临床信息

利用Kaplan-Meier绘图仪数据库中提取的数据分析Dock6、Dock7或Dock8表达与GC患者总体生存率或无复发生存率之间的相关性[40]. 从GEO（仅Affymetrix微阵列）、EGA和TCGA下载来自Kaplan-Meier绘图仪数据库的基因表达数据、无复发和总体生存信息。Kaplan-Meier绘图仪胃癌数据库包括GSE29272的临床信息(n个 = 268），GSE14210(n个 = 146），GSE22377(n个 = 43），GSE15459(n个 = 200），GSE51105(n个 = 94）和GSE62254(n个 = 300）数据集。数据库由PostgreSQL服务器处理，该服务器同时集成了基因表达和临床数据。为了分析特定基因的预后价值，根据患者的中位生存率将患者样本分为两组。

质粒构建和转染

Dock6过表达和下调慢病毒、miR-148b-3p过表达慢病毒和对照慢病毒购自Genechem（中国上海）。Dock6的SiRNA和miR-148b-3p的microRNA模拟物和抑制剂购自Ribo Bio（中国广州）。为了产生稳定的Dock6-敲除细胞，SGC-7901 M细胞感染lent-Cas9病毒（MOI=50），并用2.5μg/ml嘌呤霉素培养2周。然后，用lent-Dock6-sgRNAs（MOI=50）或lent-sgcontrol（MOI=50）感染SGC-7901-LV-Cas9细胞。通过流式细胞术（FCM）筛选SGC-7901-LV-Cas9-sgDock6（SGC-7901 M-Dock6-KD）细胞或SGC-7901-LV-Cas9-sgcontrol（SGC-7901 M-control）细胞。为了产生Dock6过表达和miR-148b-3p过表达细胞，用lent-Dock6（MOI=100）或lent-miR-148b-3p（MOI=50）或相应的慢控慢病毒感染细胞，并用2.5μg/ml嘌呤霉素处理选择稳定细胞2周。Dock6的siRNA最终浓度为100 nM。将微小RNA模拟物和抑制剂分别以150nM和300nM的最终浓度添加到细胞中。用siRNA或microRNA模拟物或抑制剂转染48小时后，从细胞中提取总RNA和蛋白质以进行进一步研究。

GST下拉试验和western blot试验

根据制造商的说明，使用Active Rac1 pull-down and Detection Kit（Thermo Scientific，USA，16118）进行GST下拉分析。如前所述进行Western blot分析[39]. 使用的主要抗体为抗Dock6（Sigma，HPA049423，1:1000）、抗β-肌动蛋白（Proteintech，60008–1，1:2000）、抗癌基因42（CST，2462S，1:100）和抗Rac1（Millipore，05–389，克隆23A8，1:200）。

Transwell研究

迁移分析，5×10⁴将200μl RPMI-1640培养基（含1%FBS）中的细胞接种到上部Boyden室（美国纽约州科宁市）。对于侵入试验，用60μl Matrigel（200 mg/ml）涂布培养箱，并在无菌条件下干燥过夜，以及1×10⁵将200μl RPMI-1640培养基（含1%FBS）中的细胞接种到培养箱中。用RPMI-1640培养基（含20%FBS）填充下室，培养细胞24小时。然后，去除残留在膜上侧的细胞，将粘附在膜下侧的细胞固定并用0.5%结晶紫染色。为了评估细胞的运动性，对5个随机场（20×）中的细胞进行了计数和分析。每项分析均一式三份。

体内研究

BALB/C裸鼠（6周龄）用于体内研究。根据动物护理机构指南，这些小鼠被安置在第四军医大学实验动物中心。所有动物实验均由第四军医大学动物护理委员会批准。尾静脉转移模型中，3×10⁶将细胞注射到裸鼠的尾静脉中。在肝转移模型中，3×10⁶将细胞注射到裸鼠的脾脏中。注射10周后，给小鼠腹腔注射D-荧光素（Xenogen，Hopkinton，MA，150 mg/kg），并使用IVIS 100成像系统（Xenorgen）拍摄生物发光图像。然后，通过颈椎脱位处死小鼠，取出肺或肝脏，并准备进行组织学检查（苏木精和伊红（H&E）染色）。

萤光素酶报告基因研究

GeneCopoeia（中国上海）合成了含有野生型（WT）Dock6–3'-UTR序列和突变型Dock6-3'-UTR序列的质粒。如前所述，根据制造商的说明，使用双荧光素酶检测试剂盒（GeneCopoeia）检测荧光素酶活性[38].

统计分析

所有统计分析均使用SPSS 20.0软件（美国伊利诺伊州芝加哥SPSS公司）。用Student t检验比较各组之间的定量数据。采用四分法检验Dock6/miR-148b阳性样本在不同类别之间的分布是否存在显著差异。使用Kaplan-Meier分析和log-rank检验估计总生存率。Cox比例风险模型用于根据从单变量分析中选择的变量确定影响生存率的独立因素。A类P（P）的值P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。

结果

GC组织中Dock6表达增加，提示预后不良

为了探讨Dock-C亚组GEF（Dock6、Dock7和Dock8）在GC中的潜在作用，我们首先在8个GC队列中研究了它们的mRNA表达(n个 > 10） 来自Oncomine数据库(网址：www.oncomine.org)，结果表明Dock6是上调最多的基因（附加文件2：表S1）。然后通过Kaplan-Meier分析分析Dock6、Dock7和Dock8表达与GC患者预后的相关性[40]. Dock6的三种探针均表明，Dock6高表达患者的总体生存期或无复发生存期短于Dock6低表达患者，而针对Dock7或Dock8的不同探针显示，Dock7/Dock8高表达与总生存期或无复发生存期之间存在不同的相关性（附加文件三：图S1）。因此，在Dock-C亚组Rho GEF中，Dock6可能是GC启动和进展的重要效应器。

为了研究Dock6在GC中的潜在作用，我们分析了30对GC组织和邻近非肿瘤组织中Dock6的mRNA表达水平，实时PCR结果显示，GC组织中Dock 6 mRNA表达显著高于非肿瘤组织（图1a个,P（P）< 0.01). 然后用IHC染色检测90对GC组织和邻近非肿瘤组织中Dock6蛋白的表达水平，68.9%（62/90）的GC组织中观察到较高水平的Dock6，而36.7%（33/90）非肿瘤组织（图。1b和c,P（P）< 0.001). Dock6阳性表达与性别、淋巴结转移和较高的TNM分期有关（附加文件4：表S2）。单变量和多变量分析表明，较高的临床分期、阳性淋巴结转移和Dock6阳性表达是GC患者总体生存的独立危险因素（附加文件5：表S3）。Kaplan-Meier分析结果表明，Dock6阳性表达的GC患者的总生存时间比Dock6阴性表达的患者短（图。1天). 此外，根据IHC研究确定，Dock6在淋巴结转移中的表达远高于原发性GC组织（图。第1页). 这些结果提示Dock6可能参与GC转移和恶性进展。

图1

Dock6在GC组织中高表达，提示预后不良。一Dock6在原发性GC组织和配对非肿瘤组织中的相对mRNA表达(n个 = 30），^**P（P） < 0.01之间。b条IHC检测到Dock6在GC和邻近非肿瘤组织中的代表性表达。比例尺代表200μm（低倍率）和50μm（高倍率）。c（c）Dock6在原发性GC组织和邻近非肿瘤组织中表达的比较。天Dock6表达与GC患者总生存期相关性的Kaplan-Meier分析。e（电子）Dock6在邻近非肿瘤组织、原发性GC组织和淋巴结转移中表达的代表性IHC染色。比例尺代表200μm（低倍率）和50μm（高倍率）

Dock6促进GC增殖和转移

实时PCR研究和western blot研究用于研究Dock6在正常胃上皮细胞（GES-1）和GC细胞系（AGS、SGC-7901、HGC-27、MGC-803和BGC-823）中的表达，并且Dock6的表达在GC细胞中高于GES-1细胞（图2a个). 为了研究Dock6在GC细胞增殖中的作用，我们用慢病毒Lenti-Dock6生成SGC-7901-Dock6-OE细胞，用siRNA生成BGC-823-siDock6细胞（附加文件6：图S2a-b）。MTT分析和集落形成研究表明，Dock6过表达增加了SGC-7901细胞的增殖，而Dock6下调降低了BGC-823细胞的增殖（附加文件6：图S2c-d）。FCM分析表明，Dock6过表达增加了G2/M期细胞的比例，而Dock6 RNAi降低了G2/M-期细胞的比率（附加文件6：图S2e）。这些结果表明Dock6有助于GC细胞的增殖。

图2

Dock6在体内外促进GC转移。一实时PCR分析GES细胞和GC细胞系中Dock6 mRNA表达和Dock6蛋白表达的western blot分析。b条Western blot分析高转移潜能GC细胞系（MKN-28 M和SGC-7901 M）和相应低转移潜能细胞系（PKN-28NM和SGC-79 01NM）中Dock6蛋白的表达。c（c）Western blot分析所示GC细胞系中Dock6蛋白的表达。天跨阱研究表明，Dock6缺陷降低SGC-7901M细胞的迁移和侵袭能力，而Dock6过度表达增加SGC-7901-NM细胞的运动能力。比例尺，50μm。^*P（P） < 0.05.e（电子）-小时体内尾静脉转移试验。将指示的GC细胞注入裸鼠尾静脉，然后在注射后10周对肺组织进行无创生物发光成像和H&E染色。比例尺代表500μm（低倍率）和50μm（高倍率）。^*P（P） < 0.05.i-l公司体内脾转移试验。将显示的GC细胞注射到裸鼠脾脏中，然后在脾内移植后10周进行无创生物发光成像和肝组织H&E染色。比例尺代表500μm（低倍率）和50μm（高倍率）。^*P（P） < 0.05

为了确定Dock6在GC细胞迁移和侵袭中的可能作用，通过western blot研究检测了Dock6基因在高转移潜能的GC细胞株（MKN-28M和SGC-7901M）和相应的低转移潜能细胞系（MKN-28NM和SGC-79 01NM）中的表达。Dock6在MKN-28 M和SGC-7901 M细胞中的表达分别高于MKN-28NM和SGC-79 01NM细胞（图。2亿). 然后通过Lenti-Dock6感染建立SGC-7901NM-Dock6-OE细胞，并通过感染表达Cas9和Dock6-sgRNA的慢病毒建立SGC-17901 M-Dock6-KD细胞，然后通过western blot检测这些细胞系中Dock6蛋白的表达水平（图。2厘米). transwell研究结果表明，Dock6过表达上调SGC-7901NM细胞的迁移和侵袭，而Dock6下调降低SGC-7901 M细胞的运动能力（图。第2天).

为了研究Dock6在体内GC细胞转移中的作用，采用了体内尾静脉和肝脏转移试验。在尾静脉转移试验中，将SGC-7901NM-Dock6-OE细胞、SGC-7901 M-Dock6-KD细胞或对照细胞注射到裸鼠的尾静脉中（每组10只小鼠）。注射后10周，拍摄生物发光图像（图。第二版). Dock6过表达增加了SGC-7901NM细胞的肺转移并缩短了小鼠的总生存时间，而Dock6下调降低了SGC-7901M细胞的肺转移并增加了小鼠的总生存时间（图。2f-克). H&E分析证实了肺转移的发生率（图。2小时). 在肝转移试验中，将SGC-7901NM-Dock6-OE细胞、SGC-7901 M-Dock6-KD细胞或对照细胞注射到裸鼠（每组10只小鼠）的脾脏中。脾内注射10周后，拍摄生物发光图像（图。第2页). Dock6过表达增加了SGC-7901NM细胞的肝转移并缩短了小鼠的总生存时间，而Dock6下调减少了SGC-79 01M细胞的肝迁移并增加了小鼠的总体生存时间（图。2j-k型). H&E研究证实了肝转移的发生率（图。2升). 综上所述，这些结果表明Dock6在体内外增加了GC细胞的转移。

Dock6通过激活Rac1和Cdc42促进GC迁移和入侵

Dock家族中的GEF有两个结构域：DHR1结构域结合磷脂，DHR2结构域执行鸟嘌呤核苷酸交换活性[16,41]. 据报道，Dock6通过其DHR2结构域激活Rac1和Cdc42，并促进轴突生长和血管平滑肌细胞（VSMC）迁移[41,42]. 我们使用GST下拉分析来研究Dock6对GC细胞中Rac1和Cdc42激活的影响。Dock6过表达增加了Rac1和Cdc42的激活，Dock6敲除降低了GTP-Rac1及GTP-Cdc42水平，而Dock6不影响总Rac1与Cdc42表达（图3a年). Transwell分析表明，Rac1抑制剂NSC23766（Selleck，50μM）和Cdc42抑制剂ML141（Selleck20μM）阻断了Dock6介导的GC迁移和侵袭（图。3亿). 创伤愈合实验表明，Dock6过表达上调了SGC-7901NM细胞的迁移能力，而NSC23766和ML141可以逆转Dock6介导的细胞迁移（图。3立方厘米)这表明Dock6通过增加Rac1和Cdc42的活化而促进GC转移。

图3

Dock6通过激活Rac1和Cdc42促进GC迁移和入侵。一对所示细胞中Dock6的表达、Rac1/Cdc42的激活状态和总表达进行GST下拉和western blot分析。b条跨阱研究发现，Rac1抑制剂（NSC23766，50μM）和Cdc42抑制剂（ML141，20μM）可以阻断Dock6介导的细胞迁移和侵袭。比例尺，50μm。c（c）伤口愈合试验用于评估指示细胞的迁移

Hsa-miR-148b-3p通过靶向Dock6的3'-UTR抑制其表达

通过分析TCGA数据库中Dock6的基因突变和拷贝数[43,44]，我们发现在258名患者中有2/258名（0.8%）患者的Dock6扩增（图4a类)Dock6 mRNA的表达与拷贝数的变化呈正相关（图。4b个). 然而，在Dock6 mRNA高表达的患者中，258例患者中有12例（4.7%）没有出现基因扩增，表明其上调涉及其他机制。

图4

Hsa-miR-148b-3p通过与3'-UTR结合抑制Dock6的表达。一TCGA队列中GC患者Dock6的遗传改变率。b条TCGA队列中具有不同遗传改变的GC患者的Dock6 mRNA表达模式。c（c）使用Target scan（红色）、Microosm（黄色）、miRDB（绿色）和PicTar（蓝色）数据库预测可能针对Dock6的microRNA。天Dock6的3'-UTR和突变结合位点中预测的miR-148b-3p结合位点示意图。e（电子）miR-148b-3p抑制Dock6的转录。用Dock6-3'-UTR、突变的Dock6-3’-UTR或阳性对照、miR-control或miR-148b-3p模拟物共同转染细胞，并测定相对荧光素酶活性。^*P（P） < 0.05,^***P（P） < 0.001.（f）实时PCR分析所示细胞中Dock6 mRNA的表达。^***P（P） < 0.001.克Western blot分析Dock6蛋白在指示细胞中的表达

微RNA是癌症进展的重要效应器。接下来我们研究了microRNAs是否在GC中上调Dock6表达中发挥作用。使用Target scan、Microosm、miRDB和PicTar数据库预测可能针对Dock6的microRNA。所有四个数据库仅鉴定出Hsa-miR-148b-3p，表明miR-148b-3Gp可以调节Dock6的表达（图。4厘米，其他文件7：表S4）。为了进一步研究miR-148b-3p是否通过与3'-UTR结合来调节Dock6的表达，进行了荧光素酶报告分析。将WT Dock6 3'-UTR序列或突变的3'-UTR序列插入荧光素酶报告载体（图。第4天). 每个构建体都与miR-模拟物对照或miR-148b-3p模拟物联合转染，结果表明miR-148b-3p模拟物显著降低了转染WT Dock6 3'-UTR的细胞中的荧光素酶活性，但未降低转染突变Dock6 3'-UTR的细胞的荧光素酶活性（图。第四版)表明miR-148b-3p可以通过直接与3'-UTR结合降低Dock6转录。然后使用实时PCR和western blot分析验证miR-148b-3p对Dock6表达的调节，结果表明miR-148b-3p模拟物降低了Dock6的表达，而miR-148b3p抑制剂增加了Dock5的表达（图。4f-克).

人类GC组织中Dock6的表达与miR-148b-3p的表达呈负相关

据报道，miR-148b-3p在GC组织中低水平表达并抑制GC增殖[36,37]. 为了验证miR-148b-3p在GC中的作用，我们首先通过原位杂交检测了miR-148b-3p在胃癌组织和配对非肿瘤组织中的表达。miR-148b-3p在非肿瘤组织中的表达显著高于GC组织（图5a-b类). 胃癌组织中miR-148b-3p的负表达与淋巴结转移和较高的TNM分期呈正相关（附加文件8：表S5）。Kaplan-Meier分析结果表明，miR-148b-3p表达阴性的GC患者总生存期短于miR-148b-3p表达阳性的患者（图。5厘米). GC组织中Dock6的表达与miR-148b-3p的表达呈负相关（皮尔逊相关系数=− 0.301,P（P） = 0.004）（图。5d-e（5d-e）). Kaplan-Meier分析表明，Dock6阳性表达和miR-148b-3p阴性表达的GC患者的总生存期最短（图。第5页). 因此，Dock6的表达与人类GC组织中miR-148b-3p的表达呈负相关。

图5

Dock6的表达与人类GC组织中miR-148b-3p的表达呈负相关。一原位杂交检测miR-148b-3p在GC组织和邻近非肿瘤组织中的代表性表达。比例尺代表100μm（低倍率）和50μm（高倍率）。b条miR-148b-3p在原发性胃癌组织和邻近非肿瘤组织中表达的比较。c（c）miR-148b-3p表达与GC患者总生存期相关性的Kaplan-Meier分析。天Dock6的代表性IHC染色和所示邻近非肿瘤组织和原发性GC组织中miR-148b-3p的原位杂交染色。比例尺代表100μm（低倍率）和50μm（高倍率）。e（电子）分析相同GC组织中Dock6表达与miR-148b-3p表达的相关性。（f）Dock6和miR-148b-3p同时表达与GC患者总生存率相关性的Kaplan-Meier分析

miR-148b-3p通过抑制Dock6/Rac1/Cdc42信号通路抑制GC转移

据报道，miR-148b-3p可抑制多种癌症的转移[32,33,34]; 然而，其在胃癌转移中的作用尚不清楚。接下来我们研究了miR-148b-3p是否通过抑制Dock6的表达来调节GC转移。Transwell分析表明，Dock6过表达逆转了miR-148b-3p模拟介导的SGC-7901 M细胞迁移和侵袭抑制，而Dock6下调阻断了miR-48b-3p抑制剂介导的增加SGC-7901M细胞迁移与侵袭（图第6页). 体内尾静脉和肝转移研究表明，miR-148b-3p过表达降低了SGC-7901 M细胞的肺和肝转移，而Dock6过表达逆转了这种转移抑制（图。第6b-j页).

图6

miR-148b-3p通过降低Dock6的表达抑制GC转移。一Transwell分析显示GC细胞的迁移和侵袭能力。比例尺，50μm。^**P（P） < 0.01,^***P（P） < 0.001.b-f型体内尾静脉转移测定。将指示的GC细胞注射到裸鼠的尾静脉中，然后在注射后10周对肺组织进行无创生物发光成像和H&E染色。比例尺代表500μm（低倍率）和50μm（高倍率）。^*P（P） < 0.05.g-k公司体内脾转移试验。将显示的GC细胞注射到裸鼠脾脏中，然后在脾内移植后10周进行无创生物发光成像和肝组织H&E染色。比例尺代表500μm（低倍率）和50μm（高倍率）。^*P（P） < 0.05

最后，GST下拉结果表明，miR-148b-3p模拟物降低了Rac1和Cdc42的激活，而miR-148b-3p抑制剂增加了GTP-Rac1与GTP-Cdc42水平（图第7页)表明miR-148b-3p可以抑制Rac1和Cdc42的激活。跨阱实验表明，miR-148b-3p抑制剂上调了SGC-7901NM细胞的迁移和侵袭，而Rac1抑制剂NSC23766和Cdc42抑制剂ML141可以阻断miR-148b-3p抑制剂介导的GC迁移和侵袭（图。第7页). 这些结果表明，miR-148b-3p通过抑制Dock6/Rac1/Cdc42信号通路降低GC细胞的运动性。

图7

miR-148b-3p通过激活Rac1和Cdc42来促进GC细胞的运动。一GST下拉和western blot分析所示GC细胞中GTP-Rac1和GTP-Cdc42的表达水平。b条跨孔研究发现，miR-148b-3p抑制剂增加了SGC-7901NM细胞的迁移和侵袭能力，而Rac1抑制剂（NSC23766）和Cdc42抑制剂（ML141）阻断了miR-148b-3p抑制剂介导的GC细胞迁移和侵袭。比例尺，50μm**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001

讨论

Rho GTPases在各种肿瘤的发生和发展中起着关键作用，我们以前的数据表明，Rho、Rac1和Cdc42是GC恶性转化和转移的重要效应器[10,11,12,13,14]. 然而，GC中Rho GTPases的调控在很大程度上仍然未知。通过生物信息学分析，我们发现Dock6，一种非典型的Rho GEF，可能参与GC进展。据报道，Dock6可以促进轴突生长和VSMC迁移[28,41,42]. 然而，Dock6在GC中的作用和分子机制尚不清楚。在这项研究中，我们提供了第一个证据，证明Dock6在GC中过度表达，其阳性表达与淋巴结转移和较高的TNM分期有关。Dock6阳性表达的GC患者的总生存时间比Dock6阴性表达的患者短。在本研究中，我们发现Dock6在体外能够促进GC细胞的增殖。我们还发现，Dock6在淋巴结转移瘤中的表达高于原始GC组织，并且Dock6可以增强GC细胞在体内外的迁移和侵袭能力。

作为GEF Dock家族的一员，Dock6被报道通过“开启”Rac1和Cdc42促进轴突生长和VSMC迁移[41,42]. 根据之前的报道，我们的数据表明，Dock6可以通过激活Rac1和Cdc42来促进GC细胞的运动。最近，报道了Dock6敲低介导的Rac1/Cdc42激活抑制的补偿机制[45,46]. 在用RNAi急性击倒Dock6后，Rac1和Cdc42的活化降低，RhoA的活化增加；然而，当Dock6长期下调时，ISG15表达被抑制，Rac1和Cdc42的活性状态被IQGAP1稳定[47,48]. 在本研究中，我们发现Rac1和Cdc42的激活受到Dock6的慢性下调和慢性上调的影响，因此GC中是否存在这种代偿机制需要进一步研究。

在神经元中，AKT通过增加Dock6在Ser¹¹⁹⁴而PP2A通过对Dock6进行去磷酸化而增加了Dock6的GEF活性[28]. miR-142-3p通过直接靶向Dock6并降低其表达来抑制VSMC的运动[42]. 然而，Dock6在GC中过度表达的机制尚不清楚。在本研究中，我们发现Dock6 mRNA的表达与其拷贝数的变化呈正相关。除了拷贝数的改变外，Dock6 mRNA上调还涉及其他机制。为了研究microRNAs是否参与Dock6的表达调控，我们使用四个数据库预测可能靶向Dock6基因的microRNA，发现miR-148b-3p可能调节Dock6表达。通过荧光素酶报告子分析，我们发现miR-148b-3p通过靶向3'-UTR抑制Dock6转录。此前，miR-148b被报道抑制GC增殖[36,37]. 在本研究中，我们发现miR-148b-3p在GC组织中的表达较低，其在GC组织的阴性表达表明预后较差。Dock6表达与胃癌中miR-148b-3p表达呈负相关，Dock6阳性但miR-148b-3p表达阴性的患者预后最差。我们还发现miR-148b-3p通过抑制Rac1和Cdc42的激活来抑制GC转移。所有这些结果表明，miR-148b-3p通过抑制Dock6/Rac1/Cdc42轴来抑制GC转移。

结论

我们证明Dock6在GC中过度表达，并通过激活Rac1和Cdc42促进GC转移。miR-148-3p通过抑制Dock6/Rac1/Cdc42信号通路降低GC运动。因此，Dock6可能是潜在的预后生物标志物和GC的新治疗靶点。