人类白细胞基因表达的社会调节

摘要

背景

社会环境对人类健康的影响在流行病学文献中已经得到了很好的证实，但其功能基因组机制尚不清楚。本研究分析了长期经历高水平与低水平主观社会隔离（孤独）的人群的全基因组转录活性，以评估转录控制途径活性的变化，这些变化可能导致社会隔离人群的不良健康结果增加。

结果

DNA微阵列分析确定了14名高孤独与低孤独个体循环白细胞中差异表达的209个基因，包括免疫激活、转录控制和细胞增殖相关基因的上调，支持成熟B淋巴细胞功能和I型干扰素反应的基因下调。基于启动子的生物信息分析显示，含有抗炎糖皮质激素反应元件（GREs；第页=0.032）和携带炎症前NF-κB/Rel转录因子反应元件的基因的过度表达(第页= 0.011). 促炎和抗炎信号的这种相互转换不是由于循环皮质醇水平的差异，也不是由于其他人口统计学、心理或医学特征。生物信息学分析中显示差异活性的其他转录控制途径包括CREB/ATF、JAK/STAT、IRF1、C/EBP、Oct和GATA途径。

结论

这些数据首次表明，人类全基因组转录活性与社会流行病学风险因素有关。糖皮质激素反应基因转录受损和促炎症转录控制通路活性增加，为长期处于高度主观社会隔离状态的个体中炎症疾病风险升高提供了功能基因组学解释。

背景

大量流行病学研究已将社会环境特征与人体健康联系起来[1,2]但这些效应的基因组机制在很大程度上尚未探索。最强大的社会风险因素之一涉及个人亲密人际关系的数量和质量。社会孤立的人增加了全因死亡的风险[1,2]以及几种特定的传染病、肿瘤和心血管疾病[三–6]. 这些流行病学调查结果的生物学基础尚不清楚，部分原因是尚不清楚社会隔离的影响是否主要源于客观剥夺工具性社会支持（例如身体、认知或经济援助），或者来自与主观社会隔离（即孤独）相关的经历过的威胁和焦虑的生物后果。很少有流行病学研究明确区分客观和主观的社会隔离，但在已有的研究中，一些证据支持每个方面都有重大贡献[1,5,7–10]. 然而，这些动力学影响疾病病理生物学的生理信号途径仍然缺乏了解。

动物社会接触的实验操作可以激活神经内分泌信号通路[11–14]具有调节病原体（病毒、细菌、肿瘤）和宿主免疫反应中基因表达的潜力[4,14–26]. 没有实验研究分析了慢性社会隔离对人类转录的影响，但观察性研究的数据表明，主观社会隔离（孤独）与应激激素皮质醇循环水平的增加有关[27–30]. 这种肾上腺糖皮质激素可以通过核激素受体介导的基因转录控制来调节多种生理过程[31]. 糖皮质激素受体（GR）的皮质醇激活通过抑制核因子（NF）-κB/Rel转录因子和其他促炎信号通路（例如Janus kinase-signal传感器和转录激活剂（JAK/STAT）和干扰素反应因子（IRF）信号通路）发挥广泛的抗炎作用[32,33]. 然而，鉴于大多数与隔离相关的疾病都是由炎症增加引起的（例如慢病毒复制、动脉粥样硬化和实体组织恶性肿瘤），慢性孤独者皮质醇水平升高是自相矛盾的[34–36]. 考虑到糖皮质激素的广泛抗炎作用，皮质醇水平升高的慢性孤独者应该相对保护免受炎症介导的疾病的影响，而不是根据经验观察到风险增加。

高皮质醇水平个体炎症相关疾病的一个可能解释是GR通路的功能性脱敏，GR通路介导对糖皮质激素的转录反应。已有研究表明，几种分子机制使细胞对糖皮质激素的抗炎作用不敏感在体外包括GR表达减少NR3C1号机组基因，GR蛋白的翻译后修饰，GR拮抗剂的表达增加，GR转录辅助因子的活性降低[37]. 在人类和动物模型中，长期的应激与NR3C1号机组增加细胞对糖皮质激素抑制促炎细胞因子反应的抵抗力[37–40]. 因此，可以想象，促炎信号在高皮质醇水平的社会隔离人群中持续存在，因为受损的GR介导的信号转导阻止细胞基因组有效“听到”循环糖皮质激素发出的抗炎信号。

本研究利用了体内基于基因组学的策略，用于识别长期经历高水平主观隔离（孤独）的人免疫系统中差异表达的基因，并定义调节这些差异的上游转录控制途径。差异表达启动子的生物信息学分析[41,42]测试来自高孤独个体的免疫细胞显示的特定假设体内，在基础生理条件下：1.）抗炎糖皮质激素转录控制通路的活性降低；和2.）增加促炎症NF-κB/Rel途径的活性。结果显示，经历过社会隔离的独特“转录指纹”，包括免疫激活的基因组指示，以及形成人类免疫系统中全球基因表达的促炎和抗炎转录控制途径活性的相互转换。

结果

样品特征

在芝加哥健康老龄化和社会关系研究（CHASRS）的14名参与者的循环白细胞中评估了全球基因转录谱[43]. 在加州大学洛杉矶分校孤独感量表的前15%中，对经历了高度主观社会隔离的个人进行了评分，在后15%中，通过孤独感得分定义了经历主观社会融合的个人的年龄、性别和种族匹配比较组[28]. 表1提供了每个群体的人口统计特征，以及医疗、行为和心理社会特征。该样本由美国老年人（中位年龄55岁）组成，他们具有不同的种族背景（50%为盎格鲁裔美国人，43%为非裔美国人，7%为西班牙裔/拉丁裔）和不同的社会经济地位（平均家庭年收入为62500美元，范围为25000美元至150000美元）。大多数研究参与者是女性（78%为女性，22%为男性），在进行基因表达分析之前的3年中，测得的孤独水平是稳定的（平均1年的测试-再测试相关性第页= 0.90; 所有3年的组内相关性=0.937，第页< 0.0001). 样本选择程序产生了经历过社会隔离的平均水平的预期差异（加州大学洛杉矶分校孤独得分的差异，第页= 0.0002; 表1). 在所分析的任何医疗或行为维度上，高孤独参与者与低孤独对照组没有差异，但他们略年轻（4年的差异，第页=0.011），家庭收入较低（平均每年45000美元，而87500美元，第页=0.010），并报告了较高水平的感知压力(第页=0.023）和抑郁症状（50%≥CE流行病学研究抑郁量表（CESD）分界点为10，对照组为0%，第页= 0.038). 在随后的分析中，这些人口统计学和心理差异被视为潜在的混淆因素。

表1研究参与者的人口统计学、医学、行为和心理社会特征

差异基因表达

为了评估与慢性孤独相关的白细胞转录改变，我们使用Affymetrix U133A高密度寡核苷酸阵列进行了全球基因表达谱分析，以调查22283 mRNA转录。在第四或第五年CHASRS访视期间，通过肘前静脉穿刺收集外周血单个核细胞。图1显示了人类淋巴细胞主观社会隔离的“转录指纹”，绿色表示基因在高孤独个体中相对过度表达的程度，红色表示相对表达不足的程度。共有209个转录本差异表达，代表144个不同的命名人类基因（列在附加数据文件1中）。其中，78（37%）在高度孤独的个体中过度表达，131（63%）表达不足，表明对白细胞转录组有净抑制作用（差异第页通过二项式检验<0.0001）。

图1

高孤独与低孤独个体的差异基因表达。从主观社会隔离分布的顶部和底部15%的个体收集的外周血白细胞RNA样本中评估了全基因组转录谱。Affymetrix U133A高密度寡核苷酸阵列分析发现，209个转录本显示组间平均表达水平差异>30%（绿色=高孤独状态下过度表达，红色=表达不足）。高度的主观社会隔离与表达基因数量的统计显著净减少相关（131个下调与78个上调，第页精确二项式检验值）。

高孤独个体白细胞过度表达的基因包括控制细胞生长和分化的多种转录因子(表皮生长因子受体1,埃及镑3,FOSB公司,BHLHB2型,EP400型)，以及染色质结构的调节因子（DNA拓扑异构酶TOP2B排名，的ARID1A公司和SMARCC1型SWI/SNF染色质重塑复合物组蛋白的成分H2AFV公司和组蛋白乙酰转移酶MYST3年). 这些发现表明，社会隔离可能会潜在地影响细胞生长和分化的基本基因调节过程。与该假设一致，过度表达的基因还包括促进细胞周期进展的分子(川东北25B,G0S2号机组,MYBL1型,数字视频3,基站2,ARFGEF2型)，参与核苷酸和蛋白质生物合成的酶(PPAT（生产件批准）,MTRR公司)，细胞骨架重塑因子(DCTN1号机组,KIF21B公司,RPH3A型)以及RNA加工和核输出的相关因素(西北三区,HNRPL公司,DDX17型,SFPQ公司). 就白细胞而言，细胞周期在免疫激活和增殖中起着关键作用。在这组过度表达的基因中出现了其他一些免疫激活迹象，包括促炎细胞因子、趋化因子、颗粒酶、蛋白酶和炎症介质受体(IL1B级,IL8号机组,IL8RB公司,IL10RA（IL10RA）,PTGDR公司,KLRC3型,天然气处理厂,GZMK公司、和多个HLADR公司基因），以及前列腺素合成的主要调节因子环氧化酶2(COX2型/PTGS2型). 其他过度表达的免疫细胞活化指标包括即时早期反应基因IER2标准胰岛素样生长因子信号通路的成分(IGF2R型,IGFBP3型)和激活诱导的反调节因子参与通路脱敏(TNFAIP公司,DUSP1型,RGS1（RGS1）)和受体脱落(MAN2C1型,ADAM8公司,艺术S-1). GOstat生物信息分析[44]通过识别涉及免疫反应和炎症（GO:0009607，GO:0006952，GO:0006955；GO:0009613）、应激反应（GO:0006950）、，抗原处理（GO:0019886、GO:00119884、GO:0045012）、趋化因子和细胞因子活性（GO:0042379、GO:0008009、GO:0005125；GO:0001965）、脱氧核糖核苷酸代谢（GO:0009262）和核小体活性（GO:0000786）（所有第页< 0.05).

对表达不足基因的分析补充了广义免疫激活的描述，显示细胞周期抑制剂的表达减少(CDKN1C公司,CSPG6公司,第15页/PAF公司/KIAA0101号机组,SPARC公司,FKBP5型)，凋亡相关基因(MCL1公司,BIRC1公司,HSXIAPAF1号机组，以及TNFSF10型/TRAIL），抗增殖细胞因子TGF-β(TGFB1型)和NF-κB抑制剂Apo J(CLU公司). 然而，免疫反应的几个特定维度在这种普遍的免疫激活背景下表现出选择性抑制。参与I型干扰素应答的基因下调，包括信号转导子STAT1（状态1）干扰素应答基因2'，5'-寡腺苷酸合成酶1(办公自动化系统1)，干扰素刺激基因12(IFI27)，干扰素诱导蛋白6-16(G1P3系列)、干扰素诱导蛋白15和44(第1页第2页,国际单项体育联合会44). 编码免疫球蛋白轻链、连接链和重链的基因也下调(IGLC2型,IGLL1型,IGK公司/IGKC公司/IGKGV公司,IGJ公司,IGLJ3型,IGHG1型,IGHM公司)，B淋巴细胞成熟标志物(CD79B型,CD269型/TNFRSF17号文件)和参与B细胞分化的转录因子(伊卡洛斯/ZNFN1A1型,POU2AF1号机组). 因此，慢性孤独者的循环白细胞补体显示出免疫激活和促炎信号的广泛基因组指示，伴随着成熟B淋巴细胞功能和固有抗病毒反应的选择性降低。

通过实时RT-PCR选择两个关键功能GO类别的八个具有差异活性（免疫激活和转录控制）的转录物，以独立验证差异表达。在7例病例中，结果与微阵列指示一致，RT-PCR证实了IL1B级,IL8号机组,PTGS2型/COX2型,FOSB公司,表皮生长因子受体1,川东北25B和表达不足G1P3系列（同时、多变量所有转录本的MANOVA差异第页<0.0001，以及第页每个单独分析的转录本<0.05；附加数据文件2）。显微数据和定量RT-PCR均发现GRNR3C1号机组高孤独与低孤独个体白细胞中转录水平相当的基因（RT-PCR差异<4%，第页=0.815，微阵列<15%，第页= 0.112). CD3的表达(CD3G,CD3D系统,CD3E细胞,CD3Z公司)，CD8(CD8A型,CD8B1型),CD4细胞，CD56(NCAM1号机组),CD19编号，以及CD14号机组也具有可比性（所有差异均小于10%第页> 0.20). 因此，观察到的单核细胞基因表达差异并非源于循环单核细胞RNA库中白细胞亚群mRNA相对流行率的变化[45–47].

C反应蛋白

为了验证功能基因组分析中出现的炎症信号增加的情况，我们测定了研究第2、3和4年期间获得的血液样本中C反应蛋白（CRP）的循环水平。在混合效应线性模型分析（年×孤独因子设计）中，高孤独个体的平均CRP值约为低孤独参与者的两倍（平均值=1.33±0.22 mg/l对0.65±0.22；孤独主要影响，第页= 0.0014).

转录控制途径

皮质醇水平

为了确定高孤独个体中免疫激活基因转录的增加是否源于抗炎糖皮质激素皮质醇循环水平的降低，我们在研究第1年中连续三天在醒来、30分钟后和睡觉时检测了唾液皮质醇浓度，3和4。混合效应线性模型分析（时间×孤独因子设计）表明，高孤独个体的平均每日唾液皮质醇水平没有显著降低（平均值=4.061±0.417μg/dl，而低孤独个体为4.541±0.342；孤独主要效应，第页= 0.2374). 然而，与低孤独参与者相比，高孤独个体的循环皮质醇水平日间下降更少（时间×隔离交互作用，第页= 0.0474; 表中的平均值2). 这种差异是由于晚上皮质醇水平稍高所致；觉醒后0到0.5小时唾液皮质醇浓度的变化在各组之间没有显著差异(第页=0.8610），但在高孤独个体中，0-16小时和0.5-16小时的下降都不太明显(第页分别为0.0260和0.0396）。在将测量时间视为觉醒后小时数的线性效应的分析中，也观察到皮质醇昼夜节律变钝（高孤独者的斜率=-0.202±0.033μg/dl/h，低孤独者为-0.301±0.042；小时×孤独交互作用，第页= 0.0119).

表2高孤独与低孤独个体的唾液皮质醇水平

糖皮质激素转录反应

为了确定社会分离物中免疫激活基因转录的增加是否源于GR介导的转录活性的降低（尽管其皮质醇配体的水平大致相似），我们对启动子DNA序列进行了转录元件聆听系统（TELiS）生物信息学分析[41]. 对差异表达启动子中糖皮质激素反应元件（GRE）患病率的分析表明，来自社会隔离个体的白细胞中GR靶基因的表达显著不足。在高孤独个体过度表达的基因调控序列中，TRANSFAC V$GR_Q6转录因子结合基序（TFBMs）的流行率比低孤独个体过度表示的基因低63%（平均值=0.257±0.063 vs.0.094±0.041；第页= 0.0325). 敏感性分析中也出现了类似的结果，即参数化地改变了扫描的启动子序列的长度（从转录起始点起-300 bp，-600 bp，-1000到+200 bp）以及启动子序列与TFBM一致模体的严格匹配（MatSim得分=0.80，0.90，0.95），平均为0.53倍（±0.10）所有9种参数组合的差异(第页= 0.0020). 利用更严格的差异基因表达定义（表达差异50%，对应5%的错误发现率（FDR））进行的敏感性分析也得出了类似的结果，平均差异为0.82倍（±0.09）(第页= 0.0009). 这些结果与社会隔离个体白细胞中GR介导的转录活性显著降低一致（图2).

图2

GR和NF-κB信号通路的转录活性。TELiS生物信息学分析评估反式-激活活性基于高孤独个体与低孤独个体中209个过度表达转录物启动子中GR和NF-κB反应元件的相对流行率（数据表示各组启动子中反应元件的平均±标准误差流行率）。中的贡献-反式通过与全基因组DNA的零分布进行比较，测试差异表达启动子中观察到的NF-κB和GR反应元件的反向偏斜的调节影响顺式-Affymetrix U133A阵列分析的209个转录物的10000个随机样本产生的结构关联。

NF-κB转录反应

为了确定免疫激活基因在高孤独个体中的转录增加是否源于促炎症NF-κB转录控制通路的活性增加，TELiS生物信息学分析还评估了NF-κ的B/Rel反应元件在差异表达启动子中的相对分布。结果表明，在社会隔离个体中过度表达的基因启动子中，NF-κB/Rel基序的流行率是社会整合个体中过度表示的基因启动因子的2.9倍（TRANSFAC V$CREL_01基序：在社会整合个体中过度表达基因的平均0.129±标准误差0.040位点/启动子，而在孤立个体中为0.377±0.086；差异第页=0.0108乘以吨-测试）（图2). 在参数敏感性分析中也出现了类似的结果，启动子长度和基序匹配严格性的所有9个参数组合的平均差异为2.69倍（±0.47）(第页=0.0069），在基因选择中使用5%FDR严格性进行分析时，平均差异为1.30倍（±0.09）(第页< 0.0001).

NF-κB的GR交叉调节

GR靶基因转录的模拟减少（.53倍差异）和NF-κB/Rel靶基因转录的增加（2.69倍差异）的生物信息学指示与这两种途径的已知交叉抑制一致[37]. 对这两种途径的联合TELiS分析得出启动子TFBM分布的净偏差为5.08倍（比率=2.69/0.53）。为了确保这种偏斜基序的流行反映了在反式而非NF-κB与GRE TFBMs之间的反向关系顺式-在人类基因群体的调控结构中，我们通过计算所有检测基因（而不是在社会分离物中显示差异表达的特定子集）的相似大小的随机样本中的TFBM流行率来评估NF-κB/GRE流行率的全基因组分布。相对于顺式-由Affymetrix U133A微阵列分析的22283个转录物中209个转录物的10000个随机样本生成的结构TFBM流行率，在差异表达基因的启动子中观察到的5.08倍NF-κB/GRE偏斜显著大于全基因组零分布下的偶然预期（图2; 双尾第页= 0.0070). 根据差异基因表达的高严格5%FDR标准估计NF-κB/GRE相互斜交的分析中也出现了类似的结果(第页= 0.014). 因此，NF-κB/Rel和GRE TFBM在隔离相关基因启动子中的流行率之间的负相关可能反映了反式-激活性影响而非人口层面的偏见顺式-人类启动子的结构。

医疗和行为混杂因素

确定NF-κB-和GRE应答基因表达中与孤独相关的改变是否可能源于单核细胞RNA库中不同白细胞亚群的流行差异[45–47]在鉴定差异表达基因和随后的TFBM生物信息学之前，采用协方差分析（ANCOVA）调整CD3、CD4、CD8、CD14、CD19和CD56转录物相对流行率的基因表达谱。与上述研究结果（“差异基因表达”）一致，结果继续显示，来自社会隔离个体白细胞中过度表达基因的启动子中NF-κB/GRE的流行率显著增加（全部第页≤ 0.0239).

为了确定NF-κB/GRE比值的孤独性相关增加是否源于其他人口统计学、医学、心理、社会或行为特征的相关差异，额外的ANCOVA在转录控制通路的生物信息学分析之前调整了这些特征的基因表达谱。控制人口统计学因素（包括年龄、性别、种族、婚姻状况和家庭收入第页≤0.0249），其他既定的疾病心理风险因素（包括抑郁、感知压力和敌意；所有第页≤0.0334），医疗条件（包括高血压、冠状动脉疾病、心肌梗死、肺气肿、类风湿关节炎、癌症、溃疡、中风或其他神经疾病；所有第页≤0.0395），其他生物医学参数（包括体重指数和他汀类药物、β受体阻滞剂、抗炎药、利尿剂、抗抑郁药和其他精神病药物的使用；所有第页≤0.0486），以及行为风险因素（包括吸烟和饮酒；所有第页≤ 0.0085). 社会隔离个体的糖尿病诊断率和抗糖尿病药物的使用率无显著性趋势，但NF-κB/GRE比值升高仍接近统计学意义，尽管这些因素得到了控制（两者均为第页≤ 0.0594).

与之前的研究一样[2,28]主观社会隔离（由加州大学洛杉矶分校孤独感量表测量）仅与个人社交网络的客观规模（由社交网络指数测量）适度相关；r=+0.277，第页= 0.3603. 在控制客观社会网络密度变化的分析中，长期处于高度主观社会隔离状态的个体的NF-κB/GRE比率仍然显著升高(第页= 0.0258). 这一结果与之前的研究结果一致，即神经内分泌功能与主观社会隔离比与客观社会网络密度更密切相关[2,28].

为了进一步区分慢性孤独和主观社会隔离（即状态孤独）中短暂波动的影响，我们进行了协方差分析，以控制在特定研究访视期间评估的加州大学洛杉矶分校孤独感得分的残余方差，在该访视中对基因表达进行了分析。特质孤独感通过研究访视1-3（组分类的基础）的平均UCLA得分进行评估，状态孤独感被量化为个体在访视4或5（基因表达访视）的UCLA得分与特质孤独感之间的差异。尽管控制了状态孤独的变化，但与高特质孤独和低特质孤独相比，基因表达谱继续显示NF-κB-/GRE反应基因的表达显著升高(第页= 0.0120).

其他信号通路

为了确定可能导致基因组活性分离相关差异的其他转录控制途径，我们对TRANSFAC数据库中的190个其他脊椎动物TFBM基序进行了探索性TELiS分析（表三). 在分析参数的参数变化中一致出现的两个结果涉及CREB/ATF转录因子家族活性的增加（启动子TFBM的平均增加2.2倍，第页=0.0044），Octamer（Oct）家族转录因子活性降低（平均降低62.2%，第页=0.0004）（图三). CREB/ATF活性增加与微阵列显示一致PRKAR1A公司PKA的调节亚基在高度孤独的参与者中表达不足，这可能构成性地去抑制PKA向CREB的信号传导。Oct-转录因子活性降低与观察到的Ikaros转录因子表达不足一致(ZNFN1A1型)和其他B淋巴细胞成熟标志物。

图3

高孤独与低孤独个体的转录控制途径存在差异。数据表示在对高孤独个体与低孤独个体白细胞过度表达基因的TELiS生物信息学初级分析中转录因子结合基序的平均（±标准误差）流行率。

表3寂寞相关基因启动子中的转录因子结合基序

利用默认最佳参数设置进行TELiS分析（表三)还发现了与社会隔离相关的其他几种信号改变，包括：STAT家族转录因子的激活，这些转录因子通过多种细胞因子和生长因子受体介导信号传导；IRF1活性降低，对I型干扰素有特异性反应（与之前提到的干扰素反应基因下调一致）；GATA家族转录因子活性降低。这些结果在初步分析中具有统计学意义，但当TELiS分析参数发生参数变化时，这些结果偶尔不显著[41]. 因此，STAT、IRF1和GATA变更的指示应视为临时性的。在TELiS分析的192个脊椎动物转录控制基序中，没有其他与主观社会隔离相关的一致差异活动。

讨论

这项研究首次系统分析了全基因组转录改变作为社会流行病学对人类健康影响的潜在机制。长期与他人隔离的个人患几种炎症相关疾病的风险增加[1–6]本研究中发现的白细胞转录改变的广泛模式为从分子水平理解这种风险提供了框架。来自持续高度主观社会隔离（孤独）人群的免疫细胞显示，控制基本细胞转录过程、细胞周期进展、促炎细胞因子信号和前列腺素合成的基因表达增加。然而，在这种免疫激活的普遍背景下，免疫反应基因的几个功能不同的亚群表现出选择性表达不足，包括与先天性抗病毒抵抗有关的I型干扰素反应基因，以及支持抗体生成和成熟B淋巴细胞功能的基因。这些白细胞转录动力学与临床数据一致，表明社会分离物中宿主耐药性的复杂变化模式，包括炎症介导疾病的风险增加[1,2]伴随着对病毒感染的抵抗力下降[三,4,16,25]体液免疫反应受损[29]. 除了为理解社会流行病学的生物学机制提供分子框架之外[48,49]本研究结果为合理选择生物干预措施以纠正这些影响提供了功能基因组靶点。这里确定的孤独感转录指纹也可能提供一种新的基因组生物标记物，用于评估临床疾病发病前此类干预措施的影响。

本研究的一个关键贡献涉及使用最近开发的结构/功能生物信息学来识别驱动基因表达的候选上游转录控制途径体内与社会风险因素相关的功能基因组改变。抗炎GR途径活性的降低以及NF-κB/Rel和JAK/STAT信号的相互增加，代表了本研究在白细胞转录组水平上观察到的免疫激活谱增加的可能介质。GR反应基因的表达减少尤其显著，因为高孤独个体的循环皮质醇水平与社会整合个体大致相当，并且在下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）的后期最低点略高轴输出（与以前的结果一致）[27–30]. 因此，高孤独个体白细胞中GR靶基因的表达减少似乎并非源于HPA轴未能维持正常循环皮质醇水平，而是源于GR介导的激素信号进入细胞转录组的转导减少。这一假设与先前在行为应激过程中受体介导的糖皮质激素不敏感的迹象一致[38,40]以及最近发现的GR转录抑制的分子机制[37]. 孤独与GR降低无关(NR3C1号机组)mRNA水平，表明GR的转录后修饰是转录抑制的最可能机制[37]. 需要进一步分析以确定GR脱敏的特定分子位点，但本研究中发现的炎症基因表达的广泛变化表明GR的功能修饰在以下水平上具有生理意义：体内基因调控。因此，人类基因组功能确实对社会环境条件敏感，但由于信号转导途径活动的干预变化（例如GR不敏感），转录改变可能并不总是跟踪神经内分泌活动的变化。

这项研究确定了社会隔离的清晰基因组指纹，并确定了可能影响其表达的候选转录控制途径，但在解释这些结果时必须考虑几个局限性。首先，目前的发现是基于从社会流行病学风险维度的低极端和高极端抽样的相对较少的个体，因此需要在更广泛地代表人类社会表型总变异的更大样本中进行复制。然而，值得注意的是，与主观社会隔离相关的转录改变的大小和诱导间一致性足够显著，在相对较小的样本中达到了较高的统计显著性水平。目前尚不清楚炎症信号和基因表达的改变是否会发生在白细胞以外的其他细胞类型中，或者是否会在其他组织中观察到不同的转录改变模式。还不清楚这里观察到的主观社会隔离和白细胞转录谱之间的强大数量关系是否源于社会过程对基因表达的因果影响（例如，通过神经内分泌系统），或者免疫系统中不同的基因表达是否会导致社会行为的变化（例如，通过促炎细胞因子和前列腺素对中枢神经系统功能的影响）[50]. 急性“疾病行为”的影响不太可能解释目前的结果，因为这项研究分析了经历孤独的长期个体差异（即，持续表达至少三年）。然而，需要进行纵向研究，以排除慢性炎症变化可能潜在影响社会行为长期个体差异的可能性。本研究鉴定了一种可能的神经内分泌转录改变介质（GR信号），已知其与人类的社会表型有关[27–30]并受到动物模型中实验性社会隔离的影响[11–14]与社会对基因表达的影响相一致。长期社会行为的实验操作最终可能需要在人类临床环境中确定因果关系。从这项研究的辅助分析中可以清楚地看到，基因表达和社会隔离之间的关系不能归因于其他已知的人口统计学、心理学、社会学、，或医疗风险因素（包括感觉到的压力、抑郁、敌意、社会经济地位以及循环白细胞池中子集分布的改变）。控制孤独感短暂变化的辅助分析也表明，慢性主观社会隔离（特质孤独）的转录相关因素并非仅源于状态孤独感的短暂变化。持续的社会隔离感似乎是一种独特的流行病学风险因素，与免疫细胞基因表达的广泛改变有关，而免疫细胞基因的表达与促炎和抗炎转录控制途径的活性相互转换有关。

关于社会隔离的健康风险是否主要源于客观上缺乏社会联系（例如，身体、认知或经济援助的减少），社会流行病学文献中存在争议或来自社会隔离的主观体验（导致对激活神经内分泌应激反应的威胁/不确定性的感知）[2,28,51]. 在本研究中，发现主观社会隔离的功能基因组相关性在很大程度上独立于个人社会网络的客观规模。这一结果强调了主观感知过程在通过神经内分泌改变将社会因素的影响传递到物理生物学中的关键作用，以及它们对细胞基因表达的后续影响[4,28,51,52]. 此外，生物信息学分析确定了几个可能介导这些效应的候选转录控制通路，包括炎症相关GR、NF-κB/Rel和JAK/STAT通路，以及CREB/ATF、IRF1、GATA和Oct转录因子家族。这些候选的“社会信号转导途径”为理解人类基因组与调节细胞基因表达的外部社会环境刺激物之间的分子相互作用方面的社会流行病学提供了一个机制基础[26,48,49].

结论

这些数据确定了人类白细胞主观社会隔离的独特转录指纹，这涉及炎症和免疫反应基因的基础表达增加。差异表达启动子的生物信息学分析表明，这些效应可能是由抗炎糖皮质激素转录控制通路活性降低和促炎症NF-κB/Rel通路活性互补增加形成的。这些数据提供了第一个证据，表明社会环境风险因素与人类基因转录的全球变化有关，并为理解慢性主观社会隔离感（孤独感）的人类中观察到的炎症疾病风险增加建立了分子背景。稳定的循环皮质醇水平和受损的糖皮质激素受体介导的转录之间的分离强调了需要在最终驱动疾病表达的功能基因组动力学水平上分析社会环境风险。

材料和方法

参与者

数据来自CHASRS——一项为期5年的队列分析，对230名50-67岁讲英语的男性和女性在研究开始时的心理、社会、经济和生物医学结果进行分析[43]. 年度研究访问收集了详细的生物医学、社会、心理和经济评估，包括完整的病史、体重指数和腰围、唾液皮质醇的昼夜测量、自主神经系统活动的实验室测量，以及社交网络特征、压力、，抑郁和个性（详见下文）。健康相关行为特征评估包括睡眠质量、营养、运动、记忆和认知功能。2005年，166名剩余参与者中的153人（92%）同意提供10毫升外周血样本用于基因表达分析。对来自14个个体的样本进行基因表达分析，如下所述。程序由芝加哥大学和加州大学洛杉矶分校的机构审查委员会批准。

社会隔离

通过UCLA-R孤独感量表评估主观经历的社会隔离[53]在每年的研究访问中。在匹配年龄、性别和种族后，从研究第1年、第2年和第3年的10名孤独感分布中得分一直排在前15%的个体和第1年和第2年以及第3年得分始终排在后15%的10名个体中选择生物样本进行分析。来自低孤独个体的两个样本和来自高孤独个体的四个样本产生的RNA不足以进行可靠的基因表达分析，因此分析基于十四个个体（八个低孤独个体，六个高孤独个体）。通过社会网络指数评估客观的社会隔离[54].

背景特征和混杂因素

使用既定工具评估人口统计学、社会学、心理学和医学特征[43]包括抑郁症的测量[55]，感知压力[56]，敌意[57]、体重指数、医生诊断的疾病、抗炎药（包括非甾体抗炎药）、利尿剂、他汀类、β受体阻滞剂、抗糖尿病药和抗抑郁药的使用。在收集数据时，参与者没有感染性疾病症状、主要疾病和抗炎药。样本采集时间为上午10点至下午2点（两组的中值均为上午11点）。

白细胞基因表达

总RNA提取自10⁷使用Affymetrix U133A高密度寡核苷酸阵列对循环白细胞（从10 ml肘前静脉穿刺样品中收集的单核细胞，通过ficoll密度梯度离心分离；RNAlater/RNeasy，Qiagen，Valencia，CA，USA）和5μg产生的RNA进行分析[58]如前所述，在加州大学洛杉矶分校DNA微阵列核心中[41,59]. 稳健的多阵列平均[60]用于量化22283个分析转录物的表达，差异表达基因被鉴定为那些在高孤独个体与低孤独个体样本中平均表达水平差异≥30%的基因（对应于10%的FDR）[59]. 通过GO注释、功能注释中的基因参考以及通过NCBI入口基因检索的PubMed文献链接来确定单个基因的功能特征[61]. 使用GOstat确定多个差异表达基因之间的功能共性[62]使用默认的严格性参数（Benjamini FDR<0.10）[44]. 差异表达基因的完整列表见附加数据文件1，原始数据保存在国家生物技术信息中心基因表达总表（GEO系列GSE7148）。

逆转录聚合酶链反应

使用TaqMan基因表达分析（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），通过定量实时RT-PCR独立分析在微阵列分析中被鉴定为差异表达的转录物：IL8号机组（Hs00174103_m1），川东北25B（Hs00244740_m1），IL1B级（Hs00174097_m1），表皮生长因子受体1（Hs00152928_m1），FOSB公司（Hs01547109_m1），PTGS2型（Hs00153133_m1），IFI6/G1P3（Hs00242571-m1），GAPDH公司（Hs99999905_m1）。我们还验证了GR mRNA等效表达的微阵列指示，NR3C1号机组（Hs00353740_m1）。每个样品的分析(n个=14）使用iCycler仪器（Biorad，Hercules，CA，USA）、Quantitect Probe RT-PCR酶（Qiagen）和制造商推荐的一步热循环方案进行三次。ISGF12使用已发布的引物序列和反应条件进行分析[33]. 将每个分析物的阈值循环数归一化为GAPDH进行分析。多变量方差分析（MANOVA）同时测试了所有分析物和独立样本之间的组差异吨-测试评估了每个转录本的差异表达。

转录调节分析

TELiS的2样本变体[63]确定驱动差异基因表达的上游信号转导途径[41]. 初步分析比较了TRANSFAC数据库中脊椎动物V$GR_Q6和V$CREL_01 TFBMs的流行率[64]在高孤独个体与低孤独个体中基因过度表达的启动子中。主要分析使用默认扫描参数[41]并使用第页独立样本的值吨-异方差的韦尔奇修正检验[65]. 为了评估结果对技术变化的稳健性，敏感性分析检查了启动子长度的参数变化（相对于RefSeq转录起始位点-300 bp，-600 bp，-1000 bp到+200）和基序匹配严格性（MatSim=0.80，0.90，0.95）[41]. 敏感性分析还测试了差异基因表达定义日益严格的影响（捕获基于1.5倍变化，对应于5%FDR）[59].

利用协方差分析进行辅助分析[65]控制主观社会隔离（表示x个)和其他人口统计学、心理学或医学协变量（表示c（c）)这可能会影响基因表达。在这些分析中，参与者每个基因的表达谱（表示为年)首先进行调整，以消除因协变量引起的任何方差（基于一般线性模型年=c（c）+e（电子）)和剩余协变量调整的基因表达谱(e（电子）)然后测试作为社会隔离函数的显著差异（即在一般线性模型中e（电子）=x个+z（z），其中z（z）表示残余误差）[65]. 根据协变量调整表达谱分析确定差异表达的基因，然后按照上述方法分析启动子TFBMs的差异流行率。

通过差异表达基因启动子中的对数转换流行率（NF-κB TFBM流行率/GRE TFBM盛行率）来量化NFκB反应元件和GRE的相互活性。韦尔奇吨-测试评估了倒数偏差的统计显著性（对数比≠0），蒙特卡罗随机抽样分析评估了观察到的偏差源于GRE和NF-κB反应元件之间的反向关系的概率顺式-人类启动子群体的结构（而不是反式-TELiS针对的激活活动）。蒙特卡罗分析涉及10000个周期，其中：1）从Affymetrix U133A阵列检测的人类基因群体中随机抽取一组基因，其数量相当于在社会隔离个体与整合个体中发现差异表达的基因；和2.）计算每个随机样本的NF-κB/GRE患病率。由此产生的10000个零假设比率的抽样分布量化了一组随机的人类基因产生NF-κB/GRE流行比率的概率，该比率大于或等于所观察到的一组差异表达基因所显示的比率。

在对NF-κB/Rel和GR活性进行假设驱动分析后，额外的探索性分析分析了TELiS数据库中190种其他脊椎动物TFBM的患病率[41]包括启动子长度和基序匹配严格性的参数变化，以评估结果对分析参数的敏感性。

糖皮质激素水平

在3个研究年中的每一年中，通过连续3天在清醒时（0小时）、30分钟后（0.5小时）和傍晚休息前（16小时）采集的唾液样本中皮质醇浓度的放射免疫测定来评估HPA轴的活性[27]. 使用混合效应线性模型（SAS PROC mixed；SAS Institute，Cary，NC，USA）分析对数转换的皮质醇浓度，将一天中的时间视为3级重复测量因子或觉醒后小时的线性效应（0，0.5，16）。日（1-3）和年（1-4）被建模为重复测量，皮质醇水平的个体差异和昼夜下降被建模为嵌套在低孤独与高孤独中的随机效应。

C反应蛋白

通过循环CRP水平评估全身炎症生物学。使用高灵敏度酶免疫测定法分析研究第2年、第3年和第4年期间获得的血点样本[66]，并使用混合效应线性模型（SAS PROC mixed）对每名参与者的纵向观察结果进行分析，采用一年（2、3和4，作为重复测量）×孤独度（高与低）析因设计。标准异常值检测算法（SAS PROC UNIVARIATE）确定CRP值异常高，并将其排除在分析之外，因为它们可能反映急性感染而非慢性炎症的影响。

其他数据文件

本文的在线版本提供了以下附加数据。附加数据文件1是一个表格，列出了通过微阵列分析确定的在高孤独与低孤独个体白细胞中差异表达的转录物。附加数据文件2是一个图，显示了验证所选转录物差异表达的RT-PCR分析结果。