引用：Sahni N，Yi S，Daniels KJ，Srikantha T，Pujol C，Soll DR（2009）白细胞中信息素选择性上调基因参与生物膜形成白色念珠菌《公共科学图书馆·病理学》5（10）：e1000601。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000601
编辑：Christina M.Hull，美国麦迪逊威斯康星大学
收到：2009年6月15日；认可的：2009年8月31日；出版：2009年10月2日
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介绍
在自然界中白色念珠菌是杂合的(一/α） 在交配型基因座处，MTL公司 [1]–[4].为了交配，它们必须首先进行纯合子一/一或α/α[5]–[7]然后从白色转换为独特的不透明表型[8],[9]从白色表型到不透明表型的转换自发发生，涉及主开关位点的激活和失活，工作任务1 [10]–[12]。
在交配过程中，每种交配类型的不透明细胞释放各自的信息素，诱导相反交配类型不透明细胞极化，形成交配投射，在G1中受阻，发生趋化性和融合，其方式类似于单倍体细胞酿酒酵母 [9],[13]–[19]然而，从白色切换到不透明的要求被认为既独特又矛盾。为什么白色念珠菌经历一个非常复杂的表型转变，以达到交配能力，而对酿酒酵母? 令人惊讶的发现是，交配无能的白细胞也会对交配信息素做出反应，但其反应方式与交配无能的不透明细胞不同，这提供了线索。信息素在白细胞中没有诱导其在不透明细胞中诱导的反应。相反，它诱导细胞之间的凝聚力，粘附到基质上，并促进生物膜的形成[20]生物膜的形成是原核和真核微生物的一种普遍毒力因子，它提供了抵抗抗体和宿主挑战的环境[21]–[23].如果生物膜由白色念珠菌白细胞，它还提供了一个有利于交配的环境[20]白细胞对信息素的反应已被证明是MTL公司-所有主要分支的纯合菌株白色念珠菌，包括实验室菌株SC5314的衍生物[24]。
突变分析表明，白细胞对信息素的反应与不透明细胞交配反应涉及相同的受体和MAP激酶途径[25],[26]然而，这条途径激活了不同的下游反式-作用因子[25].删除CPH1（CPH1）编码不透明细胞中信息素反应途径靶向的下游转录因子，阻止不透明细胞反应，但不阻止白细胞反应[25]白细胞中信息素反应途径靶向的下游转录因子尚未确定。在白细胞中，信息素诱导一些基因的表达，这些基因也在不透明细胞中诱导，以及一些白细胞特有的基因[13],[20],[24]由于信息素对白细胞的主要影响包括增加粘附力、增加内聚力和增强生物膜形成，我们预测信息素诱导的白特异性基因将在这些过程中发挥关键作用。在这里，我们证明了白特异性基因是通过富含A的白特异性信息素反应元件WPRE调节的(AAAAAAAAAA GAAAG公司)与富G响应元素OPRE不同(GTGAGGGA公司)调控不透明细胞信息素反应中的基因。这些结果支持了我们早先的结论，即白色基因由单一的白色特异性反式-作用因子[25]此外，我们通过突变分析表明，白细胞特异性基因在粘附和白细胞生物膜形成中起着基本作用。此外，在缺乏不透明细胞信息素来源的情况下，这些基因以及信号转导途径对于白细胞生物膜的形成至关重要，这表明存在基于信息素的自分泌系统或信息素无关的过程。有趣的是，白细胞特异性基因被信息素上调MTL公司-纯合子白细胞在生物膜形成中起作用一/α细胞，代表自然界中发现的大多数菌株[1]–[4]总之，这些结果为白细胞信息素反应的进化提供了线索。
结果
白特异性基因的选择性诱导
在过去的研究中，基因CSH1型 [25]，或19.2077[24]和或19.6274[24]已证明白细胞中的信息素选择性上调，但不透明细胞中的该信息素不上调。为了确定其他类似上调的基因，我们通过northern blot杂交分析了103个基因的表达模式，这些基因与粘附、细胞壁生物发生、生物膜形成、成丝或转换（补充表S1). 其中9个基因(EAP1（EAP1）,PGA10型,RBT5型,菲律宾比索,菲律宾比索,LSP1号机组,企业所得税1,太阳41,WH11号机组)在白色而非不透明细胞中强烈上调(图1A). 带着基因CSH1型或19.2077和或19.6274(图1A)，最后一次重命名PBR1型（信息素诱导生物膜调节器1）在白细胞生物膜形成中的作用，我们在此证明，我们有12个基因用于进一步分析，这些基因被信息素选择性上调白细胞而非不透明细胞中的信息素。
推测信息素调节顺式-作用元件
识别潜在的信息素调节顺式-作用元件、12个白特异性测试基因的启动子和6个基因的启动子都是以前被信息素在不透明细胞中选择性上调的，MFA1型,保险丝1,CPH1（CPH1）,电子控制1,KAR4标准和冲压1([14],[20],[25],[27]和N.Sahni，S.Yi，D.R.Soll，未发表的观察结果），使用Motif Elicitation（MEME）软件的Multiple EM（模型）进行序列分析[28]–[30]为了识别白色组和不透明组中同源性最高的一致序列。对白色和不透明组中基因的1000个碱基对上游区域进行分析，以确定一个共同的基序，其上限为15 bp，E值≤0.001作为阈值[28]–[30]在这个严格的阈值下，E值表示在一组相似大小的随机序列中，得分与分析的基序相同或更好的基序的预期数量[30]所有12个白特异性基因的启动子都包含至少一个假定的白信息素调节元件（WPRE）拷贝，与一致序列具有高度同源性AAAAAAAAAA GAAAG公司(图1B; 补充的，补充的表S5). 使用相同的严格E值≤0.001作为阈值，发现这六个基因的启动子中没有该DNA序列，信息素在不透明但非白细胞中选择性上调。共有序列与以下信息素反应元件（PRE）的共有序列没有同源性：酿酒酵母 [31]–[33]或玉米Ustilago maydis [34]白特异性基因启动子也包含WPRE样序列，与一致序列同源性较低（补充表S5). 只有与共有序列具有最高同源性的WPRE序列被包括用于初始分析。
再次使用E值≤0.001且长度上限为15 bp的MEME程序作为阈值[28]–[30]，所有6个不透明特异性基因的启动子均包含至少一个具有唯一一致序列的推测不透明信息素调节元件（OPRE）拷贝GTGAGGGA公司(图1C; 补充的，补充的表S6). 在这个E值下，白细胞中信息素选择性上调的12个基因的启动子中没有该元素。它与酿酒酵母 [31]–[33]或玉蜀黍黑粉菌 [34]贝内特和约翰逊[27]已报告存在假定的PRE元素，类似于酿酒酵母在一些（但不是全部）不透明细胞中，信息素上调了基因。在十个信息素调节的不透明基因的扩展列表中(MFA1型,保险丝1,STE2型,SST2型,CPH1（CPH1）,KAR4标准,电子控制1,RAM1（随机存取存储器1）,CEK2号机组,RBT1型)，我们发现序列与酿酒酵母平均E值为10的PRE-like元素+2，这表明同源性可能是虚假的[28]–[30]相反，10个基因中的每一个都有一个OPRE序列，平均E值为10−5（补充表S6). 将MEME搜索中的长度减少到最多9个碱基对，以识别相同的一致序列（补充表S6)这些结果强烈表明，OPRE更适合顺式-调控信息素诱导不透明基因表达的作用序列比弱同源序列酿酒酵母类前序列，它们彼此之间的同源性弱到可以忽略不计，并且不存在于信息素调节的所有不透明基因中（补充表S6)。
如果信息素通过OPRE上调不透明特异性基因，通过WPRE上调白色特异性基因的表达，则不透明细胞和白色细胞中信息素上调的基因应具有与白色和不透明特性基因相同的高E值元素。四个这样的基因，STE2型,CEK2号机组,不锈钢2和RBT1型 [20],[27]使用MEME软件以相同的高度严格E值≤0.001作为阈值进行分析。在这个严格的阈值下，所有四个基因的启动子至少有一个WPRE和至少一个OPRE(图1D; 补充的，补充的表S5和S6系列)。
WPRE调节信息素诱导的白特异性基因表达
尽管序列分析显示了潜在的顺式-作为元素，只有功能分析才能确定它们的角色。为了测试推定的WPRE是否作为信息素反应物发挥作用顺式-白色特异基因的作用序列，四个白色特异基因中每一个的一个等位基因EAP1（EAP1）,第10页,CSH1型和PBR1型从12个基因中选择，在自然中被删除一/一菌株P37005产生杂合缺失突变体EAP1（EAP1）/企业应用程序1,PGA10型/第10页,CSH1型/csh1型和PBR1型/pbr1型然后选择性地删除每个杂合子中与WPRE一致序列同源性最高的保留等位基因启动子中的WPRE，导致WPRE缺失突变EAP1（EAP1）WPREΔ/企业应用程序1,PGA10型WPREΔ/第10页,CSH1型WPREΔ/csh1型和PBR1型WPREΔ/pbr1型.然后将这些突变体的WPRE缺失衍生物替换为本地基因和启动子，以生成补充对照EAP1（EAP1）WPREΔ-EAP1（EAP1）/eap1型,PGA10型WPREΔ-PGA10型/第10页,CSH1型WPREΔ-CSH1型/csh1型和PBR1型WPREΔ-PBR1型/pbr1型所有补体菌株在蛋白质定位研究和西方分析的开放阅读框的3′端都含有GFP标签。纯合缺失突变体eap1/eap1,pga10/pga10,csh1/csh1和pbr1/pbr1，也是通过删除原始杂合突变体中剩余的等位基因而产生的。
EAP1（EAP1）编码一种糖基磷脂酰肌醇锚定的细胞壁蛋白，在生物膜发育中作为黏附素发挥作用酿酒酵母以及在一/α应变白色念珠菌 [35]–[37]。PGA10型，也称为RBT51型，编码一种假定的疏水性细胞外膜蛋白，该蛋白在一/α应变白色念珠菌 [38].在补充菌株中EAP1（EAP1）WPREΔ-EAP1（EAP1）/企业应用程序1和PGA10型WPREΔ-PGA10型/第10页GFP标记的Eap1和Pga10分别定位于α-信息素诱导的白细胞表面(图2A)。CSH1型编码一种参与细胞表面疏水性的蛋白质一/α细胞[39],[40]和PBR1型将在生物膜发育中发挥作用MTL公司-纯合细胞。在补充控制中CSH1型WPREΔ-CSH1型/csh1型和PBR1型WPREΔ-PBR1型/pbr1型GFP标记的Csh1和Pbr1分别主要定位于α-信息素诱导的白细胞的细胞质中(图2A)。
测试α-信息素是否通过假定的信息素反应元件激活了四个白特异性基因水处理厂，通过northern分析将每个基因的表达与亲本菌株P37005（纯合缺失突变体）、水处理厂在α-信息素缺失和存在的情况下，缺失突变体和补体对照。
EAP1（EAP1）
在缺乏α-信息素的情况下，EAP1（EAP1）在亲本（P37005）菌株、WPRE缺失突变体和补充对照菌株的白细胞中以基础水平表达(图2B). α-信息素在亲本和补充对照菌株中的表达上调(图2B). 应变表达EAP1型WPREΔ/企业应用程序1在没有或存在α-信息素的情况下保持在基础水平(图2B)。
PGA10型和CSH公司
在缺乏α-信息素的情况下，PGA10型和CSH1型在亲本菌株、补体对照菌株和WPRE缺失突变体的白细胞中基本水平表达(图2B). α-信息素上调PGA10型和CSH1型在亲本和补充对照菌株中分别增加了5倍和6倍以上(图2B). α-信息素也上调了第10页和CSH1型在WPRE缺失突变体中，但不到亲本或补充对照菌株中刺激水平的三分之一(图2B)。
PBR1型
在缺乏α-信息素的情况下，PBR1型在亲本品系、补充对照品系和WPRE缺失突变体的白细胞中未检测到表达(图2B). 因此，与其他三个测试基因一样，似乎没有基本表达。α-信息素上调亲本和补体对照菌株PBR1的表达(图2B). 它也上调了PBR1型在WPRE缺失突变体中表达，但仅达到受刺激亲代和补体对照细胞的十分之一(图2B)。
低但可复制的表达水平PGA10型,CSH1型和PBR1型由α-信息素诱导的WPRE缺失突变体可能由三个基因启动子中第二个较弱的信息素反应元件介导。我们在三个基因的每个启动子中都发现了一个较低的一致性WPRE（lcWPRE）PGA10型,CSH1型和PBR1型分别位于−432和−418、−408和−394以及−262和−248 bp之间。补充说明中描述了所有12个白特异性信息素诱导基因中的低一致性WPRE序列表S5为了测试这些位点是否能够诱导低水平的信息素，我们从菌株中删除了它们CSH1型WPREΔ/csh1型和PBR1型WPREΔ/pbr1型，产生菌株CSH1型WPRE△lcWPRE△/csh1型和PBR1型WPRE△lcWPRE△/pbr1型两个WPRE突变体启动子中lcWPRE的缺失完全消除了白细胞中信息素的低水平诱导(图2C). 这些结果表明CSH1型和PBR1型导致WPRE缺失突变体中观察到的信息素残留诱导水平较低(图2B). 我们还利用抗GFP标签的抗体进行了western分析，比较了WPRE缺失突变体中蛋白质Csh1和Pbr1的水平CSH1型WPREΔ/csh1型和CSH1型WPRE△lcWPRE△/csh1型、和PBR1型WPREΔ/pbr1型和PBR1型WPRE△lcWPRE△/pbr1型分别使用补充控件。蛋白质水平与转录水平显著一致(图2D)。
最后，我们发现其他白特异性基因也是如此[25],[26]，四个选定基因的上调EAP1型,PGA10型,CSH1型和PBR1型被信息素阻断在突变体中钢4/钢4和双突变体cek1/cek1 cek2/cek2但不是在突变体中cph1/cph1（未显示数据）。这些结果表明，与一般的白特异性基因一样，信息素对这些基因的上调依赖于MAP激酶途径，而不是靶转录因子Cph1。
OPRE调节信息素诱导的opaque特异性基因表达
为了评估假定的不透明信息素反应元件OPRE是否介导信息素诱导不透明特异基因，我们为CPH1（CPH1）和MFA1型α-信息素选择性上调不透明而非白细胞中的基因[25]。CPH1（CPH1）编码下游转录因子的基因，激活不透明特异性基因和MFA1型为基因编码一-信息素。保留基因启动子中的OPRECPH1（CPH1）和MFA1型杂合子拷贝CPH1/CPH1和MFA1/MFA1型分别被选择性删除，导致OPRE缺失突变体CPH1（CPH1）OPREΔ/cph1型和MFA1型OPREΔ/mfa1型. TheCPH1（CPH1）OPREΔ以及MFA1型OPREΔ然后将相应突变体中的拷贝替换为野生型ORF和启动子，以生成补体对照CPH1（CPH1）OPREΔ-CPH1（CPH1）/cph1型和MFA1型OPREΔ-MFA1型/mfa1型GFP基因在框架内融合用于定位和西方研究。两者的野生型基因拷贝CPH1/CPH1和MFA1/MFA1型也被删除以产生纯合子缺失突变体cph1/cph1和mfa1/mfa1.GFP标记的菌株中的Cph1蛋白CPH1（CPH1）OPREΔ-CPH1/CPH1定位于α-信息素处理的补体菌株不透明细胞的细胞核中，这对于不透明特异性反式-作用系数(图3A)。
的表达式CPH1（CPH1）和MFA1型然后通过northern分析评估亲本菌株P37005、纯合子缺失突变体、OPREΔ突变体和补充对照中是否存在α-信息素。在缺乏α-信息素的情况下，CPH1（CPH1）和MFA1型在亲本菌株、补充对照和OPRE缺失突变体的不透明细胞中未检测到表达(图3B、C). α-信息素上调CPH1（CPH1）和MFA1型在亲本和补充对照菌株中(图3B、C). 它也上调了CPH1（CPH1）和MFA1型在OPRE缺失突变体中，但仅约为亲代或补充对照细胞水平的十分之一(图3B、C). 这些低水平的激活可能由较弱的OPRE介导，WPRE突变体也是如此。在这两个基因中都发现了一个与一致序列OPRE同源性较低的位点CPH1（CPH1）和MFA1型发起人（补充表S6). 这些结果表明，OPRE，而不是酿酒酵母Bennett和Johnson鉴定的类前序列[27]作为不透明细胞中α-信息素上调基因启动子的主要反应元件。
为了进一步支持Cph1通过OPRE上调不透明特定基因的说法，我们分析了这些基因的表达MFA1型和KAR4标准，均包含OPRE（补充表S6)，在突变体中cph1/cph1在该突变体中，这两个基因均未被α-信息素上调([25]; S.Yi和D.R.Soll，未发表的观察结果）。结果表明，细胞必须含有一个功能性Cph1，用于α-信息素诱导的基因表达，这些基因通过OPRE进行调节。
四个信息素诱导的白特异性基因在不透明信息素反应中不起作用
Northern分析显示，在12个α-信息素诱导的白特异性基因中，有9个在没有或存在α-信息素时的不透明细胞中没有检测到信号，还有3个(菲律宾比索,引用1,RBT5型)在α-信息素存在和不存在的情况下，在相同的基础水平上表达(图1A). 因此，有人会认为，这些白细胞特异性基因中没有一个在不透明细胞对信息素的反应中起作用。为了直接验证这一假设，我们检测了四个基因纯合子和WPRE缺失突变体的不透明细胞EAP1（EAP1）,PGA10型,CSH1型和PBR1型，在α-信息素的作用下形成shmoos，或与天然α/α菌株WO-1的不透明细胞交配。信息素诱导shmoo形成的频率(图4A)以及交配混合物中的融合(图4B)亲本菌株P37005的不透明细胞、纯合缺失突变体、WPRE缺失突变体和补体对照菌株之间无法区分。shmoos一家(图4C)由突变体的不透明细胞响应α-信息素形成，不透明细胞之间形成交配融合一/一突变细胞和不透明α/αWO-1细胞(图4D)，与亲本菌株P37005的菌株没有区别。这些结果表明，信息素诱导的白特异性基因在不透明细胞的交配过程中不起作用。
所有四个测试基因在白细胞粘附反应中都起作用
作为对信息素的反应，白细胞的内聚力和对基质的粘附力急剧增加[20],[25],[26]为了测试被α-信息素上调的四个选定的白色特异性基因是否在粘附中发挥作用，我们比较了亲本和突变体菌株之间的信息素反应。α-信息素诱导亲本菌株P37005 90%以上的白细胞粘附在塑料盘底部(图5A). 这意味着比未经处理的细胞增加了100倍以上。虽然α-信息素也诱导了四个纯合缺失突变体的粘附增加企业应用程序1/企业应用程序1,第10页/第10页,csh1型/csh1型和pbr1型/pbr1型诱导水平分别为亲本菌株的24%、43%、38%和14%(图5A). 仅删除四个基因启动子中一致性最高的WPRE区域，导致信息素诱导粘附的减少与纯合缺失突变体几乎相同(图5A). 亲本和WPRE缺失突变体中粘附在培养皿底部的细胞密度示例如所示图5B这些结果表明，所有四个基因都在信息素诱导的粘附中起作用，但没有一个基因足以实现信息素诱导反应。值得注意的是，α-信息素诱导的粘附水平在以下纯合子和WPRE缺失突变体中最低PBR1型(图5A). 还应该注意到，每个WPRE缺失突变体与本地基因的互补导致野生型水平粘附的重建(图5A)。
由于α-信息素的低水平诱导CSH1型和PBR1型在WPRE中，通过删除第二个较低共识的WPRE来消除突变(图2C)我们测试了缺失突变体中信息素诱导的粘附是否进一步减少CSH1型WPRE△lcWPRE△/csh1型和PBR1型WPRE△lcWPRE△/pbr1型.粘附水平与突变体相同CSH1型WPREΔ/csh1型和PBR1型WPREΔ/pbr1型（补充图S2)表明这些突变体中诱导的残留粘附水平是由于其他基因产物的作用。
这四个基因都在白细胞生物膜反应中起作用
在没有不透明细胞的情况下，白细胞形成生物膜依赖于功能性白细胞信息素反应途径[26]这种白细胞生物膜通过添加1%的不透明细胞而得到增强[20],[25]我们分析了在没有不透明细胞和有10%不透明细胞（后者不透明细胞的比例为1∶1）的情况下，四种信息素诱导的白细胞特异性基因在白细胞生物膜形成中的作用一/一和不透明的α/α细胞。大概是不透明的一/一细胞，通过释放一-信息素，在不透明的α/α细胞中上调α-信息素的合成，为大多数白人提供α-信息激素的连续来源一/一细胞刺激[20]将生物膜浇铸在硅橡胶表面，培养48小时，固定并分析白细胞基底层的形成，生物膜上部菌丝的形成，菌丝取向，基质形成和生物膜厚度，使用激光扫描共聚焦显微镜。
在缺乏母株少数不透明细胞的情况下，大多数白细胞形成的生物膜平均厚度为73±5µm；四株补充对照菌株的平均值为69±1µm(图6A). 差异无显著性（p值大于0.05）。在存在少数不透明细胞的情况下，由亲本菌株P37005形成的生物膜的平均厚度为106±5µm，而四个补充菌株的平均厚度则为98±4µm。与没有不透明细胞时相比，这两个菌株的厚度分别增加了45%和43%(图6A). 少数不透明细胞的存在与否差异显著(图6A). 在缺乏和存在少数不透明细胞的情况下，由亲本和补充对照菌株的白细胞形成的生物膜具有白细胞的基底层，在这一层之上是垂直排列的交错菌丝区域(图6B、C). 这些生物膜含有一种细胞外基质，用钙氟染色（补充图S1A). 还测量了亲本菌株P37005生物膜培养上清液中在无或存在少数不透明细胞的情况下β-葡聚糖的浓度[41].在有不透明细胞的情况下，浓度比没有不透明细胞时高58%(图6E). 差异显著。
在没有不透明细胞的情况下，四个纯合缺失突变体的生物膜厚度平均为56±6µm，四个WPRE缺失突变体生物膜厚度为56±4µm(图6A). 因此，这些生物膜平均比亲代和补充对照细胞薄20%(图6A). 这些差异是显著的（补充表S7). 不透明细胞的存在对缺失突变体形成的生物膜厚度的影响很小(图6A). 像素强度扫描用于测量对照和突变细胞生物膜厚度的示例如所示图6F。
在无不透明细胞和有不透明细胞的情况下，缺失突变体形成的生物膜没有一致的白细胞基底层；基质处的细胞稀疏或呈片状(图6B、D). 基质的张力也远小于对照菌株的张力(图6B和补充图S1B). 此外，菌丝形成斑块并水平定向(即，与底层平行）(图6B、D)而不是垂直方向，与对照细胞生物膜的垂直方向相反(图6B、C). 这种异常取向可能是由于染色结果显示基质显著减少所致（补充图S1). 生物膜上清液中β-葡聚糖的测量结果表明，在缺少或存在少数不透明细胞的情况下，突变株与亲本染色之间存在显著差异。对于WPRE缺失突变体EAP1（EAP1）WPREΔ/企业应用程序1和PBR1型WPREΔ/pbr1型β-葡聚糖水平在无不透明细胞的情况下平均分别降低33%和19%，在有不透明细胞时分别降低44%和42%(图6E). 这些差异被证明是显著的。总之，这些结果表明，所分析的四个α-信息素诱导的白特异性基因中的每一个对于在无不透明细胞和存在不透明细胞的情况下正常生物膜的形成和结构都是必不可少的。
信息素反应途径成分缺失突变体的表达模式
虽然四个WPRE调节的白细胞特异性基因被信息素激活的MAP激酶途径诱导的下游转录因子激活[25],[26]这并不排除它们通过环回控制机制在信息素反应途径中调节上游基因的作用。因此，我们测试了信息素是否上调了α-信息素受体基因，STE2型和配合系数一基因，MFA1型，在纯合子和WPRE缺失突变体中EAP1（EAP1）和PBR1型。我们还测试了CSH1型和PBR1型α-信息素上调了EAP1（EAP1）缺失突变体，以及是否CSH1型和EAP1（EAP1）在PBR1型缺失突变体。未观察到对表达的影响(图7A、B). 纯合子和WPRE缺失突变体也获得了类似的结果CSH1型（未显示数据）。这些结果表明，信息素诱导的、参与粘附和生物膜发育的白色特异性基因在信息素信号的转导或其他信息素诱导的基因的上调中不起作用。
过度表达PBR1型在其他缺失突变体中
四个白特异性基因的纯合子和WPRE缺失突变体在粘附力方面表现出较大但不完全的降低(图5A). 影响最大的是纯合子和WPRE缺失突变体PBR1型(图5A、B). 这些结果表明，四个受试基因对粘附反应的贡献可能是独立的，也可能是相加的。为了探索这个假设，我们转化了亲本菌株P37005和WPRE缺失突变体EAP1（EAP1）WPREΔ/企业应用程序1,PGA10型WPREΔ/第10页,CSH1型WPREΔ/csh1型和PBR1型WPREΔ/pbr1型带有一个构造，其中PBR1型在诱导物的控制下四环素发起人[42]。该构建物针对的是ADH1（ADH1）基因[42]结果菌株为P37005-tetPBR1型（控制），EAP1（EAP1）WPREΔ/eap1-设置PBR1,PGA10型WPREΔ/pga10-tetPBR1,CSH1型WPREΔ/csh1-tetPBR1和PBR1型WPREΔ/pbr1-设置pbr1四环素类似物多西环素上调四环素调节基因被证明是剂量依赖性的，并且不依赖于信息素，如PBR1型WPREΔ/pbr1-设置pbr1(图8A)。
错误表达PBR1型在缺乏信息素的情况下，转化亲本菌株P37005的粘附力增加，约为α-信息素诱导的粘附力的三分之一(图8B、C). 在缺乏α-信息素的情况下，四个转化的WPRE缺失突变体中的错误表达导致了相似水平的诱导(图8B、C). 在α-信息素的存在下，PBR1型转化亲本菌株和四个WPRE缺失突变体中的错误表达导致粘附水平高于PBR1型在缺乏α-信息素或仅用α-信息素来处理细胞时表达错误(即，在没有强力霉素的情况下）(图8B、C). 这些结果表明PBR1型在没有信息素诱导的情况下，其他三个测试基因的表达会导致粘附增加，同时PBR1型错误表达和α-信息素诱导的天然基因表达对粘附有加性效应。为了进一步探讨这一点，我们转化了双突变体cek1/cek1 cek2/cek2 [25]错误表达模块位于ADH1（ADH1）轨迹。该突变体未经α-信息素诱导EAP1（EAP1）,PGA10型,CSH1型或本地PBR1型(图8D). 错误表达PBR1型在没有或存在α-信息素的双突变体中，粘附力增加到亲本对照中α-信息激素诱导水平的三分之一(图8E). 该结果支持以下建议：PBR1型单独导致粘附性增加，但不能达到控制水平。
由于WPRE缺失突变EAP1（EAP1）,PGA10型和CSH1型以基本或轻微诱导水平表达这些基因(图2B)，错误表达PBR1型在这些WPRE缺失突变体中，Pbr1仍可能分别与基因产物Eap1、Pga10或Csh1相互作用。为了进一步测试独立性，缺失突变体eap1/eap1和csh1/csh1用含有tet的载体转化PBR1型生成eap1/eap1-泰特PBR1型和csh1/csh1-泰特PBR1型以及在缺乏或存在α-信息素和/或强力霉素的情况下评估粘附性。结果与用tet转化的WPRE突变体获得的结果非常相似PBR1型(图8C). 这些结果支持以下观点：白特异性α-信息素诱导的基因可能独立地和附加地产生粘附。
讨论
不透明和白色反应途径的差异
白细胞的α-信息素反应途径，从受体到MAP激酶级联，包括与不透明细胞的信息素反应通路相同的基因产物(图9)[25],[26]然而，路径的下游目标不同。不透明途径的靶点是转录因子Cph1，它是酿酒酵母转录因子Ste12[43]–[45]然而，白色通路的靶点是一种与Cph1不同的转录因子，目前尚未确定[25].英寸酿酒酵母，信息素通过转录因子Ste12上调参与交配反应的基因，该转录因子与一种常见的信息素反应元件PRE结合[31]–[33]在这里，我们提供了证据表明，在不透明细胞中，Cph1通过与富含GC-的不透明特异性信息素反应元件OPRE结合而激活不透明特异基因酿酒酵母如建议的那样，预样序列[27]我们还提供了证据表明，在白细胞中，白特异性转录因子通过与富含AT-的白特异性信息素反应元件WPRE结合来激活白特异性基因(图9). 每个opaque-specific基因的启动子包含至少一个OPRE而不包含WPRE，每个白色特异基因的启动程序包含至少一种WPRE而不含OPRE。白细胞和不透明细胞中信息素上调的基因同时具有WPRE和OPRE(图9). 因此，白信息素反应中的基因调控策略似乎涉及一个单一的白特异性转录因子和一个单一白特异性的转录因子顺式-作用启动子元件，以及不透明信息素反应中的基因调控策略似乎涉及单个不透明特异性转录因子和单个不透明特异性顺式-作用启动子元件(图9). 这些策略与酿酒酵母它还通过一个主要转录因子和一个单一的显性转录因子激活基因顺式-作用调节元件[31]–[33],[44],[45]。
白细胞特异性基因与粘附反应
在我们发现的12个基因中，每一个都被白细胞而非不透明细胞中的信息素强烈上调，其中包含一个WPRE。其中四个基因的缺失或WPRE从其启动子中的缺失导致白细胞对信息素的粘附反应显著降低。但在任何情况下，基因、代表基因的WPRE或代表基因的组合WPRE和lcWPRE的完全缺失都不会导致粘附反应的完全丧失，这表明每个基因的蛋白产物可能对信息素粘附反应作出独立但相加的贡献。因此，这四种基因产物中没有一种对信息素的粘附反应至关重要。在其中进行的实验PBR1型表达不当表明PBR1型单独，在任何一个都没有表达的情况下EAP1（EAP1）或CSH1型(即，在空突变体中），导致进一步但不完全的粘附增加。WPRE和全纯合子缺失突变体也是如此。此外，错误表达PBR1型在突变体中cek1/cek1 cek2/cek2，其中EAP1（EAP1）,PGA10型,CSH1型和本地PBR1型不能诱导，导致粘附增加到诱导控制应变的34%。这些结果表明，粘附响应由PBR1型白细胞中的粘附反应可能与其他三个基因的粘附反应无关。因此，α-信息素诱导的白细胞粘附可能代表多种粘附系统的总和。
白细胞特异性基因与生物膜反应
删除四个随机选择的白特异性基因中的每一个都会导致对α-信息素的粘附反应出现可重复的损失，范围在57%到86%之间。相反，删除四个基因中的任何一个或它们的WPRE都会导致生物膜形成相对均匀的缺陷。由于生物膜的形成是一个复杂的过程，涉及多种细胞表型、基质形成和成熟过程中的一系列步骤[46]–[53]有人可能会预料到，四个基因中的每一个缺失都会导致不同的部分缺陷。然而，如果所有四个基因都在生物膜发育的早期阶段发挥作用，例如在基质上形成最初的细胞基底层[50],[54],[55]则所有后续步骤在四个缺失突变体中可能都存在类似的缺陷，从而解释了生物膜缺陷的一致性。
在缺乏少数不透明细胞的情况下诱导白细胞生物膜的形成
也许我们最令人惊讶的观察是，白色生物膜发育的主要缺陷一/一在缺少和存在少数不透明细胞的情况下，四个白特异性基因的纯合和WPRE缺失突变体显示了细胞。缺陷包括硅橡胶基质上缺少连续致密的基底层，水平方向的菌丝斑块而非均匀致密，基底层以上区域的菌丝垂直交织，细胞外基质急剧减少。这些缺陷发生于少数不透明细胞的缺失和存在，表明白细胞具有自动激活的能力。考虑到白色反应，包括增加粘附和上调白色特异性基因，取决于信息素的外源来源，这些结果表明了两种机制之一。首先，可能存在一种专制制度，其中MTL公司-纯合子白细胞在有利于生物膜形成的条件下放置在表面时，能够通过释放相反交配类型的信息素进行自我刺激。然后，这种信息素与同一细胞上的受体结合，激活白细胞反应途径。自怀特以来，这种情况似乎是合理的一/一细胞具有α-信息素基因，α/α细胞具有一信息素。我们之前曾提出，基于α受体缺失突变体的缺陷表型，自分泌系统可能调节白细胞生物膜的形成，钢2/钢2 [26]突变体在没有少数不透明细胞的情况下形成了一层厚度减小的斑片状生物膜，与观察到的突变体相似eap1/eap1,pga10/pga10,csh1/csh1和pbr1/pbr1在自分泌系统的替代机制中，白细胞可能依赖于在没有信息素的情况下信息素反应途径的基本活性，以形成正常的生物膜。在酿酒酵母，这种基础活性不仅在信息素反应途径中观察到[33],[56]–[58]，但是α三聚体G蛋白复合物的亚单位，Gpα1当其过度表达时，可以在没有信息素的情况下激活交配反应的变化[57]。目前正在进行实验，以区分这些替代方案。
MTL公司-纯合子和MTL公司-杂合生物膜
在这里，我们完全专注于MTL公司-纯合生物膜形成。MTL公司-杂合的(一/α） 然而，菌株约占天然菌株的90%[1]–[4]因此必须解释自然界中形成的大多数生物膜。有趣的是，被确定为受α-信息素强烈上调的12个基因中，大多数是白色的，但不是不透明的，一/一细胞直接或间接参与了一/α生物膜。在一/α细胞，已经证明1）EAP1（EAP1）导致与上皮细胞的结合减少[59]以及在在体外平行板流动室模型与导管[35]; 2） 删除PGA10型(RBT5型)导致脆弱的生物膜[38]; 3） 删除CSH1型导致亲水性降低[39]，这是一种增强生物膜形成的特性[60]; 4)菲律宾比索在中下调周日41/周日41突变体[61]; 5） 和LSP1号机组和企业所得税1在生物膜形成过程中上调[62]因此，必须通过白色形成生物膜MTL公司-纯合细胞和MTL公司-杂合子细胞在形态和分子水平上都可以进行比较，即参与一/阐明α生物膜的形成，并评估两种不同生物膜在发病机制中的作用。
白细胞信息素反应的进化
似乎有理由假设白细胞生物膜对信息素的反应是从不透明细胞的交配反应演变而来的白色念珠菌。不透明的反应途径与酿酒酵母，它从念珠菌半丝酵母菌系统发育树早期的类群[63],[64]非常明显，两者都不是酿酒酵母也不是的成员念珠菌组，除白色念珠菌和高度相关的物种杜氏假丝酵母 [65],[66]，进行白色-无色过渡。白细胞对信息素的反应似乎仅通过保护性生物膜的形成促进不透明细胞的交配[20]，这表明它是由不透明的响应引起的，以便促进它[20]因为白细胞信息素反应似乎只存在于白色念珠菌，它代表了一种最近才进化的途径，似乎借用了在交配过程中发挥作用的信息素反应途径的整个上部。观察发现，白细胞中的α-信息素选择性上调了基因表达，而非不透明细胞似乎在一/α生物膜，也表明白细胞信息素反应途径调节的参与白细胞生物膜形成的靶基因可能来源于一个祖先的程序一/α生物膜形成。因为它代表了一个最近的事件，路径的借用部分似乎没有足够的时间通过基因替换或改变来进行完善。
材料和方法
应变和应变维护
菌株P37005，一种来自血液感染的天然临床分离物MTL公司基因型一/一 [1]，用于衍生纯合缺失突变体和WPRE突变体。利用WPRE突变体产生补体菌株。所有菌株都保存在含有改良Lee培养基的琼脂上[67],[68]补充了夹竹桃素B，它能不同地将不透明部分和菌落染成红色[69]。
WPRE和OPRE的MEME标识
识别特定于白色和乳白色的候选人顺式-作用信息素反应元件（PRE）白色念珠菌，一组白色的相特异和不透明的相特异信息素诱导基因被提交到模体发现计划MEME[28]–[30]在基序分析之前，所有选择的基因都通过northern分析进行了验证，以通过信息素进行诱导。将12个白特异性和6个不透明特异性信息素上调基因的开放阅读框上游的1000个碱基对汇集到两个各自的组中，并进行MEME分析。MEME的网站地址是http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgiMEME程序分析输入启动子序列，以确定它们之间的相似性，并得出共识模体，这些模体可能存在于所分析的部分或全部启动子中。参数设置如下：每个图案的宽度在6到15之间，3种不同图案类型的限制输出，以及程序中定义的默认值的其他参数。结果根据MEME分析，得出了一个E值，定义为在随机序列中找到同样保守模式的概率[30]白色和不透明基因组的分析结果中得分最高的分别是保守的DNA基序WPRE和OPRE。每个启动子中都突出显示了WPRE或OPRE位点，并显示了与翻译起始位点的距离。
为了识别启动子中的强WPRE或OPRE基序，将“单个基序的出现次数”参数设置为每个序列零个或一个，MEME的结果为每个启动子产生一个E值最高的基序。为了识别启动子中其他较弱的WPRE或OPRE基序，将“单个基序的出现次数”参数设置为任何重复次数，MEME的结果为每个启动子产生更多的基序（如果有的话），具有相同的一致性，但E值较低。值得注意的是酿酒酵母预处理(TGAAACA公司)[31]–[33]在我们的分析中没有用相同的参数确定，尽管一个包含类似序列的基序酿酒酵母PRE的E值很低，为10+2.结果与Bennett和Johnson的观察结果一致[27]，谁报告的酿酒酵母PRE存在于不透明细胞中信息素诱导的一些基因中，但并非所有基因中。
WPRE突变体、WPRE补体菌株和基因断裂突变体的构建
可回收的SAT1鳍状盒SAT1-2A，包含一个主要的抗诺沙星标记SAT第页 [70]，根据先前描述的方案用于所有突变体构建[25]最初的SAT1翻转质粒pSFS2A是德国瓦茨堡大学Joachim Morschhäuser博士慷慨捐赠的。为了产生WPRE突变体，采用了两步策略。首先，获得编码区的杂合突变体。简言之，通过PCR分别使用引物对f1、r1和f2、r2（补充表S2). 然后分别用SmaI消化5′和3′片段，并用T4 DNA连接酶连接在一起。通过PCR扩增融合产物，并将其克隆到pGEM-T Easy载体（Promega，Madison，WI）中，生成质粒pGeneX1-T。然后将SAT1-2A盒插入SmaI消化的去磷酸化质粒pGene X1-T中，生成pGeneX1-2A。该质粒用SacI和SacII（或PvuII）消化CSH1型)，然后引入白色念珠菌电穿孔菌株P37005[71]通过PCR和Southern分析证实了衍生的杂合子。杂合子在YPM培养基中接受pop-out方案[25]删除CaSAT1公司标记，然后执行下一步。第二，WPRE元件直接从杂合背景下的内源性启动子中删除。使用的方法如下。使用引物对pf1和pr1（补充引物对表S2). 此外，通过PCR扩增了两个DNA片段，分别跨越要删除的WPRE元件的5′和3′侧的启动子区域，引物对列在表S2然后使用引物对pf2和pr2（补充表S2)生成3′侧翼DNA片段。然后分别用SmaI消化5′和3′侧翼DNA片段，与T4 DNA连接酶融合，用引物pf1和pr2（补充）进行PCR扩增，并连接到pGEM-T Easy载体（Promega，Madison，WI）中，生成质粒pGeneXw-T。将SAT1-2A盒插入SmaI-digested，去磷酸化质粒pGeneXw-T，产生pGeneXw-2A。该质粒用SacI和SacII（或PvuII）消化PGA10型)然后通过电穿孔引入[71]进入第一步获得的杂合菌株。每个基因获得两个或多个独立的WPRE缺失突变体，并通过PCR测序和Southern分析进行验证。我们用这种方法产生了突变体EAP1（EAP1）WPREΔ/企业应用程序1,PGA10型WPREΔ/第10页,CSH1型WPREΔ/csh1型、和PBR1型WPREΔ/pbr1型（补充表S4)。
为了获得上述每个WPRE缺失突变体的补充菌株，设计了一个包含完整启动子区域、ORF和C末端GFP融合的DNA序列，以针对每个WPRE删除突变体的基因拷贝。SAT考试第页首先从YPM培养基中的WPRE突变体中去除标记[25]用引物wQ1f和wQ1r（补充引物表S2). 使用引物wQ2f和wQ2r扩增跨越终止密码子下游区域的3′区（补充表S2). 通过PCR扩增5′-3′融合产物，并将其亚克隆到pGEM-T Easy to derive pGeneXwQ-T中GFP公司和SAT第页用引物GFBhF1和SATBgF1（补充表S2)，使用质粒pK91.6（T.Srikantha和D.R.Soll，未出版）作为模板。这个GFP公司-坐用BamHI和Bg1II消化片段，并将其连接到BamHI（或BglII，如果是CSH1型)-经消化、去磷酸化质粒pGeneXwQ-T得到质粒pGene XwQ-SAT。测序证实C末端GFP融合为框架内融合。然后用SacI和SacII消化pGeneXwQ-SAT，并转化为WPRE缺失突变体。得到的补体菌株通过PCR、测序和Southern分析进行了验证。我们用这种方法产生了补充的对照菌株EAP1（EAP1）WPREΔ-EAP1/EAP1,PGA10型WPREΔ-PGA10/PGA10,CSH1型WPREΔ-CSH1/CSH1型、和PBR1型WPREΔ-PBR1/PBR1。
每个基因的零突变也被创造出来。如前所述，杂合突变体是基于选择标记SAT衍生的第页 [70]然后使用相同的策略构建第二个等位基因的缺失盒，以删除第一个拷贝。用SacI和SacII消化产生的质粒pGeneX2-2A，并通过电穿孔将其转化为每个基因的杂合突变株。每个基因至少产生了两个独立的空突变体，并通过PCR和Southern分析进行了确认。我们用这种方法产生了空突变体企业应用程序1/企业应用程序1,第10页/第10页,csh1型/csh1型和pbr1型/pbr1型。
Northern分析
northern印迹杂交的方法已经详细描述过了[12],[25]通过聚合酶链反应（PCR）检测与粘附、细胞壁生物发生、生物膜形成和丝状形成有关的基因。合成这些基因探针的引物见补充表S3通过图形程序Adobe Photoshop™中的灰度值分析对northern印迹中每个带的信号强度进行量化。
GFP标记蛋白质成像
通过蔡司Axioplan2立式光学显微镜和63×Plan-Apochromat油浸物镜（数字孔径1.4）观察GFP标记蛋白的荧光。Attoarc HBO 100外荧光灯使用Omega Set XF 100过滤器在475-nm处激发GFP。所有样本均使用相同的采集参数。AxioVision 4.6版软件用于图像采集。然后使用Adobe Photoshop™准备图像以供发布。
西方分析
蛋白质印迹分析的方法已经在前面描述过[26]用兔抗GFP抗体（SC-8334，Santa Cruz Technology，Santa Cruz，CA）检测GFP标记蛋白。
嘘声和交配
3×10响应下shmoo形成的分析方法−6Mα-信息素，即合成的13-单体，先前已详细描述过[13],[25]还描述了与WO-1菌株的不透明α/α细胞匹配的测试方法[9]。
粘附和生物膜形成
前面详细描述了α-信息素诱导的塑料表面粘附的分析方法[20],[24]。在塑料Costar 12-well集群板（康宁生命科学，Lowell，MA）表面16小时后评估粘附性。少数不透明细胞（5%不透明）增强白细胞生物膜的分析一/一P37005细胞和5%不透明α/αWO-1细胞）[20]在硅酮弹性体表面培养48小时后，通过激光扫描共聚焦显微镜分析生物膜厚度。通过生物膜深度的钙氟染色强度表示为一个图形，其中平均像素强度（y轴）绘制为深度的函数（x轴）。计算每个X-Y光学截面中所有像素（512×512）的平均灰度值（0–256）。为了观察生物膜中细胞之间的聚合物外物质（EPS），也被称为“基质”，钙氟的兴奋性增加。由于EPS比生物膜中的细胞暗得多，780 nm的激光功率增加到细胞像素饱和的程度。然后使用Adobe Photoshop™去除饱和像素（细胞），留下EPS的图像。使用Confocal Assistant软件LUT（补充图S1)。
产生PBR1-misexpression菌株
质粒pNIM1[42]本研究中使用了含有GFP基因和四环素调节启动子的。pNIM1质粒也是Joachim Morschhä用户慷慨赠送的礼物。的ORFPBR1型基因，通过PCR扩增，引物列在补充中表S2，用SalI消化并亚克隆到质粒pNIM1中，该质粒已用SalI进行消化并去磷酸化，以获得pTet-PBR1。正确的方向PBR1型ORF经测序证实。GFP基因在框架内融合到PBR1型ORF公司。质粒pTet-PBR1随后用ApaI plus SacII消化，并转化为野生型或突变菌株。转化子经PCR和Southern分析验证。激活PBR1型northern分析证实了强力霉素的转录。我们用这种方法产生了衍生菌株P37005-tetPBR1型,EAP1（EAP1）WPREΔ/企业应用程序1-泰特PBR1型,PGA10型WPREΔ/第10页-泰特PBR1型,CSH1型WPREΔ/csh1型-泰特PBR1型,PBR1型WPREΔ/pbr1型-泰特PBR1型和cek1cek2-tetPBR1。
生物膜分泌的（1，3）-β-葡聚糖浓度的测量
相等数量的电池（5×107)如前所述，将突变株或亲本菌株的（-）和（+）1%不透明细胞分别铸入RPMI培养基中的硅橡胶方块上[20],[25],[26]48小时后，通过在不干扰培养物的情况下移走上清液、以4000rpm离心5分钟并除去上清液来收集来自生物膜培养物的上清液。然后使用Glucatell（1,3）-β-葡聚糖检测试剂盒（马萨诸塞州法尔茅斯科德角协会）测量上清液中的葡聚糖浓度[41]。在540 nm的微孔板阅读器（MDS Analytical Technologies，Sunnyvale，CA）中测定光密度（OD）值，并根据制造商的方案通过终点分析评估葡聚糖浓度。每种条件和菌株使用四种生物膜。葡聚糖浓度的平均值和标准偏差显示在条形图中。
加入号码
有关本研究中基因的详细信息，请访问念珠菌基因组数据库http://www.candidagenome.org。基因名称和ORF编号如下：EAP1型（或19.1401），PGA10型（或19.5674），CSH1型（或19.4477），PBR1型（或19.6274）、RBT5（或19.5636）、，LSP1号机组（或19.3149），菲律宾比索（或19.3829），菲律宾比索（或19.6081），太阳41（或19.3642），WH11号机组（或19.3548.1）或19.2077，企业所得税1（或19.4393），STE2型（或19.696），CEK1（CEK1）（或19.2886），CEK2号机组（或19.460），SST2型（或19.4222），RBT1型（或19.1327），MFA1型（或19.2164.1），保险丝1（或19.1156），CPH1（CPH1）（或19.4433），电子控制1（或193374），KAR4标准（或19.3736），RAM1（随机存取存储器1）（或19.5046）。
