摘要
印度洋地区各国最近爆发了一场前所未有的基孔肯雅病毒（CHIKV）感染疫情，引发了急性疼痛综合征，伴有高烧、乏力、皮疹、多关节炎和致命的脑炎病例。基孔肯雅病的基础和CHIKV的向性尚不清楚。在这里，我们描述了近期临床CHIKV菌株的复制特征。人类上皮细胞和内皮细胞、原代成纤维细胞以及在较小程度上来源于单核细胞的巨噬细胞容易感染并允许病毒产生。相反，CHIKV在淋巴细胞和单核细胞系、原代淋巴细胞和单细胞或单核细胞衍生的树突状细胞中没有复制。CHIKV复制是细胞病变，并且与感染细胞中的凋亡诱导有关。氯喹、巴非霉素A1和抗dynamin-2的短发夹RNA抑制了病毒的产生，表明病毒通过依赖pH的内吞作用进入。CHIKV对I型和II型干扰素的抗病毒活性高度敏感。这些结果为CHIKV及其哺乳动物宿主之间的相互作用提供了一般性的见解。
作者摘要
基孔肯亚病毒（CHIKV）是一种新出现的α病毒，导致印度洋地区各国出现前所未有的疫情，导致急性疼痛综合征，伴有高烧、乏力、皮疹、多关节炎和致命的脑炎病例。最近的疫情复发记录在金沙萨（1999-2000年估计有50000例）、印度尼西亚（2001-2003年）、印度洋马约特岛、毛里求斯、留尼汪岛和塞舌尔（2005-2006年在拉留尼旺岛有270000例）和印度（2006-2007年估计有140万至650万例）。CHIKV的生物学知识严重缺乏。特别是，关于CHIKV（和大多数高山病毒）与人类原代细胞的相互作用，几乎一无所知。我们研究了来自La Réunion的临床CHIKV菌株的复制特性和嗜性。我们设计了各种检测方法和试剂来跟踪病毒复制，我们在这里报告了粘附细胞（上皮和内皮细胞、原代成纤维细胞）以及巨噬细胞对感染敏感。相反，血细胞不允许病毒复制。我们还描述了病毒进入途径和对干扰素的敏感性。这些结果为CHIKV及其哺乳动物宿主之间的相互作用提供了一般性的见解。本文是巴斯德研究所、Groupe Hospitalier Sud Réunion和其他机构的众多团队合作的结果。我们的目标是建立一个专责小组，在病毒学、免疫学和细胞生物学方面拥有多种互补的专业知识，以确定这种神秘病毒的特征。
引用：Sourisseau M、Schilte C、Casartelli N、Trouillet C、Guivel Benhassine F、Rudnicka D等人（2007）重组基孔肯雅病毒的特征。公共科学图书馆·病理学3（6）：e89。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0030089
编辑：Michael J.Buchmeier，美国斯克里普斯研究所
收到：2007年2月9日；认可的：2007年5月14日；出版：2007年6月29日
版权：©2007 Sourisseau等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作者和来源得到了认可。
基金：这项工作得到了国家卫生微生物应急管理局（ANR-MIME-039-01）、CNRS、INSERM和巴斯德研究所的资助。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
缩写：CHIKV、，基孔肯雅病毒；CPE、，细胞病变效应；直流电，树突状细胞；Dyn-2，dynamin-2；干扰素，干扰素；单克隆抗体，单克隆抗体；莫伊，感染的多重性；中国人民银行，外周血单个核细胞；圆周率，感染后；RRV、，罗斯河病毒；SD、，标准差；SFV、，塞姆利基森林病毒；shRNA，短发夹RNA；SINV、，Sindbis病毒；TCID50，组织培养感染剂量50
介绍
基孔肯亚病毒（CHIKV）是一种属于多哥病毒科的甲病毒，1952年首次从坦桑尼亚的一名发热患者身上分离出[1,2]. CHIKV通过几种蚊子传播给人类埃及伊蚊和白纹伊蚊是两个主要的载体。通常在咬伤后4-7天开始出现症状。急性感染持续1至10天，特征是疼痛的多关节痛、高烧、乏力、头痛、呕吐、皮疹和肌痛[2–4]. 在斯瓦希里语中，“基孔肯亚”一词的意思是“弯曲的步行者”。事实上，在许多患者中，慢性和致残性关节痛持续数月。在过去50年中，CHIKV在东非、南非和东南亚引发了多次疫情[5]. 金沙萨记录了最近的疫情复发（1999-2000年估计有50000例）[6]，印度尼西亚（2001-2003）[7]印度洋马约特岛、毛里求斯、留尼汪岛和塞舌尔群岛（2005-2006年，留尼汪汪岛有270000例）[5])和印度（2006-2007年估计有140万至650万例）[8–10].
最近在拉留尼旺岛发生的CHIVV入侵的规模出乎意料，2005-2006年785000名居民中有40%受到感染。这是在一个具有西方卫生保健环境的国家中首次出现CHIKV疫情。报告了严重形式的疾病，约有250例死亡病例（相当于每1000例感染中有一例死亡）[11]. 以前很少或从未描述过的临床病例包括淋巴细胞减少、严重皮肤病损害、成人（通常是老年人）和新生儿致命性肝炎和脑炎，以及妊娠期间胎儿传播导致新生儿脑病或堕胎[4,12]. 许多因素可以解释为什么这种病毒最近传播得如此有效。CHIVV可能是第一次到达拉合恩，遇到了非免疫和敏感人群。参与当地传播的蚊子（白纹伊蚊）数量丰富，可能具有较高的矢量容量[13]. 循环的CHIKV菌株可能也获得了特定的复制特性。对印度洋疫情近期临床分离株的广泛基因组分析发现，与实验室适应病毒的少数先前可用序列相比，具有独特的分子特征[5]. 特别是，观察到病毒包膜糖蛋白E1的变化，可能影响病毒的融合、组装和/或向性。
与相关的模型α病毒如Sindbis病毒（SINV）、Semliki森林病毒（SFV）和Ross River病毒（RRV）相比，CHIKV的生物学知识严重缺乏；这可能反映出CHIKV主要影响发展中国家的人。阿尔法病毒是一种被包裹的单链正性RNA病毒[2]. 阿尔法病毒附着在不同物种的许多不同细胞类型上的特征较差的受体上。E1尖峰蛋白驱动融合过程，E2与细胞受体相互作用[14,15]. 个别病毒具有不同但广泛的向性，在一定程度上解释了不同的疾病模式[2]. 病毒进入通常通过受体介导的内吞作用发生，融合依赖于内体酸化[16–19]. 20世纪60年代，CHIKV被用于刺激鸡胚样成纤维细胞产生I型干扰素（IFN）[20,21]干扰素很可能在病毒清除和疾病发病机制中发挥重要作用。20世纪60年代至80年代的早期研究表明，CHIKV可在多种非人类细胞系中复制，包括Vero细胞、鸡胚成纤维细胞样细胞、BHK21、L929和Hep-2细胞[22–25]，通常会导致显著的细胞病变效应（CPE）[2]. 据我们所知，CHIKV与人类原代细胞的相互作用尚未被广泛描述。在这里，我们报道了来自留尼旺岛的临床CHIKV菌株的复制特征和嗜性，并对CHIKV与其人类宿主之间的相互作用提供了一般的见解。
结果
CHIKV复制分析
CHIKV与人类细胞的相互作用几乎一无所知。因此，我们设计了各种实验来研究细胞培养中CHIKV的复制。四种临床菌株（从La Réunion患者中分离），其基因组已测序[5]，进行了分析。分别从两名患有脑病的新生儿的血清和脑脊液中分离出CHIKV-21和CHIKF-27菌株，而CHIKV-49和CHIKV-115来自两名患有典型脑病的年轻成人[5]. 这四个菌株在遗传上很接近，在E1糖蛋白中只有一个多态性残基（密码子226）[5]. 与参考菌株（1952年在坦桑尼亚分离）相比，这些留尼汪分离物的非结构蛋白和结构蛋白出现了1%–2%的氨基酸变化。避免选择较小的实验室适应性变体[26]，病毒在C6/36蚊子细胞中仅扩增了两次，然后进行鉴定。使用标准程序测量C6/36上清液的病毒滴度（用待测上清液系列稀释液感染Vero细胞，并测量CPE的外观）[27]并经焦点免疫分析证实（参见材料和方法). 标题达到106–107四株菌株C6/36上清液中的组织培养感染剂量50（TCID50）/ml。
我们首先使用HeLa上皮细胞系作为靶点。HeLa细胞在高感染多重性（moi）下暴露于CHIKV-115，用针对α病毒衣壳（C）保守表位的单克隆抗体染色后，通过免疫荧光检测病毒蛋白的存在[28]. 在感染后2小时（pi），观察到弱的点状染色，可能对应于靶细胞结合或内化的传入病毒（未显示）。在24小时pi时，整个细胞液中的抗C染色更强烈(图1A） ●●●●。小鼠多克隆抗CHIKV抗体也在感染细胞中发出强烈信号，使胞浆和质膜染色(图1A） ●●●●。然后通过流式细胞仪对感染细胞的比例进行量化。在高病毒剂量（moi 10）下，在24–48小时pi时，80%–100%的细胞对CHIKV抗原呈阳性(图1B和1C） ●●●●。生产性感染和病毒蛋白的表达随着初始接种物的增加而增加(图1B） 。动力学分析表明，感染在培养物中迅速传播，因此表明HeLa细胞能够产生感染性病毒(图1C） ●●●●。在高mois（10和1）时，约50%的细胞在8-16 h pi时被感染，而在低mois（0.1）时CHIKV阳性细胞出现延迟(图1C） ●●●●。这种快速病毒传播与上清液中高水平感染性病毒的释放有关，达到106–107高moi（10和1）在24–48小时pi下的TCID50/ml，低moi（0.1）在48–72小时pi时的TCID50/ml(图1D） ●●●●。四株CHIKV菌株也获得了类似的结果，表明它们在HeLa细胞中的表现相似(图1E） ●●●●。
已知阿尔法病毒在脊椎动物细胞培养物中产生显著的CPE[2]. 这也是HeLa细胞中CHIKV的情况，如免疫荧光观察和比色分析（MTT细胞活力测试）所测，在24小时pi（高moi）时发生广泛的细胞死亡(图2A和2B） 。同样，这种CPE随病毒接种量的不同而变化(图2B） 。死亡细胞CHIKV抗原阳性，可见大量细胞碎片(图2A） ●●●●。感染细胞的死亡与凋亡有关，这可以通过大量活性caspase-3和CHIKV双阳性细胞的存在进行评估(图2C） ●●●●。在三个独立的实验中，在第1天pi，75%±5%的CHIKV阳性细胞也表达活性caspase-3。感染细胞的另一个凋亡标记物也呈阳性（TUNEL染色，未显示）。
值得注意的是，我们反复观察到流式细胞仪分析的有效感染细胞数量与上清液中的病毒滴度之间存在明显差异（例如，比较，图1C和1当使用低moi时为D）。这很可能是受感染细胞种群迅速广泛死亡的结果，尤其是在高mois条件下：受感染细胞的百分比实际上是在活细胞上测量的。流式细胞术检测可能主要检测高水平病毒蛋白的细胞。
我们还通过Western blot分析对CHIKV进行了表征。在CHIKV感染的HeLa细胞的裂解液和从上清液中造粒的病毒颗粒中检测到各种病毒蛋白(图3A） ●●●●。从表观分子量来看，细胞裂解物中的主要病毒蛋白很可能是包膜糖蛋白E2（62 kDa）、包膜糖蛋白质E1（52 kDa[25]. 细胞裂解物中的其他条带可能对应于非结构蛋白和结构蛋白，以及前体或中间裂解产物[2,25,29]. 颗粒上清液中的三条主要带可能对应于低水平的p62、E2–E1双链（56和52 kDa）和C(图3A） ●●●●。从患者（未显示）的血清中获得了类似的Western blot图谱，表明这些病毒蛋白在感染者体内合成并具有免疫原性。
一项电子显微镜研究显示，CHIKV感染细胞中存在大量病毒样颗粒（36 h pi）(图3B） 。病毒显示了字母病毒的特征[30,31]：大小为50–70 nm，C蛋白的二十面体样外壳，其表面存在病毒包膜糖蛋白(图3B） 。尽管α病毒出芽的细胞内位置一直存在争议[30,31]我们的分析表明，CHIKV主要在HeLa细胞的质膜上萌发。
总之，这些结果表明CHIKV在HeLa细胞中有效繁殖，通过凋亡导致感染细胞快速死亡。病毒复制可以用各种方法进行评估，包括通过免疫荧光或流式细胞术检测感染细胞，测量上清液中的病毒释放，以及定量细胞活力。
CHIKV的细胞取向
我们测试了一组永生化和原始人类细胞复制CHIKV的能力。上皮衍生细胞系HeLa、293T和BEAS-2B以及原代成纤维细胞（Hs 789.Sk皮肤细胞和MRC5肺细胞）对病毒高度敏感。感染24小时后，流式细胞术显示60%以上的细胞CHIKV阳性(图4A和4B） 免疫荧光分析（未显示）。CHIKV感染与广泛的细胞死亡和上清液中高水平感染病毒的释放有关（未显示）。有趣的是，通过在病毒暴露前将融合培养物在无血清培养基中保持至少10天而获得的静止MRC5细胞（通过流式细胞仪对细胞周期进行分析，95%的细胞位于G0/G1，未显示）也容易感染(图4B） 。因此，CHIKV在分裂和非分裂细胞中复制。我们还发现了一种上皮细胞系（A549肺泡细胞），对CHIKV感染具有抵抗力。在第2天pi，不到5%的细胞表达CHIKV抗原，没有任何CPE(图4A和4B） 。然后我们测试了分别从骨髓和大脑中分离的两种人类内皮细胞系TrHBMEC和hCMEC/D3[32,33]. 有趣的是，TrHBMEC细胞很容易被CHIKV感染和杀死，而hCMEC/D3细胞则更具耐药性(图4B） 。在hCMEC/D3中，24小时pi时只有1%的细胞为CHIKV+，该比例没有随时间增加，也没有观察到明显的CPE（未显示）。值得注意的是，猴子Vero细胞对CHIKV感染也很敏感(图4B） ●●●●。
基孔肯雅病急性期与病毒血症高峰期相关，可达到108病毒RNA拷贝数/ml（P.Laurent、K.Le Roux、P.Grivard、G.Bertil、F.Naze等，未发表数据）。因此，我们询问血源细胞系是否支持CHIKV复制。Jurkat（CD4+T淋巴细胞）、THP-1和U937（单核细胞）以及B-420（EBV-转化的B细胞）对CHIKV感染是难治的(图4B） 。然后我们检查了原始血细胞的敏感性。我们检测了非活化和PHA活化的外周血单个核细胞（PBMCs）以及纯化的细胞亚群，包括CD14+单核细胞、活化的CD4+T细胞、未成熟和成熟的单核细胞衍生的树突状细胞（DC）。这些细胞类型对CHIKV感染均不敏感，病毒暴露不会对这些细胞产生任何明显的毒性(图4C） ●●●●。
我们通过设计一种检测方法来表征病毒与这些敏感和限制性细胞的结合，进一步证明了CHIKV的向性。靶细胞在4°C下与CHIKV孵育1h（mois为10和50），用抗CHIKV抗体染色后用流式细胞仪测定结合病毒材料的数量。病毒结合因细胞类型而异。以下是两种具有强结合的细胞类型（Vero和BEAS-2B细胞）和另外两种具有不可检测结合的细胞（THP-1和初级单核细胞）的示例图5，同时表1总结了整个测试细胞板的结果。有趣的是，病毒结合效率和感染敏感性之间通常存在良好的相关性(表1).
总之，这些结果表明CHIKV容易感染大多数（但不是全部）受试的粘附细胞系或原代细胞，而血细胞对病毒不敏感。没有感染通常是由于传入的CHIKV与靶细胞结合不良。值得注意的是，对所分析的四株CHIKV菌株以及在蚊子（C6/36）或哺乳动物（HeLa）细胞中产生的病毒也获得了类似的结果，这表明这些菌株在细胞培养中的嗜性没有明显差异。
CHIKV对人类初级巨噬细胞的生产性影响
由于单核细胞对CHIKV不敏感，我们询问巨噬细胞是否允许CHIKV复制。单核细胞衍生的巨噬细胞由健康供体的PBMC制备[34]. 细胞表达CD14、CD4和CCR5（巨噬细胞谱系的标记物），强烈粘附于底部微孔，并显示出较高的吞噬活性（未显示）。巨噬细胞在37°C下暴露于CHIKV 2–4小时，通过广泛清洗去除未结合病毒，并通过免疫荧光分析和测量感染病毒的释放来评估病毒随时间的复制(图6). 在4小时pi时，可以看到一些微弱的细胞内点，可能与传入的病毒粒子相对应。随后，在培养物中检测到了（24小时pi）具有强烈CHIKV信号的高效感染细胞。根据供体的不同，大约5%–50%的细胞在24–48小时后呈阳性，其中抗C单克隆抗体（mAb）（未显示）或多克隆抗CHIKV抗体呈阳性(图6A） ●●●●。上清液中释放出感染性病毒物质，达到104–10524–48小时时的TCID50/ml，然后随时间缓慢下降(图6B） 。来自八个不同供体的细胞和各种CHIKV菌株（未显示）也获得了类似的结果。我们还通过实时PCR分析定量了病毒RNA随时间的释放（P.Laurent、K.Le Roux、P.Grivard、G.Bertil、F.Naze等，未发表的数据）。10级6–10772小时时，三个不同供体巨噬细胞中的病毒RNA拷贝数达到。描述了两个供体细胞在mois为10和50时感染的结果，以及一个供体的mois为1和10时感染的细胞的结果图6有趣的是，感染性病毒的数量在第1天或第2天达到峰值，然后下降，而病毒RNA的产生并没有下降得那么快。这表明受感染、死亡的巨噬细胞可能释放非感染性病毒RNA。总之，这些结果表明CHIKV能有效感染单核细胞来源的巨噬细胞。然而，巨噬细胞中病毒复制的程度低于HeLa细胞。
CHIKV入口通道
类阿尔法病毒SINV和SFV通过氯菊酯介导的内吞作用穿透靶细胞，低pH值的内吞室促进包膜糖蛋白的构象变化和病毒融合[15,16,18]. 我们检查了CHIKV感染是否需要较低的内体pH值才能进入。HeLa细胞被两种破坏细胞内囊泡酸化的化合物处理，即bafilomycin-A1，一种空泡质子ATP酶抑制剂[35]或弱碱性氯喹。这两种化合物都能有效抑制CHIKV阳性细胞和CHIKV-相关CPE的出现(图7A和7B） 。Bafilomycin-A1在2.5到250 nM的剂量下有效，没有明显的细胞毒性，而氯喹的活性浓度范围要窄得多：该化合物在10μM时完全抑制CHIKV感染，但在100μM时有毒(图7B） 。值得注意的是，如果将这两种化合物的添加延迟至CHIKV暴露后3小时，则未观察到抑制作用(图7A） ●●●●。这表明对酸性隔室的需求是病毒周期早期阶段的特征。
我们通过敲低dynamin-2（Dyn-2）的表达，进一步研究了网格蛋白内吞途径的作用，dynamin-2-是形成网格蛋白包被的凹坑和小泡以及小窝所需的关键蛋白[18,36,37]. 这是通过使用表达EGFP的慢病毒载体和针对Dyn-2的短发夹RNA（shRNA）实现的[38]. HeLa细胞转染抑制EGFP+细胞中Dyn-2的表达(图7C） ，具有预期的功能意义，如转铁蛋白受体表面表达的显著增加所证明(图7C） ●●●●。有趣的是，缺乏Dyn-2的HeLa细胞在很大程度上对CHIKV感染无效，而用编码对照shRNA的载体转导的细胞通常受到感染(图7D） ●●●●。在四个独立的实验中，缺乏Dyn-2与HeLa细胞对CHIKV敏感性降低20倍有关(图7D） ●●●●。总之，这些实验强烈表明，CHIVV需要一条活性的氯氰菊酯依赖性内化途径，并以低pH值的内体隔室为靶点，才能成功感染。
CHIKV复制对IFN敏感
干扰素是1957年首次发现的一种具有抗病毒活性的未定义物质。过去几十年的工作定义了两类抗病毒物质：第一类干扰素（IFNα/β），通过共享受体发出信号；第二类干扰物（IFNγ），通过独特的干扰素γ受体发出信号。有趣的是，在20世纪60年代，CHIKV被用于刺激鸡胚成纤维细胞样细胞产生干扰素[20,21]，但尚未评估干扰素对CHIKV感染的影响。我们利用HeLa感染系统确定了干扰素在限制CHIKV感染中的潜在作用。用干扰素α预处理细胞1亿，干扰素β1a个或干扰素γ6小时，剂量为10至1000 IU/ml，然后通过流式细胞仪分析病毒复制。有趣的是，这三种干扰素能有效抑制病毒蛋白的表达(图7A） ●●●●。此外，干扰素治疗可显著降低病毒诱导的CPE(图7B） 。四种病毒株的结果相似，表明CHIKV对IFN的抗病毒作用高度敏感。值得注意的是，巨噬细胞中的干扰素也强烈抑制CHIKV复制（未显示），表明干扰素的抗病毒作用在原代细胞中也可见。
讨论
我们在这里描述了CHIKV病毒的复制特征，这是一种导致印度和印度洋地区其他国家最近疫情暴发的病毒。到目前为止，还没有使用现代技术对这种病毒进行仔细检查。我们设计了一组分析，以跟踪病毒复制并描述培养实验中CHIKV的细胞向性。我们报告CHIKV在各种人类粘附细胞中复制，包括上皮细胞和内皮细胞，以及原代成纤维细胞和巨噬细胞。相反，T、B淋巴细胞和单核细胞衍生DC不易受感染。病毒通过pH依赖性的内吞途径进入。这种病毒的生命周期很短：只要8–16小时，就可以检测到大量新感染的细胞，从而释放出高水平的子代病毒。上清液中的病毒滴度达到105–108TCID50/ml，取决于细胞类型。CHIKV对哺乳动物细胞具有高度的细胞病变性，可诱导感染细胞凋亡。此外，I型和II型干扰素显著抑制CHIKV复制。这些特征通常与其他α病毒的特征相对应，其中研究最多的是SINV、SFV和RRV[14,31,39,40]. 甲病毒属包含20多个成员，可能在2000年至3000年前分化[40]. 一些α病毒在人类中是非致病性的，而另一些则会引起不同强度的不同疾病，大致可分为美洲脑炎病毒和全球分布的关节炎病毒[2,41]. 因此，每种病毒类型都可能进化出自己与宿主相互作用的方式。
到目前为止，对α病毒的研究大多是在小鼠和其他动物细胞中进行的。特别是，CHIKV与人类细胞的相互作用尚未确定。我们在这里报道了一些人类上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞对CHIKV敏感。加上最近的发现，CHIKV在人类肌肉卫星细胞中复制，而在分化的肌管中不复制[42]，我们的结果表明CHIVV对粘附细胞表现出相当广泛的趋向性。然而，CHIKV在hCMEC/D3内皮细胞和A549上皮细胞中均未有效复制。这种CHIKV抗性细胞的鉴定将有助于进一步研究破译进入或进入后病毒事件。例如，CHIKV的细胞受体尚不清楚。我们通常观察到病毒结合与靶细胞感染之间的直接关系(表1). 我们的结果表明，由于缺乏表面结合受体，hCMEC/D3细胞没有受到感染。这种情况可能与A549细胞不同，A549细胞对感染不敏感，但仍能结合病毒颗粒。A549细胞可以非特异性地结合进入的病毒（通过不参与生产进入的受体），或者在结合后的步骤限制感染。
至于其他字母病毒[14,16,43]，CHIKV条目依赖于pH。病毒复制被抑制内体酸化的化合物阻断，可能需要网格蛋白机制，正如Dyn-2对病毒复制的需求所证明的那样。Dyn-2还通过小窝控制网格蛋白的非依赖性摄取[38,44]因此，我们有兴趣研究caveolae是否也参与了CHIKV的进入。虽然氯喹阻断了CHIKV的复制，但细胞培养中氯喹的治疗（抗病毒）指数相当窄(图7); 因此，在建议将氯喹用作受感染者的抗病毒治疗时应谨慎。
CHIKV在人类细胞培养中具有高度的细胞病变，感染细胞迅速发生凋亡。阿尔法病毒复制强烈影响基本的细胞生理过程，抑制细胞转录和翻译，并将细胞资源转向病毒蛋白质和基因组的合成[45]. SINV诱导细胞凋亡发生在细胞进入水平，而不需要病毒复制[46,47]. 要确定CHIKV是否也存在这种情况，以及CHIKV感染细胞的凋亡是否参与发病机制，还需要进一步的研究。
干扰素是先天免疫系统的重要组成部分，可防止甲病毒疾病[14,48,49]. 2005年的一项研究提出了甲型肝炎病毒的毒力和对I型干扰素的耐药性之间的相关性，正如东部马脑炎病毒所报道的那样[49]. 我们在此表明，CHIKV的情况可能不同，因为这种致病性病毒在细胞培养中对I型和II型干扰素保持完全敏感。这强烈表明，先天免疫系统控制着病毒，并负责在感染急性期观察到的病毒血症迅速下降（几天内）。这将有助于确定哪些IFN诱导的蛋白质介导CHIKV复制的抑制。一个有趣的候选者是ISG15，它最近被证明是一种在小鼠体内对抗SINV的关键抗病毒分子[50].
与贴壁细胞相比，初级淋巴细胞、T细胞、B细胞和单核细胞系不允许CHIKV复制。RRV和SFV也有类似的结果[51,52]. 这两种α病毒包膜糖蛋白假型逆转录病毒载体能有效转导粘附细胞，但不能感染淋巴细胞和单核细胞[51,52]. 这可能是由于淋巴细胞和单核细胞缺乏足够的受体表达。我们可以推测，这些细胞中也没有CHIKV受体，这得到了我们实验中缺乏病毒结合的支持。由于基孔肯雅病急性期出现病毒血症高峰（P.Laurent、K.Le Roux、P.Grivard、G.Bertil、F.Naze等，未发表的数据），我们试图确定急性感染者的PBMC是否携带CHIKV。我们没有观察到三名血浆病毒载量在105– 108RNA拷贝数/ml（未显示）。因此，PBMC在体外对CHIKV不敏感，在体内可能不会感染。
人类单核细胞衍生DC对CHIKV复制不敏感。多种参数调节α病毒感染树突状细胞的能力；例如，RRV包膜糖蛋白允许小鼠感染，而不允许人类DC感染[52]. SINV载体感染人类DC是由E2中的一个氨基酸取代决定的[53]. 在小鼠模型中，委内瑞拉马脑炎病毒对皮肤树突状细胞的体内靶向是发病所必需的，也受E2中氨基酸的调节[54]. 另一方面，与哺乳动物细胞衍生制剂相比，蚊子细胞衍生的RRV和委内瑞拉马脑炎病毒对小鼠髓样树突状细胞的感染增强[55]. 这是因为哺乳动物细胞中产生的病毒能够更好地诱导I型干扰素[55]. 在我们手中，单核细胞衍生的DC对蚊子（C6/36）或人类（HeLa）细胞产生的CHIKV不敏感。未成熟DC和成熟DC也观察到类似的结果，将未成熟DC暴露于CHIKV（来自C6/36或HeLa细胞）不会诱导其成熟，也不会促进I型干扰素的产生（未显示）。我们的结果强烈表明，单核衍生DC对CHIKV具有内在抗性。进一步的工作应该检查其他DC亚群的敏感性，如浆细胞样DC和Langerhans细胞。
我们在此证明，与树突状细胞相比，人类原代巨噬细胞对CHIKV敏感。巨噬细胞的感染与上清液中感染性病毒子代的释放有关。这一过程的效率低于HeLa细胞，只有5%–50%的细胞群呈阳性，病毒滴度稳定在104–105pfu/ml，具体取决于细胞供体。这种复制受限可能是由于受感染的巨噬细胞分泌IFN或其他细胞因子所致。RRV是另一种致关节炎病毒，也感染巨噬细胞[41,56–58]. 巨噬细胞与RRV病的发病机制有关，至少在小鼠感染模型中是如此。在这个模型中，肌肉和关节中观察到炎性巨噬细胞的浸润[41,59]以及用巨噬细胞毒性药物治疗小鼠以消除症状[60]. 此外，RRV可以诱导培养物中巨噬细胞的持续生产性感染[56,61]. 已有报道称，在单核细胞/巨噬细胞系中，抗体依赖性增强RRV感染，但这一过程是否在体内发挥作用尚待证实[41,56].
然而，RRV和CHIKV与巨噬细胞的相互作用存在显著差异。首先，RRV主要是使用小鼠单核细胞/巨噬细胞或人类单核细胞样细胞进行研究的，据我们所知，没有证据表明RRV感染原代人类巨噬细胞。此外，RRV[56]，而非CHIKV(图4B） 感染单核细胞，如U937细胞。CHIVV会导致突然出现严重的关节炎和发热，而RRV引起的症状通常较轻且较为缓慢[40]. 这些差异是否与病毒与体内巨噬细胞的差异性相互作用有关尚待确定。
在最近拉留尼汪爆发的CHIKV期间，在比较最初和后来的循环毒株时，报道了病毒基因组的进化。特别注意到E1糖蛋白（A226V）突变株的选择[5]. 在我们的研究中，我们使用了四种不同序列的临床CHIKV菌株。在我们的分析中，所有变体的行为都类似，这表明所报道的进化并不是由于选择了对人类细胞具有改性取向的病毒。
总的来说，我们的结果为α病毒的复制和CHIKV的发病机制提供了新的见解。我们确定了一组对CHIKV敏感的人类细胞类型，我们的下一个目标是进一步描述CHIKV如何与这些细胞相互作用。确定树突状细胞、巨噬细胞和其他细胞类型如何感知CHIKV，以及在遭遇过程中产生哪些细胞因子，将是很有意义的。将我们的结果与体内情况联系起来也很有用，例如，通过从CHIK感染者的生物样品中确定在疾病的急性和慢性阶段哪些细胞携带病毒。
材料和方法
细胞和试剂。
HeLa细胞，293T细胞，原代皮肤细胞（Hs 789.Sk，美国型培养物收集[ATCC]编号7518；http://www.atcc.org)在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养TrHBMEC、BEAS-2B细胞、MRC5细胞和Vero细胞。hCMEC/D3在EBM2培养基中生长（克隆学，http://www.cambrex.com网站)A549细胞在含有10%热失活FBS的F12K培养基中生长。TrHBMEC和hCMEC/D3细胞是Babette Weksler、Ignacio Romero和Pierre-Olivier Couraud的一种礼物，分别是从骨髓和大脑中分离出来的永久性人内皮细胞系[32,33]. MRC5细胞是原代人胎肺上皮细胞（ATCC编号CCL-171）。A549（ATCC编号CCL-185）是人类恶性肺泡II型肺细胞，BEAS-2B（ATCC号CRL-9609）是SV40转化的人类气道上皮细胞。静止的MRC5细胞是通过在无血清培养基中保持融合培养获得的，其中10−6病毒暴露前至少10天服用M-地塞米松（通过流式细胞仪分析细胞周期，G0/G1时95%的细胞未显示）。通过Ficoll离心分离健康供体的浅黄色外周血单个核细胞。使用磁珠（Miltenyi Biotec，http://www.miltenyibiotec.com). B-420细胞是EBV永生化B细胞[62]. THP-1和U937单核细胞、Jurkat T细胞、PBMC、初级淋巴细胞和单核细胞在含有10%FBS的RPMI培养基中生长。白纹伊蚊C6/36细胞在28°C的Leibovitz-L15培养基中生长，添加5%FBS和胰蛋白酶磷酸盐。DC的制备如所述[62,63]. 使用磁珠（Miltenyi Biotec）通过阳性选择从PBMC中分离CD14+单核细胞。为了使巨噬细胞分化，在使用前将单核细胞培养在含有5%人AB阳性血清和5%SVF及rHu M-CSF（12.5 ng/mL）（Promokine，网址：http://www.promoke.de). 氯喹和巴菲霉素来自西格玛(网址：http://www.sigmaaldrich.com)，来自ImmunoTools的IFN(http://www.immunotools.de).
CHIKV滴定。
使用标准程序，在Vero细胞上滴定病毒样本TCID50/mL。简单地说，将连续稀释的细胞培养上清液（100μL）分成8份加入96个接种有10份的平板中4Vero细胞。在感染后5天对CPE进行评分，通过测定最后稀释度计算滴度，给出50%的细胞显示CPE的孔。使用焦点免疫分析获得类似的滴度[5].
CHIKV感染。
描述了从临床样品中制备CHIKV[5]. 将四株CHIKV菌株在C6/36细胞中繁殖两次，按照说明收集上清液并在−80°C下冷冻[5]在滴定和进一步使用之前。粘附细胞（在6孔或24孔板中约25%的汇合处电镀）和非粘附细胞（0.5×106–1 × 106在进一步分析之前，将细胞/实验点）在37°C下暴露于指示的病毒2-4小时，广泛清洗并培养不同时间。moi定义为每个靶细胞的CHIKV感染单位数量（以Vero细胞为TCID50计算）。
CHIKV绑定。
粘附细胞（约5×10镀膜56孔板中的细胞/实验点）和非粘附细胞（5×105细胞/实验点）以1ml的最终体积暴露于CHIKV（CHIKV-21或CHIKV-115菌株）（在4°C下1小时）。用小鼠多克隆抗CHIKV抗体染色后，用流式细胞术分析CHIKV蛋白的表达。
细胞活力。
用经典的MTT法测定细胞活力[64]. HeLa细胞被镀在96-well板中，并暴露于指示的病毒。24至48小时后，将70μg MTT（3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2H-四唑溴化铵，Sigma）（10μL的7 mg/mL溶液）添加到100μL培养基中，在CO中培养5小时237°C培养箱。然后移除介质，并使用100μL酸异丙醇（异丙醇中0.04 N HCl）溶解晶体。使用550 nm的测试波长在ELISA阅读器上读取板。
通过实时PCR定量CHIKV RNA。
将细胞暴露于指定的CHIKV溶液中2-4小时，用PBS清洗，并培养指定的时间段。使用MagNA纯LC总核酸分离试剂盒（Roche Diagnostics，http://www.roche.com网站). 使用Light Cycler（罗氏诊断）测量CHIKV RNA水平（P.Laurent、K.Le Roux、P.Grivard、G.Bertil、F.Naze等，未发表数据）。
电子显微镜。
HeLa细胞感染CHIKV（moi 1）。感染后36小时，细胞在PBS-3%戊二醛中固定1小时，在PBS-1%四氧化锇中固定2小时。在PBS中冲洗后，将细胞转移到0.2M的碳酸缓冲液中30分钟。细胞在30%甲醇中清洗10分钟，在2%醋酸铀酰-30%甲醇中染色1小时，并在30%甲醇里清洗。然后将细胞在乙醇系列中脱水成环氧丙烷并嵌入Epon 812中。用JEOL 1200EX2显微镜检查细胞(网址：http://www.jeol.com).
表达shRNAs的慢病毒载体。
如前所述，生产并使用表达GFP和shRNA的慢病毒载体（针对Dyn-2或作为对照的无关蛋白）[39].
致谢
我们感谢Babette Weksler、Pierre-Olivier Couraud、Ignacio Romero和Isabelle Greiser-Wilke提供的试剂礼物，以及Emmanuelle Perret（巴斯德成像研究所）在显微成像方面的专家协助。
作者贡献
MS、CS、NC、CT、FGB、DR、NSF、MCP、HF、MPF、FB、PVA、PEC、SO、AG、FAS、PD、AM、MLA和OS构思、设计或执行了实验。MS、CS、NC、CT、FGB、DR、NSF、KLR、MCP、HF、FB、PVA、PEC、SO、AG、IS、FAR、FAS、PD、AM、MLA和OS分析了数据或更正了论文。BV、AZ和AS提供的试剂/材料/分析工具。MS、MLA和OS撰写了这篇论文。
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