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研究文章

GPER激活通过上调SIRT1/3-AMPK-UCP2通路减轻绝经后糖尿病大鼠心脏功能障碍

  • 侯赛因·阿齐兹语,

    角色概念化，资金收购，调查，方法，项目管理，资源，监督，验证，可视化，写作–审查和编辑

    H.Azizian@ssu.ac.ir（HA）；Shokoufeh.mahmoodzadeh@mdc-berlin.de（SM）

    附属伊朗亚兹德沙希德·萨多吉医学科学与卫生服务大学医学院亚兹德神经内分泌研究中心

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  • Zeinab Farhadi，

    角色数据管理，调查，方法，软件，写作——原稿

    附属伊朗亚兹德沙希德·萨多吉医学科学与卫生服务大学医学院亚兹德神经内分泌研究中心

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  • 迈克尔·巴德，

    角色概念化，写作–审查和编辑

    附属公司德国柏林亥姆霍兹协会（MDC）马克斯·德布吕克分子医学中心，DZHK（德国心血管研究中心），德国柏林合作伙伴网站，柏林慈善大学，柏林自由大学和德国柏林洪堡大学的法人会员，吕贝克大学生物研究所，吕贝克，德国

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  • Jalil Alizadeh Ghalenei，

    角色形式分析，写作——原稿

    附属伊朗亚兹德沙希德·萨多吉医学科学与卫生服务大学医学院亚兹德神经内分泌研究中心

    ⨯
  • 穆罕默德·阿明·加法里，

    角色形式分析，软件，写作——原稿

    附属伊朗亚兹德沙希德·萨多吉医学科学与卫生服务大学医学院亚兹德神经内分泌研究中心

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  • Shokoufeh Mahmoodzadeh公司

    角色概念化，方法，项目管理，监督，验证，可视化，写作–审查和编辑

    H.Azizian@ssu.ac.ir（HA）；Shokoufeh.mahmoodzadeh@mdc-berlin.de（SM）

    附属公司德国柏林亥姆霍兹协会（MDC）马克斯·德布吕克分子医学中心，DZHK（德国心血管研究中心），德国柏林合作伙伴网站

    ⨯

摘要

与非糖尿病女性相比，绝经后糖尿病女性患心血管疾病的风险更高。sirtuins变化引起的心脏细胞代谢改变是绝经后糖尿病女性CVD的主要原因之一。一些研究已经证明G蛋白偶联雌激素受体（GPER）在绝经后糖尿病CVD中的有益作用。然而，GPER具有心脏保护作用的分子机制尚不清楚。在本研究中，我们使用高脂饮食/链脲佐菌素诱导的卵巢切除（OVX）2型糖尿病（T2D）大鼠模型，研究了G-1（GPER-agonist）对西尔曲肽的影响，以及它们参与心脏代谢和功能调节的下游通路。动物分为五组：假对照组、T2D组、OVX+T2D组，OVX+T2D+载体组和OVX+/T2D+G-1组。G-1给药6周。最后，测定血流动力学因素，并通过Western blot分析测定sirtuins、AMP活化蛋白激酶（AMPK）和解偶联蛋白2（UCP2）的蛋白水平。此外，还测量了心脏氧化应激生物标志物的水平。研究结果表明，T2D导致左心室功能障碍和心肌氧化应激迹象，并伴有心脏Sirt1/2/3/6、p-AMPK和UCP2蛋白水平降低。此外，更年期状态的诱导加剧了这些变化。相反，G-1治疗通过增加Sirt1/3、p-AMPK、UCP2和改善氧化状态，改善了卵巢切除相关的血流动力学变化。该结果为GPER通过Sirt1/3、p-AMPK和UCP2操作的心脏保护作用提供了证据，从而改善了心脏功能。我们的结果表明，提高Sirt1/3水平可能会为绝经后糖尿病CVD提供新的治疗方法。

引用：Azizian H、Farhadi Z、Bader M、Alizadeh Ghalenoei J、Ghafari MA、Mahmoodzadeh S（2023）GPER激活通过上调绝经后糖尿病大鼠的SIRT1/3-AMPK-UCP2通路来减轻心脏功能障碍。公共科学图书馆·综合18（12）：e0293630。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0293630

编辑：王美静，美国印第安纳大学医学院

收到：2023年7月11日；认可的：2023年10月16日；出版：2023年12月22日

版权：©2023 Azizian等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。

数据可用性：所有数据都是完全可用的，没有任何限制。

基金：本研究由伊朗亚兹德Shahid Sadoughi医学科学大学向H.A.提供的拨款（1400.285）资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

2型糖尿病（T2D），尤其是女性，是一种新出现的流行病，每年在全球范围内直接或间接导致数千人死亡，原因是共病，包括心血管疾病（CVD）[1]. 此外，更年期与代谢紊乱（如T2D）增加有关，导致线粒体功能和心脏代谢改变，导致左心室肥厚和细胞外纤维化[2]. 糖尿病诱导的高血糖通过改变胰岛素信号、氧化应激、线粒体功能、钙处理受损、炎症增加以及脂肪酸作为能量来源的消耗增加，影响心脏结构和功能。由于心脏持续而剧烈地工作，它需要线粒体以ATP分子的形式提供大量能量。因此，心脏线粒体对心脏的正常功能起着至关重要的作用[三]. 由于线粒体功能障碍和氧化应激在糖尿病相关CVD中起着重要作用，因此以线粒体为靶点可以有效治疗糖尿病诱导的CVD[4]. 线粒体生理功能受损的机制之一是线粒体蛋白质的翻译后变化，这主要由乙酰化介导[5]. Sirtuins（Sirt）是III类组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）的一个家族，由于需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）调节蛋白质的乙酰化状态，因此与其他类别的HDAC不同。Sirtuins对NAD的需求可能表明其参与调节影响心脏代谢和营养状态的基因表达[4]. 在哺乳动物中发现的七种sirtuin中，Sirt1、Sirt2、Sirt3和Sirt6通过调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化，在调节细胞代谢和线粒体功能方面发挥着关键作用。因此，这些sirtuins也调节参与心脏代谢的几个重要基因的转录[5].

AMP-activated protein kinase（AMPK）是一种重要的细胞能量利用传感器，可以平衡氧化应激，在肥胖和糖尿病等情况下，磷酸化及其活性会降低[6]. AMPK信号通路是线粒体功能的主要调节器[7]AMPK也可能通过增加NAD+水平来激活sirtuins[8]. AMPK信号通路受损也是糖尿病和代谢综合征（如心肌病和肾病）引起疾病的促因[9]. 此外，AMPK已被证明具有多效性心脏保护作用，通过改善能量供应和调节其他生理过程恢复心脏功能障碍[6]. 解偶联蛋白（UCPs）位于线粒体内膜，参与维持线粒体功能和调节氧化应激[10]. UCP2是UCP家族的成员，可以通过抑制活性氧（ROS）的生成来保护心肌细胞免受氧化应激[10]. 此外，AMPK调节UCP2的活性[11]通过改善能量供应和调节其他生理过程，具有多效性心脏保护作用[6].

17β-雌二醇（E2）是女性的主要雌激素，通过各种分子和细胞途径对能量状态和心脏代谢发挥保护作用[12]. 因此，绝经后妇女更容易受到E2减少引起的代谢紊乱的影响[13]. E2的保护性代谢作用传统上归因于经典E2受体，其由基因组途径介导，这是一个耗时且缓慢的过程[14]. 最近，越来越多的证据表明，G蛋白偶联雌激素受体（GPER）作为一种7跨膜受体，在心脏和血管等多种组织中表达，并介导E2的快速生物作用[15]. 基于遗传学和药理学方法，越来越多的文献强调GPER在调节E2代谢功能和心脏功能中的作用[12]. 最近，我们和其他作者证明E2通过GPER对绝经后、T2D和肥胖具有代谢性心血管和抗炎保护作用[12,15]. 然而，GPER改善代谢和心血管疾病的详细机制尚未完全确定[12].

因此，鉴于上述情况，本研究的目的是研究GPER是否调节绝经后T2D大鼠的心脏sirtuins。为了验证这一假设，我们在雌性大鼠中建立了绝经T2D状态（绝经糖尿病状态）和GPER激动剂治疗的模型。

方法

化学品和抗体

链脲佐菌素（STZ）和二甲基亚砜（DMSO）以及生理盐水来自Sigma-Aldrich（美国），而G-1（选择性GPER-agonist）来自Tocris Bioscience（美国）。STZ溶解在0.1 M柠檬酸盐缓冲液（pH 4.4）中，而G-1溶解在16%二甲基亚砜和0.9%盐水中，用作G-1的载体[16]. 放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液、BCA蛋白分析试剂盒和增强化学发光（ECL）plus试剂盒分别来自美国皮尔斯圣克鲁斯生物技术公司和伊利诺伊州阿灵顿高地阿默沙姆。用于Western blot分析的主要抗体如下：抗SIRT1、抗SIRT2、抗SIRT3、抗SIRT 6和抗UCP2抗体来自Santa Cruz Biotechnology（德克萨斯州，美国），磷酸-AMPK（Thr172）、AMPK和β-肌动蛋白抗体来自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利，美国）。二级抗体来自Santa Cruz Biotechnology（美国得克萨斯州）。

动物和实验设计

雌性Wistar大鼠（3-4个月，210–230克）来自伊朗亚兹德沙希德·萨多基医学科学大学动物中心。雌性大鼠被饲养在空调（22–25°C）房间，光-暗循环（12:12 h），自由获取食物和水。本研究符合国家卫生研究院关于动物护理和使用的道德准则，并得到沙希德·萨多伊大学动物护理机构委员会的批准(IR.SSU.1400.285号). 雌性大鼠随机分为五组（每组7-10只）：假对照组（Sh-Ctl）；T2D；卵巢切除（OVX）+T2D；OVX+T2D+车辆（Veh）；和OVX+T2D+G-1。如前所述，在实验开始前两周对动物进行OVX[15]. 为了建立T2D模型，雌性大鼠被给予高脂饮食（HFD）8周。随后，动物禁食24小时，并接受静脉注射STZ（30 mg/kg）。注射后一周，证实大鼠的空腹血糖水平超过200 mg/dl[17]. 在确认T2D后，雌性大鼠每周三天通过静脉注射G-1（200μG/Kg）或载体，持续6周[12]. 体重（BW）变化百分比计算为（最终BW–初始BW）除以初始BW乘以100，其中初始BW为治疗第1天的BW。该实验过程的时间表如所示图1.

缩略图
下载：
图1。实验设计示意图。

G-1：GPER激动剂，h：小时，OVX：卵巢切除，Sh-Ctl：假对照，STZ：链脲佐菌素，T2D：2型糖尿病，Veh：溶媒。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0293630.g001

血液动力学和代谢参数

完成治疗方案后，通过静脉注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（80/10 mg/kg）对雌性大鼠进行深度麻醉。在颈部切开一个切口后，在动物的气管内放置一个套管，以便在紧急情况下进行通风。然后在右颈动脉内放置一根充满肝素盐水的聚乙烯导管（PE-50），并将其推进至左心室。平均动脉压（MAP）和血液动力学指标，包括左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、收缩期左心室压力的最大上升率（+dp/dt max）和舒张期压力的最大下降率（−dp/dt max）记录在8通道PowerLab Physiograph系统上（澳大利亚ADInstruments）[18].

血液动力学实验完成后，通过静脉注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物对雌性大鼠进行深度麻醉。快速取出心脏，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，称重，然后在液氮中冷冻。使用己糖激酶法在全自动化学分析仪Olympus AU400（日本奥林巴斯公司）上测量空腹血糖（FBG）水平[19].

心脏组织中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的测定

对于每只大鼠，将左心室的一部分在冰镇裂解缓冲液中均质，然后在11269 x g和4°C下离心10分钟。上清液保持在−80°C下，以进行进一步处理。根据制造商的说明，使用商用ELISA试剂盒（德国ZellBio GmbH）测定SOD活性和MDA水平（脂质过氧化产物）。

样品制备和Western印迹

将每只大鼠的左心室在冰镇裂解缓冲液中均质，并在15339 x g和4°C下离心15分钟。使用BCA方法测量蛋白质浓度。等量的蛋白质经SDS-PAGE凝胶处理，分离的蛋白质转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂牛奶封闭膜（4°C下过夜），然后在室温下分别用抗Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt6、UCP2、p-AMPK（稀释1:1000）和β-actin（稀释1:2000）的一级抗体孵育三小时。在用吐温-20（1x PBST）在磷酸盐缓冲盐水中洗涤（三次，每次5分钟）后，在室温下用辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:15000）孵育膜60分钟。使用增强化学发光（ECL）系统检测蛋白质条带密度，并使用Image J软件（UVP，UK）量化相对于负载控制β-肌动蛋白或AMPK表达的条带强度。

统计分析

数据表示为平均值±平均值标准误差（±SEM）。使用GraphPad Prism（6.0版）软件进行统计分析。采用单因素方差分析评估统计差异，然后进行Tukey-Kramer检验。P≤0.05被认为具有统计学意义。

结果

GPER激活可抵消更年期对BW、FBG和HW的影响

在当前研究中，如所示表1与Sh-Ctl组相比，雌性大鼠T2D诱导导致FBG（P≤0.001）、BW和HW（P≤0.01）显著增加。通过诱导T2D大鼠的更年期状态（OVX+T2D vs.T2D），所有三个参数-BW（P≤0.01）、FBG和HW（P＜0.05）均进一步显著增加。然而，G-1治疗显著抑制了OVX-T2D雌性大鼠的BW、FBG和HW升高（P≤0.05）。然而，由于在OVX+T2D+载体组和OVX+T2D组之间未发现任何其他测量参数的统计显著差异，因此我们在下文中不对其他参数提及这一点。

缩略图
下载：
表1。GPER激活对OVX-T2D雌性大鼠体重、空腹血糖和心脏重量的影响。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0293630.t001

GPER激活改善OVX-T2D雌性大鼠心脏功能

图2显示了不同组的基础血流动力学和左心室指数的变化。正如预期的那样，与Sh-Ctl组相比，T2D诱导导致MAP和LVEDP显著增加（P≤0.01），±dp/dt（P≤0.1）和LVSP显著降低（P≤0.05）。然而，T2D动物绝经状态的诱导增强了观察到的变化。因此，与T2D组相比，更年期合并糖尿病（OVX+T2D）导致MAP和LVEDP水平显著升高，LVSP和±dp/dt显著降低（P≤0.05）。有趣的是，我们的数据显示，G-1激活GPER显著影响OVX+T2D大鼠的心脏功能。与溶媒组相比，G-1治疗导致OVX-T2D动物的MAP和LVEDP显著降低，LVSP和±dp/dt显著增加（P≤0.05）。

缩略图
下载：
图2。实验组的基础血流动力学和左心室指数。

（A） MAP、（B）LVSP、（C）LVEDP、（D）+dp/dt max、（E）−dp/dt最大值。所有数据均表示为平均值±SEM。*与Sh-Ctl相比，P≤0.05和**P≤0.01。#与T2D相比，P≤0.05。+P≤0.05 vs.OVX+T2D+Veh。单向方差分析，然后进行Tukey-Kramer检验+dp/dt max：收缩期间左室压力的最大增加率，−dp/dt最大值：舒张期间左室压的最大降低率，G-1:GPER激动剂，LVEDP：左室舒张末期压力，LVSP：左室收缩压，MAP：平均动脉压，OVX：卵巢切除，Sh-Ctl：假对照，T2D：2型糖尿病，Veh：车辆。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0293630.g002

GPER介导OVX-T2D雌性大鼠左心室Sirt1和Sirt3表达上调

几项研究报告称，糖尿病心脏中的sirtuin蛋白水平受到影响[5,20]. 根据这些数据，如所示图3我们可以表明，与Sh-Ctl组相比，雌性大鼠T2D的诱导显著降低了Sirt1（P≤0.01）、Sirt2、Sirt3和Sirt6蛋白的心脏水平（P≤0.05）。与T2D组相比，T2D大鼠卵巢切除诱导导致心脏Sirt1（P≤0.01）、Sirt3和Sirt6（P≤0.05）表达水平的降低更大。有趣的是，G-1激活GPER显著逆转了更年期诱导的Sirt1和Sirt3蛋白表达的减少（P≤0.05）。卵巢切除术和GPER激动剂G-1均未对Sirt2蛋白表达水平产生任何影响。

缩略图
下载：
图3。

Western blot分析各组左心室中（A）Sirt1、（B）Sirt2、（C）Sirt3和（D）Sirt6蛋白水平。在每幅图中：上部面板：受试组雌性大鼠左心室组织中相应Sirt蛋白（如图所示）和β-肌动蛋白（如内部对照）的代表性免疫印迹。下面板：各组中各自Sirt蛋白的表达作为相对带强度与肌动蛋白带强度的比值。所有数据均表示为平均值±SEM。*与Sh-Ctl相比，P≤0.05和**P≤0.01。#P≤0.05且##与T2D相比，P≤0.01。+P≤0.05 vs OVX+T2D+Veh。单向方差分析，然后进行Tukey-Kramer检验。G-1：GPER激动剂，OVX：卵巢切除，Sh-Ctl：Sham-control，Sirt1:Sirtuin 1，Sirt2:Sirtuin-2，Sirt3:Sirtuin3，Sirt6:Sirtuin.6，T2D：2型糖尿病，Veh：载体。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0293630.g003

GPER激动剂G-1促进OVX-T2D雌性大鼠左心室AMPK磷酸化

由于AMPK是心脏能量代谢的关键调节器，我们在研究中调查了心脏AMPK激活（即AMPK磷酸化（p-AMPK））在不同动物组中是否发生改变。如所示图4与Sh-Ctl组相比，雌性动物T2D诱导显著降低了心脏p-AMPK蛋白水平（p≤0.01）。虽然卵巢切除术显著增强了雌性T2D动物左心室p-AMPK蛋白水平的降低（OVX+T2D vs.T2D，p≤0.05），但GPER激动剂G-1治疗显著逆转了这些动物左心室中p-AMPK水平的下降（OVX+T2D+G-1 vs.OVX+T2D+Veh，p≤0.05）。

缩略图
下载：
图4。Western blot分析各组左心室p-AMPK表达水平。

上面板：检测组雌性大鼠左心室组织中p-AMPK和AMPK的代表性免疫印迹。下面板：各组中p-AMPK的表达为相对带强度与AMPK带强度之比。所有数据均表示为平均值±SEM。**P≤0.01 vs.Sh-Ctl。#与T2D相比，P≤0.05。+P≤0.05 vs OVX+T2D+Veh。单向方差分析，然后进行Tukey-Kramer检验。G-1：GPER激动剂，OVX：卵巢切除，Sh-Ctl：假对照，T2D：2型糖尿病，Veh：载体。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0293630.g004

GPER激活增加了OVX-T2D雌性大鼠左心室UCP2水平并降低了氧化应激

接下来，我们研究了UCP2蛋白表达的变化，该蛋白主要表达于线粒体内膜，并调节线粒体生物生成、活性氧（ROS）生成和脂肪酸氧化。如所示图5A与Sh-Ctl组相比，T2D雌性大鼠左心室UCP2蛋白的表达显著降低（T2D vs.Sh-Ctl，P≤0.05）。同样，这些大鼠卵巢切除状态的诱导导致UCP2蛋白表达水平进一步显著降低（OVX+T2D vs.T2D，P≤0.05）。然而，GPER激动剂（G-1）治疗降低了卵巢切除的效果，并与这些大鼠左心室UCP2蛋白水平的上调相关（OVX+T2D+G-1 vs.OVX+T2D+Veh，P≤0.05）。

缩略图
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图5。

（A） 检测各组左心室中UCP2蛋白表达水平的蛋白质印迹分析和MDA和SOD水平的（B，C）测量（通过ELISA）。（A） 上面板：检测组雌性大鼠左心室组织中UCP2和β-肌动蛋白（作为内部对照）的代表性免疫印迹。下面板：各组UCP2的表达为相对带强度与β-肌动蛋白带强度之比。各组左心室MDA含量（B）和SOD活性（C）的变化。所有数据均表示为平均值±SEM。**P≤0.01 vs.Sh-Ctl。#与T2D相比，P≤0.05。+P≤0.05 vs OVX+T2D+Veh。单向方差分析，然后进行Tukey-Kramer检验。G-1：GPER激动剂，MDA：丙二醛，OVX：卵巢切除，Sh-Ctl：假对照，SOD：超氧化物歧化酶，T2D：2型糖尿病，UCP2：解偶联蛋白2，Veh：载体。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0293630.g005

最后，为了阐明GPER激活对氧化应激和抗氧化防御的影响，我们检测了左心室MDA和SOD水平的变化(图5B和5C). 与Sh-Ctl组相比，T2D组心脏MDA水平显著升高（P≤0.01，图5B). 雌性T2D大鼠卵巢切除诱导与心脏MDA水平显著高于雌性T2D鼠相关（P≤0.05，图5B). 相反，GPER激动剂（G-1）治疗导致心脏MDA水平显著降低（OVX+T2D+G-1 vs.OVX+T2D+Veh，P≤0.05）。与Sh-Ctl组相比，T2D组动物心肌SOD活性显著下降（P≤0.01，图5C). 卵巢切除导致T2D雌性大鼠左心室SOD活性更显著降低（OVX+T2D vs.T2D，P≤0.05）。然而，用GPER激动剂（G-1）治疗可以抵消这些变化，提高心脏SOD活性（OVX+T2D+G-1 vs.OVX+T2D+Veh，P≤0.05，图5C).

讨论

E2缺乏和T2D会加剧心脏代谢紊乱，当两者结合时，心脏代谢紊乱会加速，并会出现额外的CVD[21]. 目前，绝经后女性糖尿病引起心脏代谢紊乱的机制尚不清楚，有效的治疗方案也有限[21,22]. 一些研究认为线粒体，特别是线粒体sirtuins，是治疗心脏代谢紊乱的一个很有希望的靶点[5,21,23]. 现有的动物模型为更详细地研究心脏代谢紊乱的机制提供了适当的条件，本研究旨在探讨GPER对绝经后T2D大鼠心脏线粒体功能的调节作用。利用该动物模型，我们发现：首先，T2D下调心脏sirtuins、p-AMPK和UCP2水平可能会增加心脏MDA的生成，降低SOD活性，从而导致心脏功能障碍。其次，绝经诱导（卵巢切除）通过Sirt1/3/6、p-AMPK和UCP2的显著降低加重了糖尿病心脏的心脏功能障碍依赖机制第三，长期服用G-1增加了卵巢切除T2D雌性大鼠心脏Sirt1/3、p-AMPK和UCP2的表达水平，改善了绝经引起的心脏氧化应激并部分恢复了心脏功能障碍。

保持稳定的体重取决于能量摄入和消耗之间的平衡。增加能量消耗的一个可能机制是线粒体UCP增加[12]. 糖尿病[24]和卵巢切除术[25]由于能量摄入增加，可能导致体重增加。分子研究表明，服用G-1的雌性小鼠UCP的表达增加，这可以对抗肥胖[12]. 与这些数据一致，我们在研究中还观察到，患有T2D和OVX的雌性大鼠体重增加显著增加，而G1治疗则修正了这些影响，这很可能与这些大鼠UCP2表达的增加有关。

几项研究报告了T2D对心脏结构和功能的有害影响[26,27]. 与这些数据一致，我们在研究中还表明，与Sh-Ctl组相比，糖尿病雌性大鼠表现出心肌肥大，MAP和LVEDP增加，LVSP和±dp/dt降低。临床研究表明，糖尿病患者的心脏与心脏功能障碍典型的基因表达变化有关[28]. T2D状态下心脏结构和血流动力学参数的这些变化归因于炎症[29]高血糖和高胰岛素血症[30]. 在目前的研究中，在OVX-T2D中观察到血液动力学参数的严重损伤，这支持了先前关于卵巢切除术对心肌质量产生不利影响的报道[31]糖尿病大鼠的功能[25,32]. 此外，更年期对女性左心室收缩和舒张功能也有负面影响[33]. 有趣的是，在当前的研究中，用GPER激动剂G-1治疗OVX+T2D大鼠导致心脏收缩和舒张功能的改善，这可以通过LVSP增加、±dp/dt max和LVEDP降低来衡量。据报道，其激动剂G-1的慢性GPER激活可减轻卵巢切除对雌性高血压大鼠舒张功能和左心室重塑的不利影响[34]. 此外，G-1作为GPER激动剂可减轻大鼠左心室肥厚并恢复舒张功能[35]. GPER激活可改善缺血/再灌注损伤大鼠和小鼠离体心脏的收缩功能并缩小梗死面积[36,37]. 研究还表明，长期皮下输注G-1可抑制去卵巢大鼠间质心肌纤维化并改善充盈压力[34].

本研究结果表明，通过HFD-STZ方法诱导T2D会降低Sirt1、Sirt2、Sirt3和Sirt6的表达，当我们诱导T2D动物绝经时，观察到Sirt1，Sirt3，和Sirt5的水平进一步降低。然而，G-1治疗弥补了Sirt1和Sirt3的减少，并增加了它们的表达。与这项研究的结果一致，其他研究表明糖尿病和肥胖会降低Sirt1的表达[9]，Sirt2（警报2）[5]，Sirt3[38]、和警报器6[39]. 此外，Song等人[40]表明Sirt1在肥胖和2型糖尿病妇女中的表达受到抑制。此外，Sirt1的表达[41]，Sirt3[42]和Sirt6[43]卵巢切除情况减少。由于Sirt1、Sirt2、Sirt3和Sirt6参与心脏的葡萄糖摄取，这些sirtuins在调节新陈代谢和心脏功能方面发挥着重要作用[5,22]. 此外，据报道，糖尿病患者Sirt1和Sirt3水平的降低可通过作用于线粒体蛋白而引起心脏并发症[44]. 迄今为止，很少有研究探讨GPER对心脏sirtuins的作用。白藜芦醇是一种GPER激动剂，已被证明通过增加心脏中Sirt1和Sirt3的活性和表达以及改善心脏线粒体功能来对抗糖尿病的影响[20,41]. 此外，有研究表明，雌激素受体（ER）的激活通过激活AMPK/哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）信号通路增加心脏中Sirt1的表达[45,46]. 此外，研究表明，ERs的激活通过激活Sirt3启动子增加了Sirt3的表达[47]增加Nrf2的核转位[48]从而逆转线粒体功能障碍。

如今，参与能量稳态的生物过程，如AMPK信号通路，已被用于对抗胰岛素抵抗和代谢紊乱[49]. 在这方面，我们发现糖尿病降低了心脏中的p-AMPK，而绝经加剧了这种下降，G-1能够抵消它。有充分证据表明，AMPK调节受损在胰岛素抵抗和T2D的发展以及生理和药理学上AMPK的激活中起着重要作用，可以预防这些疾病[50–53]也有证据表明，绝经后妇女骨骼肌中AMPK活性降低[54]. 研究表明，在啮齿类动物中诱导绝经会导致AMPK在各种组织中的表达和活性降低[55,56]E2治疗在几分钟内逆转了这些变化，并调节了肌肉对葡萄糖的摄取，这表明E2和GPER的非基因组途径可能在这一过程中发挥了重要作用[54,57]. 此外，GPER激动剂已被证明通过抑制线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放和激活AMPK信号传导来改善心脏功能[37]. 此外，GPER激活还通过增强AMPK信号通路改善血脂异常[58]. 总的来说，这些数据表明GPER可能是绝经后妇女代谢紊乱的治疗靶点。

在本研究的最后一部分，研究表明，HFD诱导糖尿病导致UCP2水平和氧化应激降低，这在糖尿病和更年期的同时加剧。然而，相反，GPER刺激能够通过增加UCP2和SOD以及降低MDA来抵消这些变化。有证据表明，糖尿病可通过心肌线粒体功能障碍和氧化应激诱导加速心肌病[59]. 因此，防止过度氧化应激可以改善心脏功能。UCP2是线粒体内膜蛋白的一个成员，在调节脂肪酸氧化、线粒体生物生成和氧化应激中发挥重要作用，其减少发生在糖尿病和肥胖患者中，与氧化应激增加和心脏功能障碍有关[60]. 此外，两个糖尿病心脏的过氧化脂质生成水平（如MDA）增加，SOD活性降低[61]和心肌细胞在高糖培养基中[62]已观察到。本研究中观察到更年期条件下UCP2的减少和氧化应激的增加与其他研究一致[41,63,64]. 罗杰斯等人[65]研究表明，卵巢切除导致UCP2降低，进而降低脂肪酸的氧化能力。这种氧化能力的降低导致氧化应激和有害心脏变化的增加。卵巢激素通过控制能量消耗的中枢机制和环境机制，以及通过作用于AMPK-mTOR信号通路，提高抗氧化酶的活性并减轻氧化应激的产生，对雌性哺乳动物的代谢状态产生重大影响[66]. 据报道，G-1通过增加UCP2来减少老年小鼠大脑中的氧化应激。GPER激动剂还通过增加线粒体的生物发生和功能来改善大脑功能，而线粒体的生物发生和功能在更年期会下降[64]. 老年OVX小鼠经G-1治疗后，总抗氧化能力和SOD增加，G-1通过改变氧化和抗氧化参数防止血管损伤[67].

结论

总之，雌性动物的T2D通过sirtuins、p-AMPK、UCP2和SOD的减少以及心脏MDA的增加导致心脏功能障碍。此外，E2缺乏（更年期模型）加剧了这些变化。然而，用GPER激动剂G-1治疗可能至少部分抵消更年期的增强效应。综上所述，我们的结果提供了证据，证明G-1升高心脏Sirt1/3、p-AMPK和UCP2水平可能会改善更年期糖尿病女性心脏的线粒体功能，这可能会逆转氧化应激，从而可能改善心脏代谢状态和功能(图6). 在未来的女性转化研究中，我们将检查G-1对绝经后糖尿病女性心脏治疗的益处是否也能得到最终证明。

缩略图
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图6。GPER激动剂G-1通过Sirt1/3-AMPK-UCP2途径发挥心脏保护作用的拟议潜在机制示意图。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0293630.g006

致谢

我们要感谢Z.Hafizi在样品收集方面的帮助以及在蛋白印迹和ELISA检测方面的技术援助。

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