摘要
支气管肺发育不良（BPD）是早产儿新生儿发病的一个主要原因，其发生是由于肺部发育受阻和出生后多次受辱所致。患有BPD的婴儿接触补充氧气也有早产儿视网膜病变的风险。因此，我们在BPD小鼠模型中研究了高氧对视网膜血管系统的影响。该模型的视网膜表型，我们称之为高氧诱导的增殖性视网膜病变（HIPR），显示视网膜血管系统严重破坏，血管模式丧失，视网膜内血管生成紊乱，炎症和视网膜脱离。新生小鼠从出生后第0天（P）到第14天接受75%的氧气暴露，以建立BPD模型，然后在室内空气中恢复1天（P15）、7天（P21）或14天（P28）。我们量化了视网膜厚度、HIF-1α、NOX2和VEGF的蛋白水平，并通过免疫组织化学检查了这些蛋白的细胞位置。我们检测了视网膜血管完整性和炎症标志物，包括巨噬细胞（F4/80）和淋巴细胞（CD45R）。与对照组相比，HIPR小鼠的正常视网膜血管发育受到严重破坏，取而代之的是一片混乱的视网膜内血管生成。在所有时间点，与对照组相比，HIPR显示持续的玻璃样血管和明显变薄的中央视网膜。HIF-1α蛋白水平在P15时升高，而VEGF水平在P21前持续升高。在P21观察到视网膜内纤维蛋白原，然后在P28观察到视网膜下沉积。在P21和P28处分别观察到炎症淋巴细胞和巨噬细胞。该模型表现为视网膜血管发育受阻、视网膜内血管生成炎症和视网膜脱离的严重表型。
引用：Lajko M、Cardona HJ、Taylor JM、Shah RS、Farrow KN、Fawzi AA（2016）《高氧诱导增殖性视网膜病变：视网膜血管发育早期中断伴严重且不可逆的神经血管中断》。公共科学图书馆·综合11（11）：e0166886。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166886
编辑：M.Elizabeth Hartnett，美国犹他大学（盐湖城）
收到：2016年9月2日；认可的：2016年11月5日；出版：2016年11月18日
版权：©2016 Lajko等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。
数据可用性：所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院（5R21HD077336，K.N.F.和A.A.F.；R01HL109478，K.NF.）和西北纪念基金会（K.N.F）普伦蒂斯之友资助计划（the Friends of Prentice grants Initiative of the Northwestern Memorial Foundation）的资助。组织学服务由西北大学组织学和表型研究实验室提供；共聚焦显微镜在西北大学高级显微镜中心进行。两个核心设施均由授予Robert H Lurie综合癌症中心的NCI CCSG P30 CA060553提供支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
介绍
在美国，早产（定义为胎龄不足37周的婴儿）约占出生婴儿的10%[1]. 随着新生儿护理的进步，极早期胎龄（>23周）和低出生体重儿（<1000g）的存活率使支气管肺发育不良（BPD）成为影响这些早产儿的最常见慢性肺部疾病和长期发病率[2,三]. 随着当今新生儿护理水平的提高和更小、更不成熟婴儿的存活率的提高，“新”BPD与以前的时代大不相同，其标志是肺和微血管发育受阻[三,4].
由于正常的视网膜血管形成在胎龄36-40周之前是不完整的，早产儿也容易发生视网膜血管损害[5]. 早产儿视网膜病变（ROP）是儿童失明的主要原因之一[6]. 起初，ROP是过量补充氧气的直接后果，导致视网膜血管发育受损，未经治疗，最终导致牵引性视网膜脱离和视力受损。随着新生儿单元氧饱和度的更好控制，目前的ROP仅限于第一世界胎龄小于26周的早产儿。相反，氧气毒性仍然是第二世界的一个因素（第三次ROP疫情）[7]. 在诊断为BPD和肺动脉高压的早产儿中，ROP（2级或更差）的发病率达到64%[8]. 因此，在早产和肺发育不足的情况下接受补充氧气的早产儿可能有视网膜血管发育不良的风险。
啮齿动物视网膜血管系统完全在出生后发育，这使其成为研究早产和氧气暴露相关血管损害的良好模型。其中一种模型是氧诱导视网膜病变（OIR），从出生后第7天开始，氧暴露限制在5天内（P7）。OIR小鼠出现血管闭塞，随后出现视网膜前新生血管；然而，血管生成在2～3周内退化，视网膜血管重建[9,10]. 为了模拟BPD，新生儿啮齿动物的高氧暴露复制了BPD婴儿的解剖结构（肺泡极化减少，胶原沉积增加，间质厚度增加）和功能变化（肺容量和弹性下降）[11,12]. 虽然患有BPD的人类婴儿暴露于多种其他损伤，如感染、炎症和营养不良，这些损伤会加剧他们的肺部疾病，但高氧诱导的小鼠模型已被广泛用于研究氧化损伤在BPD发展中的具体作用。出生后暴露于85%氧气中14天，然后恢复室内空气14天，与在室内空气中饲养的年龄相匹配的对照组相比，小鼠的肺发育持续异常，这表明氧化损伤的恢复非常缓慢，如果完全恢复的话[13]. 大鼠暴露于P4至P14的高氧（75%氧气）环境中，然后在室内空气中放置14天，肺平均极化受损，视网膜厚度降低[14]. 在OIR大鼠模型中，在50%和10%氧气之间循环14天，视网膜前新生血管在血管和无血管视网膜边界之间形成[15].
在本研究中，我们报告了高氧诱导的小鼠BPD模型的视网膜表型[16——18]. 我们探讨了在该模型中发生的独特而严重的视网膜病变，我们称之为高氧诱导增殖性视网膜病变（HIPR），重点关注血管生成、视网膜厚度、血管完整性和炎症。我们将研究重点放在HIPR中的视网膜血管和氧化变化上，因为正在发育的视网膜血管系统极易受到氧扰动的影响[19]. 由于高氧暴露在出生后立即开始，我们预计HIPR将与OIR显著不同。我们假设正常的血管发育将受到严重影响，玻璃样血管将持续存在以弥补视网膜血管的缺陷。一个主要的未知数是，这种严重的高氧诱导的视网膜血管发育中断是否仍然与这些眼睛在室内空气中的显著神经血管恢复（类似于OIR）相一致，或者这些血管变化是否会如此严重，以至于达到视网膜神经血管发育的“不可逆”点。
方法
高氧诱导增殖性视网膜病变模型
所有动物程序均按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南所有实验方案均由西北大学动物护理和使用委员会批准。C57BL/6J（库存编号：000664，Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA）小鼠被放置在带有氧气控制器（Pro-Ox 110；Biospherix，Lacona，NY，USA[16,17]. 高氧暴露是持续的，只有在动物护理时才会短暂中断。每24小时将水坝从高氧状态转到室内空气中，以防止过度的氧气毒性[16]. 小鼠在高氧（HIPR）中安乐死两周后（P14），或在安乐死前1天（P15）、1周（P21）或2周（P28）移至室内空气中。对照组，年龄匹配的小鼠在室内空气中饲养（RA）。在实验暴露后，用过量异氟醚和颈椎脱位对幼鼠实施安乐死。随后进行开胸手术以确认死亡。在颈椎脱位之前采集眼睛。这些程序是按照美国兽医协会安乐死小组的建议进行的。如果研究动物出现任何疾病或痛苦的迹象，他们将立即接受人道安乐死。在实验终点之前，用于这项工作的动物没有生病或死亡。
视网膜平面支架
将整只眼睛固定在4%多聚甲醛（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德）中，并将其稀释在磷酸盐缓冲液（PBS）中3-4小时。如前所述，眼睛被染色[20]. 简单地说，视网膜杯被切开，玻璃体被移除。多次清洗后，用PBS/0.1%Triton X-100渗透视网膜18小时。用10%驴血清、1%Triton X-100和1%牛血清白蛋白（BSA）封闭视网膜2小时。洗涤后，GS-Isolectin IB4使用1%Triton®声波风廓线仪在PBS中稀释594（IB4）18小时(表1). 几次洗涤后，制作4个径向切口，并用ProLong Gold Antifade试剂（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）固定视网膜。
免疫组织化学
将视网膜切片（7μm）脱蜡，并在80°C的柠檬酸钠缓冲液（10nM柠檬酸钠，0.05%吐温-20，pH 6.0）中进行抗原回收20分钟。切片在4°C的封闭溶液（10%驴血清、0.1%Triton X-100、1%BSA）中放置18小时。对于HIF-1α染色，用链霉亲和素/生物素封闭试剂盒（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）封闭内源性生物素，用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15分钟。初级抗体(表1)在封闭溶液中涂抹1小时。清洗后，应用次级抗体1小时。对于HIF-1α，应用ABC溶液（Vector Laboratories）30分钟，用3,3'-二氨基联苯胺（Sigma-Aldrich）进行可视化，并用0.5%甲基绿（Sigma Aldric）进行复染。对于所有荧光抗体(表1)切片用0.1%或0.5%苏丹红在70%乙醇中染色以熄灭自体荧光。部分用DAPI复染、冲洗、安装和密封。切片使用蔡司LSM-510 Meta共焦显微镜（德国Oberkochen蔡司）或尼康80i Eclipse立式显微镜（日本东京尼康）和Photometrics CoolSnap CF相机（亚利桑那州图森Photometics）进行成像。
西方印迹法
视网膜的处理如前所述[34]. 简单地说，眼球摘除后立即在1X Mg2+溶解缓冲液（EMD Millipore，Billerica，MA）中用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma Aldrich，St.Louis，MO）和磷酸酶抑制剂鸡尾液（EMD-Millipoer）对视网膜进行解剖和溶解。使用Bradford方法定量上清液的蛋白质浓度[35]. 40μg蛋白质在4–20%的Tris-glycine凝胶（Bio-Rad，Hercules，CA）上分离，转移到硝化纤维素膜上，并在室温下用5%的BSA在Tris-buffered生理盐水中稀释并添加吐温-20（TBST）封闭1小时。膜与初级抗体孵育(表1)在4°C的TBST中，在5%BSA中稀释18小时。清洗后，用二级抗体培养膜(表1)持续2小时，并使用化学发光法进行暴露（英国Little Chalfont，GE Healthcare）。使用ChemiDoc XRS（Bio-Rad）分析条带，并将其归一化为β-肌动蛋白。数据是相对于房间空气控制±平均标准误差（SEM）的折叠变化。
血管内皮生长因子酶联免疫吸附试验
按照western blotting的描述解剖视网膜，对组织进行超声处理，并使用Bradford方法测定蛋白质浓度[35]. 使用Quantikine ELISA测定小鼠VEGF的VEGF水平（明尼阿波利斯研发系统公司）。结果显示为pg/mL/mg总蛋白。
视网膜厚度分析
摘除眼球并将其固定在10%中性缓冲福尔马林（Fisher Scientific，Pittsburg，PA）中24小时，然后转移到70%乙醇中或在4%多聚甲醛中固定4小时，然后再转移到PBS中。将眼球石蜡包埋，视网膜切片用二甲苯脱蜡，并用乙醇脱水。每40μm切片进行苏木精和伊红染色（VWR、Radnor、PA），并用Permount（Fisher Scientific）固定。使用ImageJ软件（NIH，Bethesda，MD）进行分析。视网膜厚度测量如前所述[36]. 简单地说，两名蒙面观察者测量了视网膜的整个厚度，从感光细胞外段尖端到星形胶质细胞，在两个视网膜位置，靠近视神经（中央）和视网膜周边。报告两名观察者的平均值，并计算组间相关系数（ICC）。
马森三色
视网膜横截面脱蜡，并在Bouin’s固定剂（德克萨斯州阿灵顿市Ricca Chemical）中固定18小时。切片在自来水中冲洗10分钟。对Sigma-Aldrich Masson三色试剂盒（HT15）进行了一些改进[37]. 我们选择不使用魏格特的铁苏木精溶液，因为视网膜有高度的细胞核，很难观察到任何胶原染色，所以细胞核被染成黑色。将载玻片放入Biebrich scarlet酸性品红中2秒钟，然后用水冲洗。将载玻片在磷钨酸/磷钼酸溶液中分化15分钟，与苯胺蓝孵育10分钟，并在1%乙酸中分化30秒。经过几次清洗，载玻片在一系列乙醇中脱水，并在二甲苯中清除。
统计分析
所有数据均使用SPSS（v.23.0；IBM Corp，Armonk，NY）或GraphPad Prism for VEGF ELISA（GraphPad-Software Inc.，San Diego，CA）进行分析。结果以平均值±SEM表示。对不同窝龄（每组4-5只）的小鼠进行分析。使用ANOVA和Bonferroni’s评估组间差异临时的比较。结果在p值<0.05时具有统计学意义。
结果
高氧诱导的增殖性视网膜病变显示视网膜血管发育严重受阻，视网膜内血管生成紊乱
为了检查视网膜血管的发育，我们用isolectin B染色视网膜扁平支架4（IB4），内皮细胞的标记，位于P14、P21和P28。在室内空气中饲养，对照组小鼠的视网膜血管发育正常，P21将浅层网络完全延伸至周边视网膜(图1A). 相比之下，HIPR没有证据表明中央或外周视网膜中存在正常的血管分支网络或形成血管，P21处视神经周围的血管生成被严重紊乱的血管生成完全取代，P28处的血管内皮细胞继续增大为一片缠结的内皮细胞，没有任何分支组织网络的迹象(图1A). 此外，HIPR有持续的玻璃样血管，这些血管附着在视网膜中周的视网膜平架上(图1B). 玻璃体血管可能是在视网膜剥离时无意中被切除的，以便进行平面安装成像(图1A)，所以中的横截面图1C提供持久性玻璃样血管的更好例子。IB4染色的横截面显示，玻璃体血管与视网膜非常接近(图1C). 通过P21，在内网状层（IPL）形成腔内血管(图1C). 与OIR小鼠模型中描述的视网膜血管重建不同[9,10]在HIPR模型的P28处，没有证据表明视网膜血管生成或血运重建的退化，也没有证据表明有任何血管组织或分支的尝试。
相对缺氧导致视网膜HIF-1α、VEGF和VEGFR2水平升高
考虑到HIPR小鼠视网膜血管异常的程度，我们试图确定HIF-1α和VEGF蛋白水平及其与对照组相比的细胞位置。与P14的早期时间点相比，高氧解除后第15天HIPR的视网膜HIF-1α蛋白表达显著增加（9.4±3.0倍变化）（4.6±1.4倍变化，p<0.05）(图2A). HIPR P15的HIF-1α相对增加在P21中不再出现（1.6±0.9倍变化，p<0.05）。在对照视网膜中，HIF-1α在视网膜神经节细胞层（RGCL）和内核层中发现，在HIPR小鼠中定位相似，但表达强度较高(图2B).
与对照组小鼠相比，通过ELISA测定的HIPR中VEGF蛋白表达在所有时间点均升高，与HIF-1α蛋白水平增加相对应(图3A). 在HIPR模型中，视网膜VEGF水平在P21达到峰值（163.1±28.1 pg/ml，N=4），P28降低（35.5±12.1 pg/ml（N=4，p<0.05）(图3A). 在所有时间点，HIPR视网膜的玻璃样血管中都存在VEGF免疫染色(图3B). 在HIPR中，VEGF在P15和P21定位于RGCL。IPL中的VEGF与特异性内皮细胞标记物CD31共同染色(图3B). 在P21时，HIPR中的VEGF与无长突细胞、水平细胞或活化的Möller细胞均未共同定位(S1图).
由于VEGF受体-2（VEGFR2）是血管生成所必需的，也是VEGF的靶点，因此我们试图确定HIPR视网膜中VEGFR2的任何变化[23,38,39]. 在成人视网膜中，VEGFR2有望标记内皮细胞、Mϋller细胞和感光细胞[23,25,26]但在发育过程中，P5在神经细胞（主要是神经节细胞）中发现VEGFR2，P15在视网膜神经节细胞和内皮细胞中都发现[24]. 对视网膜横截面进行VEGFR2免疫染色，并与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）联合标记，以染色活化的Mϋller细胞和星形胶质细胞。我们发现VEGFR2主要存在于对照视网膜的RGCL中，也存在于一些Mϋller细胞中(图4). 在HIPR中，与对照组相比，Mϋller细胞中的VEGFR2染色增加，并且随着模型的进展，染色增加(图4). 通过P21，VEGFR2主要与活化的Mϋller细胞共同染色(图4).
高氧诱导增殖性视网膜病变时视网膜NADPH氧化酶2表达增加
在小鼠OIR模型中，NADPH氧化酶2（gp91phox/NOX2）被认为能产生活性氧，促进VEGF介导的视网膜新生血管形成[40,41]. 考虑到视网膜扁平支架中血管生成紊乱的程度(图1)以及我们观察到的VEGF和VEGFR2增加（图三和4)，我们检测了NOX2蛋白水平和NOX2的细胞位置。在HIPR中，NOX2从P14（0.8±0.2倍变化，N=8）显著增加到P15（7.8±2.5倍变化，M=5，p<0.05），从P15显著增加到P21（15.3±2.2倍变化N=5，p<0.05）(图5A和5B)VEGF增加后(图3B). NOX2定位于对照视网膜的血管。相反，在HIPR中，在P15和P21的RGCL中观察到NOX2(图5C).
高氧诱导增殖性视网膜病变的视网膜变薄和玻璃样血管持续存在
为了量化视网膜厚度并检查形态学差异，我们用苏木精和伊红染色视网膜横截面。HIPR小鼠在所有时间点均可见持续的玻璃样血管；显示了一个具有代表性的P21示例(图6A). P21和P28使外丛状层显著变薄，核内外层明显合并(图6B).
为了确定视网膜厚度，从视神经（中央）和周边进行测量。在每个时间点，HIPR小鼠的视网膜中央明显比对照组薄(图5C，p<0.05）。通过P28，控制中心视网膜测量值为208.5±19.6μm（N=3，ICC=0.95）；而HIPR测量值为149.5±11.2μm（N=3，p<0.05，ICC=0.94）(图6C). 在外围，HIPR在P21和P28处的视网膜明显比对照组薄(图6D，p<0.05）。通过P28，对照组外周视网膜测量值为146.2±7.8μm（N=3，ICC=0.90），而HIPR为106.6±10.0μm(图6D).
血管生成紊乱附近的内源性和外源性纤维蛋白原沉积
正常、健康视网膜无纤维蛋白原免疫染色。其他BPD动物模型和婴儿的肺部纤维蛋白和纤维蛋白原沉积是炎症和纤溶的标志[42——46]. 视网膜纤维蛋白原沉积也见于视网膜缺血的动物模型，包括OIR和猴子的糖尿病视网膜病变[47,48]. 为了检测异常的视网膜内血管是否维持其内部血-视网膜屏障功能，我们使用与IB4共染的视网膜横截面研究了视网膜、玻璃体和视网膜下间隙中的纤维蛋白原沉积。对照组视网膜、视网膜下间隙或玻璃体未见纤维蛋白原染色(图7). 相比之下，在HIPR中，纤维蛋白原染色出现在视网膜（内核和IPL，与严重紊乱的血管相邻，在IPL中呈汇合片）、玻璃体和视网膜下间隙，从P21开始(图7). 我们无法在P14或P15的HIPR中识别腔内血管（或纤维蛋白原）。纤维蛋白原和IB4染色共同定位于IPL，类似于P21处的NOX2染色(图5C). 这一发现表明，IPL中异常的血管系统功能严重不足，导致纤维蛋白原（分子量340kDa）等大分子渗入视网膜[49,50]. 视网膜下间隙的纤维蛋白原染色以及视网膜变薄，特别是外视网膜，提示HIPR患者存在慢性渗出性视网膜脱离。
高氧诱导的增殖性视网膜病变引起迟发性视网膜炎症反应
在视网膜缺血、血管渗漏和血管生成的模型中，视网膜内和视网膜下纤维蛋白原的存在表明炎症反应是创伤愈合反应和病理变化的重要组成部分[51——55]. 为了研究HIPR中的白细胞浸润，我们对F4/80（巨噬细胞）和CD45R（B淋巴细胞和一部分T淋巴细胞和NK细胞）进行了免疫荧光染色[30,31]. 无巨噬细胞(图8A)或CD45+细胞(图8B)在对照组视网膜的任何时间点均可见。相反，在HIPR中，在IPL的P21和P28处可以看到CD45R+白细胞(图8B)，在这些时间点紧密复制IB4、纤维蛋白原和NOX2的定位。此外，在IPL的P28处检测到许多巨噬细胞(图8A). 在HIPR的持久性玻璃样血管中观察到巨噬细胞和白细胞(图8).
高氧小鼠视网膜牵拉的胶原纤维证据
由于我们观察到视网膜脱离的证据，我们使用Masson的三色试剂盒对视网膜横截面上的胶原纤维进行染色，以排除玻璃体中牵引性胶原沉积。胶原纤维仅在HIPR中观察到(图9). 在P21处，玻璃体中可检测到胶原纤维，内部视网膜有明显的局灶性附着和峰值（箭头所示），表明这些胶原纤维正在对视网膜施加牵引力(图9). 到P28时，更多的胶原纤维附着在视网膜内侧，有玻璃体出血和玻璃样血管持续存在的迹象(图9). 这些结果与牵引性视网膜脱离高度一致。
讨论
我们研究了小鼠高氧诱导的BPD模型（HIPR）的视网膜表现，该模型显示视网膜血管发育严重受阻、血管生成紊乱、视网膜内血管渗漏以及渗出性和牵拉性视网膜脱离(图10). 在IPL中P21处看到的紊乱的视网膜内血管并没有显示出任何正常的视网膜血管图样（图1和7). 在这种紊乱的血管生成发生之前，观察到HIF-1α、NOX2和VEGF的激增（图2,三,5). GFAP共染活化Mϋller细胞上VEGFR2的定位(图4)IPL中的VEGF(图3和S1图)与异常新生血管的位置相对应，这表明来自活化的Mϋller细胞的错误定位信号可能是这些异常血管生长的驱动因素(图4).
小鼠视网膜血管系统完全在出生后发育，之前有一个星形胶质细胞网络，形成视网膜浅血管发育的模板，通过P8到达周边视网膜[10,26,56]. 在P7周围，浅层血管向下萌芽进入外核层，形成由P12完成的深部血管丛，而中间神经丛则由Mϋller细胞信号引导，从IPL中P12和P15之间的深部网络向上萌芽形成[10]. 成熟的视网膜血管网通过P21相互连接。在HIPR中，星形胶质细胞网络在P14和P15处正常，甚至可以在外周视网膜中看到(图4B). 通过P21，RGCL中的大多数GFAP染色与Mϋller细胞过程相一致，表明星形胶质细胞不再表达GFAP，它们可能受到损害(图4). 在OIR模型中，Dorrell等人表明视网膜血管系统的加速血运重建和玻璃体内新生血管的消退依赖于血管生成期星形胶质细胞和小胶质细胞的存活[57]. 在HIPR中，严重的氧气暴露可能会损害星形胶质细胞，导致血管模板的丢失，并可能部分解释该模型中正常模式的视网膜浅层血管发育的永久性失败。
早产儿在从相对缺氧的宫内环境过渡到呼吸室内空气的过程中，出生时面临大量氧气暴露。随后，他们经常接触超生理氧，以确保出生后所有组织都有足够的氧气供应。这种额外的氧气是ROP I期的原因，在ROP I期，视网膜经历继发于HIF下调的血管发育延迟，因此VEGF不会释放。这些眼睛的周边视网膜仍然是无血管的。第二阶段开始于视网膜继发性缺血，继发于血管减少和神经代谢的氧气不足，导致INL和RGCL中的视网膜HIF水平升高[58]导致视网膜前血管生成紊乱，通常位于视网膜无血管区和血管化区之间的边界[59]. 然而，这些杂乱无章的血管长入玻璃体，并不能使无血管周边视网膜再灌注，并可能导致视网膜牵引、玻璃体出血和视网膜脱离[59].
与OIR相比，HIPR并不是ROP的精确模型，因为其极端严重。在人类ROP中，视网膜血管开始发育子宫内大约16周胎龄[60]，这就是我们认为临床上尚未在早产儿中发现HIPR表型的原因，因为22周是早产儿最早的生存期窗口[61]). 在HIPR小鼠中，氧气暴露在视网膜血管发育之前开始于P0，到P14时，从腔室取出时，视网膜仍然完全无血管(图1). 第15页(图7)，这些视网膜仍然没有视网膜血管的证据，具有持续的玻璃样血管（图1和6A级). 然而，OIR中的细胞因子表达谱与我们在HIPR的P14和P15中发现的相似。HIPR中HIF-1α和VEGF分别在P15和P21增加与该模型中发生在P12的第二个缺氧期OIR相关[10,62]（图2和三). OIR中新生血管的位置发生在中周边视网膜，在无血管和有血管视网膜之间，投射到玻璃体[9,10]. 同样，在人类ROP中，血管生成发生在玻璃体中[59]. 相反，在HIPR中，新生血管在IPL内的中央视网膜以及玻璃体血管与视网膜接触点的视网膜中周形成（图1和10).
视网膜平架显示周边无血管视网膜(图1A)横切面上可见持续的玻璃样血管仍附着在中周(图1C). 扁平支架用IB4染色，显示出小胶质细胞、巨噬细胞和内皮细胞染色[63——65]. 我们将其用作内皮细胞标记物。我们发现，虽然IB4确实在该模型中对巨噬细胞进行染色，但与F4/80的重叠是不完整的，这表明IB4正在标记内皮细胞(S2图). 此外，使用CD31，一种更特异的内皮细胞免疫染色，我们发现它同样标记了IPL内的血管生成性病变(图3).
考虑到异常新生血管在体内的位置，我们试图确定VEGFR2在HIPR中的位置。VEGFR2已被证明存在于神经元细胞中[25,66,67]并且在Müller细胞中表达直至成年，表明其在神经元细胞保护中的作用。在HIPR中，VEGFR2与对照组相比增加，并且随着时间的推移，Mϋller细胞的VEGFR2标记逐渐增加(图4). 此外，玻璃样血管的VEGFR2染色(图4)和血管内皮生长因子(图3)表明玻璃样血管中存在增殖活跃的内皮细胞[68]. 这可以用两种潜在机制来解释。第一种可能是Mϋller细胞（和玻璃样细胞）VEGFR2的表达，对VEGF的增加作出反应，试图重演正常血管发育并引导血管发育视网膜血管丛。然而，与正常的视网膜发育不同，在正常视网膜发育中，神经元随着缺氧梯度逐渐成熟，从而允许有模式和有调节的血管发育，在HIPR中，视网膜神经元几乎由P14完全发育，因此，这些信号可能是不协调的，并导致IPL内和与中周边的玻璃体血管接触的视网膜表面上的血管生成紊乱。玻璃体中的VEGF免疫染色支持了这一假设(图3)和Mϋller细胞(S1图)；然而，额外的分子研究（例如。就地杂交）以确定HIPR中VEGF的确切细胞来源。第二种可能的解释是，Mϋller细胞中VEGFR2的增加是对极度缺血视网膜的保护机制。基于视网膜变性模型的其他研究[69——71]很可能Mϋller细胞释放VEGFR2作为保护性反应信号。同样，发现VEGFR2在第5期人类ROP纤维血管膜中增加[72]浆液性视网膜脱离患者玻璃体液中可溶性VEGFR2增加[73]. 在重债穷国，VEGFR2的增加可能是这两种机制的表现；这是一个引导性线索，试图使外视网膜血运重建，以及类似于伤口愈合反应的保护性反应机制[74,75].
为了进一步确定IPL中血管的后果，我们试图确定这些血管是否维持完整的血视网膜屏障。在生理条件下，血浆中纤维蛋白原含量较低。然而，损伤或内皮细胞功能障碍后，血浆中的血管渗漏、炎症标记物和纤维蛋白原水平增加[29]. 在我们的模型中，在视网膜内发现纤维蛋白原，与IPL中的异常血管相邻，表明血管渗漏(图7). 纤维蛋白原在炎症中起着重要作用[76,77]. 它能够结合血小板上的整合素和非整合素受体，以促进伤口愈合反应，包括血小板聚集、巨噬细胞活化、趋化因子表达、内皮细胞粘附、迁移、毛细血管形成以及肥大细胞粘附和活化[29,77]. 在我们的模型中，纤维蛋白原（在P21处可见）可能有助于巨噬细胞的激活和募集（首次在P28处检测到），以及淋巴细胞（从P21处开始），这表明IPL同时出现炎症反应(图8).
在这个模型中，视网膜脱离发生在P21和P28之间，表现为视网膜外侧变薄、感光细胞破裂和视网膜下间隙中的纤维蛋白原沉积（图6和7). 在这个模型中，对视网膜脱离有两种可能的解释。第一种是炎症性渗出性脱离。支持这一点的证据包括视网膜下纤维蛋白原的存在、视网膜内渗出和致密的炎症性视网膜内白细胞浸润。第二个潜在病因是牵引。根据内视网膜的Masson三色染色，我们认为牵引也是导致该模型视网膜脱离的原因(图9). 最有可能的是，视网膜脱离是两种机制共同作用的结果，炎症沉积以及玻璃体中进行性牵引成分。这并不罕见，这也是ROP晚期婴儿常见的综合表现[78]. 视网膜变薄是其他视网膜脱离模型的特征，这些模型显示，由于与脉络膜氧源分离，在脱离后的1-3天内，外核层细胞和感光细胞急剧减少[79,80]. 我们还观察到外部丛状层的缺失(图6)表明水平细胞和双极细胞与感光轴突之间的神经元突触发生二次衰减。在孔源性视网膜脱离的猫模型中，脱离50天后外丛状层收缩，Mϋller细胞充满退化感光细胞的空间[80]. 在HIPR中，Mϋller细胞激活首先出现在P21(图4)随着外丛状层的损失(图6)表明与孔源性模型相比，该模型中视网膜脱离的后果迅速而严重。然而，在HIPR模型中，还需要更多的实验来证实突触的丢失，描述胶质细胞的反应以及早期的时间点和脱离过程。
我们之前已经证明，暴露于该模型的小鼠有氧化应激增加的证据，线粒体靶向的抗氧化剂可以防止肺和心血管系统的终末器官损伤[16,81]. NOX家族被认为是血管中ROS的重要来源，并已被证明在视网膜血管生成和缺血性视网膜病的发病机制中具有重要作用[27]. 内皮细胞表达NOX1、NOX2和NOX4；而血管平滑肌细胞表达NOX1和NOX4[27,28]. NOX2缺乏的小鼠由于超氧化物产生减少而减少了OIR中的新生血管形成[40]. 在另一项研究中，OIR小鼠P14处NOX2的蛋白表达增加，对应异常血管生成的开始，同时使用pan-NOX抑制剂、罗布青素、正常VEGF表达水平和抑制新生血管生成[82]. 在HIPR中，NOX2在P15和P21处增加(图5)与P21处的异常血管形成相一致，这表明NOX2增加可能促进HIPR中的血管生成，类似于其在OIR模型中的作用。
总之，我们的研究表明，BPD模型小鼠出生后立即长时间高氧暴露可导致侵袭性增殖性视网膜病变（HIPR），其特征是严重破坏正常血管发育，取而代之的是从P14到P28的逐渐生长的无组织腔内血管生成，伴随着视网膜内部炎症反应，最终导致牵引和渗出性视网膜脱离。该模型中VEGF的细胞成分和来源似乎局限于炎症细胞和Mϋller细胞上表达的VEGFR2。该模型中Mϋller细胞在视网膜血运重建方面的错误尝试并没有重现正常模式的视网膜血管系统，因为它发生在IPL中是对局部创伤愈合、纤维蛋白原介导的反应，而不是视网膜神经元件或神经胶质细胞的反应。这些细胞可能是转化的胶质细胞或内皮细胞，使用这一新开发的HIPR模型进行进一步研究可以帮助我们更好地理解ROP和其他缺血性视网膜病变的分子过程。未来的研究侧重于P15和P21之间的中间时间点，也可能有助于阐明促进血管生成及其向纤维化转变的其他分子变化，同时需要进行长期研究，以进一步确定HIPR视网膜脱离的特征。
支持信息
S1图。在高氧诱导的增殖性视网膜病变中，VEGF定位于内网状层。
免疫组织化学显示VEGF（红色）细胞位置。切片用无长突、水平和激活的Mϋller细胞标记Pax6（黄色）和活化的Mέler细胞标记GFAP（绿色）染色。在HIPR中，VEGF定位于IPL，而不是GFAP+或PAX6+细胞元件。最右边的列显示VEGF染色与VEGF和GFAP染色分离。INL，内核层。RGCL，视网膜神经节细胞层。内网状层，IPL。比例尺，50μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166886.s001
（畅通节能法）
作者贡献
- 概念化：AAF KNF公司。
- 形式分析：ML HJC KNF AAF公司。
- 资金收购：AAF KNF公司。
- 调查：ML HJC RSS。
- 方法：HJC JMT KNF ML AAF公司。
- 写作——原稿：毫升AAF。
- 写作–审查和编辑：ML AAF KNF HJC JMT RSS。
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