摘要
目标
肠神经病变是一种严重的胃肠道疾病，其结果并不令人满意。我们的目的是通过将小鼠肠道神经嵴细胞（ENCC）移植到神经节和无神经节小鼠肠道，研究肠道神经干细胞治疗此类疾病的潜力体内并分析功能集成和长期安全性。
设计
表达出生后ENCC的黄色荧光蛋白（YFP）产生的神经球Wnt1-cre；R26R-YFP/YFP型将小鼠肠道移植到野生型胎鼠的神经节后肠或无神经节的后肠内皮素受体tm1Ywa公司小鼠（缺乏功能性内皮素受体B型）。然后使用免疫组织化学方法评估肠道ENCC的整合和分化，使用钙显像评估细胞功能，使用PCR检测非靶向YFP表达的长期安全性。
结果
YFP+ENCC在受体神经节肠内植入、增殖并分化为肠神经元和胶质细胞。移植细胞及其投射物沿内源性肌间神经丛扩散，形成分支网络。内源性神经纤维的电点刺激导致YFP+移植的ENCC中出现钙瞬变（F/F0=1.16±0.01；43个细胞，n=6）（TTX消除）。长期随访（24个月）表明，移植的ENCC没有引起肿瘤或扩散到其他器官（肠外部位PCR阴性）。在无神经胶质细胞的肠道中，ENCCs类似地扩散和分化形成神经元和神经胶质网络，其投射与过渡区的内源性神经网络密切相关。
结论
移植的ENCC成功植入受体神经节和无神经节肠道，表现出适当的扩散、定位和重要的功能整合，没有任何长期安全问题。本研究为肠神经干细胞疗法的开发和应用提供了关键支持。
引用：Cooper JE、McCann CJ、Natarajan D、Choudhury S、Boesmans W、Delalande J-M等（2016）在体内小鼠肠道神经嵴细胞的移植；雕刻、功能集成和长期安全。公共科学图书馆·综合11（1）：e0147989。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0147989
编辑：胡文慧，美国天普大学医学院
收到：2015年10月20日；认可的：2016年1月11日；出版：2016年1月29日
版权：©2016 Cooper等人。这是一篇开放获取的文章，根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。
数据可用性：所有相关数据均在论文及其支持信息文件中。
基金：NT由Great Ormond Street Children’s Charity（GOSHCC）支持。JC、DN、CM和JMD由GOSHCC拨款资助。JC由医学研究委员会提供部分资金（G0800973）。PVB得到了Wetenschappelijk Onderzoek基金会（G.0501.10）和Bijzonder Onderzoeksfonds基金会（OT 10/046）的支持。WB是Fonds Wetenschappelijk Onderzoek的博士后研究员。这项工作得到了国家健康研究所生物医学研究中心的支持，该研究中心位于大奥蒙德街儿童医院NHS基金会信托基金会和伦敦大学学院。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
介绍
肠神经病变是一些最严重的临床胃肠道（GI）疾病，其特征是正常推进收缩活动失败，导致管腔内容物流动的功能性障碍。[1–三]原型疾病包括先天性巨结肠症和后天性食管失弛缓症，这两种疾病分别是由胃肠道远端和近端固有肠神经元的绝对缺失或丢失引起的。其他疾病如肠假性梗阻和慢传输型便秘的基础是更细微的神经元缺陷，这表明肠生理学研究中的组织学或收缩曲线上存在神经病变。[4–7]
肠神经病变通常是毁灭性的疾病，如果不治疗，将危及生命。目前可用的治疗方法主要局限于手术减压或切除最不正常的肠段，以及提供专业营养（通常为肠外营养）以保持生长和发育。此类干预措施的结果往往不令人满意，并伴有严重并发症[8,9]强调替代方法的必要性。
再生医学的巨大进步使神经再生取代缺陷或有缺陷的肠神经元作为肠神经病变的潜在治疗策略的前景成为了前沿。[8,10–12]几种细胞类型已被确定为细胞替代治疗的潜在供体细胞来源，如皮肤衍生前体细胞和中枢神经系统祖细胞[13–16]. 可以说，实现这一最终目标的最有希望的进展是使用肠神经嵴细胞（ENCC）取得的，该细胞由肠神经干细胞、神经元和胶质细胞组成，来源于迁移神经嵴（NCC）的原始群体，在胚胎发生过程中，这些细胞在肠道内定居形成肠神经系统（ENS）[17–22].
十多年前，人们首次从小鼠肠道中分离出肠道神经干细胞，包括先天性巨结肠模型。[23]从那时起，从人类肠道（包括通过传统内窥镜检查获得的患者的肠道粘膜）中分离此类细胞取得了稳步进展[24]. 我们和其他人已经证明，在培养过程中形成的离散细胞聚集物或神经球（包括肠神经干细胞、神经元和胶质细胞）中包含的ENCC可以定植受体肠道在体外.[23–32].
最近，体内研究证实，主要来自胚胎小鼠肠道的ENCC能够迁移、增殖和分化，并且在移植到出生后的小鼠肠道后保留了一些功能。[16,33–36]尽管这些初步研究已经解决了ENS干细胞移植的可行性问题，但仍存在一些挑战，包括长期安全性和移植细胞形成神经网络的能力问题，这些神经网络与内源性肠神经网络相连。在移植后形成整合的和功能性ENS的能力，体内在治疗无神经节和真神经节性肠神经病方面至关重要。
本文证实，出生后小鼠衍生的ENCC可以定植神经节小鼠肠道体内并形成神经网络，在功能上与内源性ENS整合。我们发现ENCC类似地定居于无神经节细胞肠。移植细胞似乎不会对受体动物造成任何长期安全风险。
材料和方法
动物
本研究所用的动物均按照当地批准和1986年《英国动物（科学程序）法案》进行饲养，并获得内政部的许可（PPL70/7500）。Wnt1-cre；R26R-YFP/YFP型老鼠[37–39]其中NCC表达的黄色荧光蛋白（YFP）用于获得YFP+肠道NCC（ENCC）。R26R-YFP/YFP型幼崽（在没有cre的情况下，YFP不表达）被用作神经节受体肠，YFP+ENCC被移植到其中。内皮素受体tm1Ywa公司缺乏B型内皮素受体（先天性巨结肠模型）的小鼠（取自Jackson实验室（JAX#003295））被用作YFP+ENCC的无神经节细胞受体肠。
ENCC的分离、细胞分选和培养
从出生后早期获得YFP+ENCCs（P2-P4）Wnt1-cre；R26R-YFP/YFP型老鼠。在37°C下，以酶解（胶原酶，Sigma，1mg/ml）方式分离肠肌条（包括肌层、肌间神经丛和粘膜下神经丛）30分钟。用神经球培养基（NSM）（DMEM F12补充B27（英国InvitrogenLife Technologies公司）、N2（英国Life Technols公司）、20ng/ml EGF（英国Peprotech公司）、20 ng/ml FGF（英国Peprotech公司）和Primocin抗生素（英国Invivo Gen公司）清洗分离的细胞，并通过100μm和40μm网孔过滤。
使用荧光激活细胞分选（FACS）从YFP的总细胞群中分离出ENCC。在使用MoFloXDP细胞分选仪（Beckman Coulter）进行FACS之前，分离的细胞在含有2%胎牛血清的NSM中重新悬浮。
在NSM中6孔培养皿的纤维连接蛋白涂层孔上电镀之前，用NSM清洗ENCC。它们被保存在培养基中，大约1周后生成神经球。在最多维持30天的培养物中产生的初级神经球用于移植。
ENCC体内肠道移植
表达YFP的ENCC来源于Wnt1-cre；R26R-YFP/YFP型小鼠被移植到野生型神经节远端结肠R26R-YFP/YFP型断奶时（出生后第21天）通过剖腹产（n=66），窝友（在没有cre的情况下不表达YFP）。将同样表达YFP的ENCC移植到Ednrbtm1Ywa公司突变体（通过花斑斑纹识别）在出生后第9-13天（n=5）尽早发现。
剖腹产术在异氟烷麻醉下进行，使用0.05%卡必利（Norbrook）和0.25%马卡因多聚腺苷（AstraZenica）止痛药。通过腹膜在下腹部切开，露出肠道。暴露了从腹膜腔内可到达的结肠最远端（距离直肠约0.5厘米）。ENCC作为神经球（每只动物3个），使用连接在口吸管上的细玻璃毛细管进行选择，并使用注射器针头的斜面将其插入肠浆膜的小口袋中。将外部肠管返回腹部，并使用可吸收缝合线（Ethicon）和伤口夹（World Precision Instruments）闭合剖腹手术切口，术后7天取出。
手术时腹腔内注射溴脱氧尿苷（BrdU）（英国西格玛；PBS中的10mM（10μl/g重量，10 mg/ml BrdU。
已移植R26R-YFP/YFP型手术后定期检查小鼠，其中4只（66只中的4只）移植小鼠在手术后12小时内明显不适，并按照方案实施安乐死。原因被确定为肠穿孔。其余的动物通常在移植后保留约4周，然后牺牲和切除肠道进行分析，尽管一些动物被保留长达24个月以获得长期安全性数据。5个移植Ednrb中的3个tm1Ywa公司移植后2-4天，突变体出现腹部肿胀和状态丧失，没有明显的肠穿孔，并被安乐死。其他2只动物在移植后第5天被安乐死。
聚合酶链式反应
为了确定Wnt1-cre；R26R-YFP/YFP发动机-移植后衍生的移植细胞迁移到肠道以外的位置R26R-YFP/YFP型受体进行PCR鉴定cre转基因。脑、肺、心、肝、脾、肾、肾上腺和肠系膜在祭祀时收集并冷冻。Wnt1-cre；R26R-YFP/YFP型阳性对照组织取自Wnt1-cre；R26R型YFP/YFP肠道组织、移植肠道、YFP+神经球和Wnt1-cre；R26R型YFP/YFP耳部活检。使用在4μl水中稀释1μl的DNAReleasy（Anachem）提取DNA，加热至75°C 5分钟，然后96°C 2分钟。使用cre引物（5'-ACCTGATGCAATTTCGGC和5'-GATGCAACGAGATGAGGTTCCGC）和60°C退火温度的循环进行PCR。
免疫组织化学
如前所述，用免疫组织化学方法固定和分析细胞和移植肠[24,40]. 研究中使用的一级和二级抗体列于表1和表2.
简言之，为了进行全量免疫标记，将胃肠道固定在4%PFA中（1h），清洗（2x10min，PBS），然后封闭（1h-过夜，全量封闭溶液（WBS）（PBS，2%Triton X-100，10%羊血清）。在清洗（2x1h，PBS与1%Triton X-100）和添加二级抗体（24h，4°C）之前，在4°C下应用一级抗体48h。清洗次级抗体，并将样本安装在玻璃盖玻片上进行成像。
为了标记BrdU抗体，首先用上述其他一级抗体标记样本。样品固定后（4%PFA，10分钟，RT），在PBS中清洗3次。然后在RT中用2M HCl处理15分钟。清洗（3x15分钟）后，在4°C下使用大鼠抗BrdU（英国牛津生物技术公司，1:20）过夜，然后使用山羊抗鼠568（1:500）二级抗体。按照上述方法进行抗体后清洗和安装。
图像在蔡司LSM 710共焦显微镜（英国剑桥蔡司）上采集，并使用ImageJ和Adobe Photoshop软件进行处理[41,42].
移植小鼠ENCC的钙显像
如前所述，从移植小鼠中取出结肠段，并立即浸入先前含氧（95%氧气/5%二氧化碳）的Krebs溶液中（mM:120.9 NaCl、5.9 KCl、1.2 MgCl2、2.5 CaCl2、11.5葡萄糖、14.4 NaHCO3和1.2 NaH2PO4）。去除粘膜后，将肠道准备物紧紧固定在Sylgard-line腔中，浆膜面朝上。在此阶段对移植的YFP+细胞进行鉴定和成像。
然后用荧光钙加载组织2+指示剂Fluo-4AM（分子探针，Invitrogen；5mM）和Cremophor EL（瑞士Buchs的Fluka Chemika；0.01%）在Krebs溶液中在室温下持续氧化20分钟。
加载后，在成像前清洗组织（2x10分钟，Krebs）。实时荧光成像在配备有20x（NA 1）水浸透镜、Poly V单色仪（TILL Photonics，Gräfelfing，德国）和冷却CCD相机（Imago QE；TILL Photonics，Gräfelfing，德国）的蔡司审查显微镜上进行。通过无重力灌注系统将实验室体积保持在3ml，确保95%氧气/5%二氧化碳通过的克雷布斯溶液（RT）持续灌注（1ml/min），多余溶液通过蠕动抽吸泵清除。Fluo-4在475nm处激发，其荧光发射在525/50nm处收集。图像（640X512像素2)采集频率为2 Hz。
通过铂电极（直径25μm）施加电刺激（2 s，20 Hz，300μs电脉冲；Grass Instruments，Quincy，Massachusetts，USA），铂电极插入观察到的感兴趣移植区域的最外围YFP+细胞或纤维200μm处。在插入过程中，应注意确保接触限制在内源性（非YFP+）纤维。为了确认YFP+移植细胞中信号的神经元来源，在河豚毒素（1μM，Sigma，Bornem，比利时）存在下进行了实验。局部应用高K+也被用作确定宿主组织内移植细胞的基本功能的手段。
使用TILLVision软件（TILL Photonics）收集图像，并在IGOR PRO（Wavemetrics，Lake Oswego，Oregon，USA）中进行采集后分析。通过将图像堆栈注册到第一个图像来消除运动伪影。在每个细胞上绘制感兴趣区域（ROI），将荧光强度归一化为每个ROI（F/F0）的基础荧光，并分析峰值[43–45].
结果
YFP+ENCC形成包含神经元、胶质细胞和假定肠神经干细胞的神经球
肠肌条取自Wnt1-cre；R26R-YFP/YFP型P2-4岁小鼠，其中NCC及其衍生物表达YFP。肠分离后，通过FACS选择YFP+ENCC，这些细胞占肠细胞总数的16.5±1.9%（n=6）(图1A). 在培养的2周内，选定的YFP+小鼠ENCC形成了直径约20μm的特征性神经球，在一个月内其大小增加到约120μm(图1B). 神经球包括表达ENS标志物的细胞，如泛神经元标志物TuJ1（神经球内31.7%±3.2%的细胞（n=3））和胶质细胞标志物GFAP（27.7%±5.9%（n=3）），它们在整个培养过程中保持其YFP表达(图1C). 它们还含有Sox10免疫阳性但GFAP阴性的细胞(图1D)，推测肠神经干细胞（Sox10+细胞占神经圈内细胞的67.7%±8.7%（n=3），因此Sox10＋；GFAP-肠神经干细胞约占40%）。
移植的ENCC在神经节宿主肠道中表现出适当的定植、定位和ENS样网络的形成
将YFP+神经球移植到出生后的野生型小鼠后肠远端。随后，在移植后24个月内，在所检测的56/62只动物（90.3%）的肠壁内发现了YFP+移植的ENCC。在肠道内，YFP+ENCC从移植部位经口和分析传播，并与内源性ENS共同形成广泛的分支网络(图2A包括插图和S1图面板A）。移植后15周，YFP+网络平均覆盖4.3±3.1mm的面积2在距移植部位1.4±0.4mm处观察到细胞体（n=10）(S1图面板B和C）。这些参数以及移植细胞的近端扩散与移植后的天数呈正相关(S1图B组（r=0.68，n=32，p<0.01）；1C（r=0.54，n=28，p<0.01）；和1D（r=0.51，n=28 p<0.01）。平均经口扩散（0.9±0.38mm）和经口传播（0.9？.4mm）之间没有显著差异（t=0.45，n=6，p<0.5）。
细胞体(图2B)和投影（箭头，图2A)从，移植的YFP+TuJ1+神经元细胞位于内源性肌间神经丛内，并在其中投射数毫米。移植细胞周围点状标记突触囊泡蛋白突触素（箭头，图2C)提示宿主肠道内形成突触。
移植的YFP+ENCC显示宿主肠道内的功能整合
为了测试移植的YFP+ENCC在宿主肠道肌肉组织内的功能整合，我们检测了[Ca2+]我内源性肠神经网络的电刺激(图3A)或使用高K+作为神经元激活的一种手段。内源性肠神经纤维的电点刺激导致YFP+移植ENCC的细胞体和纤维中的钙瞬变（F/F0=1.16±0.01；43个细胞，n=6）(图3B-3D和S1电影). 这些钙瞬变在1μM TTX存在下被消除，证实了它们的神经元特性(图3D和3E; 43个细胞，n=6）(S1电影). 局部应用高K+在YFP+移植细胞网络中也导致类似的广泛钙瞬变，并导致肌肉组织大幅度收缩（数据未显示）。
移植的YFP+ENCC在体内产生一系列ENS细胞类型
移植后4周用免疫荧光法分析移植YFP+ENCC的ENS细胞类型。53±14%的移植细胞表达神经元标记物TuJ1（n=13）(图4A和S2图面板A和S3图面板A）。nNOS表达细胞占大多数神经元（移植细胞的50±5%；图4B和S2图面板B和S3图面板A）。移植细胞表达其他神经元标记物，如ChAT、Calbindin和VIP(S2图面板C、D和E），但这些细胞类型数量较少（数据未显示）。移植细胞也表达胶质细胞标记物S100和GFAP(图4C和S2图面板F和G）。S100+细胞占移植细胞的64±22%(S3图面板A；n=3）。
YFP+ENCC移植后增殖，产生肠神经元和胶质细胞
通过BrdU掺入评估移植YFP+细胞的增殖能力。移植时和24小时后给予BrdU脉冲。在YFP+细胞中鉴定了BrdU掺入，并在不同细胞类型中进行了量化(S3图面板B）。26±19%的TuJ1+细胞(图4A和S3图面板B和C；n=13），nNOS+细胞的36±19%(图4B和S3图B组，n=3）和32±17%的S100+细胞(图4C和S3图面板B；n=3）显示BrdU掺入。这表明不同比例的表达神经元和胶质标记的移植细胞来源于移植后48小时内增殖的细胞。
移植的YFP+ENCC不会出现不受控制的增殖、形成肿瘤或扩散到其他器官
对接受YFP+ENCC移植的小鼠进行了长期研究，以评估这些移植的安全性。虽然最初的BrdU暴露（移植后48小时）导致移植细胞中BrdU掺入，但移植后4周剔除前48小时的暴露并未显示BrdU的掺入（数据未显示），表明移植细胞没有不受控制的增殖。对19-25个月大的移植动物和组织（包括大脑、肺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺和肠道肠系膜）进行宏观和PCR检查，未能发现任何YFP荧光或cre公司肠道以外器官和阳性对照中的转基因(图4D).
YFP+ENCC移植到aganglionic Ednrbtm1Ywa公司肠型分支神经元网络
内皮素受体tm1Ywa公司小鼠远端结肠无神经节细胞增生症的特征是长度可变，而我们群体中的突变体存活约两周。Tuj1免疫组化显示近端结肠呈正常神经节化(图5A和5Ai)向过渡带低角化区发展(图5A和5Aii)最远端的肠道虽然显示由外源性纤维支配，但缺乏内在的ENS(图5A和5Aiii).
将YFP+神经球移植到可从Ednrb腹腔进入的后肠最远端tm1Ywa公司小鼠（n=5）。移植细胞存活，3-5天后，五分之四的肠道中可以通过YFP荧光进行鉴定(图5B). 移植细胞包括Tuj1+神经元(图5Bii)和S100+胶质细胞（数据未显示），并扩展形成相互连接的神经网络(图5Bi). 与过渡区内源性神经元密切相关的移植神经元的进一步投射(图5Bii并插入5Bii）。
讨论
我们的研究证实了体内将出生后来源的ENCC移植到神经节和无神经节的出生后肠道。移植的细胞不仅能够成功移植到肠道的重要部分，而且能够显示与内源性神经网络的关键功能整合。重要的是，我们的研究表明，ENCC移植从长期来看是安全的。
迄今为止，只有另一项研究对ENCC的植入和功能完整性进行了强有力的测试体内移植[32]. 然而，我们的研究将这项工作扩展到了许多领域，从植入评估、移植后细胞行为和与内源性神经元的功能整合，到生存能力和安全性的长期研究。我们还能够评估体内移植到无节段肠。
我们对产后肠道的独家使用体内设置为ENCC的供体和受体可以最好地概括自体移植的临床设置。我们之前已经证明，即使使用微创技术（如内窥镜检查），也可以从人类产后肠道中获取ENCC。这些细胞成功地克隆了受体无神经节肠，胚胎肠保存在绒毛尿囊膜上或人类肠保存在体外[24]. 尽管人类ENCC仍需在体内我们的小鼠研究证实，将ENCC自体移植到无神经节和真神经节小肠的治疗策略是一个可行的选择。
先前的研究表明，具有内源性肠神经元的受体肠对移植细胞的接受能力较差[10]. 我们的研究和其他人的研究[16,33,35,46]证实这并不是为ENCC治疗一系列无神经节细胞病特征的肠神经病变（如慢传输型便秘、肠假性梗阻或损伤后发生的肠道神经病变）打开巨大潜力的情况。
在我们的研究中，移植的ENCC在移植后的受体肠道中表现出显著的增殖。BrdU分析证实，尽管分娩后细胞高度增殖（以大致相等的比例产生神经元和胶质细胞），但移植细胞并没有继续增殖，似乎在几周内达到稳定状态。这模仿了侮辱或伤害后内源性ENS的行为[47]这意味着移植细胞可能对负责维持ENS结构和功能完整性的内源性信号机制作出反应，可能位于神经球植入后的损伤部位。尽管如此，这种扩张能力可能会持续到现状鉴于它表明移植后可能会产生足够的“治疗性”细胞，从而在受体ENS中进行定植和整合，因此它的实现具有巨大的前景。
当然，治疗的成功取决于适当的分化和功能整合。在我们的研究中，正如最近报道的那样[32]，我们使用了来自出生后的YFP+ENCCWnt1-cre；R26R-YFP型/YFP小鼠产生YFP+神经球，由成熟神经元和胶质细胞以及肠神经干细胞组成，但缺乏非ENS细胞（例如平滑肌和成纤维细胞样细胞）。移植后，YFP+ENCC能够生成神经元和胶质细胞，包括一系列神经元亚型。重要的是，在移植的ENCC中，nNOS+细胞是主要的神经元亚型。这可能对肠神经病变的治疗至关重要，其中许多疾病的特征是ENS或更具体地说是抑制性nNOS神经元的丧失，伴有紧张性收缩和受影响的肠道不能充分放松[48,49]. 我们的进一步研究将旨在确定移植细胞的nNOS成分是否能够恢复nNOS缺乏模型中的抑制反应
移植的ENCC定位于肌间神经丛，它们的投射沿已建立的网络延伸相当长的距离，伴随着突触标记突触素的表达，表明它们与宿主神经肌肉系统整合。在Hotta等人的工作中，作者对单个移植的ENCC进行了细胞内记录，证实它们是功能活跃的神经元，并表明它们在受体肠道内的功能整合[35]. 使用不同的细胞内钙成像方法，我们能够进一步表明，刺激内源性肠神经纤维导致YFP+移植神经网络内的多个细胞出现广泛的钙瞬变。多个移植细胞的这种放电表明电路的整合，这是神经病变模型功能改善所必需的。该技术已广泛用于演示ENS功能[44,45]. 这些研究确实表明移植的神经网络与内源性神经肌肉组织的功能整合，但并没有证实这会转化为结肠运动的变化，如收缩功能或腔内容物的转运。使用野生型神经节肠排除了这种评估，因为人们不太可能看到运动性的超生理变化。这需要在肠神经病变或无神经节细胞神经病模型的背景下进行。
迄今为止，研究表明移植的ENCC对无神经节细胞肠道的定植几乎完全限于在体外实验[24,28]考虑到巨结肠症小鼠模型的存活率很低。我们已经能够将这些研究进展为体内移植支持ENCC重建神经网络能力的数据。虽然，受体EDNRB阴性动物的存活率有限，但我们能够输送细胞体内并表明他们能够成功嫁接。接受短期评估后，移植的ENCC存活下来，扩散开来，并与内源性神经元形成密切联系，这为在治疗环境中移植的ENCs可能能够与生成功能电路所需的内源性ENS建立联系提供了希望。尽管与其他人的经验一致，我们的实验继续受到先天性巨结肠小鼠模型（包括Ednrb和单异形Ret51）存活率低的阻碍，但新的策略可能有助于今后在此类动物中进行研究。Stamp等人最近报道了一种先天性巨结肠大鼠模型的手术模型，该模型中肠道造口的形成在理论上有助于评估移植后的良好存活率和健康状况[50]. 替代方法包括使用受影响较小的肠神经病变模型，如nNOS空突变，该突变与生存期相符，但具有可检测的神经功能缺损[51]或其他无神经节细胞增生症模型，如使用苯扎氯铵（BAC）等治疗方法对ENS进行化学消融[47,52].
我们研究的一个优势是对移植后24个月内的长期安全性进行了强有力的评估。在这些最终阶段的实验中，我们可以始终如一地观察到受体小鼠后肠内移植的YFP+细胞，但我们从未在任何器官中观察到YFP衍生肿瘤。此外，PCR分析表明，移植细胞仅限于远端结肠，没有证据表明其扩散或种植到远离靶器官的部位。这种对移植细胞的抑制及其在移植后一段时间内的有限增殖能力为任何未来细胞治疗的应用提供了关键的安全数据。尽管我们没有评估移植细胞的基因改变，但我们的研究有力地支持了长期的安全性，并表明ENCC移植的恶性转化或转移扩散的风险很小。
总之，我们的研究结果表明，在体内移植出生后的ENCC能够在受体小鼠肠道内成功且安全地植入。这些观察结果显著支持并推动了一系列肠神经病变细胞替代策略的发展，但这需要通过进一步的详细研究来验证体内将这些毁灭性疾病移植到更强大的模型中。
支持信息
S1图。YFP+小鼠ENCC在移植到体内内脏。
答：。YFP+移植细胞从假定的移植部位（星号）迁移，形成分支网络。箭头表示口腔和肛门细胞。B。定量来自单个神经圈的移植细胞网络所覆盖的区域随时间变化（移植后天数），（R=0.54；n=28；p<0.01）。C、。移植YFP+细胞从假定移植部位最大迁移量的量化绘制为时间函数（移植后天数）（R=0.68；n=32；p<0.01）。D。移植YFP+细胞的最大近端扩散的量化绘制为时间函数（移植后天数）（R=0.51；n=28；p<0.01）。比例尺输入一=250微米。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0147989.s001
（畅通节能法）
S2图。移植的YFP+ENCC产生神经元和胶质细胞，包括不同的神经元亚型。
A-G公司。取自全肠道制剂的z堆栈的3D重建（低倍和高倍），其中YFP+移植细胞（绿色）用一系列ENS标记物（红色；共表达黄色和箭头）进行免疫组织化学标记。移植细胞表达泛神经元标记TuJ1(一)、抑制性神经元标记物nNOS和VIP(B、 E类)、兴奋性神经元标记物ChAT和Calbindin(C、 D类)以及胶质标记物S100和GFAP(F、 G公司). DAPI用蓝色标记细胞核。比例尺输入A-G公司低倍率=50μm；高倍率=10μm。插图显示单个通道。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0147989.s002
（畅通节能法）
作者贡献
构思并设计了实验：NT JC CM DN AJB JMD。执行实验：JC CM DN WB SC。分析数据：JC CM-NT。贡献的试剂/材料/分析工具：JC CMC-NT AJB PVB WB。撰写论文：JC NT DN CM AJB JMD。
工具书类
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