摘要
正常生理变量，如年龄和性别，有助于循环microRNA（miRNA）表达水平的改变。女性身体在月经周期中的变化也可以反映在血浆miRNA表达水平上。因此，本研究旨在确定健康女性月经周期期间的血浆miRNA谱，并评估哪些循环miRNA来自血细胞。使用Exiqon Human Panel I分析方法，从月经周期的四个时间点，通过定量实时PCR测定9名健康女性的血浆miRNA表达谱。该平台还用于在相同的四个时间点研究来自混合全血RNA样本的miRNAs。我们的结果表明，健康女性的循环miRNA表达水平并未因月经周期中发生的过程而显著改变。在月经周期时间点之间，未观察到血浆miRNA表达水平的显著差异，但检测到的miRNAs数量在研究个体之间表现出相当大的差异。全血样本的miRNA分析表明，血浆中的大多数miRNA来自血细胞。血浆和血液中最丰富的miRNA是hsa-miR-451a，但一些miRNA仅在一种或另一种样本类型中检测到。总之，我们的数据表明，女性身体在月经周期中的变化不会影响循环miRNAs在可测量水平上的表达。
引用：Rekker K、Saare M、Roost AM、Salumets A、Peters M（2013）《整个月经周期的循环microRNA谱》。公共科学图书馆综合8（11）：e81166。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081166
编辑：安德鲁·沃尔夫，美国约翰·霍普金斯大学医学院
收到：2013年5月21日；认可的：2013年10月9日；出版：2013年11月14日
版权：©2013 Rekker等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。
基金：本研究由爱沙尼亚教育和研究部SF0180044s09拨款资助，欧洲区域发展基金通过爱沙尼亚基因组学卓越中心资助，爱沙尼亚企业资助，无EU30020和Eurostars EU41564 NOTED项目。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
介绍
微RNA（miRNAs）是一类在转录后水平调节基因表达的非编码小RNA。迄今为止，在所有被检测的哺乳动物组织和细胞类型中都发现了miRNAs，并在多种生理和病理过程中发挥重要作用[1]. 除了细胞和组织外，miRNAs还存在于细胞外体液中，如血浆、血清、尿液和唾液[2–4]. 虽然循环中无细胞miRNAs的起源尚不完全清楚，但人们认为miRNAss是由受损或凋亡的细胞释放到细胞外空间，并由细胞通过胞外体或胞吐积极分泌[5,6].
尽管血浆和血清中的核糖核酸酶浓度较高，但循环中的miRNAs相对稳定[7]因此被认为是生物标志物研究的良好候选者。一些研究表明，循环miRNAs的表达模式可用于识别癌症、心血管和肠道疾病患者[8,9]. 除了这些病理学之外，循环miRNA被认为是不孕不育和妇科疾病非侵入性诊断的潜在生物标志物的一个有前途的来源[10]比如子宫内膜异位症[11,12]和异位妊娠[13].
除了生理因素外，包括样本采集和样本处理在内的预分析步骤也会影响血浆miRNA的检测和定量[14]. 例如，样本采集过程中发生的溶血现象会增加血浆中红细胞衍生的miRNA浓度[15,16]. 血细胞是循环中无细胞miRNA的主要来源，血浆miRNA水平直接受血细胞计数的影响[16]. 迄今为止报道的大多数癌症特异性循环miRNA生物标记物在血细胞中高度表达，血细胞计数的变化可能会影响生物标记物的特异性，因为观察到的变化可能反映样本特征，而不是疾病[16]. 因此，重要的是找到血液细胞中不高表达的循环miRNA生物标记物。
女性身体在月经周期中经历许多生理和激素变化，子宫内膜发生重大变化。几项研究显示子宫内膜miRNA谱在月经周期中出现波动[17–20]. 例如，Kuokkanen等人（2010年）报告了增殖晚期和分泌中期月经期子宫内膜上皮细胞中miRNA的差异表达模式，表明人类子宫内膜中的一些miRNA受激素调节。这些结果表明，子宫内膜中的miRNAs在整个月经周期的基因表达调控中起着重要作用。在其他组织中也观察到miRNA表达水平的周期性变化。一项对绵羊卵巢组织的研究表明，在绵羊发情周期中，卵泡和黄体中的miRNA表达存在差异[21]. 基于此，可以合理地假设，女性体内在月经周期中发生的miRNA谱的变化也可能反映在血浆miRNA表达水平上。
因此，在将miRNA用作女性的非侵入性诊断工具之前，必须了解健康育龄女性月经周期中血浆miRNA表达谱的波动情况。由于尚未研究循环miRNA与月经周期的关系，因此本研究的主要目的是确定健康女性月经周期期间的血浆miRNA谱。其次，为了找出哪些血浆miRNAs来源于血细胞，我们研究了健康人的全血样本中的miRNA在月经周期中的变化。
材料和方法
道德声明
这项研究得到了塔尔图大学（爱沙尼亚塔尔图）人类研究伦理审查委员会的批准，并获得了所有参与者的书面知情同意。
研究参与者
共12名健康年轻成年女性（平均年龄±SD，25.7±4.8岁；体重指数22.0±3.2 kg/m2)被纳入本研究。进行问卷调查，以获取有关一般健康特征的信息，包括月经病史、药物使用、是否存在全身性疾病和其他健康状况。研究对象将自己定义为健康；受试者在参与研究时均未患有妇科、炎症或任何慢性疾病。既往无子宫内膜异位症或自身免疫性疾病史。在研究之前，没有一名被招募的参与者使用激素类药物至少3个月。所有女性均报告有规律的月经周期，月经周期间隔可达35天。月经持续时间为3至7天。12名参与者中有3名被排除在研究之外，其中两名女性在采样期间患病，一名患者血浆中的黄体生成素（LH）水平与假定的月经周期时间点不符。该研究的最终参与者人数为9人。
样品制备和RNA分离
将健康女性在一个月经周期的四个时间点的外周血样本收集到9 ml EDTA试管中，并在一小时内进行处理。样本采集的第一个时间点是月经的第一天（周期第1天）；第二个时间点为月经开始后第7天（周期第7天）；第三个时间点被确定为LH激增的时间（LH第0天），第四个时间点是LH激变后的7天（LH的第7天）。使用尿液LH测试Baby time™（以色列Zer Hitech有限公司）评估LH激增的时间；在检测到LH激增的同一天采集LH第0天的血样。为了证实基于尿液的LH测试的结果，在周期第7天和LH第0天从血浆样本中进一步测量LH水平。周期第7天和LH第0天的平均LH值分别为4.9±1.4 U/L（平均值±S.E.M.）和28.4±11.1 U/L。血液样本在1600进行离心分离克将血浆与血细胞分离10分钟。在16000℃时，通过额外的离心步骤进一步处理血浆克10分钟。所有离心步骤均在4°C下进行。将软皮和血浆部分收集到单独的试管中。未对浅黄色皮毛样本（此后称为“全血样本”）进行红细胞（RBC）分析。肉眼观察血浆中未发现溶血迹象。此外，NanoDrop 2000（美国威尔明顿热电科学公司）分光光度计在波长λ200-800 nm处的测量结果表明，在414 nm处没有出现明显的峰值，对应于血浆中氧血红蛋白的最大吸光度[15]. 将三卷Trizol LS试剂（Invitrogen，Life Technologies，USA）添加到血浆和血液中进行RNA分离；样品在−80°C下储存，直至进一步处理。根据制造商的说明，使用miRNeasy Mini试剂盒（德国希尔登市齐根）从4 ml血浆或250µl血液中分离出RNA，对使用Trizol LS试剂代替齐唑溶解试剂的方案进行了微小修改。RNA分离的最终洗脱体积为50µl。
用RNA 6000纳米芯片（安捷伦科技，加利福尼亚州帕洛阿尔托，美国）评估从全血样本中分离的RNA的质量和数量，所有RIN值均≥8.0。安捷伦RNA芯片未用于血浆RNA样品的质量评估，因为血浆中循环的无细胞RNA由短片段组成，因此不存在核糖体RNA峰。用安捷伦小RNA芯片评估所有RNA样品中是否存在miRNAs。
血浆和血液样本的miRNA分析
在月经周期的四个时间点采集的九名女性血浆样本用于miRNA分析（共36份血浆样本）。此外，合并的全血RNA样本用于miRNA分析。在月经周期的四个时间点（四个池，每个时间点一个），从六名健康个体（血浆研究中九分之六的个体）分离的全血RNA样本生成池。对于每个池，以相同浓度（总RNA的400 ng）混合RNA。根据制造商的说明，使用TURBO DNA-free™试剂盒（美国德克萨斯州奥斯汀Ambion）用DNase处理RNA。
使用通用cDNA合成试剂盒（Exiqon，Vedbaek，丹麦）进行反转录反应。对于每个反应，使用4µl RNA，相当于从320µl血浆或20 ng总血液中分离出的RNA量。
采用Exiqon miRCURY LNA microRNA Human panel I（V2.M）定量实时PCR（qRT-PCR）检测375个人类miRNA的表达谱。使用Exiqon推荐的循环参数，在7900HT热循环器（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上进行了扩增。为了确定使用的人面板I板之间的技术差异，分析了板间校准器（IPC）。血浆和血液样本的IPC（UniSp3）水平在Ct值分别为19.6±0.5（平均值±SD）和19.7±0.2的样本中高度相似。
qRT-PCR数据使用GenEx软件2.0进行分析（MultiD Analysis，瑞典）。阈值循环（Ct）值大于36被认为低于检测水平。qRT-PCR数据集采用全局平均策略进行归一化[22]. 用比较Ct法计算相对表达[23]. 将月经周期时间点之间的血浆miRNA表达水平与相对miRNA表达值的单因素方差分析进行比较。通过双尾非配对t检验确定血液和血浆样本之间miRNA表达的差异。根据Bonferroni校正对多次测试的P值进行了调整。将显著性阈值设置为倍变≥2，校正后的P值≤0.00026（199个检测到的miRNAs数据集）或≤0.00027（190个检测出的miRNA数据集），分别用于时间点之间血浆miRNA表达的比较以及血液和血浆miRNA的比较。对检测到的血浆miRNA的数量进行双因素方差分析（无复制），以评估月经周期时间点和研究个体之间的差异。在该分析中，P值≤0.05被认为具有统计学意义。
结果
血浆中表达的miRNAs
使用Exiqon实时PCR分析，对9名女性在月经周期中四个不同时间点的血浆样本（共36个样本）进行375个miRNAs的分析。平均而言，所有血浆样本中375个miRNA中有197个（范围从94到315个miRNAs）检测到阈值水平Ct<36。健康女性血浆中检测到的15种最丰富的miRNAs出现在表1血浆样本中也检测到高水平的.hsa-miR-1979、hsa-miR-720、hsa-milR-886-3p和hsa-miR886-5p，但根据miRBase释放18，这些序列不再被视为miRNAs，并从分析中删除。
| 血浆样本中检测到miRNAs | 血液样本中检测到miRNAs |
|---|
| hsa-miR-451a | hsa-miR-451a |
| hsa-miR-486-5p | hsa-miR-144-3p |
| hsa-miR-92a-3p | hsa-miR-16-5p |
| hsa-miR-320a基因 | hsa-miR-15a-5p |
| hsa-let-7b-5p | hsa-miR-19b-3p |
| hsa-miR-93-5p | hsa-miR-142-3p |
| hsa-miR-223-3p | hsa-miR-486-5p |
| hsa-miR-185-5p | hsa-miR-92a-3p |
| hsa-miR-150-5p | hsa-miR-20a-5p |
| hsa-let-7d-3p | hsa-miR-223-3p |
| hsa-miR-25-3p | hsa-miR-103a-3p |
| hsa-miR-484 | hsa-miR-93-5p |
| hsa-miR-16-5p | hsa-miR-106a-5p |
| hsa-miR-103a-3p基因 | hsa-let-7g-5p |
| hsa-miR-106a-5p | hsa-let-7b-5p型 |
表1。从健康女性的血浆和血液样本中检测到最丰富的miRNAs。
月经周期中的miRNA谱
在整个月经周期中，健康女性的总体血浆miRNA表达谱相似。miRNA表达差异均未达到多重测试所需的显著性水平。层次聚类分析表明，样本没有根据月经周期时间点进行聚类，但研究对象形成了相当大的聚类(图S1).
除了miRNA表达水平外，还比较了研究组之间检测到的miRNA数量。在所研究的月经周期时间点中，检测到的miRNAs的平均数量相似（从192到202）(表2). 如果数据按研究对象分组，则检测到的miRNAs的平均数量在135到289之间(表2). 检测到的miRNAs数量在月经周期时间点之间没有统计学意义上的差异（P=0.8），但研究个体之间的差异具有统计学意义（P=1.5×10-7).
| 月经周期时间点 | |
|---|
| 研究参与者ID | 循环第1天 | 循环第7天 | LH第0天 | LH第7天 | miRNAs平均数（平均值±标准偏差） |
|---|
| E10型 | 221 | 175 | 199 | 202 | 199 ± 19 |
| E11号机组 | 175 | 230 | 242 | 252 | 225 ± 34 |
| 第12页 | 172 | 141 | 151 | 179 | 161 ± 18 |
| 第13页 | 115 | 162 | 113 | 148 | 135 ± 24 |
| 第15页 | 169 | 148 | 174 | 172 | 166 ± 12 |
| 第16页 | 186 | 229 | 214 | 239 | 217 ± 23 |
| 第17页 | 255 | 241 | 233 | 257 | 247 ± 11 |
| E35（E35） | 265 | 315 | 311 | 263 | 289 ± 28 |
| E37（E37） | 173 | 94 | 180 | 101 | 137 ± 46 |
| miRNAs平均数（平均值±标准偏差） | 192 ± 47 | 193 ± 67 | 202 ± 57 | 201 ± 56 | |
表2。通过Exiqon分析从血浆样本中检测到的miRNAs数量。
全血中表达的miRNAs
为了确定哪些miRNA在血细胞中表达，使用了来自每个月经周期采样点的六个人的全血样本的合并RNA。Exiqon分析的数据分析显示，在375个miRNA（范围从285到296个miRNA）中，平均有290个在合并样本中检测到Ct<36的阈值水平。健康女性全血样本中检测到的15种最丰富的miRNAs出现在表1四个池中的.miRNA组成和水平高度相似(表S1).
血浆和血液中miRNA表达的比较
为了比较血浆和血液中miRNA表达的差异，将来自同一样本类型Exiqon平板的所有数据用作技术复制品，以便将独立于月经周期日或研究对象的血浆样本与四份合并血液样本进行比较。在本分析中，至少50%的血液或血浆样本中存在低于阈值Ct<36的所有miRNAs均被视为已检测到。Exiqon平板上的375个miRNAs分别从血液和血浆样本中检测到296和199个(表S2). 这两个组分中均存在190个miRNAs，其中106个在血液中唯一检测到，9个在血浆样品中检测到(图1;表S2). 在这两种样品类型的15种最丰富的miRNA中，有9种miRNA（hsa-miR-451a、hsa-miR-486-5p、hsa-micR-92a-3p、hsa-let-7b、hsa-milR-93-5p、hse-miR-223-3p、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-103a-3p和hsa-miR 16-5p）被代表(表1). 两种样本类型中表达量最高的miRNA是hsa-miR-451a。除了9个仅在血浆中检测到的miRNA外，与血样相比，41个miRNA在血浆中的相对表达值显著升高，40个miRNA相对表达值降低（变化倍数>2；P<0.00027（Bonferroni校正）；表S3;图S1).
讨论
最近的研究表明，循环体液和细胞中全球miRNA表达模式的变化受到几个人口统计学和正常生理变量的影响。年龄[24]，性别[25]和民族血统[26]已经证明是导致miRNA表达水平差异的一些因素。在本研究中，我们研究了女性身体在整个月经周期中发生的变化是否会影响健康年轻女性的血浆miRNA模式。
miRNAs调节许多细胞过程，这些过程也发生在子宫内膜和其他组织的周期性变化中。一些研究表明，miRNAs在月经周期子宫内膜中的差异表达，并强调了它们在子宫内膜分化为接受状态中的作用[17,18,20]. 例如，这些研究报告了接受性（LH第7天）和非接受性（周期第12天或LH第2天）子宫内膜之间miRNA表达水平的7倍差异，其中miR-30d、miR-30b、miR-31、miR-193a-5p、miR-203在接受性子宫内膜中表达上调而miR-503表达下调[17,18,20]. McBride等人（2012年）观察到9个miRNAs（miR-125a、miR-199a-3p、miR-125b、miR-99a、let-7c、miR-145、miR-31、miR-202和miR-27b）表达减少，8个miRNA（miR-503、miR-21、miR-29b、miR 142-3p、miR 34a、miR 152、miR 25和miR-130a）在绵羊卵巢组织的卵泡期和黄体期表达增加[21]. 在我们的研究中，未发现月经周期时间点之间血浆miRNA表达水平的差异。基于这一发现，我们认为健康女性血浆中可检测到的miRNA水平不会因月经周期过程而发生显著变化。组织中miRNA的表达变化可能是局部基因表达调控所必需的，但波动不足以改变循环中可检测到的miRNA模式。
除了miRNA表达水平外，我们还对研究组之间检测到的miRNA数量是否存在差异感兴趣。我们研究中检测到的miRNAs数量显示出显著的诱导间差异，超过了月经周期时间点之间的差异(表2). 因此，检测到的miRNA数量的个体差异可能掩盖了整个周期中miRNA谱的可能波动。我们研究中的健康志愿者年龄和民族相同；因此，这些因素不太可能对miRNA水平产生显著影响。
血浆miRNAs是许多疾病无创诊断潜在生物标记物的一个很有希望的来源。迄今为止发现的与不同病理学相关的大多数血浆miRNA生物标记物也在血细胞中高水平表达。血细胞计数和标本处理程序的改变可能会影响候选循环无细胞miRNA生物标记物的特异性，因为观察到的变化可能是由生理变化而非疾病引起的[16]. 考虑到后者，重要的是要找到在血细胞中不高表达的循环miRNA生物标志物，这些生物标志物不太可能受到所研究疾病以外的因素的影响。为了找出从血浆中检测到的哪些miRNA来自血细胞，在月经周期的四个时间点对合并的全血RNA样本进行了miRNA分析。结果表明，在使用的检测中，大多数miRNA都是从两种样本类型中检测到的，但也有一些miRNA只存在于血浆或血液中。与血浆相比，从血细胞中检测到更多的miRNA。从这两种样本类型中检测到的大多数miRNAs在全血中的表达较高。然而，血浆样本中几种miRNAs的相对水平也较高(表S3)提示血浆中的一些miRNAs来源于血细胞以外的其他组织和细胞。研究表明，来源于肿瘤组织的miRNAs可以进入循环[2]. 此外，miRNAs通过外泌体或蛋白质复合物传递到血浆中，例如，在孕妇中，胎盘衍生的外泌物被释放到母体血液中[27]. 在我们的研究中，一些仅在血浆样本中检测到的miRNAs也在其他组织中发现。例如，miR-10b-5p、miR-205-5p和miR-214-3p在小鼠和人类卵巢中表达[28,29]; 在人类子宫内膜中检测到miR-572、miR-214-3p和miR-205-5p的表达[30–32]. 尽管如此，我们与以往研究的比较显示，结果之间存在很大重叠，表明循环中最高表达的无细胞miRNAs是miR-451a、miR-486-5p和miR-92a[16,33,34]在血细胞中也高表达[15,16].
全血中的miRNAs主要来自成熟的红细胞群体[15,35]. 在我们的研究中，RBC衍生的miRNAs[16]miR-451a、miR-144-3p和miR-16-5p在全血样本中的表达水平最高。
应该强调该研究的一些局限性。由于只研究了一组特定的miRNAs（仅限于Exiqon分析中的存在），其他血浆miRNA的表达水平可能在月经周期中发生改变。此外，不能排除缺乏显著的miRNA表达差异可能是由于研究样本数量相对较少，不足以检测到表达水平的微小波动所致。此外，由于样本汇集会导致个体变异信息的丢失，因此应考虑汇集血液样本所得数据的局限性。因此，由于样本池对稀有转录物的检测影响更大，因此，由于缺乏诱导间变异，血浆样本中唯一检测到的miRNAs可能不存在于血库中[36].
总之，我们发现月经周期时间点之间血浆miRNA表达水平没有差异。这一观察结果可用于未来各种病理学（包括妇科疾病）的miRNA生物标记物研究。血浆中有循环的无细胞miRNAs，但在全血样本中未检测到或检测到低水平的miRNA，尽管如此，血浆中的大多数miRNA也在血细胞中表达。
致谢
作者非常感谢志愿者参与本研究。此外，作者感谢Triin Laisk Podar在手稿准备过程中提供的帮助，爱沙尼亚基因组中心的Steven Smit提供的技术援助，以及Katrin Kepp收集的样本。
作者贡献
构思并设计了实验：KR MS AS MP。进行了实验：KR MS AMR。分析数据：KR AMR MP。贡献的试剂/材料/分析工具：KR MP AS。撰写手稿：KR MP。
