摘要
背景
长非编码RNA（lncRNAs）是一类重要的普适基因，参与多种生物功能。它们在多种癌症中异常表达。在本研究中，我们通过微阵列描述了6对人肾透明细胞癌（RCCC）和相应的邻近非肿瘤组织（NT）的lncRNA谱。
方法/主要发现
我们的微阵列中有33045个LncRNAs探针，探针丰富多样，可以检测到在一定水平上表达的LncRNAs数量为17157。从数据中我们发现，与NT和916个lncRNAs相比，在RCCC组织中有数千个lncRNA差异表达（≥2倍变化），在六个RCCC样本中有五个或更多的样本中差异表达。与NT相比，RCCC中许多lncRNA显著上调或下调。我们的数据表明，下调的lncRNA比上调的lncRNAs更常见。用qPCR方法对63对RCCC和NT样品中的ENST00000456816、X91348、BC029135、NR_024418进行了评价。与匹配的组织学正常肾组织相比，这四种lncRNA在RCCC中异常表达。
结论/意义
我们的研究是第一个通过微阵列确定RCCC中全基因组lncRNA表达模式的研究。结果显示，与NT样本相比，RCCC中lncRNAs簇的表达异常，这表明lncRNA在肿瘤组织和正常组织中的差异表达可能在肿瘤的发生发展中发挥部分或关键作用。总之，这项研究可能为RCCC的未来治疗提供潜在的靶点，并为癌症生物学提供新的见解。
引用：Yu G，Yao W，Wang J，Ma X，Xiao W，Li H，et al.（2012）微阵列揭示肾透明细胞癌LncRNAs表达特征。公共科学图书馆综合频道7（8）：e42377。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0042377
编辑：查德·克里顿，美国贝勒医学院
收到：2012年3月25日；认可的：2012年7月4日；出版：2012年8月6日
版权：©Yu等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作者和来源已获得认可。
基金：本研究得到了国家自然科学基金（310722383117244181170650）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
介绍
肾癌的发病率在泌尿系统肿瘤中排名第三，约占成人恶性肿瘤的3%[1]肾癌是全球第十六大最常见的恶性肿瘤。2008年，265731人被诊断患有肾癌，113315人死于此类癌症[2],[3]更严重的是，这类癌症的发病率和死亡率仍在上升[4].90-95%的肾细胞癌起源于肾脏，肿瘤的发生与种族和民族特征有关[1].
在肾脏肿瘤中，RCCC是最常见的类型，在过去60年中，其发病率在成年男性中最高。基础研究表明，遗传事件在RCCC的发展中起着重要作用[5]VHL基因突变导致的von Hipple-Lindau（VHL）缺失或异常染色质重塑以及3p时的染色体丢失导致缺氧诱导因子（HIF）家族成员的失调，HIF家族成员可以直接或间接靶向某些生长因子基因，这可能是RCCC肿瘤发生中最重要的遗传事件[6]–[8]也已证明仅VHL突变不足以产生RCCC，还需要额外的遗传事件[9]–[11]哺乳动物基因组的绝大多数转录输出被证实是蛋白质非编码基因[12]这些丰富的转录组被视为“转录噪音”。然而，在过去的十年中，许多研究报告称，这些非编码RNA在转录和转录后都具有一系列重要的调控潜力。
非编码RNA根据其长度分为短非编码RNA和长非编码RNA。MicroRNAs（miRs）是研究得最好的短非编码RNA，在许多癌症中显示出不同的表达，mir-34b、mir-29b、mir-210等已被证实参与RCCC的发展[13]LncRNAs被定义为长度超过200个核苷酸的非编码RNA。LncRNAs已被证实通过各种机制在生物过程中具有综合功能[14]越来越多的证据表明lncRNA在正常发育和疾病中发挥着重要作用[12]lncRNAs的失调已被证明与许多人类疾病有关，包括各种癌症[15]对全长cDNA序列的大规模分析已经在人类、小鼠和苍蝇中检测到大量长的非编码RNA。这些lncRNA已被证明在印迹控制、细胞分化、免疫反应、人类疾病、肿瘤发生和其他生物过程中发挥关键作用[16]–[20]但lncRNAs在RCCC中的表达及其生物学功能尚不清楚。
在本研究中，我们展示了6对RCCC样本与NT样本的lncRNAs表达谱，其中一些样本在总共63对组织中通过qPCR进行了评估。我们的结果表明，lncRNA表达谱可能为RCCC的诊断提供新的分子生物标志物或新的依据。
结果
lncRNAs概况
从lncRNAs表达谱来看，在RCCC和NT样本中可以发现差异表达的lncRNA。通过计算肿瘤/正常（T/N）的对数倍变化来显示配对样品中lncRNA的表达谱。协议制定如下：折变截止值：2.0，折变，正值表示上调，负值表示下调。Log fold-change表示绝对fold-cchange的log2值。折变和p值是根据规范化表达式计算的。我们在6例RCCC患者的RefSeq_NR、UCSC_knowngene、Ensembl、H-invDB、Fantom、Fantom_stringent、NRED、RNAdb、misc_lncRNA、UCR和lncRNA中检测到数千个差异表达的人类lncRNA。
接下来，从微阵列数据中，我们比较了6个RCCC组织及其匹配的正常组织之间的lncRNAs表达水平，并确定了平均3837个差异表达（≥2倍）的长lncRNA（范围为2262–5532）(表S1). 六名患者的基本信息显示在表S2序列获取程序可能因lncRNA来源而异。结果表明，在正常组织和肿瘤组织中可以检测到数以万计的lncRNA，但只有数千个lncRNA显著上调或下调，这可用于区分RCCC和匹配的正常组织(表S1,表S3). 与NT组织相比，共有3055个lncRNAs被6个RCCC样本中的4个样本持续上调或下调，共有1866个样本被5个样本上调或下调(表S4). ENST00000429695（Log2 Fold change T/N=−4.175355）是最显著下调的基因，而ENST00000456816（Log2 Fold change T/N=6.312544）是最明显上调的基因(表1). 不同患者上调和下调lncRNA的数量不同。我们发现下调的lncRNA比上调的lncRNAs更常见(图1).
从微阵列数据来看，lncRNA和信息RNA表达的变化如表2越来越多的证据表明lncRNAs在基因表达中发挥着重要作用。因此，我们探讨了lncRNAs表达与蛋白质编码基因表达之间的相关性。四种lncRNA表达（ENST00000456816、X91348、BC029135和NR_024418）使用大于0.85的绝对相关系数截止值和小于0.01的FRD进行。我们发现数百个基因与四种lncRNAs中的每一种都显著相关(表S5).
LncRNA分类和亚群分析
最近，一些类别或簇的LncRNA，如HOX LncRNA和具有类增强子功能的lncRNAs（LncRNA-a），已被确定为人类细胞的特异功能[21],[22]这些亚组lncRNAs更可能参与许多疾病的发生和发展，尤其是癌症。许多lncRNA被发现是从人类同源盒转录因子（HOX）簇内转录的[22]这些以时间和位点特异性方式表达的lncRNA可能使用与HOX基因相同的增强子，并可能与HOX具有全局调节功能。在当前的研究中，针对四个人类HOX基因座中407个离散转录区的所有探针的LncRNAs和编码转录物的剖面数据都显示在表S6这些数据表明，RCCC中可检测到148个编码转录物，其中71个转录物与邻近正常组织差异表达。然后，检测到大约257个转录的lncRNA，其中142个在RCCC的人类HOX基因座中有不同表达。还提供了基于John Rinn论文的lncRNAs所有探针的剖面数据表S7检测到的1787个lncRNA中有751个lncRNA表达不同[23],[24].
哈罗和他的同事将人类细胞系中的一组lncRNA定义为具有增强子样功能的lncRNA[21]这些lncRNA的耗尽导致其邻近蛋白编码基因的表达降低。这个表S8包含所有具有增强子样功能的LncRNAs探针的剖面数据，检测到846个LncRNAs，其中357个差异表达。不同表达的增强子样LncRNAs及其附近的编码基因（距离<300 kb）在表S9先前的研究表明，lncRNAs具有内在的顺调控能力，因为它可以在与自身基因座相连的情况下发挥作用。因此，我们还提供了差异表达的lncRNA和附近的编码基因对（距离<300 kb），用于样本之间的每次比较。六个样本对的对数范围为113到344，如中所示表S10（p<0.05）。
mRNA谱概述
通过30215个编码转录物探针，在六对样本中可以检测到多达13664个编码转录体(表S11). 在6对样本中，与匹配的正常组织相比，RCCC中平均有1899个mRNA（范围1591–2222）上调，而平均1743个mRNAs（范围1081–2140）下调(表S12). GO和Pathway分析表明，不同表达的mRNA可能参与一些初级物质代谢以及氧化和过氧化物相关的信号通路。这些结果支持了肾癌是一种代谢性疾病的观点。
实时定量PCR验证
首先，我们使用qPCR检测了这四种lncRNA（ENST00000456816、X91348、BC029135和NR_024418）在两组肾组织中的表达(表S13). 这些数据支持qPCR结果和微阵列数据之间的强一致性(图2). 此外，这四种lncRNA的表达也已在五种RCCC细胞系中使用qPCR进行了分析（数据未显示）。结果表明，与NT样本相比，RCCC样本中ENST00000456816、X91348上调，BC029135、NR_024418下调。（每个lncRNA的p<0.001）(表S14).
编码非编码基因共表达网络的构建
基于差异表达的lncRNA和mRNA之间的相关性分析，构建了一个编码非编码基因共表达网络（CNC网络），通过细胞图程序选择皮尔逊相关系数不小于0.99的lncRNA和mRNAs绘制网络。在这个共表达网络中，323个lncRNAs和196个mRNAs组成了CNC网络节点。519个网络节点产生了1039对共表达lncRNAs和mRNAs的网络对，大多数网络对呈正相关。CNC网络显示，一个mRNA可以与一到几十个lncRNA相关，lncRNA也可以。CNC网络如图所示表S15可能与RCCC中lncRNA和mRNA的相互调节有关。
讨论
此前，没有关于lncRNA在RCCC中表达谱的报道，也没有关于lncRNA表达与RCCC临床特征和结果之间关系的研究。RCCC与其他癌症一样，是一种由一系列基因改变引起的遗传病[5]对数千个基因组序列的描述以及大规模识别基因表达谱的技术发展为致癌分析提供了显著的改进[25]改进的技术可能有助于我们发现可能的治疗靶点，并识别新的诊断和预后标志物。因此，深入研究基因特征将有助于了解癌症的发生和发展，并有助于制定新的个性化治疗策略。一些研究表明，lncRNAs的表达在大多数人类癌症中可以被去调节[26]–[29]以前的一些研究表明，像HOTAIR这样的lncRNAs在肿瘤的发展和进展中起着重要作用[26].
本研究重点描述了RCCC的lncRNA表达谱，并解释了肿瘤组织与阴性对照（邻近正常肾组织）之间的差异。我们通过微阵列分析了6对RCCC和相邻NT样本，并在63对样本中选择了有限的lncRNA进行qPCR验证。微阵列中有33045个lncRNA和30215个编码转录物，探针丰富多样，可以定量测定大量lncRNA。为了了解lncRNAs在RCCC发展和进展中的作用，我们对lncRNA在该癌中的表达谱进行了全面深入的分析。基于微阵列数据，我们发现数以万计的lncRNAs被表达，而其中数千个在每个样本中表达不同。在所有6个样本中鉴定出146个lncRNA上调和480个下调，其中大多数还没有进行功能特征分析。这些lncRNAs可能参与RCCC的发展和进展，并可能为更好地理解RCCC的分子基础提供新的途径。
在前人工作和计算机分析的基础上，选择了4个lncRNA（ENST00000456816、X91348、BC029135和NR_024418）来验证其一致性。通过63对样本的qPCR进一步评估这四种lncRNA的表达。LncRNA ENST00000456816是一种796 bp的基因内LncRNA，从染色体3q上的基因ENSG00000214145（RP11–513G11.1）转录而来。该基因还有其他3个转录本，所有这些转录本在我们的样本中都没有检测到。一些基因，如位于染色体3p上的PBRM1，与RCCC的绝大多数突变VHL基因相对接近，在RCCC中起重要作用[5]虽然位于3q上的lncRNA距离VHL基因或PBRM1基因很远，但不能排除lncRNA可以招募染色质修饰酶以反式作用于这两个基因的可能性。这种lncRNAs是否在RCCC中发挥作用尚需进一步研究。X91348是一个1284bp的基因内lncRNA，由DiGeorge综合征关键区基因5（DGCR5）转录而成。这个位于22号染色体上的基因产生其他6个非编码转录物，但没有编码产物。1996年，Sutherland，H等人发现了与DiGeorge综合征相关的平衡易位所破坏的新转录物[30]但是这种RNA的生物学功能仍然很难理解。BC029135是从chr10转录的723 bp基因内lncRNA，NR_024418是从chr 5转录的723bp基因内incRNA。这两种RNA均未经特征化，其生物学功能尚不清楚。
qPCR结果与微阵列数据吻合良好，表明这些组织中lncRNAs表达存在变异性(图3). 这可能为区分肿瘤组织和邻近正常组织提供潜在的方法。尽管体液中的非编码RNA，如血清、尿液等，已被确定为可能的生物标记物[31]根据目前的数据，仅仅利用这四种lncRNAs作为RCCC中可能的生物标记物还为时过早，这将有助于探索RCCC中新的分子标记物。我们还发现许多lncRNA的表达与数百个蛋白质编码基因的表达显著相关。从理论上讲，lncRNAs具有内在的顺调控能力，这一点已经得到证实，另一方面，lncRNA的顺调控机制已经被描述。越来越多的证据证实lncRNAs可以同时作用于顺式和反式[21],[32],[33]顺式调节器的精确比例需要更直接的实验方法。最近，据报道，哺乳动物基因组中有1000多个lncRNAs在进化上保守，因此可能在多种生物过程中发挥作用。一些研究表明，lncRNAs参与转录调控，其在人类癌症中的表达可以被解除调控[26]–[29]另一组研究人员在不同的人类细胞系中发现了一类新的lncRNAs，具有增强子样功能[21]这些lncRNA的敲除或低表达导致其相邻蛋白质编码基因的表达降低，包括细胞分化的几种主要调节因子。我们的微阵列显示了部分增强子样lncRNA(表S8). 像经典的增强子一样，lncRNAs是方向独立的，需要在其目标基因中有一个最小的启动子来增强其转录。虽然精确的分子机制尚待确定，但这组lncRNAs表明，真核生物转录受到重叠机制的严格调控。所有描述的例子都表明lncRNAs可以作为活性调节通路的部分标记物[14]更多的是，这里研究的lncRNAs应该与增强子位点产生的转录本区分开来[34],[35]其功能尚未确定。
我们还鉴定了差异表达的lncRNAs和附近的编码基因对(表S10). 据报道，某些lncRNAs的敲低或低表达可导致其邻近蛋白编码基因的表达降低，包括几个细胞分化的主调控因子，lncRNAs和邻近编码基因可能代表共同的上游调控或局部转录效应[24],[36]–[39]因此，对lncRNAs的亚群分析可能有助于我们探索lncRNA与RCCC之间的关系。大多数lncRNA在生物体的分化和发育过程中具有明显的时空特异性。一项针对1300只小鼠的lncRNA的研究表明，在脑组织的不同部位，lncRNA具有不同的表达模式[40]前列腺癌、肝癌中都有lncRNA的表达特征[41]那么在RCCC的发展过程中，可能存在不同的lncRNA表达模式，差异表达的lncRNAs可能在RCCC中执行特殊的细胞功能。先前的一项研究表明，抗肿瘤DNA拓扑异构酶I（Top1）抑制剂喜树碱（CPT）增加了人类HIF-1α基因5′（5′aHIF-1 a）和3′（3′aHIF 1α）末端两个反义lncRNA的细胞水平，他们还证明了这两个反意lncRNA分别位于5′（5'aHIF-1a）和3'aHIF 1a诱导核膜转运和对人肾癌组织中表达的部分不同应激的反应[42].
据我们所知，这是第一项通过微阵列描述RCCC中人类lncRNA表达谱的研究，与匹配的NT样本组相比，RCCC中的一组未经调控的lncRNA异常表达。可能，这些解除调控的lncRNAs作为致癌基因或抑癌基因在这种癌症的发展和/或进展中发挥着关键或部分作用。还需要更多的工作来确定这些lncRNA是否可以作为RCCC的新的治疗靶点和诊断生物标志物。
材料和方法
患者样本
所有患者均获得了书面知情同意书，该研究得到了华中科技大学同济医学院同济医院机构审查委员会的批准。63例肾透明细胞癌患者接受了肾切除术或部分肾切除术。其中6名患者用于lncRNA的微阵列分析，57名患者用于额外评估。组织病理学诊断为肾透明细胞癌。每个受试者的肾透明细胞癌和匹配的组织学正常肾组织在切除后立即在液氮中进行snap冷冻。微阵列集合中六名透明细胞癌患者的详细信息总结如下表S2.
RNA提取
组织切片中的癌细胞比例为100%，冷冻块进行RNA提取。根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从63对快速冷冻的透明细胞癌和匹配的组织学正常肾组织中提取总RNA。用纳米滴ND-1000分光光度计评估RNA完整性。
微阵列与计算分析
在去除rRNA后从总RNA中纯化的RNA被扩增，并利用随机引物法在没有3′偏置的情况下沿着转录物的整个长度转录成荧光cRNA，并且cDNA被标记并与人LncRNA阵列v2.0（8×60K，Arraystar）杂交。从RefSeq、UCSC Knowngenes、Ensembl和许多相关文献等最权威的数据库中收集的33045个LncRNAs和30215个编码转录本可以通过微阵列检测。Arraystar LncRNA阵列协议：第1步，制备RNA样品、试剂盒和试剂：TRIzol®试剂（Invitrogen life technologies）、生物粉碎机（biospec）和Mini-Bear-16（biosspec）。步骤2，总RNA清理和RNA质量控制。步骤3，准备标记反应。步骤4，纯化标记/扩增的RNA和标记的Crna QC。第5步，杂交。步骤6，微阵列清洗。步骤7，扫描。步骤8，使用安捷伦特征提取软件提取数据。更多详情见表S18。阵列由安捷伦扫描仪G2505B扫描，采集的阵列图像通过安捷伦特征提取软件（10.7.3.1版）进行分析。使用GeneSpring GX v11.5.1软件包（安捷伦科技公司）进行分位数归一化和后续数据处理。微阵列工作由中国上海康晨生物技术有限公司执行。
编码非编码基因共表达网络的构建
网络构建过程包括：（i）预处理数据：同一编码基因具有不同的转录本，以中值表示为基因表达值，无需对lncRNA表达值进行特殊处理；（ii）筛选数据：根据显示lncRNA和mRNA差异表达的列表删除数据子集；（iii）计算皮尔逊相关系数，并使用R值计算lncRNA编码基因之间PCC的相关系数；（iv）通过皮尔逊相关系数筛选，选择PCC≥0.99的部分为有意义的部分，通过细胞图绘制NCN网络。
粉红色节点表示上调lncRNA，蓝色节点表示下调lncRNA；红色节点表示上调mRNA，绿色节点表示下调mRNA。圆形节点表示mRNA，平行四边形节点表示lncRNA。实线表示正相关；虚线表示负相关。详细信息见表S15.
Q-PCR和统计方法
使用TRIzol试剂（Invitrogen Life Technologies）从冷冻肿瘤标本中提取总RNA，然后根据制造商的说明使用Fermentas RT试剂盒（Perfect Real-Time）进行反向转录。在MX3000仪器上使用SYBR Premix Ex Taq通过qPCR检测肾癌组织中LncRNAs的表达。本研究中使用的引物如下所示(表S16). 在本研究的所有患者中评估了四种显著解除管制的lncRNA（ENST00000456816、X91348、BC029135和NR_024418）。根据制造商的方案，将2µg总RNA转化为cDNA。PCR在总反应体积为25µl的条件下进行，包括10µl SYBR Premix Ex Taq（2x）、1µl PCR正向引物（10µM）、1¦µl PCR反向引物（10uM）、0.5µl ROX参考染料II（50x）*3、2µl cDNA、8µl双蒸馏水。定量实时PCR反应设置在95°C下10分钟的初始变性步骤；以及95°C（5秒）、63°C（30秒）、72°C（30s），共40个循环，最后一次延长步骤为72°C，持续5min。所有实验均一式三份。所有样品归一化为GAPDH。每三份样品的中位数用于计算lncRNAs的相对浓度（ΔCt=Ct中位数lncRNAs-Ct中位数GAPDH）。使用2-ΔΔCt方法计算表达倍数变化[41]使用SPSS（16.0版SPSS Inc.）中的Student t检验分析癌症和对照组之间的lncRNAs表达差异。p＜0.05的值被认为具有统计学意义。
致谢
我们感谢所有参与本项目的捐赠者，感谢所有为同济泌尿组织医院、同济医学院、华中科技大学的建设做出贡献的同事，感谢所有致力于上海康晨生物技术公司微阵列服务的人们。
作者贡献
构思和设计实验：H.Xu JL XZ ZY。执行实验：GY WY JW XM WX HL。分析数据：DX YY KD H.Xiao。贡献的试剂/材料/分析工具：XG WG ZH。手稿撰写人：H.Xu GY WY JW。序列分析：BW YB。
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