摘要
胰腺癌患者的生存率极低，因为其无症状进展到晚期和转移阶段，而目前的治疗方法大多无效。因此，需要新的治疗药物和治疗方法来改善临床结果。在本研究中，我们测定了和厚朴酚的作用，和厚朴醇是一种东方草药的生物活性成分厚朴/广玉兰在两种胰腺癌细胞系MiaPaCa和Panc1上，单独使用并与标准化疗药物吉西他滨联合使用。厚朴酚对两种胰腺癌细胞系均产生生长抑制作用，导致细胞周期停滞于G1细胞凋亡的分期和诱导。在分子水平上，和厚朴酚显著降低了细胞周期蛋白（D1和E）和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk2和Cdk4）的表达，并导致Cdk抑制剂p21和p27的增加。此外，和厚朴酚治疗导致Bax/Bcl-2和Bax/Bcl-xL比率增加，有利于胰腺癌细胞的凋亡。这些变化伴随着NF-κB细胞质积累的增强，同时核分数也随之降低，NFκB应答启动子的转录活性降低。这与κBα抑制剂（IκB-α）磷酸化降低相关，导致其稳定，从而增加细胞水平。重要的是，和厚朴酚还通过限制吉西他滨诱导的NF-κB在治疗胰腺癌细胞系中的核累积，部分增强了吉西他宾的细胞毒性作用。总之，这些发现首次证明和厚朴酚对胰腺癌的生长抑制作用，并表明其作为一种新型天然药物在预防和治疗中的潜在用途。
引用：Arora S、Bhardwaj A、Srivastava SK、Singh S、McClellan S、Wang B等（2011），厚朴酚抑制细胞周期，诱导细胞凋亡，增强吉西他滨对人胰腺癌细胞的细胞毒性作用。公共科学图书馆综合版6（6）：e21573。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0021573
编辑：Dhyan Chandra，美国罗斯威尔公园癌症研究所
收到：2011年5月11日；认可的：2011年6月2日；出版：2011年6月24日
版权所有：©2011 Arora等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作者和来源得到了认可。
基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）（CA137513）和USAMCI的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
介绍
胰腺癌是美国最致命的恶性肿瘤之一，死亡率逐年上升[1],[2]根据美国癌症协会的估计，2010年，43140名美国人被诊断患有胰腺癌，36800人死亡，这标志着这种恶性肿瘤是导致癌症死亡的第四大原因[2]由于无症状进展，胰腺癌在已经转移或局部进展的阶段被诊断[3]。针对晚期疾病的治疗方法基本上失败了，大约80%以上被诊断患有这种恶性肿瘤的患者仍会在2-8个月内死亡[4]据报道，经FDA批准用于胰腺癌治疗的标准药物吉西他滨的疗效最低，仅能将患者的存活率提高几周[3],[5]因此，开发替代治疗方案和策略对胰腺癌的有效治疗至关重要。
已经在胰腺癌中测试了几种新的策略，这些策略仅针对促生长途径并与吉西他滨联合使用，以提高治疗效果[6]此外，最近的几项研究已经确定了放松调控的信号元件，如Ras、Akt、NF-κB、miRNAs等，它们不仅促进癌症进展，而且在胰腺癌中赋予化疗耐药性[7]–[9]这些生存途径的诱导源于激活基因突变、抑制途径丢失和/或通过自分泌和旁分泌信号机制增强[3],[10]事实上，现在已经证明，靶向某些信号转导节点可以有效抑制肿瘤生长和进展，并恢复肿瘤细胞对细胞毒药物的敏感性[3],[9],[10]。
在过去几十年里，天然产物一直是癌症化疗的核心，事实上，目前超过60%的抗癌药物都来自天然来源[11]在最近的几项研究中，已确定新型植物衍生化合物通过调节生物途径发挥抗肿瘤药物的作用[12]和厚朴酚，一种生物活性双酚化合物，从厚朴/广玉兰，由于其强大的抗肿瘤和抗血管生成特性，受到了广泛关注[13],[14]它已经产生了对抗皮肤癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌的有希望的数据[13],[15]–[17]和厚朴酚作为一种抗肿瘤药物的显著特点是其抑制核因子κB（NF-κB[9],[10],[18]NF-κB在包括胰腺癌在内的多种血液和实体恶性肿瘤中构成性激活，并通过直接和间接机制控制参与细胞增殖和生存的一系列基因的表达[18]–[20]在本研究中，我们首次检测了和厚朴酚对胰腺癌的作用。我们的数据表明，和厚朴酚通过引起细胞周期阻滞和诱导凋亡来抑制人类胰腺癌细胞系MiaPaCa和Panc1的生长。此外，我们的研究为和厚朴酚在胰腺癌细胞对吉西他滨的细胞毒性作用的化学增敏中的作用提供了证据。
结果
和厚朴酚对人胰腺癌细胞的生长抑制作用
以人胰腺癌细胞系MiaPaCa和Panc1为模型系统，研究和厚朴酚对胰腺癌细胞生长的影响。与载体（DMSO）处理的细胞相比，和厚朴酚处理的细胞（10-60µM）显示出形态学变化。随着和厚朴酚浓度的增加，细胞变圆、萎缩并从基质上脱落(图1A)与凋亡相关的形态学变化一致。随后，我们使用WST-1分析法测量存活率，从而量化和厚朴酚的细胞毒性作用。我们的数据表明和厚朴酚诱导了IC胰腺癌细胞株生长的剂量和时间依赖性下降50处理24、48和72小时后，分别为～43.25、31.08和18.54µM（针对MiaPaCa）和～47.44、34.17和21.86µM(图1B). 总之，这些发现表明和厚朴酚对胰腺癌细胞具有生长抑制作用。
厚朴酚导致G1胰腺癌细胞的细胞周期阻滞及诱导凋亡
抑制癌细胞生长可能是由细胞周期进程停滞或诱导凋亡引起的，或两者兼而有之[12]我们关于细胞周期分布的数据表明，和厚朴酚治疗导致胰腺癌细胞在G1S期细胞数量减少（增殖分数）(图2). 在20、40和60µM和厚朴酚剂量下，我们观察到S期细胞数量分别减少了约1.28、2.16和2.46倍（在MiaPaCa）和约1.08、1.53和1.93倍（在Panc1）(图2). 在凋亡检测中，我们的数据显示，和厚朴酚治疗24小时后，凋亡指数（PE Annexin V阳性/7AAD阴性细胞）显著增加，且呈剂量依赖性(图3). 在20、40和60µM和厚朴酚浓度下，我们观察到MiaPaCa细胞的凋亡指数增加了约1.25、2.04和3.96倍，Panc1细胞的凋亡指标分别增加了约1.34、1.98和3.32倍。总之，我们的研究结果表明，和厚朴酚对胰腺癌细胞具有细胞抑制和细胞毒性特性。
厚朴酚改变细胞周期和生存相关蛋白的表达
为了研究和厚朴酚的生长抑制作用的机制基础，我们接下来研究了它对参与细胞增殖和存活的关键蛋白表达的影响。我们的数据显示，细胞周期蛋白（D1和E）和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk2和Cdk4）的表达呈剂量依赖性下降；而和厚朴酚治疗后，在MiaPaCa和Panc1胰腺癌细胞中均观察到细胞周期素依赖性激酶抑制剂（p21和p27）的诱导表达(图4). 在存活蛋白中，我们观察到抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的水平呈剂量依赖性降低，而促凋亡蛋白Bax的水平则随之升高(图5A)导致Bax/Bcl-2比率增加(图5B，上部面板）和Bax/Bcl-xL(图5B，下部面板）。这些发现表明和厚朴酚改变了参与细胞周期和凋亡调节的蛋白质的表达，从而赋予其生长抑制作用。
厚朴酚减弱人胰腺癌细胞NF-κB的组成性激活
NF-κB在包括胰腺癌在内的多种癌症中具有组成性活性[18]–[20]已经证明，激活这个信号节点有助于细胞周期的进展[21]和凋亡抵抗[22]因此，我们研究了和厚朴酚治疗胰腺癌细胞是否对胰腺癌细胞NF-κB活化有影响。我们首先在荧光素酶报告试验中检测和厚朴酚对NF-κB应答启动子转录活性的影响。我们的数据表明，在20、40和60µM和厚朴酚治疗下，NF-κB转录活性分别呈剂量依赖性降低（MiaPaCa的约1.40、2.08和4.0倍，Panc1细胞的约1.29、1.96和5.26倍）(图6A). 为了进一步支持这一观察，我们接下来研究了NF-κB的细胞定位（细胞质与细胞核）p65亚单位。我们的免疫印迹数据表明，和厚朴酚治疗导致MiaPaCa和Panc1胰腺癌细胞核组分中NF-κB水平显著且呈剂量依赖性降低，同时细胞质组分增加(图6B). NF-κB的细胞分布受其生物抑制剂IκB相对表达的控制，该生物抑制剂使NFκB在细胞质中被隔离在一个非活性复合物中[23]因此，我们分析了和厚朴酚处理的胰腺癌细胞的细胞质提取物，以测定IκB-α水平。我们的数据显示和厚朴酚治疗后IκB-α水平呈剂量依赖性增加(图6B). 这与IκB-α磷酸化的伴随降低有关，表明暴露于和厚朴酚后IκB-α的稳定性增加。总之，我们的数据表明，和厚朴酚抑制胰腺癌细胞中NF-κB的组成型激活。
厚朴酚化学增敏胰腺癌细胞对吉西他滨的毒性
吉西他滨是FDA批准的唯一抗胰腺癌化疗药物；然而，由于化疗耐药，其疗效仍然很低[3],[5],[10]由于NF-κB的激活被认为是增强化疗耐药性的机制之一，我们检测和厚朴酚是否会在胰腺癌细胞中起到化疗增敏剂的作用。用吉西他滨单独或与亚IC联合治疗胰腺癌细胞（MiaPaCa和Panc1）50用细胞活力测定法检测和厚朴酚的浓度及其对生长抑制的影响。我们的数据表明，吉西他滨以剂量依赖性的方式抑制胰腺癌细胞的生长，与和厚朴酚联合治疗可显著降低IC50吉西他滨(图7A). 在10和20µM剂量和厚朴酚下，IC分别下降了约1.53和2.41倍（在MiaPaCa）和约1.40和2.08倍（在Panc1）50吉西他滨表明和厚朴酚的化学增敏作用(图7A). 为了确定NF-κB的作用，我们检测了其在吉西他滨（单独或与和厚朴酚联合）治疗的胰腺癌细胞中的细胞定位。我们的数据显示，在MiaPaCa和Panc1细胞中，随着吉西他滨剂量的增加，NF-κB在核室中的积累增加，细胞质分数随之降低(图7B). 值得注意的是，我们观察到和厚朴酚（即使是20µM剂量）在抑制吉西他滨诱导的MiaPaCa和Panc1细胞中NF-κB的激活方面是有效的(图7C). 这些发现清楚地表明和厚朴酚通过在胰腺癌细胞中充当化学增敏剂来增强吉西他滨的抗肿瘤疗效。
讨论
由于缺乏有效的治疗方法，胰腺癌仍然是一种毁灭性的恶性肿瘤[3]本研究表明，和厚朴酚（一种天然双酚化合物）由于其细胞抑制和细胞毒特性，可有效抑制人类胰腺癌细胞（MiaPaCa和Panc1）的生长。此外，我们的研究为和厚朴酚在使胰腺癌细胞对吉西他滨毒性产生化学增敏作用中的作用提供了证据。厚朴酚抑制NF-κB活性，导致许多细胞周期和生存相关蛋白的表达改变，从而在胰腺癌细胞中产生生长抑制和化学增敏作用。
癌细胞生长失控通常归因于增殖和凋亡途径的失控[24]事实上，分子研究表明，在多种人类癌症中，与细胞生存相关的细胞周期调节因子和蛋白质的表达经常发生改变[25]–[27]细胞周期由细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdks）和Cdks抑制剂的协同作用调节[26],[28]我们观察到用和厚朴酚治疗胰腺癌细胞导致G1-细胞周期进展的阶段性阻滞，以及细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、Cdk2和Cdk4的减少，以及蛋白质水平上p21和p27的增加。细胞周期蛋白D1及其催化伙伴Cdk4在G中占主导地位1然而，细胞周期蛋白E和Cdk2复合物从G调节细胞周期进展1至S[26],[28]因此，我们的研究结果表明和厚朴酚诱导的G1细胞周期相可能通过细胞周期蛋白和Cdks的下调以及p21和p27蛋白的上调来介导，这些蛋白与G形成异源三聚体复合物1-S Cdks和细胞周期素抑制其活性[29]这些结果与之前关于和厚朴酚对人类淋巴白血病、鳞状肺癌和乳腺癌细胞的作用的研究一致[16],[17],[30]。
跟随G1-细胞周期停滞时，细胞可能会进行修复或进入凋亡途径，以保持细胞完整性并消除错误/突变的癌前细胞和肿瘤细胞[31]因此，诱导凋亡是防止癌症发生和发展的保护机制之一，癌细胞往往对凋亡产生抵抗[24]在本研究中，我们观察到和厚朴酚处理的胰腺癌细胞显著诱导凋亡，表明和厚朴醇能够增强凋亡机制。细胞存活是通过前凋亡蛋白（如Bad和Bax）和抗凋亡蛋白（例如Bcl-2和Bcl-xL）的比例的精细平衡来维持的，这些蛋白通过释放半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶来控制凋亡过程[32],[33]因此，和厚朴酚治疗胰腺癌细胞时观察到的Bcl-2家族蛋白的表达改变，有利于Bax/Bcl-2和Bax/Bcl-xL比率的增加，这可能是和厚朴醇观察到的凋亡作用的基础。据报道，和厚朴酚治疗后软骨肉瘤细胞中的凋亡相关蛋白被解除调控，进一步支持其在诱导凋亡中的作用[34]。
我们还观察到和厚朴酚治疗后NF-κB活性受到抑制，这与抑制IκB-α磷酸化及其表达增加有关。转录因子NF-κB在多种恶性肿瘤中被组成性激活，并已被报道与胰腺癌病理学有关[18]–[20]最近的研究表明，和厚朴酚对前列腺癌和结肠癌的生长抑制作用是通过抑制NF-κB介导的[35]NF-κB转录因子由由Rel（p65、c-Rel和RelB）、p52和p50蛋白组成的异二聚体组成，并以非活性形式定位于细胞质中，与IκB（NFκB抑制剂，由α和β亚单位组成，掩盖其核定位信号[36]当IκB-α被IKK（抑制剂激酶）复合物磷酸化，导致其泛素化和降解时，NF-κB被激活。这导致NFκB从细胞质释放并转运到细胞核，随后NF-κB应答启动子激活。已知NF-κB可诱导细胞周期蛋白D1、Bcl-2和Bcl-xL（在当前研究中，和厚朴酚治疗后发生改变）的表达，以及一系列与细胞增殖和存活有关的蛋白质[37],[38]因此，可以认为和厚朴酚对胰腺癌细胞的生长抑制是通过抑制NF-κB介导的。
由于胰腺癌在诊断时处于晚期和转移状态，并且由于化疗耐药，允许的药物治疗无效，胰腺癌的临床结果仍然很差[3],[5],[10]目前，吉西他滨是治疗胰腺癌的国家标准化疗药物。吉西他滨干预DNA合成最终导致细胞周期阻滞和凋亡[39],[40]限制吉西他滨疗效的机制之一是诱导NF-κB活化以应对其治疗[41]，这可能导致细胞凋亡延迟或抑制。在这项研究中，我们已经显示了和厚朴酚对胰腺癌细胞对吉西他滨毒性的化学增敏作用。此外，我们发现吉西他滨治疗可诱导核因子-κB的核积累，与和厚朴酚联合治疗可有效抑制核因子-кB的积累。这些平行的发现表明，抑制NF-κB活性也可能介导和厚朴酚对胰腺癌细胞的化学增敏作用。事实上，早先有报道称，化疗药物的抗癌作用可以通过抑制NF-κB活性而增强[22],[41]。
总之，我们首次显示和厚朴酚对胰腺癌的生长抑制和化学增敏潜力。厚朴酚导致G1通过改变细胞周期和生存相关蛋白的表达，实现细胞周期阻滞和诱导凋亡。抑制NF-κB可能是和厚朴酚诱导胰腺癌细胞生长抑制和化疗增敏作用的重要机制之一。因此，我们认为和厚朴酚可能是治疗胰腺癌的一种有希望的新型天然药物，也可能作为一种化学增敏剂来提高吉西他滨的治疗效果，吉西他宾已经作为一种治疗药物在临床上使用。
材料和方法
试剂
Dulbecco改良的Eagle’s培养基（DMEM）和罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI-1640）培养基来自Thermo Scientific（Logan，UT）。胎牛血清（FBS）来自亚特兰大生物制品公司（佐治亚州劳伦斯维尔）。青霉素、链霉素和胰蛋白酶-EDTA购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。檀香酚是从LKT实验室（明尼苏达州圣保罗）采购的。吉西他滨由USAMCI药房提供。FuGENE转染试剂、磷酸酶/蛋白酶抑制剂混合物和细胞增殖试剂WST-1购自Roche Diagnostics（德国曼海姆）。碘化丙啶/RNA酶染色缓冲液和PE Annexin V凋亡检测试剂盒购自BD Bioscience（加州圣地亚哥）。核提取试剂盒购自Active Motif，LLC（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。抗Bcl-2、Bax和p-IκB-α（Ser32/36）（兔多克隆）、Bcl-xl和NF-κB/p65（兔单克隆）以及IκB-α（小鼠单克隆）的抗体从Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）获得。抗p21、Cdk4（小鼠单克隆）、p27、细胞周期蛋白D1、细胞周期素E、Cdk2（兔多克隆）和辣根过氧化物酶结合二级抗体的抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）。β-肌动蛋白（小鼠单克隆）抗体购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。ECL plus western印迹检测试剂盒购自Thermo Scientific。pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]质粒、pRL-TK质粒和双荧光素酶检测系统试剂盒来自Promega（威斯康星州麦迪逊）。
细胞培养和治疗
人胰腺细胞系MiaPaCa和Panc1（ATCC，Manassas，VA）分别在RPMI-1640和DMEM中作为粘附单层维持培养，并补充10%（v/v）FBS、青霉素（100单位/mL）和链霉素（100µg/mL）。细胞保持在5%的CO中237°C下的增湿培养箱。每3天更换一次培养基，当细胞达到80%的汇合时，将细胞按1∶3进行分裂。对于治疗，在二甲基亚砜中制备和厚朴酚储备溶液（10 mmol/L），储存在−20°C下，并在使用前立即用新鲜的完全培养基稀释。用不同浓度的和厚朴酚单独、吉西他滨单独或联合处理细胞（如图图例所示）。向对照组中添加等量的二甲基亚砜（最终浓度，<0.1%）。
细胞生长测定
细胞接种在96孔板（1×104细胞/孔）。24–72小时后，根据制造商的说明，使用WST-1（4-[3-（4-碘苯基）-2-（4-硝基苯基）-2H-5-四唑基]-1,3-苯二磺酸盐）检测试剂盒和适当的对照，检测处理细胞中的细胞活力。该测定基于代谢活性细胞中WST-1的裂解以形成水溶性甲赞。使用Bio-Rad Benchmark微孔板阅读器（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad Laboratories），在450 nm的波长下测量甲赞的吸光度，在630 nm处进行背景减法。生长计算为生存率百分比=[（A/B）×100]，其中A和B分别是处理细胞和对照细胞的吸光度。
细胞周期分析
用碘化丙啶（PI）染色后通过流式细胞术测定和厚朴酚治疗对细胞周期进展的影响。简而言之，细胞（1×106细胞/孔）接种在6孔板中，并在无血清培养基中进行同步培养。48小时后，用含有所需浓度和厚朴酚或二甲基亚砜的完整培养基替换培养基。处理24小时后收集漂浮细胞和附着细胞，并在4°C的70%乙醇中固定过夜。然后用碘化丙啶在37°C下使用PI/RNase染色缓冲液对细胞染色1h。在BD-FACS Canto™II（加利福尼亚州圣何塞Becton-Dickinson）上通过流式细胞仪对染色细胞进行分析，以使用Mod-Fit LT软件（马萨诸塞州托普沙姆Verity software House）计算细胞周期不同阶段的细胞数百分比。
细胞凋亡分析
接种MiaPaCa和Panc1细胞（1×106细胞/孔）。过夜培养后，用对照载体（DMSO）或不同浓度的和厚朴酚处理细胞24小时。处理后，收集细胞，并使用PE Annexin V凋亡检测试剂盒I，用7-氨基-放线菌素（7-AAD）和PE Annessin V对细胞进行染色，然后进行流式细胞术。使用Mod-Fit LT软件计算细胞凋亡中的细胞数百分比。
核和细胞质分馏
使用核提取物试剂盒制备细胞质和核提取物。简言之，用1mL冰镇PBS/磷酸酶抑制剂处理后清洗细胞，在500µL低渗缓冲液中溶解，然后在4°C下14000 g离心30 s。收集上清液（细胞质部分）后，将颗粒重新悬浮在50µL完全溶解缓冲液中，并在14000 g下在4°C下离心10 min，上清（核部分）存储在−80°C下。
蛋白质印迹分析
如前所述，对细胞进行蛋白质提取和蛋白质印迹处理[10]免疫检测采用特异性抗体：Bcl-2、Bcl-xL、Bax、NF-κB/p65、p-IκB-α（Ser32/36）、IκB-α（1∶1000）、Cdk2、Cdk4、Cyclin D1、Cyclin E、p21、p27（1∶200）和β-肌动蛋白（1∶20000）。所有二级抗体均按1∶2500稀释液使用。用ECL plus Western印迹检测试剂盒处理印迹，用LAS-3000图像分析仪检测信号（日本东京富士照片胶片公司）。使用AlphaImager（加州圣莱安德罗Alpha Innotech公司）进行密度测定。
NF-κB转录活性测定
为了测量NF-κB转录活性，将胰腺癌细胞接种（0.5×106细胞/孔）。在60%的汇合水平后，将1µg NF-κB-荧光素酶启动子报告体构建物（pGL4.32[luc2P/NF-κ）B-RE/Hygro]）和0.5µg对照报告质粒（pRL-TK）瞬时转染细胞，该对照报告质粒包含TK启动子下游的肾形肾盂肾小球荧光素酶基因。根据制造商的建议，使用FuGENE作为转染试剂进行转染。转染后24小时，细胞用和厚朴酚处理24小时，用冷PBS清洗，并在报告人裂解缓冲液中收获。使用双荧光素酶测定系统测量荧光素酶活性。所有实验一式三份进行，相对荧光素酶活性报告为转染效率标准化后的倍数诱导。
统计分析
所有实验均独立进行了至少三次。使用R统计软件对数据进行logistic回归模型拟合，以计算IC50.所得数据表示为“平均值±标准偏差”。在适当的情况下，这些数据还接受了非配对双尾Student t检验。p<0.05的值被认为是显著的。
作者贡献
构思并设计了实验：SA APS。执行实验：AB SKS SS SM。分析数据：SA AB BW APS。论文撰写人：SA AB APS。
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