摘要
背景
闭塞性细支气管炎（BO）是一种发生在多种临床环境中的纤维化肺部疾病，包括毒素暴露、自身免疫和肺或骨髓移植。尽管其临床重要性日益增加，但由于缺乏足够的小动物BO模型，对其潜在的疾病机制知之甚少。最近的流行病学研究表明，接触二乙酰（DA）是人造黄油调味料中的一种挥发性成分，是健康工厂工人出现BO的原因之一。我们的总体假设是DA会导致严重的上皮损伤和异常修复，从而导致BO的发生。因此，本研究的目的是1）确定DA是否通过气管内滴注（ITI），将导致大鼠BO的发展，以及2）表征DA ITI后的上皮再生和基质修复。
方法和主要结果
雄性Sprague-Dawley大鼠接受ITI单剂量DA（125 mg/kg）或无菌水（载体对照）治疗。灌注DA导致气道特异性损伤，随后出现快速上皮再生和BO的广泛腔内气道纤维化特征。气道阻力和肺液中性粒细胞增多随着BO的发展而发生，与人类疾病相似。尽管DA治疗后上皮细胞迅速再生，但正常表型标记物、Clara细胞分泌蛋白和乙酰化微管蛋白的表达却减少。相反，基质成分Tenascin C的表达显著增加，尤其是在BO病变中。
结论
我们已经确定DA的ITI导致BO，创建了一种新的化学诱导动物模型，该模型复制了人类疾病的组织学、生物学和生理学特征。此外，我们证明BO中存在上皮修复失调和基质肌肽C过度沉积，为潜在的疾病机制和治疗靶点提供了新的见解。
引文：Palmer SM、Flake GP、Kelly FL、Zhang HL、Nugent JL、Kirby PJ等（2011年）。大鼠注射双乙酰后出现严重气道上皮损伤、异常修复和闭塞性细支气管炎。公共科学图书馆综合版6（3）：e17644。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017644
编辑：雅克·齐默（Jacques Zimmer），卢森堡圣母公共中心（CRP-Santé）
收到：2010年11月5日；认可的：2011年2月9日；出版：2011年3月25日
这是一篇根据知识共享公共领域声明条款发布的开放存取文章，该声明规定，一旦将本作品置于公共领域，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传播、修改、构建或以其他方式使用本作品。
基金：这项研究由美国国立卫生研究院通过向美国国家环境健康科学研究院（NIEHS）的DLM和国家心肺血液研究所的SMP提供的校内研究拨款资助（拨款HL91140-01）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
介绍
闭塞性细支气管炎（BO）是一种以小气道狭窄和闭塞为特征的纤维化肺部疾病。[1]BO最常见于肺或骨髓移植，但也曾被描述为职业接触反应性挥发性化学品。[2]一旦发生BO，患者会出现不可逆的气流阻塞，根据临床情况，可能会发展为呼吸衰竭。BO与隐源性机化性肺炎不同，后者涉及肺泡内和腔内气道纤维化，常发生在感染后，经治疗后常有所改善。由于在肺或骨髓移植过程中难以确定组织学BO，因此，术语闭塞性细支气管炎综合征（BOS）已被开发用于根据无其他病因的肺功能下降来确定假定BO的患者。[3],[4]尽管BO具有临床重要性，但其发病机制尚不清楚，也没有有效的治疗方法来逆转气道纤维化。BO缺乏干预和治疗策略，部分原因是用于研究疾病发展的动物模型有限。我们研究的总体目标是开发一种相关的BO啮齿动物模型，以进一步研究疾病机制。
二乙酰（DA）是人造黄油调味料的主要挥发性成分，与微波爆米花中工人气流阻塞和BO的发生有关，[5],[6],[7]调味品[8]和二乙酰制造业[9]与这些临床报告一致，大鼠急性吸入DA可引起鼻腔和上呼吸道上皮的炎症和坏死[10]类似地，我们发现亚急性或反复吸入DA会导致小鼠鼻腔炎症和坏死[11]虽然肺症状在接触DA-的工人中占主导地位，但在DA-接触的大鼠和小鼠中，鼻腔是组织损伤最严重的部位[5],[10],[11]有趣的是，这两种啮齿动物吸入模型均未出现BO样损伤。由于啮齿动物与人类不同，是专性鼻呼吸动物，我们认为吸入会导致DA在鼻腔中的广泛吸收和反应，从而阻止DA进入远端气道。事实上，用DA蒸汽对大鼠进行的吸入剂量测定和计算模型研究表明，大鼠的鼻和气管损伤可能预示着口呼吸人类的肺内损伤。[12]
鉴于上述结果，我们假设通过气管内滴注DA（ITI）绕过鼻腔会导致大鼠出现BO。尽管博来霉素等化学物质的ITI是一种非生理性暴露途径，但已被证明是研究呼吸道毒性导致纤维化机制的一种非常有用的策略[13]为了验证这一假设，我们评估了组织学、生物学和生理学指标，并证明了DA作为相关BO模型的实用性。此外，我们假设DA的ITI会导致严重的上皮损伤和异常修复，从而导致BO的发生。为了验证这一假设，我们描述了从DA暴露到BO发生期间气道上皮细胞和基质成分的连续时间变化。使用这种方法，我们已经确定，在DA诱导的BO中发生异常上皮和基质修复。
材料和方法
道德声明
所有科学数据都是按照高技术、科学和道德标准执行的。所有脊椎动物的使用都得到了美国国家卫生研究院动物护理和使用委员会（ACUC）的批准，NIEHS保证编号为A4149-1。遵循NIH指南，确保动物数量和动物护理适当，并采取必要措施限制动物不适、痛苦、疼痛和受伤。安乐死方法和选择理由符合美国安乐死协会《安乐死指南》。兽医护理由训练有素、经验丰富的工作人员提供。
化学制品
DA（2,3-丁二酮），CAS号431-03-8，从美国威斯康星州密尔沃基市福禄卡化学公司购买，单批号1131562。纯度≥99.0%。Bradford试剂（CN 23208）购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。LDH试剂盒（CN-L7572）购自Pointe Scientific（密歇根州坎顿）。
动物
雄性Sprague-Dawley大鼠（295-305克体重）取自Charles River（北卡罗来纳州罗利）。在5-10天的适应期内，对大鼠称重并随机分为治疗组。动物被单独饲养，并提供NIH-31食物和水随意动物室以12小时的明暗循环（0700至1900小时的光照）维持。在治疗前一天和治疗后1、3和7天记录体重。在治疗后的第1、3和7天，对各组动物称重并实施安乐死（戊巴比妥，60 mg/kg ip和气胸），进行终点分析，如下节所述。
气管内灌注
在研究第1天测定的平均体重用于剂量计算。在给药当天早上，使用无菌蒸馏水作为载体，在通风罩中制备DA（188 mg/ml）。在研究第0天，对动物进行轻度麻醉（异氟烷），然后气管内滴注DA（125 mg/kg）或作为对照的载体。所有动物的滴注量（200µl）相同。
肺功能评估
在DA（n=8）或载剂（n=4）治疗7天后，使用FlexiVent机械呼吸机和数据采集系统（SCIREQ，蒙特利尔，PQ，加拿大）对部分大鼠的肺功能进行侵入性测量。将大鼠麻醉（戊巴比妥，60 mg/kg ip），插入气管插管，然后用溴化潘库溴铵（0.82 mg/kg，ip）麻痹。将压差传感器连接到气管插管上，并以90次呼吸/分钟的速度维持通气，潮气量为～8 ml/kg，呼气末正压为～3 cm水。在开始肺力学测量之前，对每只大鼠进行三次总肺容量（TLC）操作，以防止肺不张，并最大限度地增加气道和肺泡的募集，然后每只动物共进行9次循环。对每只动物在每个周期后获得的总阻力（R）、动态顺应性（C）和静态顺应性（Cst）的值进行平均，然后在每个实验组中对这些值进行平均。
尸检
在治疗后1、3和7天，对动物（n=6-9/组）实施安乐死（Nembutal，60 mg/kg ip，肺气肿）并切除肺部整体结扎右支气管，取下右下叶（尾叶）和副叶，置于冷RNAlater（Ambion，Austin，TX）中，然后在4°C下保存，直到提取RNA。然后用OCT（50%OCT，50%0.9%生理盐水）对左肺进行充气。将左肺切片置于含有OCT的冷冻模具中，置于干冰上并冷冻以进行免疫荧光显微镜检查。左肺剩余部分用10%中性缓冲福尔马林固定。剩余的右上（颅）叶和中肺叶用10%中性缓冲福尔马林充气，支气管结扎，肺叶浸在福尔马林中。在福尔马林中放置24小时后，将右肺叶和左肺段转移到70%乙醇中并冷藏，直到进行光学显微镜检查。
支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数
亚组大鼠（n=6）在用DA或溶媒治疗后1、3和7天被安乐死，并用10 ml冷钙灌洗肺3次++，镁++-游离Hanks平衡盐溶液（BSS）。BALF样品在4°C下离心500×g 10分钟。合并来自3个BALF样品的细胞颗粒，并以电子方式测定BAL细胞/大鼠的总数（Coulter ZB，Coulter Electronics，Inc.，Marietta，GA）。细胞差异由染色胞浆制剂的人工细胞计数确定。
组织病理学
在10%中性缓冲福尔马林中固定，然后用70%乙醇固定后，对右肺和左肺的切片进行常规处理，用石蜡包埋，5µm连续切片，并用苏木精伊红（H&E）和马森三色染色。通过将透镜物镜（10–40倍）乘以光电倍增管（10倍）的放大倍数来估算图像的放大倍数，以提供总放大倍数。为了评估细胞增殖，在安乐死前4小时，对动物亚组（n=12）进行50 mg/kg（0.5 ml ip）溴脱氧尿苷（BrdU）的脉冲给药。每个盒中都有十二指肠切片，以确认BrdU的全身给药。
BO的存在定义为气道内息肉样纤维化或气道壁内同心性纤维化导致的气道阻塞。为了确定DA治疗组和对照组动物的BO程度，在第3天（9只/组）和第7天（DA组9只，对照组6只）评估支气管和支气管纤维化病变的发生率。支气管和细支气管纤维化由经验丰富的肺病理学家以半定量方式分级。管腔内或壁内支气管和细支气管纤维化的命名基于病变的主要位置（例如主要位于管腔内，或主要位于气道壁内），评分如下：1-5个病灶=1+，6-10个病灶=2+，11-15个病灶=3+，>15个病灶=4+。该评分仅反映支气管或细支气管纤维化，而不反映肺泡导管、肺泡腔或肺泡壁的纤维化。尽管右肺和左肺的所有肺叶已经在不同的实验中进行了检查并且已经包含BO病变，由于剩余的肺组织用于荧光染色或RNA分析，因此本研究中的纤维化评分仅基于左肺和右肺上中叶的代表性切片。
免疫荧光
尸检时将肺切片冷冻（左侧）或福尔马林固定（右侧和左侧）。冷冻组织在−80°C下保存，直到在6µm下冷冻切片。切片在−80°C下保存，直至染色。福尔马林固定石蜡包埋组织在5µm处连续切片，玻片在室温下保存，直至染色。
主要抗体：兔抗大鼠Clara细胞分泌蛋白（CCSP）抗体（1∶20000；来自Barry Stripp）、小鼠IgG2b抗乙酰化微管蛋白（AcT）抗体（1:24000，Sigma，St Louis，MO）、鼠IgG2a抗平滑肌肌动蛋白（SMA）抗体，和兔抗人Tenascin-C抗体（1∶200，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）。二级抗体：Alexa Fluor 594驴抗兔IgG、Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG2b、Alexa-Fluor 488Goat抗鼠Ig G2a和Alexa-Fuor 488/594山羊抗鼠I gG1（1∶500，Invitrogen，Carlsbad，CA）。取枸橼酸盐缓冲液后，用5%牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲液（PBS）中封闭切片，以检测非特异性抗原反应性。在封闭溶液中稀释初级和次级抗体，并分别在4°C或室温下培养过夜90分钟。在PBS中广泛洗涤载玻片，并在Fluoromont G安装介质（Southern Biotech，Birmingham，AL）中用DAPI（Sigma，St Louis，MO）盖玻片。使用配备数码相机的奥林巴斯Provis AX70显微镜（宾夕法尼亚州中央谷）获取图像，并使用Image-Pro Plus（马里兰州银泉市媒体控制学）进行处理。
全肺转录物表达
在不同时间点的每次分析代表治疗组与对照组中至少6只单独的动物。为了进行转录分析，将右肺尾叶和副叶放入RNAlater™。使用RNAqueous-4PCR试剂盒（德克萨斯州奥斯汀Ambion）进行RNA分离，并使用分光光度计（260/280）进行定量（NanoDrop产品，德国威明顿）。质量由Bio-Rad Experion生物分析仪（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad）进行评估。使用高效逆转录试剂盒（加利福尼亚州福斯特市ABI）将RNA逆转录成cDNA。使用经验证的Taqman探针和引物组合（加利福尼亚州福斯特市ABI），在每次Taqman实时PCR检测中使用40 ng cDNA评估感兴趣基因的转录物（Clara Cell Secretory蛋白、表面活性蛋白C、胶原蛋白1alpha-1和Tenascin C）；每项试验均一式三份。循环条件为：95°C 10分钟，40次95°C循环15秒，60°C循环1分钟。使用Fam标记的靶探针和VIC标记的内源性探针，对靶转录物和内源性转录物（βactin）进行多重RT-PCR。使用ABI 7500实时PCR系统（ABI，Foster City，CA）和SDS软件版本1.3.1测定Ct值。通过比较DA dCt值和当天水dCt的值来确定折叠变化，并使用2-ΔΔCt方法。[14]
统计分析
BAL液细胞计数的变化通过单因素方差分析和Tukey多重比较试验确定。为了分析支气管和细支气管纤维化评分和肺功能参数（R、C和Cst），采用了非配对Student t检验。为了分析转录数据，使用非参数t检验比较两个独立组平均值之间的差异。所有这些分析都是使用PrismGraphPad 5进行的。小于0.05的P值被认为具有统计学意义。
结果
DA治疗动物出现BO特征的组织病理学变化
所有经DA治疗的啮齿动物，但没有一个对照，都出现了支气管和细支气管纤维化病变。这些气道纤维化灶存在于主支气管、支气管分支和细支气管。在多次实验中检查所有肺叶时，左肺、右下叶和副叶的病变数量多于右上叶和中叶。如所示表1使用反映支气管和细支气管病变程度的半定量评分系统，在所有接受DA治疗的第7天啮齿类动物中，BO持续发展，但在媒介物治疗的动物中没有，并且在DA治疗后第3天至第7天，BO的严重程度增加（接受DA治疗的啮齿类动物与媒介物对照组在第7天的支气管和细支气管纤维化评分分别为3.0±0.33与0±0，p值=0.004）。
图1显示了上皮损伤导致BO的进展。与车辆治疗的控制气道相比(图1a)到第1天，DA的ITI导致支气管和细支气管上皮严重坏死和脱落(图1b). 支气管上皮坏死处及其周围存在混合的炎性细胞群，包括组织细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。到第3天，出现再生上皮的迹象，一些气道出现中度上皮增生，周围常有由组织细胞和淋巴细胞组成的单核细胞外膜环(图1c). 此外，到第3天，息肉样气道内纤维化区域与上皮糜烂区域明显相关(图1d). 在此阶段，管腔内纤维化表现为松散的粘液样外观。到第7天，更广泛的气道纤维化伴混合性炎症浸润明显，导致气道部分阻塞，或者是管腔内息肉样增生(图1e)或通过壁内（收缩或环周）纤维化(图1f). 少数气道显示，致密纤维组织几乎完全阻塞了管腔（图1g），Masson三色染色可见明显的胶原成分(图1h).
DA-治疗动物的肺液中性粒细胞增多
ITI DA后1天和3天，BAL细胞总数显著增加，但在第7天恢复到与对照组相当的水平(表2). BAL中性粒细胞；然而，与对照组相比，经DA-处理的啮齿动物在第1、3和7天时显著升高。肺泡巨噬细胞的数量仅在第1天显著高于对照组。
经DA治疗的动物出现与严重小气道疾病一致的肺功能异常
与对照组相比，经DA处理的动物在第7天的肺功能出现显著变化。气道阻力（R）显著增加(第页<0.01），与对照组相比，DA-处理的啮齿动物(图2a). 如所示图2b和2c，两者都是动态的(第页<0.001）和静态顺应性(第页<0.001），与对照组相比，经DA处理的啮齿动物显著减少。
DA治疗的动物出现上皮特异性纤维化损伤模式
全肺转录分析，如所示图3a，表明上皮转录物CCSP（仅存在于非纤毛Clara细胞中的标记物）在第1天显著耗竭，显示下调1.8倍（p=0.005）。此外，在DA暴露后的第3天（下调1.7倍，p=0.02）和第7天（下调0.7倍，p=0.003），CCSP转录物持续耗竭。相反，肺泡细胞中存在表面活性蛋白C（SPC）水平(图3b)，在第1天仅表现出轻微的下调（下调1.2倍，p=0.18），转录水平在第3天和第7天恢复到控制水平，从而证实了气道上皮而非实质组织的损伤模式。图3c与对照组相比，胶原1α-1转录物在第3天上调了1.74倍（p=0.043），在第7天甚至增加了2.6倍（p=0.0007），这与观察到的气道纤维化相一致图1e-h.
DA导致正常气道上皮细胞快速严重丧失
对照鼠CCSP、乙酰化微管蛋白（AcT）、平滑肌肌动蛋白（SMA）和β-连环蛋白的免疫组织化学染色显示气道上皮细胞类型的正常分布、β-连环素的正常柱状膜表达和微小支气管平滑肌(图4a-c). DA ITI后第1天，只有少量正常上皮残留，少数细胞表达CCSP、AcT或β-catenin(图4d–f). 此外，上皮残留图4f呈扁平状，β-catenin呈提示性胞内染色，而非交界染色(图4f).
DA治疗后气道上皮增生
BrdU染色显示DA处理的啮齿动物的支气管和细支气管上皮快速再生。尽管在第1天两组中都有明显的最小BrdU染色（数据未显示），但到第3天，DA处理的啮齿类动物的气道上皮表现出广泛的增殖增加，这在载体对照中没有看到(图5a–c). 有趣的是，第3天管腔内息肉样纤维化区域内BrdU活性增加的证据也很明显(图5c)，但在第7天，在一个几乎完全闭塞的气道中不存在(图5d).
BO患者气道上皮细胞异常再生
对照啮齿类动物的CCSP、AcT、SMA和β-catenin的免疫组织化学染色显示气道上皮细胞类型的正常分布，大多数细胞表达CCSP或AcT，β-catenin的正常连接表达，最小气道SMA(图6a–c). 相反，在早期（第3天）有代表性病变的轻微气道中(图6d–f)与对照组相比，CCSP和AcT的表达均减少，尽管上皮连接β-catenin表达相对正常。此外，在严重闭塞气道的第7天晚期病变中，β-catenin的表达虽然紊乱，但覆盖了管腔内纤维化区域(图6i). 相反，上皮内几乎没有CCSP或AcT表达(图6g，h). 此外，SMA标记显示局部染色提示活动性管腔内纤维化区域存在肌成纤维细胞，而细支气管SMA比对照组更丰富且无组织(图6h).
DA诱导的BO的特征是Tenascin C过度基质沉积
在DA暴露后测试的所有三个时间点，基质成分Tenascin C（Tn-C）的转录表达均上调，与对照组相比，在第3天（2.07倍，p=0.008）和第7天（2.64倍，p=0.018）显著上调(图7a). 免疫组织化学染色证实DA暴露后3天和7天气道内Tn-C蛋白表达。伴有活动性BO的小气道在早期腔内息肉样病变中显示Tn-C表达积聚(图7b)弥漫于晚期BO病灶(图7c).
讨论
我们通过ITI给药DA建立了一种新型的化学诱导BO啮齿动物模型，并证明该模型复制了人类BO的生理、生物和病理特征。在单次高剂量DA暴露后7天内，大鼠气道阻力增加，BAL中性粒细胞增多，和BO的气道纤维化和组织病理学特征。与其他用于研究BO的啮齿动物模型（如异位气管移植）相比，在我们的模型中，气道纤维化是在充满血管和充气的肺实质环境中发生的[15]这一易于复制且与临床相关的模型将促进我们对BO发病机制和潜在治疗的理解。
鉴于工作场所暴露于DA和BO之间的强烈临床和流行病学联系，选择DA作为BO发展的模型。在以前的研究中，通过吸入DA暴露于啮齿类动物未能发展成BO样病变，尽管治疗大鼠和小鼠的鼻腔出现广泛坏死[10],[11]。由于啮齿动物是专性鼻呼吸者，我们假设，DA在鼻腔中的广泛吸收和反应可防止吸入时DA的毒性浓度到达远端气道，这与之前对DA蒸汽治疗大鼠的剂量测定研究一致。[12]此外，在大鼠和犬模型中，气管内给药其他化学制剂，如硝酸或胃内容物，与支气管变化有关。[16],[17]因此，在本研究中，为了绕过鼻腔，ITI给予DA。尽管该模型有助于研究BO的发病机制，但考虑到非生理给药途径，我们的结果在人类风险评估中可能用处有限。
我们已经证明，单次气管内注射高剂量DA将导致啮齿动物BO。相比之下，人体研究表明，工厂工人接触DA或人造黄油调味料的其他挥发性成分时，由于持续或间歇吸入相当低浓度的蒸汽，会产生BO。我们正在积极开展对啮齿动物的进一步研究，以更好地描述吸入不同浓度DA的长期影响以及调味品混合物中其他相关化合物的ITI。这些吸入研究可以提供当前工作场所DA暴露与人类BO发展之间的直接生物学联系。
我们模型的几个特征特别显著，与人类BO非常相似。所有经DA治疗的动物都观察到BO的标志性病变，即小气道纤维化。病变中三色染色的增加和肺内胶原转录物的显著增加证实了纤维化的存在。此外，生理气流测量为人类疾病提供了另一个强有力的生物学联系。BO的临床诊断以FEV降低的阻塞生理学为特征1（1秒用力呼气量）。尽管FEV1不能在大鼠身上测量，测量气道阻力增加和顺应性降低是啮齿动物气道阻塞的公认指标。[18]在DA诱导BO的情况下，我们观察到气道阻力显著增加，顺应性降低。考虑到DA暴露后观察到的大多数肺实质的正常外观和气道特异性损伤，这些结果表明，在DA治疗的动物中，大多数气道受到影响，并且至少部分闭塞。由于正常肺中的小气道对总气道阻力的贡献很小，因此本研究中观察到的显著变化只会发生在非常广泛的小气道疾病中。
此外，该模型中的中性粒细胞气道炎症也与人类BO中描述的情况相似。据报道，患有阻塞性肺病的微波爆米花工厂工人出现中性粒细胞炎症，并与其他肺部炎症指标的发展有关[19]肺液中性粒细胞增多也被广泛描述为与移植相关的BO[20],[21]需要进行更多的研究，以阐明在DA诱导BO的情况下，中性粒细胞参与气道上皮炎症损伤、基底膜降解或成纤维细胞活化的程度。
虽然导致DA诱导BO发生的确切机制尚不明确，但从我们的结果中可以明显看出一些有趣的发现。首先，BO似乎是由这种高反应性化学物质对下呼吸道上皮的最初严重损伤引起的。DA是一种强电泳剂，可望与细胞蛋白上的硫醇和胺反应。DA对膜蛋白的损伤可能会损害膜的完整性，导致气道上皮细胞的丢失。在一些早期病变中，我们观察到完整的上皮细胞脱落，这表明DA可能会特别影响上皮附着部位，并伴有或不伴有上皮细胞坏死。在任何一种情况下，上覆上皮的丧失和基底膜的破坏都可能是气道纤维化的先决条件。例如，一种可能的机制涉及严重的上皮损伤，导致纤维固有层暴露，使成纤维细胞前体从溃疡的气道壁迁移到管腔中。
一个非常引人注目且新颖的观察结果是，尽管DA损伤后上皮细胞迅速再生，但气道细胞组成仍然异常。我们证明尽管有明显的上皮再生，但CCSP和AcT的蛋白表达显著降低。此外，我们确认在DA暴露后测试的所有时间点CCSP转录本的耗竭。这些变化可能只是反映了部分上皮修复的正常过程和新分化上皮表达正常细胞标记物的失败。或者，异常的上皮细胞成分可能直接导致腔内纤维化的发展，可能是因为新生上皮无法限制成纤维细胞的活性。还需要进一步的研究来确定呼吸道上皮层的破坏是否也是DA暴露工人或移植受者BO发病机制的组成部分。
鉴于表达CCSP的上皮细胞亚群被认为是下呼吸道上皮正常修复的关键祖细胞，这些细胞的持续耗竭尤其可能导致疾病发病[22]一个似是而非的假设，与我们的结果一致，可能是Clara细胞及其祖细胞能力的丧失导致了异常的局部上皮修复机制，从而导致BO的发生。需要进一步的研究来确定CCSP的丢失是否对BO有积极作用，或者仅仅是疾病发展的结果。在这两种情况下，这些发现在我们的模型和人类BO之间提供了另一个强有力的相似性，因为据报道，患有BO的肺或骨髓移植受者的血液或肺液中CCSP的耗竭[23],[24].
我们研究的另一个新观察是在转录和蛋白水平上调BO中的Tn-C。Tn-C是一种基质蛋白，最近被确定在几种炎症和纤维化肺疾病中积累。例如，据报道，人类哮喘患者和哮喘小鼠模型的气道壁中Tn-C增加[25],[26]此外，在卵清蛋白哮喘激发后，Tn-C缺陷小鼠的气道高反应性、细胞募集和炎性细胞因子减少，表明这种基质蛋白在促进肺部炎症中起作用[27]最后，最近在一个异常上皮修复的小鼠模型中报道了这种基质蛋白的上调[28]在这些研究中，萘暴露被用作有效或成功上皮修复的模型，并与更昔洛韦给药表达单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）的转基因小鼠（CCtk）导致的持续性（非生产性）Clara细胞损伤进行对比。对于萘，早期升高的Tn-C水平在损伤后6天内恢复正常，而对于持续损伤模型，Tn-C转录水平在以后的时间点继续升高，呈支气管周围分布模式。然而，尽管Tn-C增加，但在该模型中未观察到BO，这可能是由于不同啮齿动物对损伤的气道反应不太严重或存在根本性差异所致。总之，这些数据支持进一步的研究，以确定Tn-C是否积极参与DA诱导的BO中支气管闭塞的发展，可能是通过与上皮或成纤维细胞的相互作用。
总之，我们已经证明DA的ITI复制了人类BO的生物学、生理学和组织学特征。目前还没有其他啮齿类动物模型在全血管充气肺实质环境下复制人类BO这些特征。使用该模型，我们证明BO的特征是上皮修复失调，并失去正常的气道细胞组成。此外，我们首次证明BO涉及Tn-C异常基质沉积，位于气道纤维化病变内。这些结果提供了一个新的模型，在该模型中，可以进一步阐明导致BO的损伤机制，并确定可能的靶点以开发新的治疗策略。
致谢
作者感谢S.Garantziotis博士和R.Dacker博士对手稿的批判性审查，并感谢Herman Price博士在开展研究过程中提供的技术援助。
作者贡献
构思并设计了实验：SMP FLK GPF DLM。执行实验：GPF FLK HLZ JLN PJK JFF WMG DLM。分析数据：SMP GPF FLK PJK WMG DLM。提供的试剂/材料/分析工具：GPF DLM。撰写论文：SMP GPF FLK DLM。
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