摘要
聚嘧啶结合蛋白1(PTBP1)是信使RNA的重要细胞调节因子,影响细胞的选择性剪接图谱及其mRNA的稳定性、定位和翻译。此外,它被一些病毒转移,以促进其复制。在这里,我们用了一本小说PTBP1型敲除小鼠以分析PTBP1型以及其在开发过程中完全移除的效果。我们发现了强有力的证据PTBP1型在胚胎干细胞和整个胚胎发育过程中的表达,特别是在发育中的大脑和脊髓、嗅觉和听觉系统、心脏、肝脏、肾脏、棕色脂肪和软骨原基中。这种广泛的分布表明PTBP1型在胚胎发育期间。经PCR和免疫荧光鉴定的纯合子后代能够植入,但生长受阻或迟缓。在胚胎发育的第7.5天(E7.5),无效突变体比同窝对照小约5倍,并且体型差距随着时间的推移而扩大。在妊娠中期,所有纯合子胚胎都被吸收/降解。在E12和断奶年龄时未对纯合子小鼠进行基因分型。缺少胚胎PTBP1型没有表现出向3个胚层分化和外胚层空化,这是原肠胚形成的标志。此外,纯合子突变体显示出畸形的外胎盘锥体和卵黄囊,这两种都是胚胎本身的早期支持结构。我们的结论是PTBP1型受精卵最早的等体积分裂和分化步骤直到胚泡的形成不需要。然而,植入后的进一步发展需要PTBP1型纯合子缺失动物的胚胎和胚外结构的大小和畸变显著减少。
引用:Suckale J、Wendling O、Masjkur J、Jäger M、Münster C、Anastasiadis K等人(2011年),PTBP1是胃化前胚胎发育所必需的。公共科学图书馆综合版6(2):e16992。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016992
编辑:Anton Wutz,英国威康信托干细胞研究中心
收到:2010年10月4日;认可的:2011年1月18日;出版:2011年2月17日
版权:©2011 Suckale等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章,允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是原创作者和来源得到了认可。
基金:这些研究得到了德国联邦教育和研究部(BMBF;网址:www.bmbf.de)来自德国糖尿病研究中心(DZD)、马克斯·普朗克学会的糖尿病能力网络(KKNDm)(网址:www.mpg.de)MS和德累斯顿再生治疗中心(CRTD);网址:www.crt-dresden.de)至KA。JS获得了德累斯顿理工大学医学院的MedDrive资助(网址:www.medizin.tu-dresden.de). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
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介绍
小鼠胚胎发育总共持续约3周。在受精后的头几天,胚胎的大小没有显著增长,直径保持在0.1毫米左右,仅分化为两种组织类型,即外部滋养层和内部细胞团。胚胎细胞的数量在植入时呈指数增长至~70,每个细胞的体积随之减少。
胚胎发育第4.5天左右植入(E4.5)[1]标志着步伐的改变。在这一点之后,胚胎的体积从E4.5时的约0.2 mm以指数形式增加到E7.5时的0.7–0.8。在此过程中,胚胎组织迅速重塑和分化。在E5.5时,致密胚胎形成一个空腔并变成卵筒。一天后的E6.5,原肠胚开始形成,在外胚层的后部区域形成原始条纹。很快,形成了外胚层、中胚层和最终内胚层三个胚层[2]。这标志着主要分化事件的开始。
在着床之前,胚胎主要依赖其自身的储备,而着床代表着从内部供应到外部供应的过渡。胚胎和母细胞形成早期的支持结构,如卵黄囊、外胎盘锥,最终形成胎盘,滋养胚胎并诱导母细胞适应[3]类似地,基因表达从预加载的母体mRNA转换为胚胎mRNA。在小鼠中,这种母体到合子的转变相对早于2细胞期或E1。RNA-结合蛋白,如PTBP1,影响前mRNA的剪接以及其稳定性和转化为蛋白质。
PTBP1(也称为非标准名称PTB和hnRNP I)是一种核酸结合蛋白,主要因其在mRNA生命周期和功能的多个方面发挥作用而闻名。其中包括拼接规定[4]——[9],3′端加工[10],[11],内部核糖体进入位点介导的翻译[12]——[14],本地化[15],[16]以及稳定性和翻译[17]——[21].PTBP1也可以结合DNA[22]作为转录因子[23],[24].
PTBP1型是哺乳动物中4个已知基因大家族的成员:PTBP1型 [25],PTBP2型 [26],活塞杆1 [27]和小型PTB [28].哺乳动物PTBP1型广泛表达,是该组研究最好的基因。PTBP2型(nPTB)是由神经元细胞类型合成的。活塞杆1在大鼠造血细胞中检测到,而小型PTB在平滑肌中表达。这个果蝇属的直系同源物PTBP1型是赫菲斯托斯在卵母细胞中,它是oskar mRNA-localizing complex的一部分,在这里它抑制其翻译[17]后来,在苍蝇胚胎发育过程中,它在中胚层和神经元谱系以及成体椎间盘和生殖系中表达[29].
根据结构数据[30]——[33]PTBP1包含4个RNA结合域。这些结构域属于RNA识别基序(RRM)家族,是最丰富的核酸结合结构域之一[34]不同蛋白质的RRM结合2–8个核苷酸,PTBP1的RRM结合3–5个核苷酸,序列偏好略有不同[35]单个蛋白质中的多个RRM增加了整体亲和力和特异性。
PTBP家族成员相互调节。除了通过外显子抑制调节自身水平导致非感觉介导的衰变外[4],PTBP1通过类似机制抑制PTBP2[5],[6]当PTBP1水平降低时,PTBP2水平通常会上调。这种转换导致剪接的广泛改变,对神经元分化至关重要[5],[6]在HeLa细胞中,通过RNAi减少PTBP1并没有显著改变蛋白水平,除了释放PTBP2抑制外,这表明这些蛋白之间存在冗余。只有当两者都降低时,一些基因的蛋白质水平才发生变化,包括释放ROD1抑制[7].
为了研究PTBP1在复杂生物体中的功能,我们开始产生一个小鼠多功能等位基因。在这份手稿中,我们报告了PTBP1型用报告基因检测到导入该等位基因及其系统性敲除的影响。
结果
一种新型多功能等位基因PTBP1型
使用Red/ET同源重组[36]我们创作了一部小说PTBP1型等位基因(图1,图S1),在其原始状态下引起系统性敲除并产生细菌β-半乳糖苷酶(LacZ公司)用于检测来自PTBP1型基因座。我们使用RT-PCR验证了转录块的效率(图S2). 可以用FLP重组酶去除停止/检测盒,导致一个与野生型不可区分的等位基因,除了外显子3到7两侧存在loxP位点。在多用途等位基因的最后阶段,这组外显子可以通过Cre重组去除,导致过早终止密码子和PTBP1的零突变。
广泛表达PTBP1型在怀孕期间
为了评估PTBP1在胚胎发育中的重要性,我们在E4-4.5着床和E20-21出生之间的相等时间间隔内对杂合胚胎干细胞(ESCs)和杂合全胚胎进行X-gal染色(图2).PTBP1型在E6.5和E7.5中显示出显著的表达模式,基本标记了外胚层。在E6.5中,我们观察到PTBP1型报告者位于内脏内胚层,但不位于卵黄囊中胚层、绒毛膜外胚层或外胎盘锥。杂合但非野生型蜕膜表达PTBP1型在外胚层周围的区域。由于X-gal仅能穿透组织1-2 mm,除了E12.5和E16.5的整个贴装制剂外,我们还对冰冻切片进行了X-gal染色。因此,在整个坐骑制剂中,皮肤中的LacZ信号非常强(图S3)但在冷冻切片中几乎检测不到(图2)结果显示PTBP1型在发育中的内部器官和组织中表达,如大脑皮层和脑室下区,在那里可以发现神经元前体,三叉神经节,鼻腔,内耳,延髓,脊髓,甲状腺,心脏,肺,肾,可能是垂体和几个软骨原基,但不是更僵化的结构图2).PTBP1型随着胚胎年龄的增加,表达变得更加受限。虽然E8.5胚胎几乎完全被X-gal染色,但在E12.5和E16.5中信号变得更加分化。我们的结论是PTBP1型在整个妊娠期和用于产生这种敲除小鼠模型的培养的胚胎干细胞中强烈而广泛地表达。
PTBP1无效胚胎植入,但严重生长迟缓
为了深入了解PTBP1的功能,我们分析了杂合子小鼠的后代PTBP1型多功能等位基因。我们注意到,平均杂合/杂合窝产仔数7.0±1.7的标准偏差小于杂合/野生型杂交的8.2+/-2.2。断奶时的基因分型显示没有纯合子后代,野生和杂合子之间的比率为0.57(表1). 这些数据表明PTBP1型无效突变体在胚胎上是致命的,因此该基因对发育至关重要。
为了确定PTBP1缺乏在哪个阶段阻碍胚胎发育,我们从E12.5中分离出反向工作的胚胎。此时可以看到两种类型的植入物:小型退化和正常大小。进一步回顾发展,我们能够观察到E6.5、E7.5和E8.5的小植入(表1),检查的最后一个时间点,此时小胚胎仍显示出细胞结构,尚未降解。在E7.5时,我们量化了最大胚胎横截面的面积。小胚胎平均为0.02毫米2,显著小于0.11mm的大胚胎2(图3). 在2胎中,我们观察到3个小胚胎和10个大胚胎(比率0.3)以及2个空蜕膜。
为了确定小型植入物的性质,我们分离了E7.5的胚胎,小心避免来自母亲蜕膜的污染,这会使产生的基因型偏向杂合子。我们用PCR分析了5个小胚胎和17个大胚胎。所有5个小胚胎的基因型均为纯合子PTBP1型敲除等位基因,15个大胚胎为野生型或杂合型,其中2个大胚胎被误分类为纯合型,可能是由于内含子PCR的问题(图4和表1).
我们用PTBP1抗体进行免疫荧光染色,证实了小胚胎是纯合子的假设(图4). E7.5的所有小胚胎仅显示来自胚胎组织的PTBP1信号背景水平,而来自周围母体杂合蜕膜细胞的正常核荧光。然而,由于使用了小鼠单克隆抗体,卵黄囊膜出现非特异性染色。结合PCR数据,这表明纯合胚胎与同窝卵相比严重发育迟缓。
空胚不能开始空化或正确形成卵黄囊和外胎盘锥
一个E7.5的野生型胚胎形成了一个被母体血液侵入的外胎盘锥[3]被卵黄囊包围(图5a). 后一种结构由壁内胚层协同构建,形成厚的基底膜(赖氏膜)和胚胎侧的滋养层巨细胞,以及外部的母血和蜕膜细胞[37]在许多纯合子突变胚胎中,卵黄囊与外胚层没有明显分离。此外,赖歇特细胞膜没有正确形成,含有异常数量的嗜酸性物质(图5a). 同样,外胎盘锥体也没有正确形成,通常缺乏蜕膜细胞、巨细胞、Reichert膜和壁细胞的特征性连接。典型的胚胎被内脏内胚层细胞包裹,内脏内胚细胞又分为具有特征性顶端空泡的立方细胞和稍后分化的鳞状细胞。即使在E7.5的最高级纯合子突变体中,也看不到鳞状内胚层细胞,显示内脏卵黄囊的形成延迟。
为了更详细地观察对照膜和突变膜的分子组成,我们对胚胎冷冻切片进行了免疫荧光(图5b)胶原蛋白4,它是基底膜中丰富而重要的结构成分[38]正常胚胎(野生型或杂合型)显示出来自赖歇特膜以及内脏内胚层下的基底膜的强胶原4信号。另一方面,胚胎缺乏PTBP1型在含有少量或不含胶原蛋白的小球形区域周围,胶原蛋白含量高的区域大量增加,这可能代表胚胎本身。
我们推测,由于发育中的胎盘和发育中的卵黄囊滋养胚胎并参与信号传递过程,因此无效胚胎可能会挨饿,并且没有足够的刺激来生长和发育。
PTBP1敲除不能完成早期发育阶段,包括空化和原肠胚形成
在~E5开始的正常胚胎中,外胚层凹陷形成一个中央腔,E7.5分为外胎盘腔、外体腔和羊膜腔。在E6处的截面上,很容易发现空化。我们从未在十几个纯合子的薄片上观察到空化现象PTBP1型E7.5时胚胎为零(图4b,5). 这些胚胎没有显示出这一阶段的3个特征性空洞中的任何一个。只有少数空胚中可以看到异常小的卵黄囊空间。
在正常小鼠胚胎中,原肠胚形成开始于~E6.5,在中空外胚层的后侧形成原始条纹。细胞分裂成3个胚层。大多数空胚畸形严重,早期的细胞类型如外胚层和内胚层无法识别(图4b,5). 只有极少数纯合子胚胎表现出类似KO的细胞层部分分离1在里面图4b为了进一步研究零突变体发育的分子基础,我们对T/支流突变胚胎与对照胚胎。T是原肠胚形成期间在原始条带中表达的胚胎转录因子。T型在正常胚胎中持续检测到,但在所有小型突变胚胎中均未检测到,而对照RT-PCR在所有样本中均呈阳性(图6).
我们解释了空腔的缺失、胚层的主要缺失以及原肠胚形成标记物的激活失败T型这表明PTBP1型E7.5的空胚虽然可以存活,但不再遵循正常的发育程序。
全身纯合消融PTBP1型在E12之前胚胎致死
我们根据动物的大小,使用全胚胎、卵黄囊或尾夹PCR来确定杂合子父母所生胚胎的基因型。此外,我们区分了表达PTBP1型在冰冻切片上使用免疫荧光技术从零突变中提取。结果总结于表1,表明纯合子突变胚胎在植入后的第一天是可行的,但在妊娠中期左右不再被检测到。在E12、E16和断奶时,PCR无法检测到纯合动物。在以前的时间点,小型蜕膜通常在其中心含有既不能进行基因分型也不能进行切片的降解物质。因此,在植入后不久偏离正常发育后PTBP1型在E8.5后不久和E12前会致命。
PTBP2或Rod1无补偿PTBP1型KO胚胎
PTBP1抑制PTBP2的表达,PTBP2在氨基酸序列上70%相同,并且具有类似的功能。在成人组织中,PTBP1的下调常常导致PTBP2的上调。因此,我们扪心自问,是否可以在PTBP1型敲除胚胎。对照胚胎表达了这两种旁白,尽管分布不同。PTBP1除周围蜕膜细胞外,在内脏内胚层和外胚层高度表达。这与LacZ报告子分析显示的表达模式一致(图2). 在E7.5胚胎中,只有外胚层中PTBP2荧光最强。然而,空突变体在E7.5处既没有PTBP1也没有PTBP2免疫荧光信号(图7). 我们还研究了3第个PTBP组中不太为人所知的副基因Rod1在PTBP1缺失胚胎中上调。使用E7.5胚胎的RNA提取物,我们进行了RT-PCR,在敲除胚胎或对照胚胎中未检测到任何扩增(图S5).
我们得出结论,突变胚胎不能补偿PTBP1型随着PTBP2或杆1PTBP1通过排除一个重要外显子来抑制PTBP2,PTBP1减少后PTBP2的上调需要一个活性PTBP2启动子。可能是因为PTBP1型胚胎中的基因敲除不会导致PTBP2的上调,因为细胞基本上受到干扰PTBP2型基因永远不会被激活。
突变胚胎的增殖和凋亡减少
为了更详细地观察缺乏Ptbp1的胚胎与含有1或2个正常等位基因的胚胎的细胞增殖情况,我们进行了BrdU和TUNEL分析(图8). 根据BrdU掺入新合成的DNA的估计,在所分析的对照E7.5胚胎中,细胞分裂率很高,尤其是来自外胚层、内脏内胚层、卵黄囊区域和外胎盘锥的强烈信号。有趣的是,外胚层和内胚层也使用Ptbp抗体进行了强烈标记(图7). Ptbps的表达水平与胚胎细胞分裂似乎存在相关性。此外,空突变体显然合成较少的DNA。
我们在对照胚胎中未检测到TUNEL,而大部分敲除胚胎显示DNA片段,表明存在凋亡(图8,底部)。妊娠约一周后,纯合Ptbp1缺失细胞开始凋亡。
讨论
PTBP1对植入后早期发育是必要的
我们创造了一种新的多用途PTBP1型等位基因,在其第一阶段用于分析系统性敲除的影响。通过对几个阶段的妊娠进行解剖,我们确定了两组胚胎——一组胚胎发育阶段的预期大小,另一组较小。早在E6.5时,群体之间的差异就显而易见,并且在E8.5后小着床开始退化之前,这种差异一直在扩大。植入后,小胚胎没有明显生长。两种胚胎群体的基因分型和免疫染色PTBP1型引导我们将小群体确定为纯合子敲除PTBP1型因此,我们得出结论:PTBP1型与早期有丝分裂不同,着床后细胞分裂与胚胎细胞质量显著增加有关。
在将小胚胎描述为纯合子KO后,我们详细分析了E7.5时无效胚胎的组织学,观察到大多数突变胚胎无法开始空化或形成3个胚层。他们也不能诱导表达T/支流,原肠胚形成早期原始条纹形成所需的转录因子。这表明PTBP1型需要经历早期的植入后过程,包括卵筒的形成和原肠胚形成。
空白胚胎还显示卵黄囊和胎盘结构畸形,通常没有可辨别的卵黄囊腔,异常增厚的嗜酸性细胞膜和巨细胞不在Reichert基底膜和蜕膜之间的典型位置。一个适当形成的卵黄囊和早期胎盘结构为胚胎提供营养,并在胚胎和母亲之间发出信号。由于这些结构在PTBP1型基因敲除后,突变胚胎可能会饿死,无法与周围的母体组织正常沟通。供应受限和分裂能力下降很可能加剧了缺乏胚胎的发育问题PTBP1型但还需要进一步的实验来区分外胚层和胚外支持结构中的缺陷。
我们观察到PTBP1型空白胚胎能够植入,但随后保持较小,这在最近一项分析小鼠影响的研究中没有发现PTBP1型胚胎和胚胎干细胞的无突变[39]该研究发现,PTBP1在滋养外胚层和胚泡的内部细胞群中都有表达,并且纯合的胚胎干细胞系不能建立PTBP1型敲除胚泡不同于其他基因型。然而,PTBP1型空干细胞可以通过病毒插入Cre-expressing结构产生。得到的小鼠ESC显示出类似水平的10月4日和Sox2系统但略有下降纳克和雷克斯1,所有未分化状态的标记。这表明即使在缺乏PTBP1型然而,由于G延迟,没有PTBP1的ESCs的增殖速度比杂合对照慢8-12倍2/M进程。这些观察结果与我们关于植入后无胚胎和对照胚胎之间的尺寸差距不断增大的数据非常吻合。然而,在该研究中,在E6.5和之后没有观察到纯合子突变体。相反,我们在植入后检测到了非常小的纯合胚胎,并分析了它们的结构。PTBP1型也成为基因组规模RNAi筛查中最热门的项目之一10月4日 [40]针对的.esiRNAPTBP1型导致10月4日以及纳克转录水平。这与碱性磷酸酶染色的缺失和典型球形ESC菌落的扁平化有关。因此,虽然PTBP1型不是对干细胞的绝对要求,它确实对胚胎干细胞的多能性有很强的积极作用。
胚胎发育中的RNA结合蛋白
上述详细数据[39]与目前的研究结果一起坚定地确立了PTBP1型作为早期胚胎发育必不可少的一个因素,特别是由于其对快速细胞分裂的必要性。PTBP1型与其他几种导致早期胚胎发育严重缺陷的RNA结合蛋白并列。例如,击倒安全气囊系统,哪个喜欢PTBP1型含有RRM,完全阻止胚泡的植入和干细胞的产生[41]。的胚胎为空ELAVL1型由3个RRM和一个SPOC域组成,植入并开始原肠胚形成,但随后由于胎盘畸形在E10.5和E14.5之间死亡[42]另一种含有RRM的蛋白质TIAR有一个更特异的缺陷,因为它是原始生殖细胞存活和精原细胞和卵原细胞形成所必需的,可能是由于它对细胞分裂的影响[43].
拼接或稳定
在目前的分析状态下,尚不清楚PTBP1的哪种分子功能是导致其空胚严重发育缺陷的原因。PTBP1对含有CU-tract的mRNA的上述稳定作用可能需要在植入后胚胎体积生长期上调时为蛋白质合成提供足够的信使。另一方面,PTBP1对胚胎细胞剪接模式的控制可能对早期胚胎的增殖至关重要。分化过程的一部分是拼接节目的分化。由于植入前胚胎只包含很少的不同组织,剪接模式可能是相似的。植入后,许多不同的组织出现,可能需要PTBP1型控制外显子的选择。进一步的实验,例如CLIP[44]为了确定PTBP1的靶点,mRNA衰变分析可以测试潜在的稳定作用,剪接形式敏感微阵列可以澄清这些问题。可能,即使是尚未确立的角色PTBP1型在结合基因启动子区域可能起作用。这些研究的主要挑战是可以获得的纯合子突变材料数量非常少。
展望
这里生成和分析的Ptbp1突变小鼠表明,缺乏参与剪接和RNA稳定性等功能的RNA-结合蛋白如何能够完全阻止胚胎发育。它还表明,paralogues Ptbp2和Rod1不能补偿Ptbp1的损失。缺乏Ptbp1的胚胎细胞原则上可以分裂,但分裂速度要慢得多。此外,Ptbp1缺失胚胎在正确分化方面也存在问题,这可能与前者有关。
利用吉田实验室等位基因(loxP-framed exon 1)和我们的多用途等位基因,(FRT-framed stop/detection cases和loxP-framed exon3–7)产生了两个新的PTBP1等位基因。这两个等位基因可以与多种Cre菌株结合,进行条件缺失。在与FLP重组酶结合前的第一阶段,本研究中使用的等位基因也可用于检测PTBP1型胚胎发育阶段E12.5和E16.5的数据证明了个体发育期间不同组织中的基因座。考虑到对胚胎干细胞的强烈兴趣和剪接模式的调节PTBP1型等位基因将是进一步剖析这种核酸结合蛋白多重功能的重要工具。更具体地说,重组酶转化后的多用途等位基因的第二阶段可用于条件敲除PTBP1型仅在胰腺β细胞中[45]为了测试该基因在胰岛素颗粒生物生成和糖尿病中的作用[18],[19],[46].
材料和方法
PTBP1多功能突变小鼠等位基因的产生
用于构建突变等位基因的PTBP1基因组序列基于从CHORI的BACPAC获得的雄性C57BL/6J细菌人工染色体RPCI24-368K20。的一部分PTBP1型首先亚克隆,然后通过Red/ET重组(基因桥)在大肠杆菌最终的靶向结构被线性化,电穿孔成R1/E129小鼠干细胞,在喂食器上生长,并使用HygB进行筛选。随后通过基因组DNA上的Southern blot和同源重组臂上的连接PCR证实靶向构建物正确插入基因组。用于修改PTBP1位点的靶向结构的完整序列可以在核苷酸数据库中找到,如GenBank,其标识符为HM588137(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/307557308).
PTBP1 KO小鼠的产生
选择经验证的干细胞克隆进行桑椹胚注射,两个克隆的胚胎生殖系传播率分别为0/50和5/80。在进行杂交和分析之前,嵌合体与C57BL/6J进行了5-8代的自交。根据德国动物福利法,遵循欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约并经区域理事会批准(24-9168.24-1-2003-2)。
基因分型
用2对引物对蛋白酶K消化后的尾夹对成年PTBP1突变小鼠进行基因分型。对1(正向:5′-CTGTAGCGTCTGTGAA,反向:ATGGCATTACGTTGATGT附件,product:299 bp)检测LacZ报告基因并区分野生型(wt)和杂合/纯合小鼠。第2对(CCTCATTGCTGTCCTGGTT公司,CCCTGGTTCCTGTCATCTT公司,产物208 bp)与终止和检测盒插入位点周围的内含子序列结合,并区分hom和wt/het基因型。
由于早期胚胎组织数量较少,因此在E9之前的妊娠期使用整个胚胎进行基因分型。仔细解剖胚胎组织,以避免受到母亲组织的污染,然后按上述方法进行基因分型。
胚胎冷冻切片和X-半乳糖染色
妊娠时间根据早上检查后的时间来确定。通过颈椎脱位,在异氟烷麻醉后处死小鼠。在冷冻磷酸盐缓冲盐水中解剖子宫。将分离的蜕膜或胚胎浸泡在30%(m/v)蔗糖的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中30分钟,以避免冷冻制品。然后将样品嵌入Tissue-Tek(Sakura 4583)中,使用液氮冷冻,切割成10µm厚的切片并安装。样品用0.2%(v/v)戊二醛、5 mM EGTA和0.1 M MgCl固定在PBS中2在4°C下洗涤10分钟。然后在LacZ洗涤缓冲液(含有0.01%脱氧胆酸钠、0.02%NP40和2mM MgCl的PBS)中洗涤切片3次5分钟2)并在含有2.45mM 5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的LacZ染色缓冲液中孵育过夜。将X-gal储备液(1g X-gal溶于40 ml二甲基甲酰胺中)在LacZ洗涤缓冲液中稀释1∶25,并添加5 mM K-亚铁氰化物和5 mM K铁氰化物,制备染色缓冲液。去除染色液和3次PBS洗涤后,在安装和亮场成像之前,允许X-gal染色在4°C的PBS中加强。
组织学和免疫组织化学
整个蜕膜在4°C的4%多聚甲醛中固定过夜,脱水并嵌入石蜡中。切割5µm切片,脱蜡并用苏木精和伊红染色。连续切片用于PTBP1的免疫检测。用Tris-EDTA缓冲液(10 mM Tris Base,1 mM EDTA溶液,0.05%v/v Tween 20,pH 9.0)处理载玻片40分钟,在95°C下进行抗原回收。然后将切片与抗PTBP1抗体(Invitrogen,prev.Zymed,#32-4800)或抗胶原蛋白IV抗体在PBS中稀释1∶200在4°C下孵育过夜。通过将切片与Cy3-结合山羊抗鼠IgG孵育来检测一级抗体(Jackson Immunor Research Laboratories)将切片在室温下用1∶500的PBS稀释45分钟。最后用含有10µg/ml DAPI的Mowiol(Biovalley)固定切片,并用配备DAPI和CY3过滤器的荧光显微镜成像。
为了对胚胎冷冻切片进行免疫标记,将蜕膜切开,包埋在TissueTek OCT中,然后在干冰上冷冻。将10µm切片切割并安装在玻璃载玻片上。用PBS清洗切片,然后在室温下在山羊血清缓冲液(16%v/v山羊血清,20mM磷酸盐缓冲液,pH 7.4,0.45M NaCl,0.3%v/vTriton-X-100)中孵育1h。然后用抗PTBP1或抗PTBP2抗体(Abnova H00058155)孵育样品-A01型)在4°C的山羊血清缓冲液中稀释1∶200过夜。通过与山羊抗鼠IgG孵育检测一级抗体1-Alexa488(Invitrogen)在山羊血清缓冲液和DAPI中稀释1∶200,室温下5µg/ml,持续45分钟。
逆转录酶PCR
从一个杂合子杂交后代中分离出两个E7.5窝幼崽,在冷冻PBS中解剖,在冷PBS中清洗2次,以降低母体污染的风险,并使用TRIzol(Invitrogen)进行提取。使用SuperScript II(Invitrogen)逆转录RNA。RT-PCR使用T/支流底漆(前底漆:TCCCAATGGGGGTGGCTTTCTG,反向底漆:阿卡加加加加加; 预期产物:474 bp)和一组不同的LacZ引物(转发:CTGGCTACCGGCGATGCGAGCGG公司,反向:GATCAGCGGGCGTCTCC,产品;310 bp)和铂金Taq(Invitrogen)。PCR产物在琼脂糖凝胶上进行分析。
BrdU分析
在第7天,将0.6 mg BrdU/10 g体重的无菌PBS注射到怀孕小鼠的胃腔(IP)中。处死小鼠,3小时后将胚胎在冷PBS中从子宫中取出。胚胎在4°C下浸泡在PBS中9%、18%和30%w/v蔗糖中,然后嵌入Tissue Tek并在−80°C下冷冻。将块体冷冻切片,厚度为8µm。
将连续切片固定在4°C下4%w/v PFA中30分钟,并在PBS和RT下0.3%v/v Triton X-100中渗透1小时。切片在室温下用PBS清洗3x5分钟。在室温下对所有切片进行2 mol/L HCl处理25分钟。用PBS清洗切片3 X 5分钟,并在室温下用10%v/v山羊血清和0.3%Triton X-100在PBS中封闭1小时。然后,用一级抗体(兔抗BrdU,abcam ab6326,在封闭缓冲液中稀释1∶500)孵育过夜。切片在室温下在PBS中清洗3 x 5分钟,并在室温下与二级抗体(AlexaF 555山羊抗兔、分子探针,在封闭缓冲液中稀释1∶500)和DAPI(5 ng/µl)孵育1小时。切片在RT的PBS中清洗3x5分钟,并用Mowiol固定。使用蔡司LSM 510共焦显微镜拍摄图像。
标记法
按照上文所述对样品进行BrdU分析。将连续切片固定在4°C下4%w/v PFA中20分钟,并在RT下用PBS清洗30分钟。切片在0.1%v/v Triton X-100中在冰上渗透2分钟。将切片在37°C的染色溶液(450µl dUTP-TMR标记溶液+50µl末端转移酶溶液,均来自Roche原位细胞死亡检测试剂盒#12156792910,并添加5 ng/µl的DAPI)中培养60分钟。用PBS对切片进行3次短暂冲洗,并将其安装在Mowiol中。使用蔡司LSM 510共焦显微镜拍摄图像。
支持信息
PTBP1多功能等位基因的构建。图中显示了用于构建PTBP1型多用途等位基因。A) 基因组序列来自细菌人工染色体(BAC),并亚克隆到更容易处理的细菌载体中。首先,通过瞬时转染Cre表达质粒插入、选择并移除loxP下位点。其次,插入并选择FRT框架止动盒和上loxP位点。B) 将经验证的靶向构建物从质粒中分离出来,电穿孔到小鼠胚胎干细胞中,并进行筛选。(ori-复制起源;sA-剪接受体;IRES-内部核糖体进入位点;b-半乳糖苷酶/潮霉素-b融合;STOP密码子;polyA信号;重组酶识别位点:FRT-Flp重组酶;loxP-Cre重组酶)。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016992.s001
(畅通节能法)
验证Ptbp1停止盒的有效性。本研究中使用的转录停止盒有时被破坏,导致合成一些全长mRNA[PMIDs 8978605,9039657,16575173]。为了验证此处使用的Ptbp1无效等位基因的有效性,我们设计了Ptbp13′端的引物,并对E7.5的小纯合和大杂合/野生型胚胎进行了RT-PCR。我们观察到,Ptbp1的3′UTR可以在所有大胚胎中扩增,而大多数纯合胚胎没有从3′Ptbpl引物中扩增出产物。在少数病例(红色)中,可以观察到微弱的信号,无效胚胎没有与周围的母体组织很好地分离。信号可能来自于少量的母细胞,这些母细胞在解剖过程中无法被清除。使用微管蛋白α1b引物确认cDNA质量。引物序列:Tuba1b cagtgtcgtagacctggaacc&ctgtggaaaaccaagctgtgg,产物226 bp;Ptbp1第12/13外显子到第14外显子acctccaacatcccccct和gcaggtgtggttcgcccc,产物198 bp(内含子2中的终止盒)。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016992.s002
(畅通节能法)
在E7.5胚胎中未检测到Rod1 mRNA。Rod1是一种核酸结合蛋白,与Ptbp1和Ptbp2同源,在酵母中已知可抑制分化。为了测试Rod1是否因缺乏Ptbp1/2而上调,我们对7.5天龄的小纯合和大杂合/野生型胚胎进行了RT-PCR。无效突变体和对照胚胎均未表达Rod1 mRNA。Rod1 cDNA阳性对照证实了Rod1扩增的效率(左);根据Rod1拼接变体,预期产品大小为423/448 bp。使用微管蛋白α1b对照引物对(产品大小226 bp)确认cDNA合成。我们测试了另外3对未扩增的Rod1引物。此凝胶显示Tuba1b引物cagtgtcgtagacctggaacc和ctgtggaaaaccagcctgtgg以及Rod1引物gcggtgagcccgtcaatccc和tctcggtgattgaatacctgat的产物。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016992.s005
(畅通节能法)
致谢
罗纳德·诺曼(Ronald Naumann)和TCF为优秀的干细胞注射提供了支持。Jussi Helppi和BMS为五星级老鼠提供住宿和服务。Jabier Gallego-Llamas,用于熟练的小鼠胚胎分析。阿兰·吉蒙德用于小鼠超声分析。Alba Diz、Gabby Krens、Elena Quesada、Francisco Pan-Montojo、Maria Grazia Magro和Silvia Brambillasca对手稿的改进提出了建议。我们感谢Patricia Simon-Assmann为我们提供了一种抗胶原蛋白4抗体。
作者贡献
构思并设计了实验:JS MS OW KA。执行实验:JS OW JM KA。分析数据:JS OW JM KA MS。贡献的试剂/材料/分析工具:KA AFS。撰写论文:JS MS。提供的技术援助:MJ CM。
工具书类
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