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研究文章

可溶性重组三体血凝素单次免疫保护雏鸡抵抗高致病性禽流感病毒H5N1

摘要

背景

高致病性禽流感病毒H5N1导致家禽多器官疾病和死亡，给家禽业造成重大经济损失。此外，它还对公众健康构成重大威胁，因为它可以直接从受感染的家禽传播给死亡率极高（60%）的人类。针对HPAI H5N1的有效疫苗接种将保护商业家禽，从而通过降低鸟对鸟和鸟对人传播的可能性提供重要的控制措施。

方法/主要发现

在本研究中，我们评估了重组可溶性三聚亚型5血凝素（sH5）的疫苗潜力三)在哺乳动物细胞中产生。分泌的、纯化的sH5三以唾液酸依赖的方式与配体结合，证明其具有生物活性。研究表明，在一次接种H5N1病毒后，它可以以剂量依赖的方式保护鸡免受致命的H5N1攻击。根据从气管和泄殖腔拭子中分离的RNA的定量RT-PCR测定，受保护动物并没有释放挑战性病毒。同样在小鼠中接种sH5三为应对HPAI H5N1的挑战提供了全面保护。

结论/意义

我们的结果表明，sH5三构成保护鸡和哺乳动物免受HPAI H5N1感染的有吸引力的疫苗抗原。由于这些重组可溶性血凝素制剂可以以较高的产量和相对较短的交付周期生产，因此能够对流行性和潜在的大流行性流感病毒作出快速反应。

引用：Cornelissen LAHM，de Vries RP，de Boer-Luijtze EA，Rigter A，Rottier PJM，de Haan CAM（2010）可溶性重组三聚血凝素的单一免疫保护鸡对抗高致病性禽流感病毒H5N1。公共科学图书馆综合5（5）：e10645。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010645

编辑：Ralph Tripp，美国乔治亚大学

收到：2010年2月18日；认可的：2010年4月22日；出版：2010年5月14日

版权：©2010 Cornelissen等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作者和来源得到了认可。

基金：这项工作得到了经济结构改善基金的资助：“荷兰冲动性兽医禽流感研究”。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益：作者P.J.M.R.和C.A.M.d.H.根据本研究报告的结果提交了专利申请。这并不会改变作者对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守程度。

介绍

甲型流感病毒是一种被包裹的负链RNA病毒，基因组被分割。尽管鸟类被认为是其他物种中所有甲型流感病毒的来源地，但它们会感染多种动物[1],[2]根据其两种表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原特性，甲型流感病毒可分为16种HA（H1-16）和9种NA（N1-9）亚型。高致病性禽流感病毒H5N1导致家禽多器官疾病和死亡，给家禽业造成重大经济损失。高致病性禽流感H5N1病毒还对公众健康构成重大威胁，因为它可以直接从受感染的家禽传播给死亡率极高（60%）的人类。人们普遍认为，人类持续接触在野生和家养禽类中传播的流感病毒构成了永久性的大流行威胁[3],[4]有效接种HPAI H5N1疫苗将保护商业家禽，从而通过降低鸟与鸟之间以及鸟与人之间传播的可能性提供重要的控制措施。因此，研制有效的流感疫苗具有高度的兽医和公共卫生重要性。

针对HPAI H5N1的常规疫苗制剂是通过在鸡胚或哺乳动物细胞中传播病毒来生产的。所使用的疫苗病毒要么是重配病毒，要么是低致病性野生型禽病毒。无论是哪种方式，都需要根据病毒在卵子或培养细胞中繁殖的能力来选择病毒，这可能会妨碍与流通的HPAI H5N1毒株的最佳基因匹配。此外，这些疫苗还有其他一些局限性[5],[6]因此，已经探索了其他针对HPAI H5N1的疫苗策略，包括使用减毒流感活疫苗等[7],[8]、基于痘病毒等异源病毒载体的活疫苗[9]，腺病毒[10]，杆状病毒[11]和新城疫病毒[12]和DNA疫苗接种[13]虽然这些不同的策略通常显示出有希望的结果，但它们的适用性最终将取决于各种重要问题，包括安全性、功效、生产和成本[5].

对流感病毒感染和疾病的保护性免疫主要通过HA诱导抗HA抗体获得。由于防止流感病毒感染与抗HA滴度相关，几乎所有疫苗方法都旨在诱导高水平的HA滴度。因此，HA蛋白是开发抗HPAI H5N1重组亚单位疫苗的首选抗原。基于重组纯化HA的流感疫苗具有以下优点：I）HA抗原可以在安全、质量可控和可扩展的条件下生产。II） 无需进行病毒培养，从而避免了a）获得在鸡蛋或细胞培养物中有效复制的病毒，b）使用生物防护设施和c）使用可能影响抗原性并引起安全问题的程序灭活病毒的必要性。三） 重组HA蛋白可以被高度纯化，从而限制由鸡蛋污染物的存在等引起的不良反应。四） 用重组HA免疫将使自然感染的动物/鸡群的血清学分化（所谓的DIVA原则；[14]). 四） 重组HA疫苗的生产周期相对较短，可以加快对新出现的流感菌株的反应。

重组HA可以使用不同的表达系统产生。当以表示时大肠杆菌产生的HA蛋白在小鼠免疫后可诱导血凝抑制（HI）滴度[15]然而，由于HA蛋白的正确折叠和三聚需要多重翻译后修饰，包括糖基化和二硫键的形成，因此HA蛋白在高等真核系统中的表达可能会导致更好的抗原性。因此，发现哺乳动物细胞衍生的HA三聚体比同样产生的单体HA蛋白能诱导更高水平的中和抗体[16]杆状病毒表达系统已被用于在昆虫细胞中产生毒株特异性HA抗原，该抗原被证明可抵抗HPAI H5N1攻击[17]然而，这种全尺寸HA蛋白的功效可能有限，因为纯化后膜蛋白可能无法保留其天然的膜结合结构[18]因此，从细胞分泌的重组可溶性稳定HA三聚体的生产似乎是一种有吸引力的替代方法。在昆虫或哺乳动物细胞中表达的这种HA三聚体确实能诱导中和抗体[16]并部分保护小鼠免受HPAI H5N1挑战性感染[19].

鉴于重组可溶性HA三聚体的潜在应用前景，我们评估了其在鸡和小鼠中诱导保护性免疫抵抗HPAI H5N1感染的能力。为此，在哺乳动物细胞中表达具有GCN4三聚基序和STREP-tag II（后者用于纯化）的重组可溶性H5蛋白。重组可溶性H5三聚体（sH5三)使用简单的一步纯化方案从培养上清液中纯化，并对其寡聚状态和生物活性进行了表征。随后，接种sH5三研究表明，该制剂在小鼠和鸡中都能提供完全保护，以抵抗HPAI H5N1的攻击，后者在单次免疫后就已经存在。

材料和方法

基因和表达载体

GenScript USA Inc.使用人类偏好密码子合成了一个与A/Vietnam/1203/2004（H5N1）（Genbank登录号ABW90137.1）中HA的残基18至523（H3编号）相对应的cDNA克隆。在该克隆中，预测的HA外域蛋白缺乏多碱基切割位点。将该cDNA克隆到pCD5表达载体中，以便在哺乳动物细胞中高效表达[20]对pCD5载体进行了修改，以便将HA-encoding cDNA克隆到带有编码信号序列的DNA序列的框架中，该信号序列是一个人工的GCN4异亮氨酸拉链三聚体基序（KRMKQIEDKIEESKQKKIENEIIARIKK）[21]和Strep-tag II（WSHPQFEK；IBA，德国）。由此产生的载体编码可溶性三聚体H5蛋白，命名为sH5三.

蛋白质表达和纯化

将含有HA胞外域编码序列的pCD5表达载体转染到HEK293S-GnTI（−）细胞中[22]使用聚乙烯亚胺I（PEI），比例为1∶5（µg DNA∶µg PEI）。转染后6小时，用293 SFM II表达培养基（Invitrogen）代替转染混合物，该培养基补充有碳酸氢钠（3.7克/升）、葡萄糖（2.0克/升）、Primatone RL-UF（3.0克/升）、青霉素（100单位/ml）、链霉素（100µg/ml）、谷氨酰胺（Gibco）和1.5%二甲基亚砜。转染后5-6天收集组织培养上清液。HA蛋白的表达和分泌通过十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）确认，然后使用小鼠抗链球菌标签抗体进行免疫印迹（IBA，德国）。根据制造商的说明，使用Strep-tachin Sepharose珠纯化HA蛋白（德国IBA）。根据制造商的说明，使用Nanodrop 1000分光光度计（Isogen Life Sciences）测定纯化蛋白质的浓度。

重组HA的生物学特性

sH5的低聚状态三通过使用Superdex200GL 10–300色谱柱（GE Healthcare）分析洗脱曲线来测定蛋白质。sH5唾液酸结合活性三采用胎球蛋白固相分析进行评估。每孔使用1µg/ml胎球蛋白涂覆96周Nunc MaxiSorp板。如图图例所示，胎球蛋白用霍乱弧菌衍生神经氨酸酶（VCNA；罗氏），然后经过三个清洗步骤。sH5型三与辣根过氧化物酶（HRP）连接的抗链球菌标签抗体（2∶1摩尔比）在0°C下预络合30分钟，然后在胎球蛋白涂层板上培养极限稀释液（60分钟，室温[RT]）。随后在ELISA阅读器（EL-808[BioTEK]）中使用四甲基联苯胺底物（BioFX）检测HA结合，在450 nm处读取OD。

鸡的疫苗接种试验

动物研究在莱利斯塔德中央兽医研究所（CVI）进行，在BSL3条件下，并经动物伦理委员会批准。在第一次鸡实验中，使用了6周龄SPF白莱霍恩鸡（德国库克沙文省洛曼）（每组10只鸡）。通过肌肉注射（0.5 ml）10µg sH5对一组动物进行两次免疫（在第0天和第21天）三按照制造商的建议，使用Stimune作为佐剂（Prionics，Lelystad）。作为挑战性对照，另一组在Stimune接受等量的PBS（模拟接种）。接种疫苗三周后（第42天），用105中位组织培养感染剂量（TCID50)感染A/越南/1194/04病毒（0.1毫升鼻内注射和0.1毫升气管内注射），并在14天内监测疾病迹象。每次免疫后3周（感染后第21天和42天【p.i.】）采集血样。

在下一个实验中，从当地的一名繁殖者那里购买了70只一日龄蛋鸡（白色莱霍恩）。根据该农场的常规，这些鸡在一日龄时接种了新城疫病毒和传染性支气管炎病毒疫苗，并在CVI的动物设施中饲养。在6周龄时，这些鸟被运送到BSL-3设施，并被分配到7个实验组，每组10只鸟。6组动物通过静脉注射10、2或0.4µg sH5免疫一次（第21天）或两次（第0天和第21天三用Stimune佐剂的抗原。当两次免疫后，在第0天和第21天给予相同剂量。作为挑战性对照，一组在Stimune接种两次PBS模拟疫苗（第0天和第21天）。接种疫苗四周后（第49天），采集血样，按照上述方法对鸡进行攻击，并在14天内每天观察临床症状。在第2天、第4天和第7天从每只鸡身上采集气管和泄殖腔拭子。

小鼠疫苗接种试验

通过静脉注射（0.2 ml）2µg sH5，对9周龄BALB/c雌性小鼠（Charles River Laboratories；每组10只动物）进行一次（第21天）或两次（第0天和21天）免疫三用施蒂穆恩作佐剂。作为挑战性对照，对一组小鼠进行模拟接种。接种疫苗三周后，通过腹腔注射用氯胺酮/木聚嗪对小鼠进行麻醉，并用50µl H5N1A/越南/1194/04（含～10半数致死剂量（LD））鼻内接种50；3.710日志TCID50；由伦敦国家医学研究所世界卫生组织流感中心的Alan Hay博士提供）。每天给小鼠称重，并在接下来的14天内检查其是否有疾病迹象。使用评分系统记录临床症状（0=无临床症状；1=粗糙涂层；2=涂层粗糙，反应性较小，搬运过程中被动；3=被毛粗糙，卷起，呼吸困难，搬运时被动；4=被毛粗糙，卷起，呼吸困难，无反应）。得分达到4分的动物被安乐死。幸存的动物在下午14天放血并处死。

病毒检测分析

气管和泄殖腔拭子保存在添加抗生素的冷胰蛋白酶磷酸盐肉汤中。通过低速离心对培养基进行澄清，并收集上清液，进行校准，并将其储存在−70°C下。解冻后，收集同一天从同一只鸟身上采集的气管和泄殖腔拭子，并使用MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit（Roche）从200µl中提取病毒RNA。随后，使用反向引物合成cDNA5′-CACTGGGCACGGTGAG-3′用引物进行45个周期的Light Cycler PCR扩增出部分M1基因5′-CTTCTAACCGAGGTCGAACGTA-3′在TaqMan荧光探针存在下作为反向引物5′-6FAM-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-X-ph。对阴性和阳性对照样品进行平行测试。检测下限约为500 TCID50。一些样本给出了非决定性的结果，这意味着在>31个周期后，它们只给出了非常微弱的信号（荧光<0.07）。

血凝抑制（HI）测定

用1%的鸡红细胞和H5N1的4个血凝单位（HAU）（A/越南/1194/04 NIBRG-14）检测鸡血样本热激活免疫血清的血凝抑制（HI）活性。此外，使用8 HAU（67 ng）重组可溶性三聚体HA蛋白测试鸡血清的HI活性。为此，将重组蛋白与上述抗链球菌标签抗体预复合，与鸡血清的限制稀释液混合，并与0.5%的鸡红细胞孵育。红钮形成被记分为血凝的证据。抗体滴度表示为显示HI的最高血清稀释度的倒数。从小鼠血液样本中制备的免疫血清用VCNA处理，在56°C下加热灭活30分钟，并使用8 HAU的sH5通过HI测定进行测试三如上所述。

酶联免疫吸附法

抗sH5抗体总滴度三使用sH5测定三-特异ELISA。为此，96-well Nunc MaxiSorp板涂有0.5µg sH5三每个孔用限制稀释的鸡或小鼠血清孵育。在广泛清洗后，用山羊抗鸡抗体或与HRP结合的山羊抗鼠抗体孵育板。使用四甲基联苯胺底物（BioFX）和ELISA读取器（EL-808[BioTEK]）观察过氧化物酶活性，读取450nm处的OD。绘制了处于曲线对数阶段的250倍稀释样品的OD值。

结果

sH5的表达、纯化和表征三

为了表达可溶性三聚体亚型5 HA（sH5三)在哺乳动物细胞中，H5外域编码序列首先被克隆到合适的表达载体中。在所使用的pCD5载体中，H5-序列之前有一个信号肽编码序列，以便高效分泌重组蛋白，之后是GCN4异亮氨酸拉链三聚体基序的编码序列[21]和Strep-tag II，后者用于净化目的(图1A). H5外结构域的表达是通过将表达质粒瞬时转染到HEK细胞中实现的。通过对细胞培养上清液进行凝胶电泳，然后使用针对Strep-tag II的抗体进行免疫印迹，验证H5蛋白的表达和分泌(图1B). 结果表明，用表达质粒转染细胞后，细胞培养上清液中容易检测到重组H5蛋白，而模拟转染后则无法检测到。分泌的H5蛋白通过使用Strep-tachin sepharose珠在一步方案中纯化。蛋白质产量在每100 ml细胞培养基0.4–1 mg重组蛋白之间变化。从细胞培养上清液中纯化H5蛋白后，通过凝胶过滤柱色谱分析H5蛋白的寡聚状态(图1C). 大部分H5蛋白以低聚物的速度洗脱，而在空隙体积中仅发现少量聚集体。H5低聚物的三聚体性质通过蓝色-活性凝胶电泳和western印迹得到确认(图1D). 当H5制剂在电泳前进行热变性并延长时间时，最初的三聚体HA物种分解为二聚体和单体。纯化sH5的生物活性三采用唾液酸化血糖蛋白胎球蛋白固相结合法进行研究。sH5的绑定三通过与抗Strep-tag II抗体结合的HRP进行测量，如材料和方法第节。H5制剂与胎球蛋白呈浓度依赖性结合。这种结合是唾液酸依赖性的，因为用神经氨酸酶（VCNA；图1E). 总之，具有生物活性的sH5三使用哺乳动物表达系统高效生产并易于纯化。

缩略图
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图1。重组可溶性三聚体H5蛋白的表达、纯化和生物活性。

（A） 所用H5表达盒的示意图。H5外域编码序列（H5）在CMV启动子控制下，在框架中克隆，DNA序列编码信号肽（SP）、GCN4异亮氨酸拉链三聚基序（GCN4）和Strep-tag II（ST）。（B） 通过SDS-PAGE和western blotting分析H5在培养基中的表达和分泌情况。使用小鼠抗Strep标签抗体检测重组蛋白。（C） 通过凝胶过滤对纯化的重组H5蛋白进行分析。所示为使用Superdex200GL 10–300色谱柱的H5蛋白制剂的洗脱曲线。232 kDa过氧化氢酶对照的洗脱由线条指示。（D） 重组H5蛋白的蓝色天然-PAGE分析。在电泳前加热HA样品后观察到的单体、二聚体和三聚体外结构域物种在凝胶中的位置。（E） 在将重组可溶性H5三聚体应用于胎球蛋白结合分析之前，将其与针对Strep-tag的HRP偶联小鼠抗体复合。在用VCNA（胎球蛋白+VCNA）治疗胎球蛋白后，也评估HA结合。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010645.g001

sH5的功效三作为鸡致命HPAI H5N1感染的疫苗

检测sH5的免疫原性三及其作为疫苗的潜力在鸡中进行了第一次试验，其中10只鸡在i.m.接种两次（第0天和第21天），接种10µg Stimune佐剂sH5三3周后，通过静脉注射致命剂量的a/越南/1194/04病毒进行挑战。另外10只鸟被模拟接种，作为挑战对照。如所示图2，用10µg sH5加强接种三授予完全保护。接种疫苗的鸡没有死亡或出现流感相关疾病的症状，而所有模拟接种的鸡在2天内死亡。血清学分析表明，模拟疫苗接种的动物均不含抗sH5抗体三由sH5确定三-特异性ELISA(图2B). 相比之下，所有接受免疫的动物在一次免疫后都表现出明显的HA抗体水平，并且在增强后这些水平进一步增加。这些抗sH5的总抗体水平三与H5N1的HI滴度密切相关(图2C). 所有模拟接种鸡的HI滴度均低于检测限。sH5后观察到的HI抗体滴度三boost的最大值为1024，最小值为64，这显然仍足以保护动物免受致命的挑战。有趣的是，50%的禽类在第一次接种疫苗三周后出现了等于64或更高的HI抗体滴度。此外，还使用sH5测定了HI滴度三而不是H5N1病毒作为凝集剂，其结果基本相似（比较图2D和2C)，证明了分析的可靠性。总之，结果表明鸡接种了两次sH5三受到H5N1致命攻击的保护。观察到的HI滴度表明，一次疫苗接种可能已经足以提供对HPAI H5N1的保护。

缩略图
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图2。sH5型三鸡的疫苗接种。

10只鸡用10ug sH5免疫两次三（第0天和第21天）。作为挑战性对照，对鸡进行模拟处理（PBS）。接种疫苗三周后，所有鸟类都受到10只5TCID公司50HPAI H5N1 A/越南/1194/04（A）Kaplan-Meier生存曲线，表明各组（B–C–D）每天的死亡率百分比。首次免疫后3周采集血样（sH5三第二次接种后3周（sH5）三2×). sH5三ELISA（B）测定的抗体水平、H5N1的HI滴度（NIBRG-14）（C）和sH5的HI效价三（D） 每只鸟的血清中。条形图表示每组的几何平均值。虚线表示本实验中与保护相关的最低抗体水平。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010645.g002

鸡疫苗接种效果：抗原剂量和疫苗增强剂的影响

这些结果促使我们确定最小sH5三提供保护和检查单次剂量是否已经足够所需的剂量。在第二次疫苗接种试验中，鸡接种了10、2或0.4µg sH5三一次或两次，四周后受到致命剂量a/Vietnam/1194/04的感染。结果如所示图3再次，所有模拟疫苗接种的鸟类都在2天内死于感染。接种两次0.4微克sH5三足以保护90%的鸡免于死亡，而当剂量为2或10µg时，所有鸡都能存活下来(图3A). 有趣的是，也用sH5进行单一疫苗接种三可以诱导足够的免疫力来保护鸡免受致命感染(图3B); 当给予2微克剂量时，只有一只鸡死亡（90%保护），而10微克剂量对所有鸟类都有保护作用。即使在单次给药0.4微克后，60%的鸡仍能避免死亡。

缩略图
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图3。sH5型三鸡单次或强化接种后的剂量滴定。

用10、2或0.4µg sH5免疫7组10只鸡三一次或两次，间隔3周。作为激发对照，一组进行模拟治疗（PBS）。接种疫苗四周后，所有鸡都受到10只5TCID公司50HPAI H5N1 A/越南/1194/04。Kaplan-Meier生存曲线，表示接种两次（A）或一次（B）（模拟）疫苗的各组每天的死亡率百分比。（C–D）sH5三通过ELISA测定每只接种两次（C）或一次（D）模拟疫苗的鸡在激发当天的抗体水平。（E–F）针对sH5测量的相同血清中的血清HI滴度三对于（模拟）接种两次（E）或一次（F）疫苗的鸡。条形图表示测试组的几何平均值。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010645.g003

血清学分析表明，对致命H5N1攻击的防护与观察到的抗sH5抗体水平密切相关三由ELISA测定(图3C-D)通过HI检测(图3E-F). 两种检测均显示出剂量依赖性抗体反应，在强化免疫后显著增强。在两次免疫后，观察到相对较高的HA抗体水平，即使使用较低的剂量，但两只动物除外，其中一只没有通过挑战(图3C). 此外，在一次免疫后，检测到显著的抗体水平，低剂量组除外。在这里，5只动物的ELISA滴度几乎无法测量。一直以来，这些动物中有4只屈服于挑战。还有一只动物在接种2µg sH5后死亡三没有检测到sH5三抗体。基本上，使用sH5进行HI分析获得了与ELISA相同的结果三作为凝血剂(图3E-F). 因此，在一次免疫后死于致命挑战的动物也表现出最低的HI滴度。

从接种疫苗的鸡中去除挑战病毒

我们分析了是否接种了sH5三减少或阻止鸡传播挑战病毒。出于实际原因，病毒脱落是通过定量RT-PCR而不是通过测量感染性病毒滴度来分析的。为此，取鸡气管和泄殖腔拭子进行疫苗剂量滴定试验图3激发接种后第2、4和7天。将每只鸡在特定日期采集的气管和泄殖腔拭子合并，并使用检测M1基因的定量RT-PCR分析合并拭子中是否存在病毒RNA。结果如所示表1在接受强化疫苗接种的鸡中，只有2只鸡呈阳性，这两种鸡的抗原含量都最低。值得注意的是，这两种动物的sH5最低三-特异性抗体滴度(图3C). 其中一只动物没有在挑战中幸存下来。其他禽类中均未检测到病毒脱落，但有3只拭子检测结果不确定。在只接种过一次疫苗的鸡中，所有死亡的动物都呈阳性。没有一只鸟接种了10微克sH5疫苗三检测呈阳性。在接种低剂量疫苗并存活下来的鸡中，有两只检测呈阳性，但仅在第2天p.i.。总之，能够控制致命的HPAI H5N1攻击感染的接种过疫苗的鸡表现出最小或无病毒脱落。

缩略图
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表1。在用H5N1攻击后从接种疫苗的鸡身上采集的气管和泄殖腔拭子中检测病毒。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010645.t001

sH5的功效三小鼠致命HPAI H5N1感染疫苗

最后，我们检查了sH5是否三对小鼠也有保护作用。因此，用2µg sH5对2组10只小鼠接种一次（第21天）或两次（第0天和21天）三用Stimune佐剂佐剂，三周后用~10 LD鼻内接种激发50H5N1 A/越南/1194/04。挑战接种后观察到的各组小鼠感染存活率、临床评分中位数和体重如所示图4。所有模拟疫苗接种的小鼠都死于感染或必须在p.i.第9天实施安乐死。这些小鼠表现出严重的临床症状，包括呼吸窘迫和显著的体重减轻，一直持续到动物死亡。接种sH5的强化疫苗三对A/越南/1194/04的致死剂量提供了100%的防护；没有一只老鼠表现出明显的疾病迹象，它们的体重保持不变。单次接种sH5三不能保护小鼠免受疾病和并发体重下降的影响；然而，40%的小鼠存活了下来。这些小鼠从第9天起开始恢复，体重恢复证明了这一点。(图4C).图4D显示了挑战前的抗H5三ELISA测定的个人血清样本中的抗体水平。大多数接种疫苗的动物都能检测到这种抗体。然而，在一次免疫后，与接受强化免疫的动物相比，这些水平仍然很低。通过测定抗sH5的HI滴度，基本上证实了这些结果三在相同的血清样本中。除一只动物的血清显示出高水平的自身凝集外，所有小鼠在两次接种时均表现出高HI滴度，而在一次接种时则表现出低HI滴量。因此，小鼠接种了两次sH5三受到HPAI H5N1致命攻击的保护，而单一疫苗提供了部分保护。保护作用的差异与观察到的血清HI滴度有关。

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图4。sH5型三给小鼠接种疫苗。

用2µg sH5免疫10组BALB/c小鼠三一次（第21天）或两次，每次间隔3周（第0天和第21天）。作为激发对照，一组小鼠被模拟处理（PBS）两次（第0天和第21天）。接种疫苗三周后，小鼠感染了～10 LD50并在接下来的14天内每天监测临床症状和体重。（A） Kaplan-Meier生存曲线表明各组每天的死亡率百分比。（B） 每组临床得分中位数。（C） 每组的平均体重表示为起始体重的百分比，绘制为时间的函数。误差条表示标准偏差。（D–E）在激发当天采集血样。sH5型三ELISA（D）测定的抗体水平。针对sH5的HI滴度三（E） ●●●●。条形表示几何平均数。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010645.g004

讨论

尽管媒体和科学界在过去一年里对新的甲型H1N1流感大流行病毒引起了所有值得理解的关注，但高致病性禽流感H5N1仍继续构成巨大的流感威胁。2009年，在德国、中国、蒙古和俄罗斯联邦的野生鸟类中发现了高致病性禽流感H5N1病毒，越南、香港、尼泊尔、印度、孟加拉国、埃及、老挝人民民主共和国和柬埔寨报告了数起禽类中的禽流感疫情，而H5N1仍在印度尼西亚的大片地区流行。同年，还报告了数十例人类确诊病例（世卫组织重大事件时间表；http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/ai_timeline/en/index.html). 尽管到目前为止，该病毒感染人类和开始有效的人与人之间传播的能力仍然受到限制，但其在野生鸟类和家禽中的持续存在和传播仍然存在出现大流行毒株的风险。通过对家禽接种H5N1病毒疫苗可以减少这种威胁，因为这将限制病毒的传播，并将鸟人传播的风险降至最低。此外，如果出现人类大流行性H5N1毒株，则迫切需要与大流行毒株相匹配的有效可靠疫苗。在本研究中，我们评估了重组可溶性H5蛋白（sH5）的疫苗潜力三)保护鸡和小鼠免受HPAI H5N1致命感染。重组HA疫苗具有较短的开发周期，在其自然宿主中进行单一免疫后证明具有保护性，而在哺乳动物模型中需要进行强化免疫才能实现完全保护。此外，sH5三诱导免疫可防止病毒从鸡体内脱落。这些有希望的结果值得进一步研究开发重组可溶性HA，作为一种快速、安全和有效的替代疫苗，不仅可以对抗H5N1病毒，还可以对抗其他甲型流感病毒。

构建重组HA表达盒，使HA蛋白以生物活性三聚体的形式由细胞高产率生产和分泌。HA蛋白的寡聚状态对诱导中和抗体的重要性最近得到证实[16]发现高分子量的低聚物和三聚体（而非单体）可有效诱导小鼠产生中和抗体。这种差异归因于对单体中的表位优先诱导抗体，而不是三聚体形式的表位[16]在之前的研究中，可溶性重组HA三聚体是通过金属亲和层析和离子交换层析纯化的[16],[19]，我们使用了基于Strep-tag系统的协议[23]带有Strep-tag的蛋白质对Strep-tachin（一种链霉亲和素的工程形式）具有很高的亲和力。通过利用这种高度特异的相互作用，Strep-tagged蛋白可以一步分离出来。此外，由于Strep-tag在温和的生理条件下洗脱，因此特别适合生成天然蛋白质[24]，HA的一个特征可能有助于重组蛋白诱导中和抗体的能力。

sH5的功效三该疫苗首先在鸡身上进行了研究。添加Stimune佐剂，一种油包水佐剂，也称为Specol，sH5三两次给药（≥2µg sH5）后，蛋白制剂诱导的免疫对致命的H5N1攻击具有完全保护作用三/剂量）。重要的是，我们的疫苗制剂也保护了单次免疫后的鸡。而接种10µg sH5疫苗后，100%的鸡得到了保护三使用2µg时，90%受到保护。以前需要类似的HA剂量来使用由全长HA蛋白组成的疫苗制剂来保护鸡，该疫苗制剂是从感染表达H5基因的重组杆状病毒的昆虫细胞培养物中纯化出来的，在油包水佐剂中乳化[17]这些结果与哺乳动物细胞产生的HA三聚体引发的中和抗体水平与昆虫细胞产生的三聚体HA抗体水平相似的观察结果一致[16].我们的sH5的功效三受保护鸟类中病毒RNA的缺失进一步证明了疫苗的制备。这意味着接种疫苗的羊群可以阻止病毒的进一步传播。

大多数常规流感疫苗需要两轮接种才能产生足够高的抗体滴度，从而为鸡提供充分的保护。在这方面，接种sHA疫苗三与其他疫苗方法相比具有潜在优势。然而，每剂量sHA的生产成本三与鸡蛋培养的灭活全病毒疫苗相比，尽管哺乳动物细胞培养系统中的重组蛋白表达已被证明具有高度的可扩展性和高效性，表达水平高达每升蛋白质的克数[25],[26].sHA标准三然而，在数百万只鸡必须单独接种疫苗的疫情中，接种疫苗在经济上是可行的，只要一次预防性接种就足够了。此外，居住在濒危地区的接种疫苗的鸡群迅速达到保护性免疫状态。在大流行时，这可能是一个特别有价值的特征，因为病毒传播周期需要尽快中断，农民、兽医和监测小组人员接触潜在人畜共患高致病性禽流感的风险应最大限度地限制。

sH5的功效三该疫苗也在小鼠中进行了研究。两次注射后，疫苗制剂对致命的H5N1攻击具有完全保护作用。单剂量免疫可使存活率达到40%。这些保护水平差异与观察到的抗H5抗体相关三动物血清中的滴度。由于小鼠接受的剂量（2µg）相对于其体重而言，至少与一次免疫后鸡获得完全保护的剂量（10µg三在赋予鸡保护性免疫反应方面比在小鼠中更有效。这种明显差异的原因尚不清楚，需要进一步调查。在迄今为止唯一一项将可溶性HA三聚体用作小鼠疫苗制剂的研究中，在两次免疫后观察到对H5N1攻击的保护作用要小得多[19]虽然在后一项研究中产生的H5三聚体与我们使用的不同，在三聚基序（t4 foldon vs GCN4三聚基元）和纯化标记（His标记vs Strep标记II）方面，差异更可能是由使用的不同佐剂（Alum vs Stimune）解释的。明矾与亚单位疫苗联合使用时可诱导低抗体滴度[27]据报道，Stimune可产生持久的功能性抗体反应[28],[29],[30]然而，Stimune未获得人类使用许可。

总之，我们已经证明了sH5三哺乳动物细胞产生的蛋白质在小鼠和鸡中用Stimune佐剂时可引起保护性免疫反应。受到致命H5N1攻击保护的鸡在感染后第7天也没有传播病毒。由于这些重组HA疫苗可以以较高的产量和相对较短的交付周期制造，因此它们提供了一种具有吸引力的替代疫苗接种策略，从而能够对流行性和潜在的大流行性流感病毒作出快速反应。

致谢

作者感谢Marius Dwars为我们提供了鸡红细胞，感谢Peter van Rossum和Simon Riemersma小组在动物实验中提供的帮助。

作者贡献

构思并设计了实验：LC RdV PJMR CAMdH。执行实验：LC RdV EAdBL AR。分析数据：LC Rd V CAMdH。撰写论文：LC PJMR CAMdH。

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