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研究文章

线粒体融合促进因子Mitofusin是PINK1/Parkin通路的底物

  • 安吉拉·C·普尔 ,

    为这项工作做出了同等贡献：安吉拉·C·普尔，露丝·E·托马斯

    附属美国华盛顿州西雅图华盛顿大学基因组科学系

    ⨯
  • 露丝·E·托马斯 ,

    为这项工作做出了同等贡献：Angela C.Poole，露丝·E·托马斯

    附属美国华盛顿州西雅图华盛顿大学基因组科学系

    ⨯
  • Selina Yu，

    附属美国华盛顿州西雅图华盛顿大学基因组科学系

    ⨯
  • 伊芙琳·S·文科，

    附属公司美国华盛顿州西雅图华盛顿大学基因组科学系，美国华盛顿州西雅图华盛顿大学神经生物学与行为项目

    ⨯
  • 利奥·帕兰克

    pallanck@u.washington.edu网址

    附属美国华盛顿州西雅图华盛顿大学基因组科学系

    ⨯

摘要

功能丧失突变粉红色1或停车场基因导致帕金森综合征的隐性遗传形式。果蝇的遗传研究粉红色1和停车场表明PINK1是一种线粒体靶向的丝氨酸/苏氨酸激酶，作用于Parkin（一种胞浆泛素蛋白连接酶）的上游，以促进线粒体断裂，尽管PINK1/Parkin途径促进线粒体断裂的分子机制尚不清楚。我们验证了PINK1和Parkin通过靶向线粒体形态发生机制的核心成分实现泛素化来促进线粒体碎片化的假设。我们报告称，线粒体融合促进因子线粒体线粒体线粒体融合蛋白（dMfn）的稳态丰度与果蝇PINK1和Parkin的活性呈负相关。我们进一步报道，dMfn以PINK1和Parkin依赖的方式泛素化，并且dMfn-与Parkin共同免疫沉淀。相比之下，PINK1或Parkin的扰动并不影响线粒体裂变促进因子Drp1或线粒体融合促进因子Opa1的稳态丰度，或Drp1的亚细胞分布。我们的研究结果表明，dMfn是PINK1/Parkin途径的直接底物，线粒体形态改变和组织变性表型来源于粉红色1和停车场至少部分原因是泛素介导的dMfn周转减少。

引用：Poole AC、Thomas RE、Yu S、Vincow ES、Pallanck L（2010）线粒体融合促进因子线粒体是PINK1/Parkin通路的底物。公共科学图书馆综合5（4）：e10054。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010054

编辑：Mark R.Cookson，美国国立卫生研究院

收到：2009年12月19日；认可的：2010年3月15日；出版：2010年4月7日

版权：©2010 Poole等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作者和来源得到了认可。

基金：这项工作得到了a.C.P.的遗传方法老龄化训练补助金（5T32AG000057-32）和L.P.的国立卫生研究院补助金（1R01GM086394-01）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

介绍

帕金森氏病（PD）是一种常见的神经退行性运动障碍，由中脑多巴胺分泌神经元的退化引起。虽然系统性线粒体复合体I损伤是一个相对常见的特征，但帕金森病多巴胺神经元变性的机制尚不完全清楚[1]表明线粒体功能障碍在PD发病机制中起主要作用。该模型的进一步支持源于特定线粒体毒素可在人类和动物模型中引发PD-like综合征的发现[2],[3]; 线粒体DNA缺失在老年人多巴胺能神经元中发生的频率很高[4],[5]尤其是PD患者[4]; 与PD家族型相关的几个基因影响模型系统中线粒体的完整性[6],[7],[8].

最近对苍蝇和脊椎动物的研究表明，参与家族性PD的两个基因，粉红色1和停车场，以一种共同的途径调节线粒体形态[6].粉红色1编码线粒体靶向的丝氨酸/苏氨酸激酶，而停车场编码E3泛素蛋白连接酶。在果蝇中，功能丧失突变粉红色1和停车场导致线粒体增大和肿胀，飞行肌、精子和多巴胺能神经元变性[9],[10],[11],[12],[13],[14]这些表型至少可以通过增加线粒体抗裂变因子Drp1的基因剂量或减少线粒体融合促进因子Opa1或Mitousin（dMfn）的基因剂量而部分受到抑制[15],[16],[17],[18]这些发现表明，PINK1/Parkin途径可促进线粒体分裂或抑制线粒体融合，两者都会导致线粒体断裂。PINK1和Parkin也被证明影响脊椎动物的线粒体形态，尽管与在果蝇中进行的研究相比，线粒体断裂是哺乳动物细胞培养中PINK1和Parkins活性降低时最常见的表现型[19],[20],[21],[22]虽然这些不一致的发现可能反映了PINK1和Parkin影响脊椎动物和无脊椎动物线粒体形态的机制不同，但这种可能性尚未得到测试，因为PINK1.和Parkin.影响线粒体形态的分子机制尚不清楚。

在我们目前的工作中，我们测试了PINK1和Parkin通过直接作用于线粒体分裂或融合促进器的核心成分而影响果蝇线粒体形态的假设。我们报告称，dMfn以PINK1和Parkin依赖的方式泛素化，dMfn的稳态丰度与PINK1-和Parkin-活性呈负相关，Parkin与dMfn-共免疫沉淀。总之，我们的研究结果表明，dMfn是PINK1和Parkin的直接底物，PINK1和Parkin活性降低对线粒体形态和组织完整性的影响至少部分源于泛素介导的dMfm周转减少。

结果

为了验证Parkin促进线粒体形态发生机制核心成分泛素介导的周转这一假说，我们试图探索Parkin活性改变对线粒体裂变促进因子Drp1和线粒体融合促进因子Opa1和dMfn稳态丰度的影响。虽然果蝇编码第二个丝裂原同源物，只在雄性生殖系中表达[23],[24]，由于dMfn的广泛表达模式，我们重点关注它[24]因为PINK1基因在Parkin上游起作用[11],[12],[14]我们还试图测试PINK1活性的改变是否影响Drp1、Opa1和dMfn的稳态丰度。为了进行这些实验，我们使用与这些蛋白质序列对应的肽免疫原制备了抗果蝇Drp1和dMfn的抗血清。图1显示了使用这两种亲和纯化抗血清以及能够免疫沉淀果蝇Opa1的商业抗血清进行的western blot分析的结果（参见材料和方法第节）测试其特异性。

缩略图
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图1。Western blot分析显示识别果蝇dMfn、Opa1和Drp1的抗血清的特异性。

（A） 来自wt苍蝇和表达UAS-dmfn-RNAi公司维也纳或UAS-dmfn-RNAi公司郭靶向dmfn公司用抗dMfn抗血清对该基因进行western blot分析。这个hsp70-GAL4型驱动程序用于诱导dmfn-RNAi公司在3小时热休克方案后24至48小时收集转基因和苍蝇进行分析。箭头表示dMfn带在94 kDa的位置。星号（*）表示在80 kDa和110 kDa处检测到两个非特异性带。（B） wt苍蝇的蛋白质提取物UAS-Opa1-FLAG公司转基因与中胚层特异性24B-镀锌4司机和苍蝇UAS-opa1RNAi公司转基因与肌肉特异性dmef2-GAL4驾驶员用抗Opa1抗血清进行了western blot分析。（C） wt苍蝇的蛋白质提取物UAS-Drp1-HA公司转基因与肌肉特异性dmef2-GAL4驾驶员和苍蝇杂合Df（2L）Excel6008删除染色体（删除drp1（数字参考1）基因）用亲和纯化的抗Drp1抗血清进行western blot分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010054.g001

抗dMfn抗血清可识别多条带，包括94kDa中的一条，这与果蝇中预测的dMfn亚型的91-94kDa大小很好地对应(图1A). 在表达两种不同RNAi结构的果蝇中，我们的抗血清识别的94kDa条带的丰度选择性降低，这两种结构的靶向是dmfn公司转录本，表明该带代表dMfn。我们的抗dMfn抗血清检测到的其他条带不受RNAi处理的影响，表明它们代表非特异性交叉反应物种。

抗Opa1抗血清检测80 kDa、100 kDa和105 kDa的条带(图1B). 这些条带中所有三条的强度都被靶向opa1蛋白FLAG标记的Opa1结构的转录和过度表达导致出现更强烈的80kDa和100kDa带。在脊椎动物中，成熟的Opa1蛋白在线粒体中被蛋白质分解成几种低分子量形式[25]因此，105 kDa Opa1带可能代表Opa1的全长或近全长形式，果蝇的Opa1预计在107和112 kDa之间，而80 kDa和100 kDa的Opa1带可能对应于该蛋白质的蛋白质水解处理形式。虽然我们不知道为什么Opa1过度表达会选择性地影响低分子量Opa1物种的丰度，但我们的研究结果支持这样的结论，即这种抗血清能够特异性地识别Opa1。

抗Drp1抗血清识别果蝇中70和75 kDa的条带，这相当接近该蛋白预测的83 kDa大小(图1C). 这两条带的强度在带有杂合零突变的苍蝇株中都会减弱drp1（数字参考1）并且在过度表达Drp1的转基因果蝇中增加，这表明这两条带都代表Drp1，并且我们的抗血清对Drp1具有特异性。在脊椎动物中，Drp1受到多种翻译后修饰，包括磷酸化、泛素化和sumoyalization[26]因此，两种不同形式的果蝇Drp1可能来源于翻译后修饰，或者源于drp1（数字参考1）基因。总之，我们的发现表明，我们针对Drp1、Opa1和dMfn的抗血清能够有效识别果蝇中的这三种蛋白质。

我们使用我们的三种抗血清比较野生型（wt）苍蝇中Drp1、Opa1和dMfn的稳态丰度，公园25无效突变体，以及粉红色1B9公司null突变体。这些分析表明，dMfn丰度在公园25和粉红色1B9公司相对于wt控制的空突变体(图2A、B). 相比之下，我们没有检测到Opa1或Drp1的稳态丰度或分子量在公园25或粉红色1B9公司相对于wt控制的空突变体(图2C、D). 中的突变粉红色1和停车场也未能影响定位于线粒体的几个控制蛋白的分子量或丰度，包括线粒体复合物V的β亚单位和线粒体电压依赖性阴离子通道（VDAC，也称为孔蛋白），这表明dMfn的丰度增加粉红色1和停车场突变体并不反映线粒体质量的普遍增加(图2). 其丰度没有显著变化dmfn公司成绩单公园25或粉红色1B9公司相对于wt的零突变（数据未显示），表明粉红色1和停车场通过转录后机制影响dMfn蛋白丰度。

缩略图
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图2。的扰动粉红色1和停车场特别影响dMfn丰度。

雄性体重（m）的蛋白质提取物，粉红色1B9公司半合子雄性、wt雄性和雌性（m和f）和公园25雄性和雌性用亲和纯化抗dMfn抗血清（A）、抗Opa1抗血清（C）、亲和纯化的抗Drp1抗血清、抗复合Vβ抗血清（A，C，D）、抗VDAC抗血清（甲，丙，D）和抗肌动蛋白抗血清（乙，丙，丁）进行western blot分析。（A）中的箭头表示dMfn带在94 kDa处的位置，星号（*）表示非特定带。（B） dMfn丰度的量化粉红色B9和公园25相对于wt控制的空突变体。因为粉红色1B9公司雄性不育粉红色1基因存在于X染色体上，我们只能产生男性粉红色1B9公司突变体，因此使用wt雄性作为这些突变体的控制种群。每个分析样品的dMfn与肌动蛋白丰度之比由三个独立的印迹获得；将wt对照的比率设置为1，并将突变比率标准化为wt比率*经Student t检验，p<0.05。（E） 线粒体和细胞溶质部分的蛋白质提取物（参见材料和方法分馏细节部分）用亲和纯化的抗Drp1抗血清、抗复合Vβ（CompV）抗血清、VDAC抗血清和抗肌动蛋白抗血清进行western blot分析。（F） wt苍蝇和过度表达Parkin的苍蝇的蛋白质提取物(hsp70-GAL4/UAS-停车)果蝇过度表达PINK1(hsp70-GAL4/UAS-PINK1)用亲和纯化的抗dMfn抗血清、抗复合Vβ抗血清、VDAC抗血清和抗肌动蛋白抗血清进行western blot分析。对苍蝇进行1小时的热休克，并在热休克24小时后收集苍蝇进行分析。箭头表示dMfn带在94 kDa处的位置，星号（*）表示两个非特异性带。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010054.g002

我们还探讨了PINK1或Parkin活性降低可能影响Drp1的亚细胞分布的可能性，Drp1从细胞质中被募集到线粒体中以促进线粒体分裂。然而，我们没有检测到与线粒体一起分布的Drp1部分发生明显变化公园25或粉红色1B9公司与wt对照组相关的突变体(图2E)尽管该实验表明，较高分子量形式的Drp1在wt和突变样品中似乎优先定位于线粒体。这一发现可能提供了对Drp1被招募到线粒体的机制的见解，并将在未来的工作中进一步探索。

考虑到dMfn的丰度在粉红色1和停车场我们还测试了PINK1和Parkin过度表达对dMfn丰度的影响。这些研究表明，相对于wt对照，PINK1或Parkin的过度表达导致dMfn丰度降低(图2F). PINK1和Parkin过度表达的影响似乎对dMfn具有特异性，因为我们未能检测到PINK1或Parkin过表达对线粒体复合物V或VDAC的β亚基丰度或大小的任何影响，VDAC与dMfm一样定位于线粒体外膜(图2F).

我们发现dMfn的丰度在粉红色1和停车场PINK1和Parkin的突变和过度表达后的减少与PINK1和Parkin-促进泛素介导的dMfn周转的假设一致。对这一假设的预测是，wt苍蝇体内存在一种泛素化形式的dMfn，至少是暂时存在的，并且这种泛素化的dMf的丰度在粉红色1和停车场突变体。为了验证这一预测，我们从野生苍蝇中免疫沉淀了dMfn，粉红色1突变体和停车场突变体，并使用抗dMfn和抗泛素抗血清对这些免疫沉淀物进行western blot分析。为了控制我们的抗dMfn抗血清的特异性，我们还从表达靶向dMfn公司转录，并用抗dMfn和抗泛素抗血清对免疫沉淀进行western blot分析。抗泛素抗血清在wt苍蝇的免疫沉淀物中检测到约120kDa的条带，但在表达靶向细胞的RNAi构建物的苍蝇中仅检测到非常微弱的120kDa-条带dMfn公司成绩单(图3)表明wt蝇体内存在低丰度的泛素化dMfn。相比之下，来自粉红色1B9公司空突变体和公园25尽管有更多的dMfn被免疫沉淀，但相对于wt，空突变体显著减少粉红色1B9公司和公园25与wt相关的突变体(图3). 使用独立产生的抗dMfn抗血清重复这些实验，从上述基因型的苍蝇中免疫沉淀dMfn，获得了相同的结果(图S1). 尽管在粉红色1空突变体(图3)，这一发现与之前的遗传学研究一致，该研究表明Parkin能够至少部分补偿PINK1活性的丧失[11],[12],[14],[15]此外，发现dMfn在粉红色1空突变体解释了粉红色1相对于的无效突变体停车场空突变体[9],[10],[11],[12],[13],[15].

缩略图
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图3。dMfn以依赖PINK1和Parkin的方式普遍存在。

用亲和纯化的抗dMfn抗血清免疫沉淀野生型苍蝇的dMfn，粉红色1B9公司突变体，以及公园25突变体。作为特异性的对照，抗dMfn抗血清也用于免疫沉淀来自带有hsp70-GAL4型驱动表达式UAS-dmfn-RNAi公司维也纳.在左侧面板中，免疫沉淀中使用的3%的裂解物输入使用抗泛素抗血清进行western blot分析，以表明所有基因型的泛素化水平相似。在中间和右侧面板中，使用抗泛素抗血清（中间面板）或抗dMfn抗血清（右侧面板）对所有四种基因型的dMfn-免疫沉淀物进行western blot分析。箭头表示wt苍蝇中检测到的未经修饰的dMfn物种，粉红色1B9公司突变体，以及公园25突变体，在表达UAS-dmfn-RNAi公司维也纳箭头表示泛素dMfn物种的位置。这些分析重复了至少三次，结果相似。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010054.g003

我们的发现与PINK1/Parkin通路促进泛素介导的dMfn周转的模型一致。虽然对我们的研究结果最简单的解释是，Parkin直接促进dMfn的泛素化，但我们不能排除Parkin通过间接机制实现dMfn泛素化的可能性。为了帮助区分这些模型，我们从wt苍蝇中免疫沉淀Parkin，并用抗dMfn抗血清对免疫沉淀进行western blot分析。为了控制dMfn与我们的抗Parkin抗血清可能的非特异性相互作用，我们还从公园25用抗Parkin抗血清进行免疫沉淀，然后将该免疫沉淀用于我们的抗dMfn抗血清的western blot分析。这些实验表明，dMfn与Parkin在wt苍蝇中共免疫沉淀，但未能在来自公园25突变体(图4). 这些发现表明Parkin与dMfn组装成复合物，并表明dMfn是Parkin的直接底物。

缩略图
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图4。dMfn与Parkin组装。

亲和纯化的抗Parkin抗血清用于免疫沉淀wt苍蝇和公园25null突变体。作为公园25苍蝇不产生任何Parkin蛋白，这种免疫沉淀可以控制其他蛋白与Parkin抗血清的任何非特异性结合。用抗dMfn抗血清对用于免疫沉淀的总裂解液和Parkin免疫沉淀的3%进行western blot分析。只有wt苍蝇中出现了与dMfn带相对应的带，表明Parkin和dMfn之间存在相互作用。星号（*）表示非特异性条带。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010054.g004

讨论

在之前的工作中，我们和其他人表明，促进线粒体断裂的基因操作，包括增加drp1（数字参考1）基因剂量和减少opa1蛋白或dmfn公司基因剂量，显著抑制粉红色1和停车场果蝇的突变表型[15],[16],[17],[18]这些发现，再加上之前的工作证明PINK1在Parkin上游的共同通路中发挥作用[11],[12],[14]，导致我们假设PINK1和Parkin通过泛素化调节线粒体形态发生机制的核心成分来影响线粒体完整性[15]我们目前的研究结果通过证明dMfn以PINK1和Parkin依赖性的方式泛素化，以及dMfm的稳态丰度在粉红色1和停车场PINK1-和Parkin-过表达果蝇的突变和减少。这些发现表明PINK1磷酸化dMfn或Parkin，从而提高Parkin泛素化dMf的效率。随后泛素介导的dMfn转换将抑制线粒体融合，从而促进线粒体断裂(图5). 在回顾我们目前的研究结果的同时，另一项主要使用培养果蝇S2细胞的研究也报告了dMfn是PINK1/Parkin通路的底物，从而为我们的结论提供了额外的支持[27].

缩略图
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图5。PINK1/Parkin途径促进线粒体断裂和周转的潜在模型。

先前的研究表明，PINK1定位于线粒体外膜，其激酶域面向细胞质[28],[39]需要选择性地将Parkin补充到受损的线粒体中，以促进这些线粒体的自噬清除[27],[28],[29],[30],[31]我们的模型假设，当Parkin募集到线粒体网受损部分时，它会泛素化（Ub）线粒体融合促进因子Mitofusin，从而标记其降解，或以其他方式使其融合促进活性失活。随后依赖Drp1的线粒体分裂将产生线粒体产物，线粒体产物受损，线粒体线粒体缺乏线粒体毒素，因此无法重新进入线粒体网络。这些小的受损线粒体分裂产物将成为自噬降解的靶点。虽然我们的图描绘了一个模型，其中Parkin在线粒体分裂前结合，但Parkin也可能在分裂后被招募到受损的线粒体中。另一种模型是，线粒体泛素化是受损线粒体周转的信号。这些可能的模型并不相互排斥。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010054.g005

我们之前的发现，PINK1/Parkin通路促进线粒体碎片化，这使我们提出，该通路可能通过自噬机制分离线粒体网受损部分进行周转[15]最近的几项研究证明，用线粒体损伤剂处理培养的脊椎动物细胞会触发PINK1选择性地将Parkin招募到受损的线粒体，Parkin在线粒体中促进这些线粒体的自噬周转，从而有力地支持了这一假设，可能是通过泛素化特定的线粒体靶点[28],[29],[30],[31]这些研究以及我们目前的研究结果增加了以下可能性：选择性Parkin介导的泛素化以及线粒体网受损部分dMfn随后的降解，再加上持续的线粒体分裂，有助于隔离线粒体对小融合不全线粒体的损伤，这些线粒体随后通过自噬被消除(图5). 然而，泛素化dMfn的大小表明它是泛素化的三倍，先前的研究表明，有效靶向蛋白酶体需要四个或更多泛素链[32]因此，对我们的研究结果的另一种解释是，尽管并非相互排斥，但dMfn的泛素化使dMfn的促融合活性失活，或作为标记受损线粒体的标签，以供自噬破坏。过氧化物酶体表面蛋白的泛素化足以表明该细胞器的自噬降解[33]与我们的后一个模型一致。目前正在进行实验以区分这些可能性。

虽然我们的模型中PINK1/Parkin途径通过dMfn的泛素化促进线粒体碎片化，这与之前关于果蝇PINK1和Parkin的研究完全一致，但脊椎动物细胞培养研究的最新发现对该模型提出了挑战。特别是，对脊椎动物系统中PINK1的几项研究发现，PINK1活性降低会导致线粒体断裂[19],[20],[21],[22]这表明PINK1可能促进线粒体融合，这与对果蝇PINK1/Parkin途径的研究得出的结论正好相反。虽然需要额外的工作来解决这些明显的冲突，但重要的是要指出，对果蝇中PINK1和Parkin的研究结果涉及的组织受到PINK1和Parkin活性丧失的严重影响，然而，至少在一些相互矛盾的脊椎动物研究中使用的细胞组织来源在很大程度上不受粉红色1和停车场因此，对这些明显不一致的发现的一种可能的解释是，在脊椎动物系统中观察到的由PINK1活性降低引起的线粒体断裂涉及这些细胞中线粒体断裂的补偿诱导，这也许也解释了他们对PINK1活性丧失的相对不敏感。该模型的潜在支持是发现，虽然在PINK1缺失的脊椎动物细胞中看到的线粒体碎片可以通过灭活Drp1来挽救，但这种操作会加剧与PINK1缺失相关的细胞死亡[21]这一发现与苍蝇实验结果完全一致。未来的工作应该解决这些明显的冲突，并进一步阐明依赖PINK1和Parkin的dMfn泛素化对线粒体完整性的影响。

材料和方法

苍蝇变种。

这个UAS-PINK1型 [12],UAS停车场 [9],UAS-Opa1-FLAG公司 [16],UAS-Drp1-HA公司 [16],UAS-opa1-RNAi [17],UAS-dmfn-RNAi公司郭 [17],dmef2-GAL4 [34],elav-GAL4型 [35],24B-镀锌4 [36]和hsp70-GAL4型 [37]转基因株系与公园25 [9]和粉红色1B9公司 [12]等位基因之前都有描述。针对dmfn公司成绩单(无人机dmfn RNAi维也纳)来自维也纳果蝇RNAi中心（奥地利维也纳）。这个Df（2L）Excel6008删除库存，删除drp1（数字参考1）该基因是从布鲁明顿库存中心（印第安纳州布鲁明顿）获得的。

热休克诱导协议。

苍蝇同时携带热休克蛋白70-GAL4通过在37°C下孵育1小时，使驾驶员和感兴趣的GAL4应答转基因受到热休克。对于RNAi转基因，苍蝇在30°C下再孵育2小时。热休克后，苍蝇要么在液氮中快速冷冻，要么在冷冻前在18°C下保持不同时间。

Antigra。

之前已经描述过识别果蝇Parkin的兔多克隆抗血清[38]利用与这些蛋白质序列相对应的合成肽（Drp1:PPAPTRPDSIENST；dMfn:FTGKVRERSKKGQP），由商业来源（宾夕法尼亚州加拿大人波科诺兔场）产生识别果蝇Drp1和dMfn的兔多克隆抗血清。使用诱导这些抗血清的合成肽作为亲和色谱中的配体纯化抗Drp1和抗dMfn抗血清，如所述（Thermo Scientific SulfoLink多肽固定试剂盒，Thermo scientifics（马萨诸塞州沃尔瑟姆）#44999）。在测试商用兔抗人线粒体毒素2抗血清（西格玛（密苏里州圣路易斯）#M6319）是否会与相应的苍蝇蛋白发生交叉反应的过程中，该抗血清用于从成虫蛋白提取物中免疫沉淀蛋白质，免疫沉淀接受串联质谱分析。该分析检测到11种Opa1肽（13.7%的序列覆盖率），但未能检测到与两种苍蝇线粒体蛋白中任一种对应的肽。支持Opa1抗血清特异性的其他证据见图1小鼠单克隆抗泛素抗血清（Ub（P4D1），sc-8017；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA）用于检测泛素化蛋白质。使用小鼠单克隆抗体检测线粒体内膜蛋白OxPhos Complex V亚单位β（Molecular Probes（Eugene，OR）#A 21351）、线粒体外膜蛋白孔蛋白（VDAC）（MitoSciences（Eugene，OR，#MSA03）和肌动蛋白（Chemicon（Billerica，MA）#MAB1501）。

蛋白质印迹分析。

蛋白质通过SDS-PAGE在10%Tris丙烯酰胺凝胶或NuPAGE 4–12%Bis-Tris凝胶（Invitrogen#NP0335）上分离，并电泳转移到硝化纤维素或PVDF膜上。在兔抗hMfn2（dOpa1）1∶500、小鼠抗OxPhos复合物V亚基β1∶20000、小鼠抗VDAC 1∶1000、小鼠抗肌动蛋白1∶50000、小鼠抗泛素1∶500的浓度下，用商品抗体进行免疫检测。二级抗体，抗兔HRP和抗鼠HRP（Sigma），以1∶10000的比例使用，信号检测使用热科学电化学发光（ECL）试剂。使用软件程序NIH Image 1.62（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）进行量化，方法是测量波段密度，并从扫描图像中相同大小的无波段区域中减去背景。

免疫沉淀。

为了产生用于免疫沉淀的蛋白质提取物，将100–200只成虫冷冻在液氮中，使用冷冻的研钵和杵磨成细粉，转移到Dounce均质器中，并在1.5 ml的溶解缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1%NP-40、10%甘油、10 mM NaF、1 mM Na）中均质三VO（旁白）4，100µg/ml PMSF，西格玛蛋白酶抑制剂混合物（西格玛#P8340））。得到的裂解物在12000℃进行离心克在4°C下放置15分钟，以去除表皮物质和细胞碎片。用裂解缓冲液将上清液的蛋白质浓度调节为2µg/µl，并在4°C下与纯化的dMfn抗血清孵育过夜。然后将蛋白G Sepharose（GE Healthcare，Piscataway，NJ）珠添加到裂解液中3小时，通过低速离心收集，在裂解缓冲液中洗涤三次，并在含有2%β-巯基乙醇的2X SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸10分钟，以释放免疫沉淀dMfn。然后对煮沸的样品进行离心，使其颗粒化，并使用western blot分析上清液。

亚细胞分离。

50只成虫在微型离心管中用小杵在亚细胞分馏缓冲液（220 mM甘露醇、68 mM蔗糖、20 mM HEPES（pH 7.4）、80 mM KCl、0.5 mM EGTA、2 mM Mg（CH三COO）2和西格玛蛋白酶抑制剂混合物（西格玛#P8340））。然后将匀浆转移到Dounce匀浆器中，用杵击30下进一步匀浆，然后在1500下离心克在4°C下保持5分钟，以制备核后上清液。核后上清液在10000℃下离心克在4°C下持续25分钟，使线粒体颗粒化，并产生由可溶性细胞溶质蛋白组成的线粒体后上清液。然后将线粒体后上清液和线粒体颗粒悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中并用于蛋白质印迹分析。

支持信息

图S1。

一种独立生成的抗dMfn抗血清证实，dMfn以PINK1和Parkin依赖的方式泛素化。Alex Whitworth博士提供了一种针对肽DTVDKSGPGSPLSRF产生的抗dMfn抗血清，用于免疫沉淀wt苍蝇、PINK1[B9]突变体和park中的dMfm[25]突变体。用hsp70-GAL4驱动UAS-dmfn-RNAi表达的苍蝇裂解液[维也纳]也进行免疫沉淀，以确认Whitworth博士提供的抗dmfn抗血清的特异性。在左侧面板中，免疫沉淀中使用的3%的裂解物输入使用抗泛素抗血清进行western blot分析，以表明所有基因型的泛素化水平相似。在中间和右侧面板中，使用Whitworth博士提供的抗dMfn抗血清衍生的dMfn-免疫沉淀物用抗泛素抗血清（中间面板）或我们的抗dMpn抗血清（右侧面板）进行western blot分析。箭头表示wt苍蝇、PINK1[B9]突变体和park中检测到的未经修饰的dMfn物种[25]突变体，在表达无人机dmfn RNAi的苍蝇中水平降低[维也纳]。箭头表示泛素dMfn物种的位置。所有显示的分析重复两次，结果相似。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010054.s001

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致谢

作者们想对劳里·安德鲁斯、莱斯利·金和Kien Trinh表示感谢，感谢他们对我们手稿中所报道工作的技术帮助。我们也要感谢郭铭博士、钟钟强博士、安德烈亚·达加博士和亚历克斯·惠特沃思博士提供的苍蝇种群和试剂。此外，我们还要感谢Gennifer-Merrihew和Michael MacCoss博士在确认抗血清特异性方面的帮助。最后，特别感谢Alex Whitworth博士从他的实验室提供了未公开的信息，并为我们提供了一种独立的抗dMfn抗血清。

作者贡献

构思并设计了实验：ACP RET LP。执行实验：ACP RET SY ESV。分析数据：ACP RET SY ESV LP。贡献的试剂/材料/分析工具：ACP RET SY ESV。撰写论文：ACP RET SY ESV LP。

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