摘要
木糖发酵是木质纤维素生物质高效生产乙醇的基本要求。尽管它们会大量发酵己糖，但长期以来人们认为酿酒酵母菌株不能在木糖上发酵或非发酵生长。人口调查发现了一些天然存在的弱木糖阳性菌株，以及一些酿酒酵母已经通过基因工程来发酵木糖，但还没有任何一种天然或工程菌株能像葡萄糖那样有效地发酵木糖。在这里，我们使用中等吞吐量屏幕来识别酵母菌属当木糖作为唯一碳源时，可以增加光密度的菌株。我们鉴定了38株具有这种木糖利用表型的菌株，包括酿酒酵母，其他严格的感觉成员以及他们之间的混血儿。所有的酿酒酵母我们鉴定的木糖利用菌株是葡萄酒酵母，对于那些能够产生减数分裂后代的菌株，木糖表型分离为一个单基因性状。我们使用平铺微阵列和高通量测序通过批量分离分析（BSA）对该基因进行了定位。该基因是一种假定的木糖醇脱氢酶，我们将其命名为XDH1型，位于S288c参考基因组中不存在的一个区域中第XV染色体右端的亚巨细胞区。我们通过基因表达微阵列和基因解剖内源性木糖表型进一步表征了木糖表型酿酒酵母木糖途径。我们已经证明了酿酒酵母酵母能够利用木糖作为唯一碳源，表征了这一性状的遗传基础以及内源木糖利用途径，并证明了利用高通量测序进行BSA的可行性。
作者摘要
由面包酵母发酵木质纤维素生物质制成的乙醇可以被视为“碳中性”，是驱动车辆的化石燃料的一种替代品。成本效益高、能效高的纤维素乙醇生产的公认要求之一是需要将纤维素生物的主要成分糖木糖转化为乙醇；然而，传统上认为面包酵母不能发酵木糖。我们试图通过观察世界各地面包酵母的近亲来研究这一假设，看看是否有任何面包酵母具有生长木糖的内在能力。我们鉴定了一些酵母菌，其中许多用于酿酒，它们在这种糖上生长非常缓慢，并对其中一种进行了详细研究。我们确定，在这种特殊的酵母中，能够在木糖上生长是由于存在一个我们命名的基因XDH1型这种基因在面包酵母的典型实验室菌株中不存在，但在天然葡萄酒酵母中似乎很常见。这种基因可能有助于继续努力制造能够有效地将木糖发酵成乙醇的酵母。
引用：Wenger JW，Schwartz K，Sherlock G（2010）通过高通量测序进行的大块分离物分析揭示了来自酿酒酵母《公共科学图书馆·遗传学》6（5）：e1000942。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000942
编辑：顾正龙，美国康奈尔大学
收到：2009年11月25日；认可的：2010年4月8日；出版：2010年5月13日
版权：©2010 Wenger等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作者和来源得到了认可。
基金：我们感谢斯坦福大学全球气候与能源项目（GCEP）（33450号拨款）以及NIH-NIGMS遗传与发育生物学培训项目（NIHGM007790号拨款）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
介绍
显然，社会有责任解决气候变化的人为原因。目前的估计表明，世界上大约95%的能源来自燃烧化石燃料[1]是二氧化碳排放的主要贡献者。在美国，运输用液体化石燃料的燃烧是这些二氧化碳排放量的很大一部分，仅次于发电（美国环境保护署）。基于这些原因，创造“碳中性”液体运输燃料应该是全球减少碳排放努力的重要组成部分。
一种已经被广泛使用的解决方案是由甘蔗（巴西）或玉米淀粉（美国）通过各种菌株发酵而成的生物乙醇酿酒酵母 [2]用作液体运输燃料的主要成分或添加剂。为了使生物乙醇成为一种可持续的、经济上可行的商品，并且不与粮食来源竞争，有必要从甘蔗或玉米生物质转向木质纤维素生物质来源，如玉米秸秆或其他农业废弃物、木材副产品或专用燃料作物，如芒属或柳枝稷[3]–[5]然而，在实现这一目标之前，必须克服一些技术挑战。对于甘蔗和玉米生物量来说，主要的糖是葡萄糖和/或果糖，这两种糖很容易通过各种方式发酵成乙醇酿酒酵母酵母菌株，通常是野生菌株，特别适合大规模发酵[6],[7]然而，在木质纤维素生物质来源中，仅次于葡萄糖的第二丰富碳水化合物是木糖，木糖是半纤维素的主要戊糖。目前还没有已知的酵母菌属它能够像葡萄糖一样有效地将木糖转化为乙醇。由于在常见的农业木质纤维素生物材料中，半纤维素的质量比例在20–50%之间，因此寻找一种经济高效的木糖转化为乙醇的方法是一个关键的障碍[8].
芽殖酵母酿酒酵母由于多种原因，它是工业发酵的首选微生物，主要是因为它在需氧和厌氧条件下都具有较高的乙醇生产率，具有较高的酒精和低pH耐受性，并且对典型生物质水解液中的许多有害化合物具有抗药性。尽管最近有证据表明酿酒酵母可以在木糖上生长，尽管生长很差[9]，据普遍报道，天然和实验室酿酒酵母菌株不发酵木糖[10]–[12]这导致了这样一种假设，即如果不借助基因工程，它们就无法用于将木质纤维素高效转化为乙醇。While期间酿酒酵母研究表明，这些菌株能够发酵木糖异构体木果糖，并拥有可能编码木糖还原酶的基因(GRE3考试,总承包商1,YPR1型,YDL124W型,YJR096W型)，木糖醇氧化(XYL2型,SOR1标准,SOR2标准)和木糖磷酸化(XKS1型) (图1)，有许多实验观察表明酿酒酵母不能发酵木糖[13]–[15]这些观察结果包括内源酶的基因表达水平低、木糖运输不良、氧化还原辅因子失衡以及通过戊糖-磷酸分流的流量不足[16],[17]尽管这些问题在实验室菌株中得到了很好的表征酿酒酵母，对内部的自然变化知之甚少酿酒酵母酵母，因为它与木糖的利用有关，正如已经显示的那样[9]可能与该表型有关。
在过去的30年里，在解决这些问题方面取得了重大进展，大部分工作都集中在将外源木糖途径酶引入酿酒酵母：木糖利用真菌中木糖还原酶[XR]、木糖醇脱氢酶[XDH]或木糖激酶[XK]的编码基因毕赤酵母针炎 [18]–[22]或编码其他真菌和细菌木糖异构酶[XI]的基因[23]–[28]也有人努力增加或调整木糖途径酶活性（XR、XK、XDH）[15],[29]–[33]和戊糖磷酸助熔剂[34],[35]，减少氧化还原失衡[36]–[41]，并使用定向进化或随机突变来提高木糖利用率[42]–[45]尽管进行了大量的工作，但在这些菌株中木糖发酵为乙醇的速度仍然比葡萄糖慢得多，木糖发酵以及通过酿酒酵母用于工业规模应用。
如上所述，已确定酿酒酵母能够在木糖上生长，这与酿酒酵母不承认这种戊糖是可用的碳源[9]它还具有丰富的自然遗传和表型变异酿酒酵母和密切相关的物种[46]–[51]在这项工作中，我们筛选了大量野生、工业和实验室酵母菌株，以确定是否有其他木糖利用菌株酵母菌属已经存在于自然界中，如果存在，则确定表型的遗传基础。我们筛选了647株菌株，发现了一些不同的酵母菌属酵母菌，主要是葡萄酒酵母，能够利用木糖，尽管用量不大。通过高通量测序在散装分离物分析中的应用[BSA][52]，我们能够在一种葡萄酒菌株中鉴定出负责木糖利用的基因酿酒酵母，编码一种新的木糖醇脱氢酶，我们将其命名为XDH1型我们观察到，该基因存在于许多不同的葡萄酒菌株中，并与这些菌株的木糖利用有关，但我们在我们的筛选中发现了其他似乎具有木糖利用独立遗传基础的菌株。我们还进行了转录谱分析，以表征葡萄酒菌株衍生物中木糖利用过程中的基因表达模式，并确定了天然木糖的贡献酿酒酵母我们观察到木糖途径酶的表型。这些数据表明，推测的酶编码XDH1型与天然木糖途径结合使用酿酒酵母识别和利用木糖的菌株。
结果
木糖利用屏幕
识别自然酵母菌属能够利用木糖的物种/菌株，我们筛选了酵母集合中的每个菌株，将其置于以木糖为唯一碳源的液体培养基中，在25°C下培养数天后，其光密度[OD]增加的能力。我们测量了647株菌株的OD(表S1)以密封的96摆板形式，具有恒定的轨道振动（参见材料和方法). 该系列主要包括酿酒酵母来自各种来源的菌株，包括葡萄酒、酿造、烘焙、实验室和临床分离物，但也含有其他狭义酵母菌酵母和它们之间的各种杂交。在测试的647株菌株中，我们确定了38株OD显著增加的菌株(表1). 这些“木糖阳性”菌株主要是（29/38）酿酒酵母葡萄酒酵母（虽然不是所有的葡萄酒酵母都是木糖阳性的），其余的是种间杂种严格的感觉组。这些木糖阳性杂交菌株在木糖培养基中的OD通常高于酿酒酵母葡萄酒品种。图2A显示了典型的酿酒酵母葡萄酒菌株图谱以及最佳杂交品种之一的图谱，比较了在含有木糖的培养基和无碳源的相同培养基中的生长情况。虽然OD的增加并不能证明木糖发酵为乙醇，甚至细胞分裂，但这些数据确实表明，木糖发酵是天然的酵母菌属能够利用木糖积累生物量的酵母。
为了了解木糖利用的遗传基础，我们选择了葡萄酒菌株作为研究重点，因为许多菌株可以产孢并与实验室菌株杂交酿酒酵母，因此我们可以确定表型的分离模式。其中二十五个木糖阳性酿酒酵母菌株可以产孢，四分体可以被切割(表1). 注意，因为菌株具有野生型总公司基因，四分体切割后获得的孢子产物实际上是完全纯合的二倍体，这是由于单倍体孢子在切割板上生长时的自交。木糖阳性的8/25酿酒酵母菌株，所有孢子产物均呈木糖阳性（如Simi White、，图2B)而在2/25中，该性状分离出2个木糖阳性：2个木糖阴性（例如Lalvin AC，图2C). 在剩下的15个菌株中，包括三个没有发现木糖阳性孢子的菌株，孢子活力很差，没有获得完整的四分体，因此无法确定分离模式。然后，我们从所有可获得木糖阳性孢子的菌株中提取木糖阳性的孢子产物，并将其交叉（参见材料和方法)到实验室酿酒酵母应变，S288c。我们观察到所有产生的二倍体均为木糖阳性，表明表型为显性（数据未显示）。然后对产生的菌株进行孢子化，在可以建立分离模式的菌株中，木糖阳性性状分离产生两个阳性和两个阴性孢子，表明木糖阳性特性是由一个基因引起的（例如Simi White，图2D). 为了确定同一基因座是否负责这些不同葡萄酒菌株的木糖利用，我们在不同葡萄酒菌株之间杂交木糖阳性孢子，并确定这些杂交后代中木糖表型的分离模式。在所有进行的杂交中，木糖阳性表型在六个四分体中分离为4∶0(图2E); 这定义了一个由至少9个葡萄酒菌株组成的队列，其中包含负责表型的单个互补群（位点）(图2F). 这些数据表明，一个单一的显性基因座负责允许木糖在这些植物中的利用酿酒酵母菌株，表明木糖利用的这种机制在我们鉴定的所有木糖阳性葡萄酒酵母中都是常见的。这些数据还表明，这个基因座可能在血统上是相同的，这与葡萄酒品种关系密切的证据是一致的，可能只有几千年前才出现分歧[46],[49],[50].
批量分离分析法鉴定责任基因
为了确定木糖利用基因的基因组位置，我们进行了BSA[53]使用Affymetrix酵母平铺阵列。BSA的工作原理是利用不同菌株之间的DNA序列多态性，以及在酵母中比较容易聚集大量减数分裂孢子产物（分泌物）这一事实。基于表型的混合分离物允许检测负责表型的基因组区域，因为与责任位点无关的区域中的DNA多态性将随机分离并“均匀”，而序列或多态性要么直接负责该性状，要么与该性状密切相关，在所有阳性分离物中均存在，在所有阴性分离物中不存在。在我们的案例中，携带木糖利用位点的西米白葡萄酒菌株被杂交到实验室菌株；此前估计该葡萄酒菌株相对于实验室菌株的DNA多态性约为0.5%[54]对Simi White/S288c二倍体的孢子进行木糖利用表型筛选，将39个阳性孢子合并到一个池中，39个阴性孢子合并到另一个池，并从每个池中分离基因组DNA[gDNA]。然后，我们将阳性和阴性gDNA池杂交到平铺微阵列（基于S288c参考基因组），期望源自Simi White的基因组区域由于Simi White和S288c之间的DNA多态性而与阵列杂交不那么牢固。日志2计算探针强度的比率（阴性/阳性），通过目视检查，在第十五号染色体右球膜下区域有一个明显的峰值，对应于阳性池gDNA微阵列的弱杂交(图3). 我们利用酵母缺失集合中的菌株进行连锁分析，确认木糖阳性性状在该区域的定位，表明木糖阳性特性与减数分裂共分离菲律宾比索(约尔386W),约尔378W、和约尔365C(2). 我们克隆了位于PHR1型（包含约尔389W,约尔390W,热休克蛋白33,约尔392W,错误1、和PAU21型)从Simi White（GSY2469）和Lalvin AC（GSY1362）的单倍体木糖阳性分离物中分离出来，并用构建物独立转化了一个基于S288c的实验室菌株（FY2），但Simi Whit和LalvinAC衍生构建物均未赋予木糖阳性表型（数据未显示），表明该基因不在该10kb区域内。因为酵母端粒区域容易扩增、插入和移位[55]相反，我们考虑了感兴趣的性状可能位于S288c参考基因组中亚基因组序列的远端插入。
为了确定XV染色体上是否有包含木糖利用表型相关基因的插入，我们在相同的Simi-White gDNA库以及四个额外的库中使用Illumina高通量测序重复了BSA，包含19个来自Lalvin AC/S288c杂交的阳性和16个来自SIHA Activ-Hefe 4/S288c杂交的阴性和16个阳性。我们选择牛血清白蛋白对单个菌株进行测序，以丰富木糖阳性表型的相关序列（或与之紧密相关的序列），因为葡萄酒菌株中可能存在许多其他新序列，这些序列不存在于S228c基因组中，但与木糖表型无关。Simi White阳性池和阴性池的测序结果约为S288c基因组的50倍覆盖率（每个池约17M映射读取数），Lalvin AC和SIHA池的测速结果约为25倍覆盖率(表S3). 使用软件程序MAQ将36个碱基对序列读取与S288c参考基因组对齐[56].
为了确定阳性池中是否存在阴性池中不存在的序列，我们执行了从头开始的组装未映射到S288c参考基因组的读码。因为从头开始的具有短序列读取的汇编具有挑战性，重要的是要有深度覆盖，并且只包括高质量的序列读取。为了实现这一覆盖率和质量，我们从所有三个阳性gDNA池中汇编了所有高质量的未映射读（其中“高质量”读被定义为不包含任何未命名碱基的读），并使用了软件程序Velvet[57]以执行装配。然后，我们使用MAQ将所有六个gDNA池（阳性和阴性）的未映射读数与从阳性池创建的天鹅绒连接进行独立对齐。我们从三个阴性池中识别出了9个合并长度约为55kb的单独接触物，这些接触物没有或很少有读映射到它们。我们设计了引物来扩增这9个连环体，并进行连锁分析，以确认这些连环体与木糖阳性性状和yor365cΔ(表S4). 然后，我们确定在这9个连接中大约有28个开放阅读框[ORFs]（>100个氨基酸），并且许多ORFs与糖代谢基因同源，包括木糖醇/山梨醇脱氢酶同源物(图4). 最近在EC1118葡萄酒菌株基因组序列中独立地观察到，在染色体XV的右亚端粒区域内，相对于含有这些ORF的S288c参考基因组存在大量插入[54],[58]。插入的总大小为65kb，表示从头开始的大会确定了该地区的大部分地区。这些数据，再加上我们的观察，S288c参考基因组中没有一个先前注释的基因位于菲律宾比索能够赋予木糖表型，强烈表明木糖利用特性存在于这种端粒插入中。
新型XDH同系词的必要性和充分性
在染色体XV插入物中的ORF中，木糖醇/山梨醇脱氢酶对我们来说特别有趣，因为它与来自酿酒酵母和其他物种(图S1)我们假设该基因可能是木糖利用性状的候选基因。我们从Simi White和Lalvin AC以及大约400个碱基的上游和下游序列中扩增了该基因，并将其克隆到欧洲标准化委员会/ARS载体pRS316[59]创建pGS104和pGS105。当这些结构体中的任何一个被转化为S288c时，它们就足以在这个以前不使用木糖的实验室菌株中利用木糖(图5A和数据未显示）。表型取决于含有该基因的质粒的存在，因为当转化子失去质粒时，木糖表型就会丢失(图5A). 这些数据表明，我们命名的这个基因XDH1型，足以允许木糖在其他野生型但木糖阴性菌株中使用。
显示…的必要性XDH1型对于表型，我们创建了一个缺失菌株(xdh1Δ)和以前一样测量木糖利用率。将两个Simi White衍生物（GSY2468/9）转化为抗性基因包含序列（～400个碱基）的缺失盒XDH1型通过聚合酶链式反应确认了缺失菌株（GSY2472/1）。删除XDH1型完全废除表型(图5B). 我们将缺失菌株与Simi White的另一个单倍体衍生物杂交，并确认在9个测试的四分体中，缺失总是与木糖阳性表型相对分离（数据未显示）。这些数据证明XDH1型木糖的利用不仅充分而且必要。
证明了这一点XDH1型负责至少两种木糖的利用酿酒酵母葡萄酒菌株（Simi White和Lalvin AC），同时考虑到我们的观察结果，即我们能够测试的所有其他葡萄酒菌株似乎都属于同一互补组，我们试图确定是否XDH1型存在于所有木糖阳性酿酒酵母菌株和其他酵母菌属我们最初在屏幕上识别的混血儿。测试是否存在XDH1型在这些菌株中，我们对筛选出的所有木糖阳性菌株进行了菌落PCR(表2). 在33/38株木糖阳性菌株中，XDH1型当时在场。有趣的是，我们无法扩增出的5株木糖阳性菌株XDH1型都被记录为巴亚努斯链球菌或两者之间的混合巴亚努斯链球菌和酿酒酵母.
我们筛选出的一些阳性菌株在木糖利用方面是杂合的，因为当孢子形成时，性状分离产生两个阳性和两个阴性孢子（或者在没有足够的活孢子来确定不同分离模式的情况下，每种类型的一些孢子）(表1). 我们对其中一些孢子进行了菌落PCR，以检测是否存在XDH1型(表3). 在这些杂合子的减数分裂后代中，每个木糖阳性分离子都含有该基因。在四种情况下（Lalvin AC、PDM、SIHA Activ-hefe 4和WE14）XDH1型与木糖阳性孢子分离，而阴性孢子不含木糖XDH1型令人惊讶的是，我们发现一些阴性孢子确实含有XDH1型基因。在一个例子中，两个阴性孢子中的一个含有XDH1型而另一个阴性孢子则没有（ATCC66283，请注意这四个孢子不是来自同一个四分体）。在其他四个病例（Montrachet、BDX、Fermichamp、French White）中，所有阴性孢子经PCR检测均呈阳性XDH1型。我们已测序XDH1型来自两个杂合四分体（Fermichamp tetrad 1A–D，BDX tetrad 1A–D）的所有孢子的ORF上游和下游约200个碱基，并且在木糖阳性和阴性孢子之间未观察到任何DNA序列多态性（数据未显示）。这表明可能有另一个位点对XDH1型在这些菌株中。总的来说XDH1型在木糖阳性菌株中，该基因与天然木糖利用所必需的假设相一致酿酒酵母菌株。
内源性木糖途径的遗传解剖
如上所述，在S288c参考基因组中有一些基因编码假定的木糖途径酶，以前有人认为XR的主要贡献者是GRE3考试,YPR1型、和YJR096W型 [14]也有人观察到GRE3考试和二甲苯2编码假定的XDH，可以赋予木糖阳性表型[14],[15]为了评估这些和其他内源性木糖基因对我们木糖表型的贡献，我们从单倍体木糖阳性Simi White衍生物（GSY2469）中单独或以各种组合删除了这些基因，并评估了各种缺失突变体的生长表型(图6).
为了测试五个木糖还原酶基因的贡献，我们在XDH1型背景。仅限GRE3考试木糖还原酶基因对表型有显著影响，当单独删除时，没有一个基因完全消除表型(图6，XR）。我们还通过创建四个缺失突变体来测试每个还原酶的充分性，只留下一个假定的还原酶基因完好无损(图6，XR）。在我们的研究背景中，只有两种假定的木糖还原酶对木糖的利用能力有显著贡献，分别是GRE3考试和YPR1型其他三种假定的木糖还原酶本身不足以利用木糖(YDL124W型,总承包商1,YJR096w型). 我们还创建了一个gre3Δypr1Δ表型几乎完全消失的双重缺失(图6，XR），尽管这些数据与其他三种木糖还原酶的数据并不矛盾，这三种酶会产生一些剩余的XR活性。这些数据共同表明GRE3考试和YPR1型是XR活动的主要贡献者酿酒酵母导数。
接下来，我们测试了三种假定的木糖醇脱氢酶对观察到的表型的贡献(图6，XDH）。有趣的是，当在XDH1型背景(sor1Δ,sor2Δ,xyl2Δ)与阳性对照相比，缺失突变体的木糖利用表型有所改善。此外，当三者一起被删除时(sor1Δsor2Δxyl2Δ)，表型进一步增强(图6，XDH）。这些数据表明，这些假定的木糖醇脱氢酶可能实际上阻碍了该菌株的能力（可能所有非木糖的利用酿酒酵母菌株）利用木糖，因此与我们新发现的负责典型木糖利用途径木糖醇脱氢酶步骤的Xdh1蛋白一致。
最后，我们引入了xks1Δ删除到XDH1型背景，编码假定的木糖激酶，负责将可发酵代谢物木糖磷酸化为木糖-5-磷酸[60],[61].删除XKS1型完全消除了该菌株利用木糖的能力(图6，XK），表明该菌株中的典型途径负责木糖代谢XKS1型编码我们观察到的木糖利用表型所必需的唯一木糖激酶。
木糖利用过程中的转录谱分析
除了了解内源性木糖途径基因如何影响木糖表型外，我们还试图描述生长介质中木糖的存在或缺失如何影响酿酒酵母随着时间的推移，在存在或不存在XDH1型基因。为此，我们测量了两次回交到S288c的Simi White菌株的三对姊妹孢子的mRNA水平。每对孢子来自一个独立的四分体，包含一个XDH1型-包含孢子（“阳性”，GSY2465、2466、2469）和一个不包含XDH1型基因（“阴性”，GSY246424672470）。我们在YPD中预先培养了六个孢子，并使用这些培养物接种了最小培养基，以添加或不添加2%的木糖作为唯一碳源（木糖的缺失是“无碳”条件）。接种后立即从这些培养物中取样（t=0），每8小时取样一次，持续72小时。然后，我们使用安捷伦酵母目录阵列分析了相对RNA丰度与混合参考值的关系，其中包含每个样品的等摩尔量。基因表达测量（Log2（样品/参考））在每个时间点对三个阳性孢子和三个阴性孢子进行平均。
为了确定内源性木糖途径是否对木糖阳性菌株中木糖的存在作出反应，我们定性地比较了木糖阳性菌中存在的所有假定木糖途径基因的表达水平酿酒酵母S288c基因组(图7). 在阳性孢子中，假定的木糖还原酶基因与只有木糖存在的参考相比上调，而在阴性孢子中，木糖还素酶基因在所有条件下都受到抑制；唯一的例外是YDL124W型，在所有孢子类型和所有生长条件下，与参考相比似乎是上调的。推定XDH的表达模式XYL2型与木糖还原酶基因相似；在木糖存在的阳性菌株中，它在整个时间过程中高度表达，但在无碳培养基中的阳性菌株和阴性菌株中的木糖和无碳培养液中，它随着时间的推移而被抑制。
有趣的是，山梨醇脱氢酶SOR1标准和SOR2标准在木糖存在和不存在的情况下，与阳性菌株中的参考菌株相比，该菌株具有氧化木糖醇的生化能力，并且在整个时间过程中，与阴性菌株中的混合参考菌株相比受到强烈抑制。因为SOR1标准和SOR2标准，这些基因阵列上的探针只有60个碱基中的1个碱基不同，因此可能存在来自这两个基因的mRNA的交叉杂交SOR公司基因。也有可能是XDH1型mRNA到这些探针，因为XDH1型以及SOR1/2号机组微阵列上的探针（6个用于SOR1标准和7用于SOR2标准). 虽然我们无法确定哪种mRNA(或1,SOR2标准或XDH1型)虽然与探针杂交，但很明显，阳性和阴性孢子中至少一个假定脱氢酶基因的表达水平存在明显差异。木糖激酶的表达水平没有显著差异，XKS1型在任何条件下或在任何孢子之间观察到。在表达上缺乏变化XKS1型这并不奇怪，因为此前有报道称XKS1型足够进行木糖代谢，而过表达可以增强工程菌株的木糖发酵[29],[62]综合来看，这些数据强烈表明XDH1型在阳性孢子中，当生长在木糖中时，允许内源木糖途径的一些成员继续表达。
为了进一步了解这些菌株的转录组反应，我们确定了在整个时间过程中发生显著变化的基因，将这些基因与其他微阵列数据集进行比较，以确定任何明确的生理反应，并在上调或下调基因组中寻找功能富集的类别。使用微阵列的显著性分析[SAM][63]错误发现率为1%，我们确定了1266个基因的列表，其表达水平随时间发生了显著变化。具体来说，我们使用两类（配对时间进程）选项进行了SAM分析，以确定阳性孢子中表达随时间变化的基因，并将木糖与无碳条件进行比较。接下来，我们再次使用SAM和两类（配对时间进程）选项，在木糖存在下比较阳性和阴性孢子时，确定了其表达随时间变化的基因。从这两个基因列表的结合中，我们删除了在阴性菌株中其表达水平随时间发生显著变化的基因，并将木糖与无碳条件进行了比较（另一个两级配对时间进程分析）。使用这种策略，我们生成了一个包含基因的列表，这些基因的表达值随着时间的推移而变化，这是由于阳性菌株和阴性菌株之间的差异，或者是由于阳性株中木糖的存在和缺失之间的差异。为了确定与这些基因表达差异相关的生理反应，我们使用HIDRA检索了1266个基因的数据[64]来自其他三个酵母微阵列实验[65]–[67]并以K=10的K-means聚类对基因进行组织[68](图8,数据集S1,S2系列). 为了与其他数据集保持一致，本研究中进行的四个时间进程实验均为零转换。在本文的实验右侧，分别是对每个基因的表达水平与增长率的相关性的测量[65]，在diauxic移位过程中的基因表达时间过程[66]，跨一组碳源（乙醇、蔗糖、果糖、葡萄糖、半乳糖和棉籽糖）的基因表达[67]以及各种条件下的一系列时间过程，包括饥饿、稳态生长和其他压力[67]。我们观察到5组（标记在热图右侧）似乎受到2%木糖阳性菌株与生长速率或应激反应相似性的强烈驱动。例如，第1组和第4组中的基因(图8)与无碳源的阳性菌株或两种条件下的阴性菌株相比，木糖阳性菌株在时间过程中表达更高，并且这些基因也与生长速率呈正相关。如预期，当GO:：TermFinder[69]用于这些组以寻找生物过程的功能富集，我们观察到已知的过程随着较高的生长速度而上调。具体而言，组1在囊泡介导的转运（GO:0016192，p=2.11e-8）和细胞定位（GO:0051641，p=3.13e-8）等方面显著增强(数据集S3)第4组富含翻译（GO:0006412，p=2.26e-41）和核糖体生物生成（GO:0042254，p=5.87e-23）以及相关过程(数据集S4). 第5组表现出相同的模式，但大部分反应相反，这意味着这些基因的表达与生长呈负相关，我们观察到，与无碳条件或两种条件下的阴性菌株相比，它们在木糖阳性菌株中的相对表达水平较低；但我们没有观察到该组的功能增强。有趣的是，在第5组中，有一小群基因（标记为）的表达是相对于木糖阳性菌株中的参考基因随着时间的推移而诱导的，在其他条件下随着时间的流逝而被抑制。该组包括鼻涕4,硫4、和热休克蛋白32这些基因都至少被认为参与了硫胺素的生物合成。众所周知，硫胺素生物合成对糖代谢很重要，是一种在多种工业酵母中选择某些成分高表达的途径[7]组1（标记†）中还有一小组基因，其行为与组中的其他基因不同，因为相对于木糖阳性菌株中的参考基因，它受到强烈抑制。在这组由7个基因组成的基因中，其中4个可能参与细胞内氧化还原平衡，因为它们都使用NADP（H）作为辅因子(TRR1号机组,OYE2公司,GDH1型,ADH6型). 一般来说，这三组人认为XDH1型在阳性菌株中，木糖存在时可产生“生长样”转录反应，而在没有木糖或没有木糖的情况下XDH1型这些菌株表现出与缺乏生长和饥饿一致的表达模式（例如第4组和第5组）。我们还观察到另外两组不符合这种模式，但木糖中的阳性菌株表现出更类似于各种压力的反应。例如，在第2组中，与其他三种条件相比，木糖阳性菌株中的相对表达较低，尽管这些基因都与生长速度密切相关，并且包括RNA代谢功能富集（GO:0016070，p=1.56e-6）和核糖体生物生成功能富集（GO:0042254，p=1.66）1.33e-5）(数据集S5). 相反，它们似乎更类似于经历氮耗尽、固定相、二胺、DTT或过氧化氢处理以及37℃热休克的菌株的表达模式。我们在第3组中观察到类似的反应，其中表达水平与我们预期的相反，如果生长速度是表达差异的主要原因，但如果菌株表现出环境应激反应，则表达水平相似。有趣的是，该组富含戊糖代谢过程（GO:0019321，p=5.7e-3）和氧化应激反应（GO:0006979，p=7.88e-3）(数据集S6). 这些数据表明，尽管这组基因通常会被抑制以响应较高的生长速度，但其中一些基因可能会对木糖的存在作出反应。
还有三组基因与生长速度或压力反应没有明显的视觉关系。在任一条件下，与无碳或阴性菌株相比，组（a）在木糖阳性菌株中的表达似乎更高。虽然该组不包含使用GO：：TermFinder的功能富集，但它确实包含许多与碳代谢相关的基因，包括PFK1型,PFK2系列,前列腺素I1,通用条款1、和地面1最后两组（b和c）在木糖阳性菌株中的表达水平均低于其他三种条件。这两个组对与转录及其调节有关的各种过程都有功能富集(数据集S7,第8节). 一般来说，这三组（a–c）中的基因在非生长条件下的表达变化幅度（相对于参照物的诱导或抑制）大于木糖存在下的阳性菌株。这些簇可以支持以下结论：在没有木糖或没有木糖的情况下XDH1型，菌株表现出一种反应（可能是饥饿），这种反应在阳性菌株中木糖的存在下根本不会诱导。总之，这些微阵列数据表明，与阴性菌株或缺乏木糖的菌株相比，存在木糖的阳性菌株能够“生长”，但仍表现出不太明显的应激样反应。这些数据与识别木糖并将其用作碳源的阳性菌株并不矛盾。
讨论
在这项工作中，我们已经表明酿酒酵母能够利用木糖而无需工程或定向进化，并确定了这种表型的遗传基础。虽然多年来人们都知道木糖异构体木果糖可以通过以下方式发酵酿酒酵母，通常认为该物种不能代谢木糖。然而，最近的研究表明，木糖利用的自然遗传变异确实存在，自然选择和育种可以提高木糖在天然菌株中的利用酿酒酵母 [9]通过对许多工业和临床分离物的筛选，我们发现该物种中存在允许利用这种糖的变异，而这种糖的发酵是从木质纤维素生物质源高效生产乙醇的重要先决条件。我们还证明了这种利用木糖的能力酵母菌属是由一个单一基因的存在所赋予的，这是一种我们命名的新型木糖醇脱氢酶XDH1型该基因对于正常非木糖利用的S288c实验室菌株中木糖的利用是必要的，并且在S288c的参考基因组序列中缺失。
我们还描述了一株木糖利用菌株的转录反应酿酒酵母木糖的存在与否XDH1型虽然这些数据不能让我们得出这个基因是否允许木糖的实际发酵（而不是简单地利用）的结论，但我们可以进行一些观察。首先，很明显，当存在这种新的XDH时，内源性木糖途径能够在转录水平上对木糖的存在作出反应。其次，我们可以推断，这种糖及其下游代谢物可能通过戊糖磷酸途径进入中枢碳代谢，这与之前观察到的情况一致。这表明工业或实验室菌株酿酒酵母可能比先前认为的更容易发酵这种戊糖，这意味着我们可以更好地利用自然界中已经存在的长期遗传潜力，并将其与定向进化和代谢工程相结合，制造出一种工业上适用的木糖发酵菌株。
这个想法酵母菌属可能比以前认为的更“准备好”发酵木糖，这进一步得到了我们对内源性木糖代谢途径的基因解剖的支持酿酒酵母我们证实了先前的数据，该数据显示由XKS1型具有功能并支持木糖代谢。我们还证明了这一点GRE3考试和YPR1型编码两种醛酮还原酶，每一种都足以在我们的菌株背景中利用木糖。一种新型木糖醇脱氢酶负责木糖利用表型的观察，以及推测编码酶的参考菌株中的基因氧化木糖醇的观察(SOR1标准,SOR2标准,XYL2型)事实上对表型有害，进一步支持氧化还原失衡的观点酿酒酵母支持木糖醇生产而非进一步代谢是正确的[70],[71]最后，我们的结果还表明XDH1型能够减少辅因子失衡，并可能能够通过木糖代谢途径推动木糖醇。
我们还发现狭义酵母菌在我们的筛选中，种间杂种似乎通过独立于XDH1型一些菌株在利用木糖方面甚至比酿酒酵母我们在这里描述的葡萄酒菌株，目前我们正试图确定负责这些其他木糖表型的基因座（或基因座）。根据中的结果表2那个节目巴亚努斯链球菌不含木糖的阳性菌株XDH1型，很可能至少还有一个其他特征尚未确定。在木糖利用途径中可能还有其他成分，天然菌株中可能存在低形等位基因，如XDH1型存在于我们鉴定的一些木糖阳性菌株的木糖阴性片段中。我们还建议，之前描述的唯一其他[9],[72]木糖表型酿酒酵母很可能是XDH1型-依赖性，考虑到葡萄酒菌株包括在最初的育种中。因为我们和其他人已经分析了只含有少量变异样本的菌株，这些变异可能存在于酿酒酵母基因库，很可能自然界中存在额外的变异，可能有助于木糖阳性表型。
最后，我们开发了高通量测序的新应用，通过BSA快速绘制未知性状。因为我们能够为我们感兴趣的表型确定明确的分离模式，在本例中为单个基因座，我们能够很容易地汇集分离物，并利用与我们的基因座分离的高频率多态性，通过测序缩小基因组位置。除了平铺阵列外，应用测序技术是至关重要的，因为我们的表型位于参考基因组中不存在的基因组区域。考虑到相关基因的数量很少，我们认为高通量测序的应用可以广泛用于将其他未知基因型与特征明确的表型联系起来。它将特别适用于基因组较小、基因组序列或拼接阵列不易获得的其他物种，或可能包含其各自参考基因组中未捕获到的变异的物种。
而在工业环境中通过以下方法将木糖有效转化为乙醇酵母菌属酵母尚未充分发挥其潜力，最近取得了很大进展。我们建议发现并研究野生菌株木糖利用的相关基因酵母菌属可能直接有助于进一步改进木质纤维素生物质发酵。此外，这些基因的功能可能会继续揭示木糖代谢中的问题区域，有助于为定向进化和代谢工程方法提供信息。
材料和方法
菌株
本研究中使用的菌株如所示表S1和表S6为了杂交二倍体总部/总部葡萄酒菌株转化为单倍体S288c菌株，用pGS35转化葡萄酒菌株(欧洲标准化委员会/ARS,抗性基因)或pGS36(欧洲标准化委员会/ARS,小时)携带质粒的转化子被孢子化(小时是允许潮霉素B抗性的基因）。孢子与单倍体混合呵如果葡萄酒菌株携带pGS36，则S288c菌株携带其中一种pGS35，反之亦然，并将其置于添加了G418（200µg/mL）和潮霉素B（150µg/mL）的YPD平板上。
培养基、生长条件和生长量化
为了筛选木糖利用率，单个菌落在含有2%葡萄糖的YP中预先生长到25℃饱和，然后用2%木糖（Sigma）或无碳源稀释1∶50到YP中。将100µL培养物在25°C下在密封的96孔板中生长5天，并在TECAN Genios读板器中每隔15分钟读取595nm的吸光度，同时进行轨道振荡。通过目测木糖中OD的增加（与无碳源相比）来确定木糖阳性，并通过在YP和Minimal中重新测试来确认[73]媒体。
因为木糖的生长不是指数增长，所以我们没有计算加倍时间。相反，为了量化木糖利用率，我们计算了OD增加线性范围内的斜率（OD随时间的变化），在初始海藻糖生长后的典型TECAN生长实验中，从20到80小时。生长曲线至少一式三份（参见表S6对于所有缺失菌株），使用t检验确定缺失菌株和“野生型”木糖阳性菌株之间OD增加率的显著差异。
基因表达阵列
为了分析基因表达，培养物在含有2%葡萄糖的YP中预生长至饱和状态，并稀释1∶50至1.1L最小培养基中[73]含2%木糖或无碳源。接种后立即开始收集100mL样品（t=0），随后每隔8小时用0.45µm分析测试过滤漏斗（Nalgene）过滤72小时，并在液氮中快速冷冻。如前所述，使用改良版热苯酚方案提取RNA[74],[75]将120个RNA样本中的每一个样本合并350ng，形成一个合并的参考样本（6个菌株在2种条件下的10个时间点）。使用安捷伦低RNA输入线性扩增试剂盒（Agilent Low RNA Input Linear Amplifiation Kit），用Cy染料（Amersham）标记325ng总RNA样品和参考物，并在65°C、10rpm的杂交箱（Shel Lab）中与安捷伦酵母基因表达阵列（v2、8x15K）杂交17小时。在安捷伦扫描仪上以5µm的分辨率扫描阵列，安捷伦特征提取v9.5.3.1用于从扫描图像中提取数据，以及数据规范化和对数计算2比率。基因表达数据已保存在GEO数据库中，登录号为GSE19121。
散装分离物分析
将Simi White（Lallemand）、Lalvin AC和SIHA Activ-Hefe 4的木糖阳性分离物杂交一次到S288c（GSY147），然后产生二倍体。如上所述，在TECAN平板阅读器中对F2分离子的木糖利用率进行评分。将每个生长的隔离物的1.5mL过夜YPD培养物旋下，再悬浮，并在300µL山梨醇溶液（0.9M山梨醇，0.1M Tris pH 8，0.1M EDTA）中冷冻。在此阶段，根据表型汇总样本，并按照所述提取基因组DNA[76]西米·怀特（Simi White）有39例阳性和39例阴性，拉文·AC有19例阳性和16例阴性，SIHA有16例阳性和6例阴性。
基因组DNA标记如下[77]使用Affymetrix基因芯片进行微阵列辅助BSA酿酒酵母基本上按照描述平铺1.0R阵列[52],[78]简而言之，对数的比率2完美匹配探针的强度绘制在每条染色体上的每个核苷酸上。对每条染色体的图进行视觉扫描，以确定强度的局部峰值。平铺阵列数据保存在GEO数据库中，注册号为GSE19121。
通过测序将相同的基因组DNA池用于BSA。使用Illumina genomic DNA Sample Kit制备5µg基因组DNA用于测序。使用Illumina Standard Cluster Generation Kit v2制备流动细胞，并在Illumiana Genome Analyzer II上对样品进行测序。使用Illumina 1.3.2管道对GAII数据进行分析，并使用MAQ v0.7.1将读取值（带质量）与S288c基因组对齐[56]使用默认参数。合并未与参考基因组对齐的阳性池中的读数，并从进一步分析中删除包含任何未命名碱基（“N”>=1）的读数。从头开始使用Velvet v0.7.55对这组过滤后的未映射读数进行组装[57]默认参数和散列长度=13。所有原始高通量序列数据都存储在SRA数据库中，登录号为SRP001391。
克隆
新的XDH被克隆到pRS316的NotI位点[59]通过使用含有NotI限制位点的引物进行PCR，从GSY2469（Simi White衍生物）和GSY1362（Lalvin AC衍生物）中提取。底漆列于表S5FY2（S288c）随后通过稍加修改的醋酸锂方法与所得质粒（pGS104和pGS105）转化[79]。质粒列在表S6如上所述在TECAN平板读取器中测定生长。
质粒损失实验如下。用于生成TECAN生长曲线的原始转化子也在YPD平板上为单个菌落划线。将这些菌落生长并复制到YPD和SC-URA平板上，从YPD平板上提取菌落，这些菌落要么保留质粒（生长在SC-URA复制平板上），要么在有丝分裂期间丢失质粒（不生长在SC-URA复制板上），然后在TECAN中再次进行测试。
删除结构
同源重组用于破坏新的XDH。底漆列于表S5简单地说，KanMX6公司从pFA6-KanMX6扩增[80]使用与用于扩增的5′和3′引物重叠的引物分别扩增了XDH同源物上下游约400个碱基KanMX6公司使用Phusion DNA聚合酶（Finnzymes）连接三个片段，并通过醋酸锂转化将产生的缺失盒整合到GSY2469和GSY2468（Simi White衍生物）中。PCR和G418抗性与木糖性状在另一个木糖阳性单倍体衍生物的杂交中的反向分离证实了缺失的正确整合。
为了从遗传学上分析内源性木糖途径，将木糖途径基因的缺失杂交到单倍体Simi White衍生物中，该衍生物之前曾两次回交到S288c（GSY2469）。二倍体菌株杂合性缺失总承包商1,GRE3考试,YPR1型,YJR096W型,XYL2型、和XKS1型从Invitrogen购买。删除SOR1标准和SOR2标准由于它们位于基本上100%相同的大基因组区域，因此从缺失收集中无法获得。删除的构造如所述[81]，除了与直接位于SOR1/2号机组打开阅读框而不是40。将转化子杂交到pgu1Δ和lrg1Δ区分sor1Δ和sor2Δ。当创建具有两个以上缺失的菌株时，通过菌落PCR追踪缺失的分离，因为这些缺失都用G418标记R（右）底漆列于表S5、和菌株列于表S6.
致谢
我们要感谢Maitreya Dunham和Douglas Ruderfer对贴片微阵列BSA数据的分析。我们感谢翁子明（Ziming Weng）和菲尔·拉克鲁（Phil Lacroute）在生成高通量序列读取方面的帮助，以及德文·斯坎内尔（Devin Scannell）在以下方面的帮助从头开始的组件。我们还感谢Barbara Dunn、Dan Kvitek、Yuya Kobayashi和R.Frank Rosenzweig对本手稿的批评性阅读。
作者贡献
构思和设计实验：JWW-KS-GS。执行实验：JWG-KS。分析数据：JWW-KS。撰写论文：JWW GS。
工具书类
- 1萨默维尔C（2007）《生物燃料》。当前生物17:115–119。
- 2Basso LC、de Amorim HV、de Oliveira AJ、Lopes ML（2008）《巴西生产燃料乙醇的酵母选择》。FEMS酵母研究8:1155–1163。
- 三。Matsushika A，Inoue H，Kodaki T，Sawayama S（2009）工程中木糖的乙醇生产酿酒酵母压力：现状和前景。应用微生物生物技术84:37–53。
- 4Hahn-Hägerdal B、Galbe M、Gorwa-Grauslend MF、Liden G、Zacchi G（2006）《生物乙醇——从今天的残留物中获取明天的燃料》。生物科技趋势24:549–556。
- 5Farrell AE、Plevin RJ、Turner BT、Jones AD、O'Hare M等（2006）乙醇可以为能源和环境目标做出贡献。科学311:506-508。
- 6Argueso JL、Carazolle MF、Mieczkowski PA、Duarte FM、Netto OV等（2009）酿酒酵母广泛用于生物乙醇生产的菌株。基因组研究19:2258–2270。
- 7Stambuk B、Dunn B、Alves-Jr S、Duval E、Sherlock G（2009）《工业燃料乙醇酵母在维生素B1和B6生物合成相关基因中包含适应性拷贝数变化》。基因组研究19:2271–2278。
- 8.Saha BC（2003）半纤维素生物转化。《工业微生物生物技术杂志》30:279–291。
- 9Attfield PV，Bell PJL（2006）利用群体遗传学推导非重组子酿酒酵母使用木糖作为唯一碳源生长的菌株。FEMS酵母研究6:862-868。
- 10Chiang LC，Gong CS，Chen LF，Tsao GT（1981）d-木酮糖发酵制乙醇酿酒酵母应用环境微生物42:284–289。
- 11Wang PY，Shopsis C，Schneider H（1980）酵母发酵戊糖。生物化学和生物物理研究通讯94:248–254。
- 12Gong CS、Claypool TA、McCracken LD、Maun CM、Ueng PP等（1983年）。酵母对戊糖的转化。生物技术生物工程25:85–102。
- 13Chang Q，Griest T，Harter T，Petrash J（2007），醛酮还原酶的功能研究酿酒酵母BBA-分子细胞研究1773:321–329。
- 14Traff KL，Jonsson LJ，Hahn-Hägerdal B（2002）假定的木糖和阿拉伯糖还原酶酿酒酵母酵母19:1233-1241。
- 15Toivari MH、Salusjarvi L、Ruohonen L、Penttila M（2004）《内源性木糖途径酿酒酵母应用环境微生物70:3681-3686。
- 16Jeffries TW（2006）木糖代谢工程酵母。Curr Opin生物技术17:320–326。
- 17.Kötter P，Ciriacy M（1993）木糖发酵酿酒酵母应用微生物生物技术38:776–783。
- 18Kötter P，Amore R，Hollenberg CP，Ciriacy M（1990）毕赤酵母针炎木糖醇脱氢酶基因，XYL2型以及木糖利用的建设酿酒酵母转化剂。当前基因18:493–500。
- 19Hallborn J、Walfridsson M、Airaksinen U、Ojamo H、Hahn-Hägerdal B等（1991）重组木糖醇生产酿酒酵母《国家生物技术》9:1090–1095。
- 20Tantirungkij M、Nakashima N、Seki T、Yoshida T（1993）《木糖类似物的构建》酿酒酵母《发酵与生物工程杂志》75:83–88。
- 21.Ho N、Chen Z、Brainard A（1998）《基因工程》酵母菌属能够有效协同发酵葡萄糖和木糖的酵母。应用环境微生物64:1852-1859。
- 22Jin YS，Jones S，Shi NQ，Jeffries TW（2002）《分子克隆XYL3型（D-木糖激酶）来自毕赤酵母针炎及其生理功能的表征。应用环境微生物68:1232–1239。
- 23Walfridsson M、Bao X、Anderlund M、Lilius G、Bullow L等（1996）木糖乙醇发酵酿酒酵母窝藏嗜热嗜热菌xylA表达活性木糖（葡萄糖）异构酶的基因。应用环境微生物62:4648–4651。
- 24Amore R，Wilhelm M，Hollenberg C（1989）木糖发酵——木糖表达的分析芽孢杆菌和放线菌酵母中的木糖异构酶基因。应用微生物生物技术30:351–357。
- 25Kuyper M，Harhangi H，Stave A，Winkler A，Jetten M等人（2003）真菌木糖异构酶的高水平功能表达：通过酿酒酵母? FEMS酵母研究4:69–78。
- 26Kuyper M，Winkler A，Dijken J，Pronk J（2004）最小代谢工程酿酒酵母高效厌氧木糖发酵：原理证明。FEMS酵母研究4:655-664。
- 27Kuyper M、Hartog MMP、Toirkens MJ、Almering MJH、Winkler AA等（2005）表达木糖异构酶的代谢工程酿酒酵母用于快速厌氧木糖发酵的菌株。FEMS酵母研究5:399–409。
- 28Madhavan A、Tamalampudi S、Ushida K、Kanai D、Katahira S等（2009）多中心真菌木糖异构酶Orpinomyces属：基因测序、克隆和表达酿酒酵母用于木糖生物转化为乙醇。应用微生物生物技术82:1067–1078。
- 29Johansson B、Christensson C、Hobley T、Hahn-Hägerdal B（2001）在两株酿酒酵母表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶及其对木糖和木质纤维素水解物发酵的影响。应用环境微生物67:4249–4255。
- 30Toivari MH，Aristidou A，Ruohonen L，Penttila M（2001）通过重组将木糖转化为乙醇酿酒酵母：木糖激酶的重要性(XKS1型)和氧气可用性。Metab工程3:236–249。
- 31.Jin YS，Jeffries TW（2003）通过改变重组木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的表达改变木糖代谢物的流量酿酒酵母应用生物化学生物技术106:277–286。
- 32.Träff Bjerre KL，Jeppsson M，Hahn-Hägerdal B，Gorwa Grauslund M-F（2004）内源性NADPH依赖性醛糖还原酶活性影响重组木糖消耗过程中产物的形成酿酒酵母酵母21:141–150。
- 33Jeppsson M、Traff K、Johansson Br、Hahn-Hägerdal B、Gorwa-Grauslend M（2003）木糖还原酶活性增强对木糖发酵重组中木糖消耗和产品分布的影响酿酒酵母.FEMS酵母研究3:167–175。
- 34Walfridsson M、Hallborn J、PenttiläM、Keränen S、Hahn-Hägerdal B（1995）木糖代谢酿酒酵母过度表达TKL1公司和TAL1（目标1）编码戊糖磷酸途径酶转酮酶和转醛酶的基因。应用环境微生物61:4184–4190。
- 35Jeppsson M、Johansson B、Hahn-Hägerdal B、Gorwa-Grauslend MF（2002）《重组木糖利用中减少氧化戊糖磷酸途径流量》酿酒酵母菌株提高木糖的乙醇产量。应用环境微生物68:1604–1609。
- 36Traff KL、Otero Cordero RR、van Zyl WH、Hahn-Hägerdal B（2001）删除GRE3考试醛糖还原酶基因及其对重组菌株木糖代谢的影响酿酒酵母表达木糖异构酶和XKS1型基因。应用环境微生物67:5668–5674。
- 37Walfridsson M、Anderlund M、Bao X、Hahn-Hägerdal B（1997）不同水平酶的表达毕赤酵母支原体XYL1和XYL2型中的基因酿酒酵母及其对木糖利用过程中产物形成的影响。应用微生物生物技术48:218–224。
- 38Verho R、Londesborough J、PenttiläM、Richard P（2003）《改良戊糖发酵的工程氧化还原辅因子再生》酿酒酵母应用环境微生物69:5892–5897。
- 39Petschacher B，Nidetzky B（2008）改变木糖还原酶的辅酶偏好，以利于NADH的利用，从而提高木糖在代谢工程菌中的乙醇产量酿酒酵母微核细胞事实7:9。
- 40Van Vleet JH，Jeffries TW，Olsson L（2008）删除对硝基苯基磷酸酶（pNPPase），电话13，在重组中酿酒酵母提高D-木糖的生长和乙醇产量。代谢工程10:360–369。
- 41Bengtsson O，Hahn-Hägerdal B，Gorwa-Grauslend MF（2009）木糖还原酶菌毛毕赤酵母改变辅酶偏好通过重组改善乙醇木糖发酵酿酒酵母生物技术生物燃料2:9。
- 42Sonnederger M，Sauer U（2003）《进化工程》酿酒酵母用于木糖上的厌氧生长。应用环境微生物69:1990-1998。
- 43Pitkänen J-P，Rintala E，Aristidou A，Ruohonen L，PenttiläM（2005）木糖恒化器分离物酿酒酵母与原始菌株的木糖、葡萄糖和乙醇代谢相比，代谢产物和酶水平发生了变化。应用微生物生物技术67:827–837。
- 44Wahlbom CF、van Zyl WH、Jönsson LJ、Hahn-Hägerdal B、Otero RRC（2003）改良重组木糖利用的产生酿酒酵母TMB 3400随机诱变及与毕赤酵母针炎哥伦比亚广播公司6054。FEMS酵母研究3:319–326。
- 45Ni H，Laplaza JM，Jeffries TW（2007），转座子突变以提高重组体的生长酿酒酵母D-木糖。应用环境微生物73:2061–2066。
- 46Carreto L、Eiriz MF、Gomes AC、Pereira PM、Schuller D等（2008）野生型酵母菌株的比较基因组学揭示了重要的基因组多样性。BMC基因组学9:524。
- 47Dunn B，Levine RP，Sherlock G（2005）商业葡萄酒酵母菌株的微阵列核型分析揭示了共享以及独特的基因组特征。BMC基因组学6:53。
- 48Kvitek DJ、Will JL、Gasch AP（2008）不同环境中应激敏感性和基因组表达的变化酿酒酵母分离物。公共科学图书馆基因4:e1000223。
- 49Fay JC，Benavides JA（2005）酿酒酵母《公共科学图书馆·遗传学》1:e5。
- 50Liti G，Carter DM，Moses AM，Warringer J，Parts L，et al.（2009）家用和野生酵母的群体基因组学。自然458:337-341。
- 51Schacherer J，Shapiro JA，Ruderfer DM，Kruglyak L（2009）综合多态性调查阐明了酿酒酵母《自然》458:342-345。
- 52Brauer MJ，Christianson CM，Pai DA，Dunham MJ（2006）通过阵列辅助体分离分析绘制新性状酿酒酵母《遗传学》173:1813–1816。
- 53Quarrie S、Lazic-Jancic V、Kovacevic D、Steed A、Pekic S（1999）《利用分子标记进行大块分离物分析及其在提高玉米抗旱性中的应用》。实验植物学杂志50:1299-1306。
- 54.Borneman AR，Forgan AH，Pretorius IS，Chambers PJ（2008）酿酒酵母葡萄酒品种。FEMS酵母研究8:1185-1195。
- 55Louis EJ（1995）染色体末端酿酒酵母酵母11:1553–1573。
- 56Li H，Ruan J，Durbin R（2008）使用映射质量分数映射短DNA测序读取和调用变体。基因组研究18:1851–1858。
- 57Zerbino DR，Birney E（2008）Velvet：使用de Bruijn图的从头开始短读汇编算法。基因组研究18:821–829。
- 58Novo M、Bigey F、Beyne E、Galeote V、Gavory F等（2009）葡萄酒酵母基因组序列揭示的真核-真核基因转移事件酿酒酵母EC1118.美国国家科学院院刊106:16333–16338。
- 59Sikorski R，Hieter P（1989）设计用于高效操纵DNA的穿梭载体和酵母宿主菌株系统酿酒酵母《遗传学》122:19-27。
- 60Rodriguez-Peña J，Cid V，Arroyo J（1998）YGR194c型(XKS1型)芽殖酵母木糖激酶的基因编码酿酒酵母FEMS微生物通讯162:155–160。
- 61Ho N，Chang S（1989）酵母二甲苯激酶基因的互补克隆大肠杆菌和酵母突变。酶微技术11:417–421。
- 62.Jin YS，Ni H，Laplaza JM，Jeffries TW（2003）重组木糖的最佳生长和乙醇生产酿酒酵母需要适度的D-木糖激酶活性。应用环境微生物69:495–503。
- 63Tusher VG，Tibshirani R，Chu G（2001）应用于电离辐射响应的微阵列的显著性分析。美国国家科学院院刊98:5116–5121。
- 64Hibbs M、Wallace G、Dunham MJ、Kai L、Troyanskaya O（2007）通过横向整合查看基因组数据的大背景。信息可视化，2007 IV’07第11届国际会议。
- 65Brauer MJ、Huttenhower C、Airoldi EM、Rosenstein R、Matese JC等（2008）酵母中生长速率、细胞周期、应激反应和代谢活性的协调。分子生物学细胞19:352–367。
- 66DeRisi JL、Iyer VR、Brown PO（1997）《探索基因组水平上基因表达的代谢和遗传控制》。《科学》278:680-686。
- 67Gasch AP、Spellman PT、Kao CM、Carmel-Harel O、Eisen MB等（2000）酵母细胞对环境变化反应的基因组表达程序。分子生物学细胞11:4241–4257。
- 68Everitt BS（1974）聚类分析。伦敦：海涅曼教育（代表）社会科学研究委员会。
- 69.Boyle EI，Weng S，Gollub J，Jin H，Botstein D，et al.（2004）GO:：TermFinder–用于访问基因本体信息和查找与基因列表相关的显著丰富的基因本体术语的开源软件。生物信息学20:3710-3715。
- 70Bruinenberg P，Bot P，Dijken J，Scheffers W（1983）氧化还原平衡在酵母厌氧发酵木糖中的作用。应用微生物生物技术18:287–292。
- 71Jeffries T（1983）细菌、酵母和真菌对木糖的利用。收件人：费希特A，杰弗里斯T，编辑。戊糖和木质素。柏林/海德堡：施普林格。第1-32页。
- 72Bell PJ、Higgins VJ、Attfield PV（2001）工业烘焙酵母和野生型酵母的发酵能力比较酿酒酵母在不同的糖培养基中。《Lett Appl Microbiol》32:224–229。
- 73Adams J，Hansche PE（1974），微生物种群研究。I.二倍体在酿酒酵母遗传学76:327–338。
- 74Schmitt ME、Brown TA、Trumpower BL（1990）一种快速简便的RNA制备方法酿酒酵母《核酸研究》18:3091–3092。
- 75Lee A、Hansen KD、Bullard J、Dudoit S、Sherlock G（2008）通过拼接微阵列和超高通量测序揭示的酵母中新的低丰度和瞬时RNA在密切相关的酵母物种中不保守。公共科学图书馆基因4:e1000299。10.1371/journal.pgen.1000299。
- 76Treco DA（1987）《酵母DNA的制备》。收录人：Ausubel F、Brent R、Kingston R、Moore D、Seidman J等人，编辑。当前质子分子生物学。纽约：John Wiley and Sons，Inc.，第13.11.11–13.11.12页。
- 77Kao KC，Sherlock G（2008）无性繁殖种群适应性进化过程中克隆干扰的分子表征酿酒酵母《自然遗传学》40:1499–1504。
- 78.Gresham D、Ruderfer DM、Pratt SC、Schacherer J、Dunham MJ等（2006年），利用单个DNA微阵列在核苷酸分辨率下进行全基因组多态性检测。科学311:1932-1936。
- 79Schiestl RH，Gietz RD（1989）使用单链核酸作为载体对完整酵母细胞进行高效转化。当前基因16:339–346。
- 80Wach A、Brachat A、Pohlmann R、Philippsen P（1994）用于经典或基于PCR的基因中断的新异源模块酿酒酵母酵母10:1793-1808。
- 81Longtine MS、McKenzie A 3rd、Demarini DJ、Shah NG、Wach A等人（1998年），多功能、经济的基于PCR的基因删除和修改的附加模块酿酒酵母酵母14:953-961。
