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研究文章

多发性硬化脑正常白质（NAWM）中的神经炎症导致Ranvier淋巴结异常

摘要

多发性硬化（MS）大脑正常白质（NAWM）中Ranvier淋巴结结构的改变与慢性炎症有关。我们发现MS NAWM中的偏执域平均比对照长，Kv1.2通道错位为偏执。通过注射淋巴毒素-α（LTα）和干扰素-γ（IFNγ）基因的慢病毒载体，在慢性脑膜炎模型中再现了这些病理特征。我们发现，肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素γ和谷氨酸可以在小脑片培养中引起偏执性延长，而N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体阻滞剂可以逆转这种延长。当这些变化被插入到模拟轴突传导的计算模型中时，观察到速度迅速下降，导致小直径轴突的传导失败。我们认为，由促炎细胞因子激活的胶质细胞可以产生高水平的谷氨酸，从而触发偏执病理，导致轴突损伤和传导缺陷。

引用：Gallego-Delgado P，James R，Browne E，Meng J，Umashankar S，Tan L，et al.（2020）多发性硬化脑正常白质（NAWM）的神经炎症导致Ranvier淋巴结异常。《公共科学图书馆·生物》18（12）：e3001008。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008

学术编辑：Mikael Simons，德国Max-Planck-Institut毛皮实验师Medizin

收到：2020年6月23日；认可的：2020年11月20日；出版：2020年12月14日

版权：©2020 Gallego-Delgado等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到认可。

数据可用性：所有数据和代码文件可从https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

基金：英国工程和物理科学研究委员会支持PG的博士研究。尸检人体组织样本由帝国理工学院的英国MS学会组织库提供（由英国MS学会资助，向RR提供007/14赠款）。这项工作得到了英国多发性硬化学会的支持（RR和NDM的批准号为978/12，RR和RJ的批准号是037/15）。NDM得到了欧洲研究理事会的支持（第七次概念验证框架拨款编号620253）。EB得到了英国生物和生物技术科学研究委员会的博士奖学金的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

竞争利益：我已经阅读了该杂志的政策，本手稿的作者有以下竞争利益：PG、RJ、EB、JM、SU和CP没有竞争利益。RR获得了MedImmune plc的研究资金以及罗氏和诺华的咨询费。OWH已收到罗氏公司的咨询费。

缩写：亚太地区，动作电位；BBB、，血脑屏障；英国标准协会，牛血清白蛋白；汽车，相干反斯托克斯拉曼散射；cDNA，互补DNA；CMV、，巨细胞病毒；中枢神经系统，中枢神经系统；CSF、，脑脊液；陆军部，暗阿古提；DMEM、，Dulbecco的改良鹰介质；相对长度单位，电子显微镜；GFAP、，胶质纤维酸性蛋白；GFP、，绿色荧光蛋白；哈佛商学院，汉克平衡盐溶液；HIV-1，人类免疫缺陷病毒1型；德国柏林国际电子消费品展览会，不完全弗氏佐剂；干扰素γ，干扰素-γ；LTα，淋巴毒素-α；低压，慢病毒；MBP、，髓鞘碱性蛋白；MEM、，最低基本媒体；MOG、，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白；夫人，磁共振波谱；理学硕士，多发性硬化；NAWM、，正常出现的白质；155奈拉，神经筋膜蛋白155；NMDA、，N-甲基-D-天冬氨酸；华侨城，最佳切削温度；PDL、，聚-D-赖氨酸；圆周率，碘化丙啶；PMD、，死亡延迟；新泽西州，偏执连接；投资回报率，关注区域；扫描电镜，平均值的标准误差；TNF、，肿瘤坏死因子

介绍

多发性硬化（MS）是中枢神经系统（CNS）的一种神经炎症性疾病，其特征是局部和弥漫性炎症、轴突变性和丢失、脱髓鞘和胶质增生[1]. 虽然MS研究的重点长期以来一直是脱髓鞘损伤，但神经元损伤和轴突丢失现在被认为是MS病理学中的早期和持续因素[2,三]可能是长期神经功能衰退的最佳预测因子[4]. 有研究表明，活化的小胶质细胞和巨噬细胞围绕有髓应激轴突[三]可能引发兰维尔淋巴结周围的肿胀，导致线粒体病理学和随后的局灶性轴突变性[5]. 进行性MS中无病变的正常白质（NAWM）实际上是高度异常的，包含慢性激活的小胶质细胞、功能失调和退化的轴突、反应性星形胶质细胞和受损的血脑屏障（BBB）[6–9]. 此外，MRI研究显示，NAWM区域异常，尤其是在疾病持续时间较长的慢性进行性患者中[10,11].

NAWM的轴突功能障碍可通过节点处的结构改变来促进，因为它们是维持快速有效跳跃动作电位（AP）传导的关键因素。Caspr1、接触蛋白和神经筋膜蛋白155（Nf155）与细胞骨架蛋白、锚蛋白B、αII和βII谱蛋白之间的相互作用有助于形成偏执连接（PNJ）[12–15]. 少突胶质细胞和轴突在这些髓鞘游离点之间复杂而紧密的分子相互作用，对于限制膜蛋白在各结区之间的运动和减少髓鞘下的电流流动至关重要，但也使PNJ特别容易受到免疫介导的病理改变。MS NAWM的尸检组织研究表明，Nf155类偏执结构的长度增加，并且在一定比例的轴-胶质连接中，靠近淋巴结的Kv1通道部分错位[16]. 然而，MS NAWM偏执/结节性紊乱的功能意义和机制尚不清楚。暴露于谷氨酸水平升高、病理性Ca的啮齿动物轴突束脊髓髓鞘的实时激光扫描相干抗斯托克斯拉曼散射（CARS）成像2+内流和钙蛋白酶1的激活证明了偏执分裂[17–19]. 用条件敲除偏执型蛋白Caspr1进行的动物研究[20]，155奈特[21]，βII精蛋白[22]，和4.1.B蛋白[23,24]显示缺乏紧密的间隔连接，骨周间隙增加，相邻帕帕阳极电压门控通道Kv1向PNJ错位，以及运动震颤和传导速度降低等功能改变。综上所述，这表明可能存在钙导致的分子偏执紊乱模型2+PNJ少突胶质细胞胞质突起中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的谷氨酸活化介导的积累[25–28]. 多重磁共振波谱（MRS）研究表明，急性MS病变和NAWM组织中的谷氨酸水平升高[29–31]. 促炎细胞因子，如TNF，可以自分泌/旁分泌方式刺激小胶质细胞，诱导谷氨酸释放[32,33]以及阻断对谷氨酸稳态至关重要的星形胶质细胞谷氨酸转运体[34–36]. 来自人体组织研究的最新数据表明，MS大脑中TNF信号水平增加[37].

在这里，我们报告称，在远离病灶的MS大脑的NAWM中，Caspr1表达的PNJ结构中断和Kv1移位，并伴有轴突改变，这可以在导致整个大脑慢性小胶质细胞活化的慢性脑膜炎大鼠模型中再现。结旁神经断裂与激活的小胶质细胞的存在相关，提示轴突损伤机制始于偏执狂，与脱髓鞘过程无关。此外，我们证明，通过IFNγ和TNF或LTα激活小胶质细胞，以及由此产生的谷氨酸释放，可以在体外小脑片培养中诱导类似的PNJ病理学。最后，我们使用生物物理模拟系统地探讨了在人体组织和动物模型中观察到的一系列偏执和近帕帕烷结构改变对传导的影响。

结果

尸检MS NAWM中PNJ结构被破坏

为了描述人类MS NAWM组织中出现的PNJ病理学特征及其与局部小胶质细胞活化和轴突细胞骨架破坏的关系，从含有脑梗和中央前回的snap冷冻组织块中，仔细选择离脱髓鞘病变至少4至5 mm的NAWM感兴趣区域，这两个区域都具有高密度的纵向轴突。用髓磷脂蛋白、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG）抗体的免疫荧光证实了髓磷脂的完整性(图1A)和HLA-DR（MHC II类）抗体证实存在具有活化形态的小胶质细胞（突起厚而短）(图1B). 定位于偏执狂的Caspr1免疫荧光显示，MS NAWM组织中Caspr1染色偏执狂（2.8±1.1μm）的平均长度比非神经控制组织中的平均长度（2.3±0.8μm，图1C-1G). 此外，MS组织中43%的偏执狂超过了对照组75%的百分位数（2.7μm），11.14%的偏执症超过了4μm，而非神经系统对照组为4.1%(图1G). 被检查的两个大脑区域之间几乎没有差异；中脑脑脚的横突长度为2.81±0.019μm，其中12%大于4μm，而中央前回的横突长为2.79±0.017μm，10%大于4μ(S1图). 这表明，与非神经系统对照组相比，多发性硬化症患者大脑中轴突的显著比例中断了Caspr1标记定义的偏执狂长度。

缩略图
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图1。MS NAWM区域包含更多与激活的小胶质细胞相关的拉长偏执狂。

（A） 抗MOG髓鞘免疫荧光用于识别脱髓鞘区域和正常出现的髓鞘。NAWM感兴趣区域（i，ii）被选为远离脱髓鞘病变的区域（iii，iv）。（B） 在整个NAWM感兴趣的区域中发现了具有活化形态的抗HLA-DR+小胶质细胞突起簇，并在第i至iv组中以更高倍率显示。（C） 横断面上单个Caspr1染色偏执狂的共焦图像及其强度分布。（D，E）来自人类死后非神经控制组（D）和NAWM MS组织（E）的偏执狂共焦图像。（F） 与非神经控制组织相比，NAWM MS组织中Caspr1+偏执长度的分布存在显著差异(第页<0.0001，Mann–Whitney试验）。（G） NAWM MS组织中Caspr1+偏执狂的比例大于对照组织中的4μm和5μm。（H） 每个区块的平均偏执型长度与HLA-DR+小胶质细胞/巨噬细胞占据的平均面积相关（r=0.43*第页<0.5，斯皮尔曼秩相关检验）。（一） 每个区块HLA-DR+小胶质细胞/巨噬细胞所占的平均面积与大于4μm偏执狂的比例相关（r=0.46**第页<0.01，斯皮尔曼秩相关检验）。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白；MS，多发性硬化；NAWM，正常的白质。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.g001

PNJ破坏与小胶质细胞激活和轴突应激有关

小胶质细胞的慢性激活和轴突变性是进行性MS中NAWM组织的两个主要病理特征。因此，我们检查了它们与偏执长度的关系，作为偏执性轴-胶质细胞破坏的标志。HLA-DR+标记的小胶质细胞所占的平均面积作为小胶质细胞活化的测量值。平均偏执型长度与偏执型>4μm的比例和平均小胶质细胞面积之间存在中度显著相关（r=0.46和r=0.43*第页< 0.05,图1H和1I). 用SMI32抗体进行双重免疫荧光标记，标记去磷酸化神经丝蛋白（轴突应激的指示物）和Caspr1，以指示偏执长度(图2A)，表明SMI32+轴突的Caspr1染色偏执型平均值（平均值=3.89±0.1μm）比SMI32-轴突的平均值=2.49±0.07μm长，图2B)非神经系统对照组（平均值=2.33±0.01μm）。此外，SMI32+轴突的平均偏执长度比对照偏执长度长66.9%，比SMI32-轴突偏执长度高56.2%(图2B)这表明偏执狂的改变与轴突应激之间有着密切的关系。

缩略图
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图2。结旁延长与SMI32+轴突和并列帕帕阳极电压门控Kv1.2通道错位有关。

（A） 长Caspr1+偏执狂与SMI32抗体共同染色的共焦图像。以去磷酸化神经丝为特征的SMI32+轴突具有拉长的偏执。（B） 来自MS NAWM和非神经控制组织的SMI32+和SMI32-轴突的副节段长度分布(****第页<0.0001，Mann–Whitney试验）。（C） 来自节点的共聚焦图像显示偏执狂（红色）和K中Caspr1的表达v（v）1.2在非病理条件和相应的RGB剖面下，并排帕帕阳极（绿色）中的通道不重叠。（D） Caspr1和K所在节点的共焦图像v（v）1.2为共定位，因此可能受到MS神经病理学条件及其强度RGB分布的影响。紫色圆圈表示两个信号都在同一区域：重叠区域。（E） 当Caspr1和K之间的差异v（v）1.2信号小于可变强度阈值，我们将该点视为重叠区域。对于每个计算的阈值，MS NAWM组织（蓝色）中重叠区域的比例大于非神经控制组织（灰色）。（F） 每个区块的平均偏执长度与强度阈值为50时重叠区域的比例相关（r=0.49**第页<0.01，斯皮尔曼秩相关检验）。（G） 每个区块长度超过4μm的偏执狂比例与阈值为50的重叠区域比例相关（r=0.57***第页<0.001，斯皮尔曼秩相关检验）。MS，多发性硬化；NAWM，正常的白质。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.g002

副淋巴结破坏与并列帕帕诺尔K相关v（v）1.2沟道位错

紧密粘附的轴-胶质连接的作用之一是促进电压门控通道的聚集和分离，并防止髓鞘下的电流分流。为了检查副节点结构的不稳定性是否会引起近场电压门控K的错位v（v）MS NAWM组织中偏执狂的1.2个通道，Caspr1（红色）和电压门控K的RGB强度曲线v（v）测量了1.2通道（绿色）标记的偏执狂和并排帕帕阳极(图2C和2D). Caspr1和K的共定位v（v）通过将两个强度信号一一相减来计算1.2。当此差异小于可变阈值时，我们将该点视为重叠区域（中的源代码S1文本). 对于可变强度阈值，MS NAWM组织在每个阈值处的重叠区域比例高于非神经控制组织(图2E). 例如，如果阈值设置为50，MS NAWM组织的重叠区域比非神经控制组织多19.7%，而阈值为100时，MS NAWM组织的覆盖区域比控制组织多41%。因此，偏执狂的分裂伴随着并列的帕帕诺德K的错位v（v）1.2条通向淋巴结的通道，使这些电压门控通道更容易暴露于更广泛的淋巴结细胞外空间，与相邻帕帕阳极的致密髓鞘相比，该空间电容性更强，电阻更小。此外，当阈值设置为50时，NAWM组织中重叠区域的比例与平均偏执长度之间存在显著相关性(图2F)偏执狂超过4μm的比例(图2G). 采用相同的量化程序评估结节Na的错位v（v）电压门控通道进入PNJ，但没有发现明显的错位，即使存在拉长的偏执狂(S2图). Na之间的重叠v（v）未观察到偏执连接的电压门控通道和组件。

大鼠皮层长时间暴露于促炎细胞因子可产生偏执性破坏

为了进一步研究NAWM慢性炎症与PNJ病理学之间的关系，我们使用了一种新型的大鼠慢性脑膜炎模型[38]. 在这个模型中，炎症是由脑膜和脑脊液（CSF）中的促炎细胞因子LTα和IFNγ的慢性生成引起的。在没有WM脱髓鞘的情况下，脑膜炎在3个月内诱导了广泛的小胶质细胞激活，而这些动物没有发生这种情况(S3图). 这使得研究弥散性神经炎症对NAWM轴突的影响成为可能，与进展性MS类似，避免了Wallerian变性和脱髓鞘导致的死亡背轴突损伤模式。对照组为注射绿色荧光蛋白（GFP）基因载体的大鼠或幼稚大鼠(S3图). 从胼胝体、扣带回和外膜的MOG免疫荧光图像中选择NAWM区域(图3A–3C).

缩略图
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图3。与GFP和naive相比，受LTα/IFNγ影响的大鼠组织中含有更长的Caspr1-偏执狂的比例更高。

（A–C）MOG染色的胼胝体、扣带回和LTα/IFNγ、GFP和幼年大鼠的外膜的免疫荧光图像。（D） Caspr1-K的共焦图像v（v）LTα/IFNγ大鼠的1.2种偏执狂和并列帕帕肽。（E–G）单个Caspr1-K的共焦图像v（v）LTα/IFNγ大鼠的1.2种偏执狂和并列帕帕肽。（H） Caspr1-测量LTα/IFNγ（蓝色）、GFP（橙色）和天真（灰色）大鼠组的偏执长度分布(****第页<0.0001，Mann–Whitney试验）。（一） 副节段长度数据被划分为不同的长度范围，并用条形图表示。LTα/IFNγ载体注射的大脑中含有大于3μm和4μm的偏执狂的比例更大。（J） 共聚焦图像中Caspr1染色的paranodes与K共聚焦v（v）1.2色并排阳极。为了量化通道的位移，获得了每个偏执和并列通道的RGB强度分布。紫色圆圈表示两个信号共同定位的区域。（K） 显示Caspr1和K之间重叠区域比例的图表v（v）1.2与GFP组和单纯组相比，LTα/IFNγ组在每个强度阈值下的RGB信号更大。（五十） 当强度阈值设置为50时，平均偏执长度与重叠区域的比例显著相关（r=0.827**第页<0.01，斯皮尔曼秩相关检验）。绿色荧光蛋白；干扰素γ；LTα，淋巴毒素-α；MOG，髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.g003

Caspr1和电压门控K的免疫荧光分析v（v）1.2对人体组织进行了通道定位(图3D–3G). 总的来说，对LTα/IFNγ组的1000个Caspr1染色偏执狂（每只大鼠200个偏执狂）、GFP组的600个偏执迷狂和幼稚组的600个中的偏执狂进行了分析。LTα/IFNγ载体组Caspr1染色的平均偏执型长度（2.41±0.01μm）比幼年大鼠（1.77±0.01μm）长35.6%，比GFP载体注射大鼠（2.08±0.02μm）长15.9%。此外，LTα/IFNγ组82%的偏执狂比天真组75%的偏执长（1.98μm）(图3H). 各组的旁淋巴结长度分布显示，LTα/IFNγ组9.7%的偏执狂长于3μm，而GFP组为4.8%，而幼稚组为0%(图3I（紫色和粉红色））。与幼稚组（77.5%的偏执狂短于1μm）、GFP组（46.7%）和LTα/IFNγ组（19.3%）相比，偏执狂的长度短于1微米(图3I). 因此，与GFP组和幼稚组相比，LTα/IFNγ载体注射的动物中存在广泛的小胶质细胞激活的节旁轴神经胶质细胞连接被高度破坏。有趣的是，GFP载体注射动物的偏执长度也有适度但显著的增加，同时小胶质细胞激活水平较低，但显著低于细胞因子载体注射动物。

Caspr1和K的RGB强度分布分析v（v）1.2通道，采用与尸检人体组织相同的方法（中的源代码S1文本)，显示LTα/IFNγ载体注射动物的大脑中含有大量重叠区域的轴突(图3J和3K)对每个阈值进行分析。因此，LTα/IFNγ动物的轴突受损更多，电压门控K脱位v（v）1.2个通道，表明PNJ受到干扰的人数多于GFP和幼稚组(图3J和3K). 当强度阈值设置为50时，LTα/IFNγ与GFP或幼稚组之间重叠区域的比例存在显著差异。此外，重叠比例与平均偏执长度相关(图3L，r=0.827），每只大鼠副结节的比例＞3μm（r=0.765）。这些结果表明偏执延长和Kv（v）1.2位错常同时出现。尽管注射LTα/IFNγ载体的动物中表达SMI-32免疫反应的轴突数量明显增加(S3D图)与MS NAWM相似，由于大鼠胼胝体、扣带回和外囊中的紧密轴突密度，无法量化这些SMI32+轴突和Caspr1+偏执长度之间的关系。

为了研究周围炎症是否在该病理学中起作用，在相同动物的连续切片上评估了NAWN区域的小胶质细胞和星形胶质细胞的数量(图4A-4F). NAWM中小胶质细胞的数量与平均偏执长度显著相关(图4G，r=0.62）和Caspr1和K之间重叠区域的比例v（v）1.2 (图4H，r=0.778）。尽管各组之间的小胶质细胞总数没有显著差异，但与GFP载体注射和幼年动物相比，LTα/IFNγ载体注射动物的小胶质瘤具有激活的形态（插图图4A-4C). 此外，星形胶质细胞的数量也与平均偏执长度相关(图4I，r=0.69）和Caspr1和K之间重叠区域的比例v（v）1.2 (图4J，r=0.75）。这些数据支持我们的假设，即小胶质细胞和星形胶质细胞是有髓轴突中偏执性轴-胶质连接中断的主要介质。

缩略图
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图4。结旁延长和Kv1.2脱位同时发生，它们与胶质细胞激活有关。

（A–C）来自LTα-IFNγ、GFP和幼稚大鼠胼胝体的IBA1+小胶质细胞（红色）的免疫荧光图像。插图显示，与GFP对照组和幼年动物相比，细胞因子载体注射动物中的小胶质细胞（以绿色显示）显示出高度激活的形态。（D–F）来自LTα/IFNγ、GFP和幼稚大鼠胼胝体的GFAP+星形胶质细胞的免疫荧光图像。（G） 小胶质细胞的数量与每只大鼠的平均偏执长度相关（r=0.62*第页<0.05，斯皮尔曼秩相关检验）。（H） 小胶质细胞的数量与Caspr1和K之间重叠区域的比例相关v（v）1.2当强度阈值设置为50（r=0.778**第页<0.01，斯皮尔曼秩相关检验）。（一） 星形胶质细胞的数量与每只大鼠的平均偏执长度相关（r=0.69*第页<0.05，斯皮尔曼秩相关检验）。（J） 星形胶质细胞的数量与Caspr1和K重叠区域的比例相关v（v）1.2当强度阈值设置为50（r=0.75*第页<0.05，斯皮尔曼秩相关检验）。绿色荧光蛋白；干扰素γ；LTα，淋巴毒素-α。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.g004

TNF/IFNγ激活的小胶质细胞和星形胶质细胞释放高水平的谷氨酸

先前的研究表明，谷氨酸水平升高能够引起淋巴结改变[17–19]. 因此，为了评估中枢神经系统中增加的促炎细胞因子水平是否能刺激小胶质细胞和/或星形胶质细胞释放谷氨酸，用不同浓度的TNF、IFNγ或TNF+IFNγ处理原代大鼠小胶质细胞及星形胶质细胞培养物(S4A图). 小胶质细胞被TNF和/或IFNγ激活，其形态从树枝状转变为更活化的变形虫形态(图5A-5D). 与对照组（24小时：33.49±2.11μM；48小时：27.73±7.33μM）(图5E)，如果剂量增加到200 ng/ml，则不会进一步增加(S4B图). 不同处理之间24小时和48小时的谷氨酸水平差异不显著(图5E). 然而，每隔24小时注射两次剂量的100 ng/ml TNF+IFNγ(图5F)与单一处理相比，培养基中的谷氨酸浓度在48小时达到最高（96.05±9.92μM）。我们在这里交替使用了TNF和LTα，因为它们在这种情况下都通过TNFR1受体发挥作用。用促炎细胞因子LTα和IFNγ对原代小胶质细胞培养物进行了相同的实验，与对照组相比，间隔24小时给药2个剂量后，也会导致显著的谷氨酸释放(S4C和S4D图). 同样，在添加100 ng/ml和200 ng/ml的TNF+IFNγ后24小时，也能显著刺激星形胶质细胞释放谷氨酸(S5A图)，尽管在100和200 ng/ml之间没有显著差异。此外，星形胶质细胞对谷氨酸的摄取被细胞因子的添加显著抑制(S5B图).

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图5。TNF/IFNγ激活的小胶质细胞释放大量谷氨酸。

（A） 未经处理的原代小胶质细胞培养物的实时图像，（B）48小时后用IFNγ处理的培养物，（C）48小时以后用TNF处理的培养液，以及（D）48小时之后用TNF/IFNγ处理过的培养物（E，F）复制品中谷氨酸水平的平均值±SEM，显示对照组和细胞因子处理之间的统计差异：（E）100 ng/ml(n个=3控制，n个=3 TNF，n个=3干扰素γ，n个=3 TNF/IFNγ），（F）2次100 ng/ml的急性治疗(n个=3控制，n个=3 TNF，n个=3干扰素γ，n个=4 TNF/IFNγ）。对细胞因子组和时间进行非参数Friedman检验，并对比较组进行事后配对Wilcoxon检验(*第页< 0.05, **第页< 0.01). 干扰素γ；TNF、肿瘤坏死因子。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.g005

TNF/IFNγ和谷氨酸直接给药诱导离体小脑片偏执延长

为了确定TNF+IFNγ和谷氨酸是否会引起MS-样偏执型病理，从P8/9大鼠的器官型小脑片中提取并培养8至10天，分别用3剂50 ng/ml TNF/IFNγ、2剂100 ng/ml肿瘤坏死因子/IFNβ、2剂小胶质条件培养基、2剂75μM谷氨酸处理，或2剂量100μM的谷氨酸（在所有治疗中，每24小时给药一次，并在最后一次给药24小时后测量谷氨酸水平(S6图). 对于每个小脑组织切片，分析了200个聚焦Caspr1染色偏执狂(图6A). 在接受TNF/IFNγ治疗的小脑切片中，50 ng/ml组Caspr1染色的偏执型长度平均比未经治疗的小小脑培养物长19.15%（2.96±0.03μm），100 ng/ml组平均长16.6%（2.88±0.04μm），图6B). 然而，当按长度范围分离偏执测量值时，与未经处理的小脑切片相比，他们具有更大比例的高度破坏的长偏执>4μm（100 ng/ml组为11.38%，50 ng/ml小组为11.34%；图6C、浅紫色和深紫色）。还观察到异常长的Caspr1染色偏执狂（图6A).

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图6。经促炎细胞因子和谷氨酸处理的小脑组织切片中拉长偏执狂的比例。

（A） 来自未经处理的小脑培养物的Caspr1染色偏执狂的共焦图像，用3剂量50 ng/ml TNF/IFNγ处理的切片，用2剂量100 ng/ml的TNF/IFFγ处理的薄片，用2个剂量75μM谷氨酸处理的切片，和用2剂量小胶质细胞条件培养基处理的切片（用2剂量100 ng/ml TNF/IFNγ处理的原代小胶质细胞培养基）；星号指向长期且混乱的偏执狂。（B） 方框图显示了治疗和非治疗培养物之间的不同偏执长度分布（非参数Kruskal–Wallis检验和事后Wilcoxon秩和检验****第页< 0.0001). （C） 相同偏执长度分布的条形图显示了不同长度的每个数据集中偏执的比例。（D） 非处理培养物（橙色）的偏执长度分布方框图，2剂100 ng/ml TNF+IFNγ与MK-801（深灰色），2剂单独100 ng/mlTNF+干扰素γ（浅灰色）(****第页<0.0001，Mann–Whitney试验）。（E） 条形图显示划分为不同长度范围的相同偏执长度分布。干扰素γ；TNF、肿瘤坏死因子。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.g006

用两次剂量100 ng/ml TNF/IFNγ后产生的原代小胶质细胞条件培养液处理五个小脑切片，这种条件导致谷氨酸释放量最大。这些小脑培养物的平均偏执长度为3.23±0.04μm，比未经处理的培养物平均长32.84%（2.47±0.027μm；每个小脑切片分析200个偏执，图6A-6C). 为了检测谷氨酸是否是小胶质细胞细胞因子条件培养液中的主要细胞毒性因子之一，用75μM谷氨酸处理4个小脑片48 h（100 ng/ml TNF/IFNγ组的平均谷氨酸浓度为96.046±9.92μM，条件培养液稀释为4:1），这导致偏执狂平均比未经处理的组织切片长26.11%(图6A-6C). 为了确认TNF/IFNγ的作用是否是由于谷氨酸的释放和作用，用2剂量100 ng/ml的TNF/IFFγ和非竞争性NMDA拮抗剂MK-801（0.6mM）处理5片切片(图6D). MK-801治疗组和未治疗组切片的偏执长度分布无显著差异(图6E). 与单独使用细胞因子治疗的培养物相比，MK-801组中长于4μm的偏执狂的比例大大降低（从11.38%降至3.3%，图6E).

PNJ断裂会影响小直径轴突的速度和传导

为了通过使用计算模型系统地检查偏执干扰对AP传播的影响，建立了双缆芯模型，并在NEURON中进行了数值求解(图7A). 选择双电缆芯导体电路分别表示轴突膜、外膜间隙和髓鞘的生物物理参数[39–41]. 我们模拟了由4种类型的隔室组成的轴突膜的功能：节点、偏执、并排和节间。节点聚集了高密度的快速Nav（v）通道（Nav（v）1.6），持久Nav（v）通道和慢Kv（v）通道(图7A，紫色）。紧靠淋巴结两侧，偏执狂被构建为无活性传导的隔室，髓鞘末端环与轴突相连的部位(图7A，深灰色）。除了偏执狂之外，并排的帕帕阳极还含有快速Kv（v）通道(图7A，中灰色）。最后，节间被髓磷脂包围，具有低密度离子通道(图7A，浅灰色）。模拟了七种纤维直径：d纤维=0.5、0.8、1.1、1.3、1.6、1.8、3.5【μm】。这些较小的轴突直径是在考虑了以往人脑和猕猴电子显微镜（EM）研究的基础上选择的，这些研究表明，中枢神经系统内轴突核心的平均直径为1μm[42]. 模拟中使用的所有结构和生物物理参数均取自先前的EM研究，总结如下图7B和7C而通道的电导和门控动力学是基于先前的电生理研究，详见材料和方法。我们的模拟预测的传导速度与纤维直径呈线性关系（V[m/s]=4.52*d纤维[微米]）(图7D，蓝线），重现了之前的实验结果(图7D，灰色虚线，Boyd和Kalu得出的速度数据[43]来自猫后肢神经的小直径轴突V=4.6*d纤维).

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图7。用于模拟21节点有髓轴突的结构和生物物理参数。

（A） 使用模拟器NEURON生成了表示轴突（Ga）、轴突周围间隙（Gp）和髓鞘（Gm）的模型的双电缆电路。具体而言，创建了21个节区、39个副节区、39个近轴区和20个节间区。（B） 模型中使用的解剖参数。从猕猴EM研究的CNS测量中选择了七种直径[42]髓磷脂周期值为0.0156μm，计算髓磷脂板层数（nl）[71]，从大鼠神经纤维测量的线性关系中得出节点间的长度[72]，根据猫腹根的直径依赖性标度关系推断出帕帕阳极旁长度[73]偏执长度是根据我们非神经控制病例中Caspr1染色的平均值确定的。（C） 生物物理参数。轴突电容基于大鼠腹根的数据[86]每片髓鞘电容和漏电导均基于青蛙坐骨神经[87]. 电阻率设置为1000欧姆*厘米2每个髓鞘层[40,87,88,89,90,91]. （D） 图中显示了模型在模拟的7种纤维直径上的传导速度（蓝色）以及猫后肢神经中测得的速度数据[43].

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.g007

为了模拟偏执型干扰，偏执型和/或并排帕帕诺尔格室的阻力降低，并排帕巴诺尔格Kv（v）通道错位。随着两个腔室的结膜间隙逐渐增大，阻力降低。在这个模型中，观察到的偏执型延长表现为外膜周围间隙的增加，假设如果PNJ处的一些髓鞘末端环与轴膜分离，这些间隙将逐渐变大[20,21]. 此外，juxtaparanodal Kv（v）通道向偏执狂错位，其电导与偏执狂周围空间的增加成比例增加。总之，模拟了以下结构安排：(图8A); （b） 偏侧和近侧肛周空间的比例增量(图8B); （c） 并排快速K的比例增量v（v）通道电导与偏执性肛周间隙(图8C); 和邻苯二甲酸酯快速K的比例增量v（v）沟道电导与偏侧和近侧足周间隙(图8D).

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图8。偏执型分裂对AP传导的影响与轴突直径成反比。

（A） 图中表示了随着偏执型周围空间的增加，偏执型边缘空间的增量以及每个核心直径处的归一化速度图。（B） 图中表示了随着偏执和近交周间隙的增加，每个核心直径处的偏执和旁交周间隙增量以及归一化速度图。（C） 表示偏执型和近侧型肛门周和肛门周K增量的图v（v）1个位错和在每个核心直径处的归一化速度图，随着偏斜周间隙的增加。（D） 表示偏执型和近侧型肛门周和肛门周K增量的图v（v）1个位错和在每个核心直径处的归一化速度图，随着偏斜周间隙的增加。（E） 在核心直径为0.4μm的轴突模型中，当5个连续的节点被破坏（橙色）时，发生传导故障，并且横突和近筋膜周围间隙宽度分别增加到0.012和0.12μm。此外，在不同的中断模式下，速度可能会衰减，传导可能会失败（橙色表示中断节点，紫色表示健康节点，红色表示传导失败）。

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在所有轴突直径中，传导速度均随着偏执侧索周围间隙的增大而降低(图8A). 将数据拟合为对数曲线，随着节旁轴突周围间隙的增加，直径较小的轴突的轴突速度下降速度快于直径较大的轴突(图8A). 当并排帕帕诺达尔快速Kv（v）通道错位到妄想室(图8B)小直径轴突的速度也下降得更快，尽管通道的错位并没有显著改变这一点。当引入了偏执和并排的日冕周围空间的渐进增量时(图8C)轴突核径0.4μm的轴突在其旁、旁轴索周间隙增加500%（旁轴索周间隙0.012μm，旁轴索0.12μm）时不能传导。同时，带有d的轴突核心0.6μm和0.8μm也不能传导，当偏执型和近端肛门周间隙增加1000%时（偏执型肛门周空间为0.022μm，近端肛周空间为0.22μm）。此外，在相同条件下，大直径轴突的速度衰减显著。例如，核心直径为2.7μm的轴突的速度降低了78.47%（y=-0.209*ln（x）+1.6457，r2= 0.99). 在最后的结构安排中，偏执和并排的肛周间隙增加，Kv（v）1人脱臼(图8D). 在这种情况下，轴突的核心直径分别为0.4、0.6和0.8μm，而轴突的中心直径为2.7μm。这些数据表明，与大直径轴突相比，小直径轴突中的AP传导可能更容易受到偏执型和近端性帕金森病的破坏。

在前4种情况下，轴突的所有21个节点都被破坏，因为增加了轴突周围空间的宽度，并取代了相邻的帕帕阳极电压门控Kv（v）通道。然而，传导失败仅发生在小直径轴突（d核心0.4、0.6和0.8μm）。因此，我们还检查了在这些直径下传导失败所需的连续节点数，以及在模拟轴突内传导后的速度衰减，在轴突内有健康的节点补丁(图8E，紫色）点缀着被破坏的节点(图8E，橙色），这更有可能反映病理情况。在带有d的轴突中核心=0.4μm时，当轴旁间隙和轴旁间隙的宽度分别增加到0.012和0.12μm时，传导失败需要5个连续的节点(图8E). 然后我们探讨了在不同模式下连续损伤少于5个节点是否也会导致传导失败或传导速度下降(图8E). 通过模拟不同的模式，我们可以观察到沿着轴突中断的节点总数并不能决定传导是否会失败，但它取决于中断的连续节点的数量。例如，当3个节点中断时(图8E，橙色）之后是2个健康的节点(图8E，紫色），传导没有失败，反而导致了73.1%的速度衰减。同时，在其他受损节点数量较少的情况下，当连续4个节点受损时，传导失败(图8E). 对具有d的轴突使用不同模式的模拟核心=0.6和0.8μm可以在第7部分和第8节图。

讨论

Ranvier的淋巴结是髓磷脂和轴突之间唯一的直接接触点，特别是在偏执型轴-胶质连接处[14,44]，这表明这些位点可能是MS免疫介导攻击的靶点之一。只有少数研究在人类MS组织中描述了副淋巴结和旁淋巴结病理学[16,45–47]，但其影响和原因尚不清楚。我们对Caspr1染色的偏执型轴-胶质连接纵向延伸和K错位的详细分析v（v）1.2通道表明，与非神经控制组织相比，MS NAWM中偏执狂的比例明显中断。这延伸并支持了我们先前的研究，该研究显示表达偏执结构的胶质神经筋膜155延长[16]. 在这里，我们报告了在广泛的NAWM样本中，caspr1+偏执狂长度、近端帕金森氏体破坏以及与轴突应激/损伤的相关性的显著变化，这些变化是由小胶质细胞激活程度定义为一个连续变量的。以前，这种关联仅在显示“低”或“高”小胶质细胞激活的MS NAWM的二元组中显示。通过持续升高的TNF/LTα和IFNγ水平，在体内和体外模型中再现了这些发现，这表明促炎细胞因子可能是该病理学的触发因素。使用原代培养物和器官型小脑片培养物进行的进一步研究表明，小胶质细胞和/或星形胶质细胞在促炎细胞因子刺激下释放谷氨酸，可能会介导偏执型患者的这些病理变化。Ranvier异常淋巴结的积聚可能导致一些不能归因于局灶性病变的全身MS症状，例如70%至90%的MS患者报告为主要症状的疲劳[48]. 尽管MS疲劳的潜在机制尚不清楚，但NAWM中Ranvier异常节点的广泛存在以及由此产生的低效动作电位传导可能起到一定作用。

偏执型轴突蛋白Caspr1或其神经胶质对应物Nf155表明偏执型轴-胶质连接的延长[16]这表明胶质和轴突蛋白可能彼此分离，导致沿轴膜扩散。因此，它可能代表髓鞘末端环路与轴突的部分或完全分离，以及环路本身的分离，从而导致髓鞘舌的完全分离。虽然我们还没有通过超微结构分析直接证明这一点，但偏执型蛋白Caspr1、Nf155、βII spectrin和4.1.B的条件性小鼠敲除[20–24]在超微结构水平上显示缺乏紧密的隔膜连接和增加的外膜间隙，这与偏执型蛋白谱的延长和相邻帕帕阳极电压门控通道Kv1向PNJ的错位有关，类似于MS组织中的情况。这种结构变化意味着偏执型和并排型中轴周空间的宽度增加，因此，这些隔室的膜电容也会发生逐渐变化。K的适当锚固中断v（v）1.2先前的研究表明，并列帕帕阳极内的电压门控通道中，锚定K的TAG1和Caspr2的表达v（v）NAWM MS组织中，轴膜的1个通道减少[49]. 因此，paranode的部分到完全破坏，以及TAG-1/Caspr2/K的三方邻苯二甲酸酯复合物的可能解离v（v）1，可以解释电压门控Kv（v）1通道沿着膜扩散。值得注意的是，在Na定位没有改变的情况下，偏执狂的分子组织受到破坏v（v）这与我们之前对MS白质脱髓鞘区域的研究一致[47]这表明偏执狂和K运动的改变v（v）1.2通道先于淋巴结的改变，只有在脱髓鞘后无偏执症状时才会出现淋巴结蛋白分布的改变。总的来说，这些组织病理学结果与进展性MS特别相关，因为偏执病理会影响轴突的生理完整性，如果炎症刺激持续存在，则可能导致逐渐增加的缺陷。

人类组织的组织病理学分析表明，MS NAWM组织中Caspr1免疫阳性的细长偏执狂占很大比例，与周围活化的小胶质细胞有关。有人认为NAWM中弥漫性轴突损伤与活化的小胶质细胞密切相关[50–52]现在我们可以添加偏执狂病理学作为NAWM变化的特征。我们的大鼠慢性表达LTα和IFNγ诱导的脑膜炎模型进一步巩固了神经炎症和有髓轴突偏执性破坏之间的关系。以前的研究已经证明在小鼠EAE模型中脊髓NAWM区域存在偏执延长[16]. 然而，在这个模型中，NAWM的变化伴随着局灶性脱髓鞘病变的出现，并且发生在相对急性的时间段内。相反，用于当前实验的模型的特征是，由于CSF中长期存在促炎细胞因子超过3个月，并且大脑中没有脱髓鞘病变，导致小胶质细胞广泛激活。表达Caspr1的偏执型轴-胶质连接的纵向延伸和电压门控K的错位v（v）1.2个通道表明，在没有脱髓鞘的情况下可以发生偏执性分裂。脱髓鞘的缺乏也表明偏执性改变发生在持续的电活动中，沉默的轴突可能不太容易受到TNF和IFNγ、活化胶质细胞释放的谷氨酸和少突胶质细胞功能障碍的联合作用。虽然无法明确排除无脱髓鞘时可能发生的顺行和/或逆行轴突变性的影响，但轴突周围小胶质细胞和星形胶质细胞释放的局灶性炎症介质可能发挥重要的局部作用。事实上，偏执延伸和K错位的程度v（v）1.2条通道与改变结节周围的小胶质细胞和星形胶质细胞数量相关。干扰素γ可能在这方面起着主要作用，因为它本身可以刺激小胶质细胞释放谷氨酸，并且已经证明它作用于小胶质细胞上的干扰素受体，使其启动吞噬活性[53]，增加TNFR1的表达[54]并促进各种促炎反应，包括TNF和IL6的释放[55].

这些部位的胶质细胞损伤机制之一可能是沿维持这些连接的适当结构和功能的蛋白质髓鞘通道的轴-胶质转运中断[44,56]. 或者，如果谷氨酸水平没有保持在稳态水平，结构的改变可能是由钙敏感蛋白酶（如钙蛋白酶1）的激活引起的。白质中成熟少突胶质细胞表达AMPA/红藻氨酸受体以及NMDA受体[27]. 然而，尽管AMPA/红藻氨酸受体主要在细胞体上表达，NMDA受体在髓鞘形成过程中表达最高[25,26,28]它们可能在感知周围其他细胞释放谷氨酸方面发挥生理作用。因此，激活的小胶质细胞沿半侧通道释放的谷氨酸可扩散到偏执和近帕帕诺尔周间隙，并产生偏执病理[17]通过作用于髓鞘细胞质通道中的NMDA受体，包括PNJ和adaxonal胶质膜[56,57]. 我们的数据表明，激活的小胶质细胞和星形胶质细胞在受促炎细胞因子刺激时释放出大量谷氨酸。这些促炎细胞因子的作用与MS密切相关，因为最近的研究表明，进行性MS患者的脑脊液中TNF、IFNγ和LTα水平升高，并与脑膜炎、皮质脱髓鞘和MHCII+小胶质细胞的激活有关[58,59]. 此外，脑脊液中TNF和IFNγ水平的增加可以诱导潜在皮层实质内TNF和干扰素γ的内源性表达[38]. TNF和LTα与TNFR1受体相互作用可通过缝隙连接/半通道系统以自分泌方式诱导小胶质细胞释放谷氨酸[32,33,60]通过诱导EAAT2/GLT-1 mRNA的下调抑制星形胶质细胞中的谷氨酸转运体[34–36]. 经TNF和IFNγ治疗的器官型切片中Caspr1+偏执型蛋白长度的增加证实了这些细胞因子在偏执型轴-胶质病理学中的重要作用。研究发现，TNF+IFNγ处理的小胶质细胞条件培养液和谷氨酸本身都可以模拟偏执型变化，细胞因子的作用可以被非竞争性NMDA拮抗剂MK-801抑制，这强烈暗示谷氨酸信号是MS NAWM偏执型病理的关键分子介质大脑。我们的研究没有观察MK801单独对器官型切片培养的影响。然而，尽管据报道MK-801在体内长期高剂量给药时会引起神经毒性[61,62]，在我们研究中使用相同剂量的MK801单独治疗孤立脊髓组织时，未观察到偏执型髓磷脂损伤[17]. 为了进一步支持我们的实验结果，MS患者的MRS研究表明，与健康对照组相比，MS NAWM区域的游离谷氨酸增加[29–31]MS CSF中也发现谷氨酸水平升高[63]. 我们的新结果也为通过降低小胶质细胞/星形胶质细胞谷氨酰胺酶活性、阻断小胶质细胞半通道（Cx32、Cx36和Cx43）或通过抑制TNF和IFNγ信号传导来进行治疗干预提供了可能性。

我们对中枢神经系统有髓轴突的生物物理模型模拟表明，妄想症改变对AP传导的功能影响可能非常有害，即使只有一小部分沿着有髓轴轴突的妄想症被破坏。最近的计算模型通过增加节点宽度来模拟偏执收缩[64]将节点阻力等同于偏执阻力[65]或者通过减少妄想症患者的髓鞘环数量[66]. 然而，这些模型仅在单个轴突直径中模拟了这些条件[64,65]或者在其中一些[66]轴突通常≥1μm。在我们的模拟中，轴突周围间隙宽度的增加逐渐产生了副结节破坏，这导致小直径轴突的速度降低和传导失败。这与离子通道离域跳跃传导的薄轴突直径生物物理理论相一致[67]并强调了肛周间隙宽度的重要性[41]. 我们的数据表明，由于直径较小的轴突具有较低的髓鞘电阻和较高的轴浆电阻，因此它们对PNJ的结构完整性具有较高的依赖性，以分流电流并维持快速有效的传导。此外，这些结果还突出了对偏执和并列帕帕诺尔舱以及节点和节点间舱进行建模的重要性，因为它们是高度敏感的区域，对于与Ranvier节点平衡电荷流至关重要。在MS NAWM组织中，激活的小胶质细胞和巨噬细胞在大脑和脊髓的WM束中的分布和密度可能会发生显著变化[三,16,50,51]. 为了考虑到这种异质性，我们决定模拟不同模式的中断（偏执和旁帕帕阳极宽度增加）和健康节点，以表征高度可变的偏执连接中断对有髓轴突内AP传导的影响，从轻度到重度。这表明，纤维直径小于0.8μm的轴突发生传导故障，仅连续5次出现偏执障碍。不同类型的扰乱性偏执狂和健康偏执狂使纤维直径小于1.1μm的轴突在路径上的某一点传导失败。这些模拟不仅表明，当偏执型轴-胶质连接结构被破坏时，AP速度会显著降低，而且还表明有髓轴突的传导失败可能取决于被破坏的连续节点的数量以及被破坏节点之间健康节点的数量。因此，他们证明，MS NAWM中弥漫性偏执型轴-胶质连接病理可以显著改变AP传导的效率和速度，从而改变MS的整体神经功能。

总之，我们的数据强烈表明，NAWM的弥漫性病理学（包括偏执性破坏）可能是由局部细胞因子诱导的炎症导致小胶质细胞过度释放谷氨酸引起的。这种偏执型病理学不能归因于局灶性脱髓鞘病变，预计会改变AP传导的效率和速度，增加MS的整体神经功能障碍。这也可能与其他神经退行性疾病中的白质改变有关，慢性小胶质细胞激活是其特征。

材料和方法

人类尸体组织

本研究的组织块由伦敦帝国理工学院的英国多发性硬化学会组织库提供。经国家多中心研究伦理委员会（MREC 02/2/39）伦理批准后，通过预期捐赠者计划，在完全知情同意的情况下收集大脑。从20例经神经病学证实的SPMS中选择34个组织块（2×2×1cm）(表1; 11名女性），平均年龄54.3岁（38至76岁），平均尸检延迟22小时（12至48小时），平均病程28.4年（12至42岁）。还从9个非神经控制大脑中选择了16个区块(表2; 3只雌性），平均年龄73.7岁（50至88岁），平均PMD为23小时（8至48小时）。所有组织块均来自中央前回（包含初级运动皮层）和位于中脑的大脑脚，因为存在包含高度纵向排列轴突的白质（WM）束，这将使定量分析更加精确。将这些块固定在PBS（4%PFA）中的4%多聚甲醛中，在30%蔗糖中冷冻，在干冰上的异戊烷中冷冻，并在−75°C下储存。冷冻切片的切割厚度为10μm，储存温度为−75°C。

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表1。尸检MS病例的人口学数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.t001

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表2。尸检非神经控制脑的人口统计学数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.t002

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表3。一级抗体详细信息。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.t003

初级和次级抗体

本项目中使用的主要抗体为：小鼠抗MOG抗体（克隆Y10，英国伦敦帝国理工学院R Reynolds教授）；兔抗髓鞘碱性蛋白（MBP）（Polyclonal，Merck，Darmstadt，德国）；小鼠抗神经丝蛋白-H（克隆NE14；默克，达姆施塔特，德国）；小鼠抗去磷酸化神经丝蛋白（克隆smi32；Biolegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥）；兔抗caspr1（克隆EPR7828，Abcam，英国剑桥）；小鼠抗caspr1（克隆K65/35；Neuromab，Davis，California，USA）；小鼠抗pan-Nav（v）通道（克隆K58/35，Neuromab，Davis，California，USA）；鼠标抗Kv（v）1.2通道（克隆K14/16，Neuromab，Davis，California，USA）；小鼠抗HLA-DR（克隆TAL.1B5，Dako Agilent，Santa Clara，California，USA）；兔抗IBA1（多克隆IgG，Wako Pure Chemical Corporation，USA）；兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（Polyclonal，Dako Agilent，Santa Clara，California，USA）；小鼠抗Calbindi1抗体（克隆CB-955，默克，达姆施塔特，德国）；和鼠抗NeuN（克隆A60，默克，达姆施塔特，德国）(表3). 用于免疫荧光的所有二级抗体均购自美国赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific）：Alexa Fluor 546山羊抗鼠IgG（H+L）、Alexa Fluor 546羊抗鼠Ig G（H+L）、Alloxa Fluor 488山羊抗鼠-IgG（H+L，Alexa Fluor 647山羊抗鼠IgG1、Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG2b、Alexa-Fluor 697山羊抗小鼠IgG2b、亚历山大Fluoro 488 Streptavidin、亚历山大荧光546 Streptavodin和亚历山大荧光647 Streptavidain。对于免疫组织化学，使用了Vector Laboratories（UK）的以下生物素化抗体：山羊制造的生物素化抗兔IgG（H+L）、马制造的生物素化抗鼠IgG。

尸体组织的免疫染色

对于所有抗原的免疫荧光，切片用4%PFA固定30分钟(表3)除Pan-Na通道抗体外，其固定时间不超过10分钟。固定后，用100%甲醇在−20°C（Sigma）下固定切片10分钟，并在0.1 M PBS-0.3%Triton X-100（Sigma-Aldrich）中清洗3次，每次5分钟。固定后，在室温下用含有10%正常马/山羊血清（Sigma-Aldrich）和PBS-0.3%Triton X-100的0.1 M PBS封闭切片并渗透1小时。最后，将切片在4°C的湿度室中与初级抗体孵育过夜(表3)在含有10%正常马/山羊血清和0.3%Triton X-100（Sigma-Aldrich）的0.1 M PBS中。一次抗体孵育后，将切片在0.1M PBS中彻底冲洗至少3次，每次5分钟。冲洗后，用与生物素结合的适当二级抗体培养切片1小时，以检测MOG、SMI32和Pan-Nav抗原，并在0.1 M PBS中冲洗。冲洗后，在室温下用Alexa Fluor Streptavidin或适当物种特异的二级荧光结合抗体培养切片2小时。最后，在0.1 M PBS和dH中冲洗组织2O、 细胞核用DAPI（1:2000稀释，Sigma-Aldrich）复染，并用Vectashield防褪色贴装介质（Vector Laboratories）贴装。盖玻片用透明指甲油固定在载玻片上。

用马（Vector Laboratories）生产的ImmPRESS HRP抗小鼠IgG（过氧化物酶）聚合物检测试剂盒对HLA-DR抗原进行免疫组化。用Bloxall封闭溶液（SP-6000）封闭组织内源性过氧化物酶活性10分钟，然后用2.5%马血清培养20分钟。用0.1 M PBS封闭并清洗后，在4°C的潮湿室中培养一级抗体过夜。将ImmPRESS聚合物试剂在室温下培养30分钟，并使用ImmPact DAB（SK-4105，Vector Laboratories）开发信号。然后用自来水冲洗组织5分钟以停止反应。用苏木精（Sigma-Aldrich）对载玻片复染5分钟，用自来水和蒸馏水洗涤，用70%、90%和100%乙醇洗涤液脱水（各2分钟），用二甲苯清除10分钟，并用DPX固定介质（Sigma Aldric）固定。

慢病毒载体生产

表达人LTα（LVLTα）、人IFNγ（LVIFNγ）或增强型绿色荧光蛋白（LVGFP）基因的慢病毒（LV）载体的产生与前面所述完全相同[38]使用带有人巨细胞病毒启动子（CMV）启动子的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）转移载体（pRRL-sincppt-CMV-eGFP-WPRE基因组质粒）。人类LTα或IFNγ的互补DNA序列（cDNA）是针对大鼠优化的密码子，包括5′Kozak序列，并由Gene Art合成（英国佩斯利生命科学公司）。如前所述，计算纯化和浓缩载体的生物和物理滴度[38]. 使用Clontech Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒计算LV基因组拷贝数（法国圣戈马因-勒雷塔卡拉）。

立体定向手术和组织加工

从Janvier（法国）获得11只8至10周龄雌性Dark Agouti（DA）大鼠（140至160 g），以3至4只为一组，在12小时的光/暗周期内饲养，可随意提供食物和水。按照先前公布的方法，在蛛网膜下腔中线角尾侧0.9 mm处进行LV载体的立体定向注射[38,68]. 大鼠要么是未经治疗的幼鼠，要么注射一次不完全弗氏佐剂（IFA）。在整个过程中，使用2%异氟烷（英国伯克希尔阿伯特实验室，氧气2 l/min）诱导大鼠并使其保持在全身麻醉下，剃去头皮并用Videne消毒液消毒（英国诺威奇Ecolab）。皮下注射0.9%生理盐水（Sigma）和0.01 mg/kg丁丙诺啡（退伍军人；英国北约克郡阿尔斯通动物健康中心），以提供术后补液和镇痛。将大鼠放置在立体定向架上（爱尔兰都柏林斯托尔廷），并通过头皮切开，观察颅骨角。在大脑前角尾侧0.9毫米处的中线上，在运动皮层水平，在颅骨上钻一个直径为2毫米的孔。注射使用精细校准的玻璃毛细管进行，毛细管连接到10μl Hamilton注射器（Hamilton，Graubunden，Switzerland）的26号针头上。将针插入硬膜下2.4 mm的深度。使用自动注射器（KD Scientific，USA）以0.2μl/min的速率引入4μl LV载体制剂（每个载体2μl），用0.5mM红曲霉蓝示踪剂在TSSM中稀释。共注射病毒1×1012LTα和GFP的基因组拷贝数/μl（GC/μl）和1×1010干扰素γ的GC/μl。将针头留在原位5分钟，使样品从注射区域扩散，然后拔出，缝合切口（Mersilk；Covidien，爱尔兰）。7至10天后拆线，每天对动物进行监测。

研究结束时，大鼠通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（200 mg/ml Euthatal；英国埃塞克斯Merial Animal Health）。在载体注射后90天，通过左心室向大鼠灌注50 ml PBS，然后在PBS中灌注100 ml 4%PFA。在PBS中30%蔗糖溶液中进行低温保护之前（48小时或直到平衡），取下大脑并将其固定在4%PFA中（4小时，室温）。将大脑植入最佳切割温度的复合物中（OCT；Tissue-Tek；Sakura，荷兰），冷冻在干冰上的异戊烷中，并在整个大脑的冠状面上以10μm的深度进行切片。除了最初的4%PFA固定步骤外，大鼠组织切片按照与人体组织相同的方案进行染色。

大鼠原代小胶质细胞和星形胶质细胞培养

根据英国内政部的规定，P0-P2 Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories，USA）被斩首。分离大脑，用无菌高压镊子和解剖剪刀解剖大脑皮层，去除脑膜，以避免任何成纤维细胞污染。将3只幼崽的皮层转移到带有解剖培养基的50 ml无菌聚丙烯锥形管中，该培养基含有Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS 1X，Gibco，ThermoFisher Scientific）。去除上清液，并用含有最低必需培养基（含4 mM谷氨酰胺的MEM，Gibco，ThermoFisher Scientific）、2.5 mg/ml木瓜蛋白酶（14单位/mg，Sigma-Aldrich，Merck）、40 g/ml脱氧核糖核酸（980单位/mg、Sigma-Aldrich，默克）和240 g/ml l-半胱氨酸（Sigma-Audrich，Merck）的消化混合物替换。将50 ml Falcon试管置于37°C的水浴（Fisher Scientific）中1 h；每隔15分钟，轻轻移液分离组织。1小时后，将皮质重新悬浮在30 ml温剥离培养基中，通过70μm尼龙细胞过滤器（美国康宁公司）过滤，去除任何未分离的碎片，并以500 rpm离心5分钟。丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在15 ml培养基中。培养基为添加了5 ml链霉素-青霉素（10000 U/ml，Gibco，ThermoFisher Scientific）、5 ml L-谷氨酰胺（200 mM，Gibco，Thermo Fisher科学）和50 ml热灭活胎牛血清（Sigma，Merck）的Dulbecco改良鹰培养基营养混合物F-12。将分离细胞的混合物置于T75培养瓶中（Nunc EasyFlask 75 cm2细胞培养瓶，Thermo Scientific），之前涂有聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL、Sigma、Merck）2小时，并用无菌水清洗3次。混合胶质细胞培养物在37°C和5%CO的加湿培养箱中保持1周2持续1周，每2天更换一半培养基以替代生长因子。一周后，星形胶质细胞在烧瓶底部形成一个连接的汇合致密单层，而大多数小胶质细胞是漂浮的。通过用力敲击烧瓶，通过机械搅拌从星形胶质细胞床中分离出初级小胶质细胞。随后，将细胞以5×10的细胞密度放置在24孔板（Nucleon Delta Surface，Thermo Scientific）中4细胞/孔。24小时后，小胶质细胞附着在板的底部，并用促炎细胞因子治疗。从烧瓶底部残留的星形胶质细胞融合层制备原始星形胶质细胞培养物。用Accutase溶液（Sigma-Aldrich）分离细胞并在5×105将每个孔的细胞放入PDL涂层的24孔板中。

小脑器官型组织培养

P8/P9 Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories）按照英国内政部的规定被斩首。分离大脑半球并将其置于含有无菌滤纸和冷剥离培养基（DMEM）的有盖培养皿中，补充5 ml链霉素-青霉素（10000 U/ml，Gibco，ThermoFisher Scientific）。用Superglue将半球与一块长方形无菌固体琼脂（4 g琼脂（Sigma）溶于200 ml蒸馏水中）粘在一起，并使用徕卡VT1200s振动仪在400μm厚的矢状面上进行切片。将小脑切片转移到含有冷培养基的60mm培养皿中，直到整个半球被切片。随后，在无菌6孔板（Costar，Corning Incorporated）中，将其涂敷在孔径为0.4μm的无菌生物孔聚四氟乙烯膜（Millicell-CM培养基插入物，Merck）上，每个培养基插入件下方放置1ml营养培养基。营养培养基含有200ml Neurobasal-A-中（Gibco，ThermoFisher Scientific）和100ml Hank’s平衡盐溶液（HBSS 1X，Gibco，ThermoFisher Scientific），补充有5ml链霉素青霉素（10000U/ml，Gibco，ThermoFisher Scientific）、5ml L-谷氨酰胺（200mM，Gibco，ThermoFisher Scientific），4.4 ml D-葡萄糖（200 g/L，Gibco，ThermoFisher Scientific）和2 ml维生素B27 Plus增补剂（50X，Gibco，Thermo Fisher科学）。在37°C、5%CO的培养箱（HeraCell Vios 160i、ThermoFisher）中，每个插入物镀一到两片小脑片2持续9至10天，每隔一天更换一半培养基以更换生长因子。为了检查切片的完整性，使用倒置显微镜（Olympus CKX53）检查宏观结构。他们还用细胞完整性标记碘化丙啶（PI，分子探针）染色。以5μg/ml的浓度添加PI，在培养基中培养60分钟，并用倒置荧光显微镜成像。9至10天后，体外（DIV）健康切片变平至约100μm，并被选择用于进一步实验。

小脑和胶质细胞培养治疗

小脑薄片以50 ng/ml的浓度分别用重组TNF（重组鼠TNF，Biolegend）、LTα（重组人LT-α，Abcam）和IFNγ（重组鼠IFNγ，Biolenged）组合处理3次24小时，或以100 ng/ml浓度间隔处理2次24小时（谷氨酸水平总是在最后一次给药后24小时测量）。用100 ng/ml或200 ng/ml的TNF、IFNγ、LT-α、TNF+IFNγ和LT-α+IFNβ剂量处理小胶质细胞培养物一次或两次（每24小时给药一次，每次给药24小时后测量谷氨酸水平）。在两次100 ng/ml剂量的TNF+IFNγ（在这种情况下，每个孔含有800μl条件培养基和200μl营养培养基）后，也用条件小胶质细胞培养基处理小脑培养物。此外，小脑切片直接用谷氨酸（L-谷氨酸，Sigma-Aldrich，Merck）处理，每24小时两次，浓度分别为75μM和100μM。用100 ng/ml TNF+IFNγ处理的一组切片也在第二剂量下与0.6 mM马来酸MK-801孵育[17]，是一种非竞争性NMDA拮抗剂（ab120028，Abcam）。将细胞因子或谷氨酸添加到原代小胶质细胞或组织中时，完全替换培养基。

用100或200ng/ml重组大鼠TNF（Biolegend）和重组大鼠IFNγ（Biolegend）治疗原发性星形胶质细胞24小时后。对于谷氨酸释放试验，细胞在补充有AGM星形胶质细胞生长培养基Bulletkit的ABM星形胶质胶质细胞基础培养基中培养24小时，而对于谷氨酸摄取试验，添加100μM谷氨酸。收集培养上清液，并按如下所述测量培养基中的谷氨酸浓度。星形胶质细胞的谷氨酸摄取量是通过从最初添加到细胞中的谷氨酸量减去培养基中测得的谷氨酸总量来测量的。

小脑器官型薄片培养的免疫荧光

小脑切片的免疫荧光分析如前所述进行[69]. 在室温下，用冷的4%PFA（在过滤器顶部添加1 ml，在过滤器下面添加1 ml）固定培养物1 h。固定后，用20%甲醇对切片进行后固定，并在0.1 M PBS-0.3%Triton X-100中清洗。为了进一步渗透，将切片与0.1 M PBS-0.3%Triton X-100孵育过夜。渗透后，用20%牛血清白蛋白（BSA、Sigma、Merck）和PBS-0.3%Triton X-100在室温下封住切片至少4小时。将切片从插入物中取出并与初级抗体孵育过夜(表3)在4°C的潮湿室内。一级抗体孵育后，在0.1 M PBS中彻底冲洗切片，每个切片3次10分钟，并在室温下用与适当荧光色素结合的适当二级抗体培养4小时。用0.1 M PBS（3次，每次10 min）和dH冲洗组织2O、 用DAPI（1:2000稀释）进行核复染，并用Vectashide Antifade Mountant安装在载玻片上。用透明指甲油将盖玻片（24×50 mm，VWR，International）固定在载玻片上。

谷氨酸比色法

根据制造商的说明，使用Abcam（编号83389）的谷氨酸比色分析试剂盒对初级小胶质细胞培养物条件培养基中的谷氨酸浓度进行分析。样品在37°C下培养30分钟，并使用SPARK多模读卡器在450 nm下读取吸光度（Tecan，Männedorf，瑞士）。根据标准曲线回归方程推断谷氨酸浓度，并根据背景值校正吸光度。结果以μM表示，并用每个条件下3-4个重复的平均值（SEM）的平均值±标准误差表示。

数据分析

所有数据均在R（R统计计算项目）中进行处理，并使用ggplot2软件包绘制。对于人类组织数据、大鼠组织数据和器官型组织培养，使用非参数Mann–Whitney检验对各组进行比较，并使用非参数Spearman秩相关检验对变量之间的相关性进行比较。对于大鼠组织数据，Kruskal–Wallis检验也用于组间比较。在小胶质细胞培养研究中，使用非参数Friedman秩和检验对各治疗组和时间进行比较，使用Wilcoxon配对比较和Bonferroni校正对各组进行比较(*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页< 0.0001). 计算所有病例中各组的平均值±SEM，绘制方框图（显示中值、25%至75%四分位数、最小值和最大值）、条形图或点图。

图像采集和分析

通过外荧光奥林巴斯BX63扫描显微镜或SP8徕卡共焦显微镜获取死后人类组织和大鼠组织的免疫染色切片图像。由于小脑器官型培养物的厚度大，所以只能用共焦显微镜进行成像。对于后者，采用了4到6个z堆叠，平均厚度为15μm，步长为0.3μm。使用斐济（美国国家卫生研究院图像J）对所有图像进行分析，并在Illustrator（Adobe Systems）中进行准备。对所有病例/样本进行量化，观察者不知道病例识别。人类MS组织中的感兴趣区域（ROI）被定义为距离局灶性脱髓鞘病变至少4mm的NAWM区域。在4×处拍摄MOG免疫荧光图像，获得整个块的整体扫描面积，以选择NAWM区域。在死后的人体组织中，在20×。通过量化HLA-DR+小胶质标记小胶质细胞所占的面积来分析小胶质细胞的激活，方法是将图像阈值设置为每幅采集图像的特定强度，然后除以每幅图像的总面积。在大鼠组织中，在放大60倍的图像中计算IBA1+小胶质细胞和GFAP+星形胶质细胞的数量。

通过测量死后人类组织、大鼠组织和小脑器官型组织切片中轴突偏执蛋白Caspr1免疫荧光染色的长度来分析PNJ的破坏。Caspr1、Pan-Na、Kv（v）1.2和Caspr1-SMI32三重和双免疫荧光图像用63倍油浸物镜拍摄。在人类和大鼠组织中的10个ROI中，只检测到病灶中Caspr1阳性轴突。在小脑器官型切片中，ROI对应于位于Purkinje细胞轴突高密度区域的4-6个z轴。在大鼠切片和小脑器官型组织切片中，在每种制剂中检测到200个聚焦Caspr1染色偏执狂。在尸检人体组织中，分析了10例经病理证实的34个区块中的6800个Caspr1染色偏执狂和10例对照病例中16个区块的3200个Caspr1-染色偏执迷。在大鼠组织中，分析了1000个来自LT-α+IFNγ组、600个来自GFP组和600个来自幼稚组的Caspr1染色偏执狂。在小脑器官型组织切片中，我们分析了6个经50 ng/ml TNF+IFNγ治疗的小脑切片中的1200个Caspr1染色偏执狂，2个经100 ng/ml肿瘤坏死因子+IFNγ处理的小脑片中的800个Caspr1-染色偏执迷狂，4个对照小脑切片的800个Caspr1-染色偏执狂，用小胶质细胞条件培养液处理的5个小脑切片中有1000个Caspr1染色偏执狂，用75μM谷氨酸处理的4个小脑片中有800个Caspr1-染色偏执疯，用100μM谷氨酸钠处理的4个中有400个Caspr1-染色偏执迷狂，用TNF+IFNγ和MK-801治疗的5个小脑切片中的1000个Caspr1染色偏执狂。

用于量化电压门控Kv（v）1.2和Nav（v）通道位错，Caspr1-Kv（v）1.2和Caspr1-Nav（v）用60×油浸物镜对每个人和大鼠样品进行双荧光成像。仅阳性Caspr1-Kv（v）1.2和Caspr1-Pan-Nav（v）研究了10个ROI中的轴突，每个组织块至少有50个轴突。Caspr1，K的RGB线强度剖面v（v）1.2和Pan Nav（v）沿着染色轴突的长度获得，以评估K和Na通道错位。2个信号之间的重叠区域被定义为轴突区域，其中Kv（v）或Nav（v）通道位于鞍旁轴。使用从斐济获得的RGB强度线剖面，Kv（v）1.2或Nav（v）每个轴突的Caspr1相互减去。如果在同一距离点上，两个信号之间的差异小于可变阈值，则确认存在重叠区域。此外，还测量了MS和非神经人类组织、GFP、LTα-IFNγ和幼年大鼠组织中具有重叠区域的轴突的总比例。每个病例和跨组计算所有线轮廓的平均值±SEM（用于计算通道错位的代码可以在S1A文本).

计算建模

建立了由21个节点组成的双缆芯模型，并在NEURON中进行了数值求解[70]使用反向欧拉隐式积分方法[40]. 将平衡电位设置为−80 mV，并在37°C的温度下进行模拟。用于生成此模型的代码可以在S1B文本该模型中使用的几何和生物物理参数总结如下图7B和7C7种不同直径的模拟（d核心=0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、2.7[μm]）），并在节点1的中点注入2 nA电流（持续0.1 ms的方脉冲）之前，允许达到静息电位1 ms。核心直径、纤维直径和髓鞘厚度之间的关系取自猕猴大脑的EM研究[42]. 根据髓鞘周期值0.0156μm计算髓鞘数量[71]. 从大鼠神经纤维（117.52+30.47*d）测得的线性关系中得出节点到节点的长度纤维) [72]. 根据猫腹根（19.6+2.58*d）的直径依赖性标度关系推断帕帕阳极旁长度纤维) [73]. 根据非神经控制组织中Caspr1染色的平均值确定偏执长度，通过从7个直径的节点到节点长度减去2个偏执和并排的帕帕阳极长度得出节间长度。为了简单起见，节点长度（1μm）保持不变。最后，偏执、旁帕帕和节间的肛周空间尺寸是基于以下右旋糖酐示踪剂在小鼠坐骨神经有髓纤维中测量的数据[74]. 测量AP沿轴突的传播长达10 ms（2000点/ms），记录节点4和16 AP的测量值，并测量AP振幅、宽度和传导速度。AP振幅[mV]被描述为超极化后电位和动作电位峰值（V最大值）AP宽度[ms]定义为振幅一半时的时间差，传导速度[m/s]定义为V之间的距离最大值节点4和16处的峰值。我们使用了4种类型的电压门控通道，如下所示：Fast Nav（v）通道，持续Nav（v）通道，慢速持续Kv（v）通道和Fast Kv（v）通道和泄漏通道。我们的模型中使用了以下电压门控信道特性：

最大节点Nav（v）通道密度设置为1000个通道/μm2[75,76]和快速Na的单电导v（v）通道设置为15 pS[77]. 因此，最大电导为1.5 S/cm2.快速Nav（v）通道选通是基于Schwarz及其同事测量人类神经的选通动力学[78]20°C时。以下浇口动力学基于这些实验数据，温度变化按q10=2.2进行调整[39,40,79].

我纳=克纳*米三*h*（V米−E纳)

α米=6.57（伏米+20.4）/（1−exp（−（V米+ 20.4)/10.3) β米=0.304（−（伏米+25.7）/（1−经验（（V米+25）/9.16）αh=0.34（−（V米+114）/（1−exp（（V米+114）/11）βh=12.6/（1+exp（−（V）米+ 31.8)/13.4)

持久性Nav（v）通道电导基于大鼠尺神经的数据[80]. 估计密度为6.5通道/μm2单通道电导为20 pS。因此，此模型中的最大电导设置为0.01 S/cm2该值取自以前的有髓轴突计算研究[39,40]. 所使用的膜选通动力学与以前的计算模型相同[39,40,81].

我小睡=克小睡*对三*（五）米−E纳)

α第页=0.0353（伏米+27）/[1−exp（−（V米+ 27)/10.2]

β第页=0.000883（−（V米+34）/[1−经验（（V米+ 34)/10]

慢速Kv（v）信道的估计密度为110/μm2[82]. 根据人类神经电生理研究，通道的单电导被量化为7至10 pS[76,82,83]. 在这个模型中，慢K的单个电导v（v）通道设置为8 pS。因此，密度为110通道/μm2最大电导为0.088S/cm2门控动力学基于McIntyre及其同事的模型[40].

我Ks（千克）=克Ks（千克）*s*（V米−Ek个)

α秒=0.3/（1+经验（（V米+ 53)/5))

β秒=0.03/（1+经验（（V米+ 90)/ − 1))

快速K的密度v（v）信道估计为12信道/μm2[82]而在大鼠周围神经中测得的通道的单电导为17 pS[82,84]. 因此，我们模型中快速K的最大电导v（v）通道设置为0.02 S/cm2这些值已在以前的计算研究中使用（q10=3）[40,82].

我千英尺=克千英尺*n个4*（五）米−Ek个)

αn个=0.00798（伏米+93.2）/（1−exp（−（V米+ 93.2)/1.1))

βn个=0.092（−（V米+76）/（1−exp（−（V米+ 76)/10.5))

节点的泄漏电导设置为gl=0.007 S/cm2[80]而偏执狂的漏电导为gl=0.0005 S/cm2相邻和节间的电导率为gl=0.005S/cm2[85].

道德许可

本研究中使用的所有人类尸检组织均来自帝国理工学院英国MS学会组织库收集的大脑，经英国国家多中心研究伦理委员会（MREC 02/2/39）伦理批准的潜在捐赠者计划完全知情同意。所有动物实验均根据英国内政部1986年《动物（科学程序）法案》（第7213号许可证）的规定进行，并获得伦敦帝国理工学院中央动物福利和伦理研究委员会（cAWERB）的批准。

支持信息

S1图。MS和非神经控制阻滞的副节段长度。

方框图表示每例NAWM MS和非神经控制组织的偏执长度分布。在年轴上，cbp指数对应于大脑脚阻滞，而pcg指数对应于中央前回阻滞。MS，多发性硬化；NAWM，正常的白质。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.s001

（畅通节能法）

S2图。淋巴结Nav通道在MS NAWM组织中的位置没有被破坏。

（A） Caspr1染色偏执型和节点电压门控Nav通道的双重免疫荧光共聚焦图像，具有跨节点和偏执型隔室免疫荧光信号的RGB强度分布。（B） 从Nav中减去Caspr1信号，当两者之间的差异小于可变强度阈值时，该点被视为重叠区域。对于计算的每个阈值，两组重叠区域的比例非常相似。MS，多发性硬化；NAWM，正常的白质。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.s002

（畅通节能法）

S3图。慢性接触LTα/IFNγ诱导的大鼠脑膜炎模型。

（A） 用MOG染色的大鼠冠状切片的免疫荧光图像。将编码LT-α和IFN-γ基因的慢病毒载体注射到大脑中线的蛛网膜下腔。白色矩形是胼胝体、扣带和外囊10个选定ROI的代表。（B） 使用的动物数量表：5只大鼠注射LTα/IFNγ，3只大鼠注射GFP，3只钉子。（C） IBA1染色并用LT-α和IFN-γ处理的大鼠冠状切片的免疫荧光图像。（D） 肝移植中Caspr1-SMI32免疫荧光α/干扰素γGFP和幼鼠组织。Caspr1染色偏执狂（红色）和SMI32+轴突（绿色）的共焦图像。绿色荧光蛋白；干扰素γ；LTα，淋巴毒素-α；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白；ROI，感兴趣区域。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.s003

（畅通节能法）

S4图。用促炎细胞因子IFNγ、TNF和LTα处理的原代大鼠小胶质细胞培养图像。

（A） 显示实验时间安排的时间表。小胶质细胞分别在24小时内接受1剂细胞因子或2剂细胞因子治疗。在24小时和48小时后，对两种情况下上清液中的谷氨酸进行了分析。（B）来自复制品的平均±SEM谷氨酸水平显示了不同浓度下对照组和细胞因子处理组之间的统计差异：200 ng/ml(n个=3控制，n个=3 TNF，n个=3干扰素γ，n个=3肿瘤坏死因子+干扰素γ），（C）100纳克/毫升(n个=3控制，n个=3 LTα，n个=3干扰素γ，n个=3 LTa+IFNγ），（D）2次急性治疗，100 ng/ml(n个=3控制，n个=3 LTα，n个=3干扰素γ，n个=3 LTα+IFNγ）。对细胞因子组和时间进行非参数Friedman检验，并对比较组进行事后配对Wilcoxon检验(*第页< 0.05, **第页< 0.01). 干扰素γ；LTα，淋巴毒素-α；TNF、肿瘤坏死因子。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.s004

（畅通节能法）

S5图。TNF-IFNγ激活的星形胶质细胞释放和摄取谷氨酸。

（A） 经TNF/IFNγ（100 ng/ml和200 ng/ml）处理的原代星形胶质细胞培养物在24小时后释放谷氨酸。重复品谷氨酸水平的平均值±SEM，显示对照组和细胞因子处理组之间的统计差异。跨细胞因子组进行非参数Mann-Whitney检验。干扰素γ；TNF、肿瘤坏死因子。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.s005

（畅通节能法）

S6图。小脑器官型组织培养。

（A） 活体扁平小脑切片的图像。切片的厚度为400μm，经过8-10次DIV后，健康切片变平至约100μm。（B，C）培养插页上小脑切片的亮视野图像。（D） 小脑切片的共焦图像，Purkinje细胞的Calbindin+抗体和星形胶质细胞的GFAP+抗体染色。（E） 小脑切片的共焦图像，用髓鞘MBP抗体和Purkinje细胞Calbindin抗体染色。（F） 小脑切片经Caspr1抗体染色的共焦图像。（G） SMI32抗体染色小脑切片的共焦图像。（H） 小脑片用促炎细胞因子TNF/IFNγ（3个剂量为50 ng/ml）治疗(n个=3），2剂100 ng/ml(n个=4））、小胶质细胞条件培养基（2份来自小胶质细胞的培养基，用2份急性剂量100 ng/ml TNF/IFNγ处理）和谷氨酸（2份剂量75 mM或100 mM）。干扰素γ；髓鞘碱性蛋白；TNF、肿瘤坏死因子。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.s006

（畅通节能法）

S7图。传导失败所需的被扰乱的偏执狂的比例。

0.6μm直径的轴突内被破坏偏执狂所占比例的差异可能会导致传导故障和速度的不同程度降低。（A） 在核心直径为0.6μm的轴突模型中，当5个连续的节点被破坏（橙色）时，发生了传导故障，并且副交感神经和近交感神经周围的空间宽度分别增加到0.022和0.22μm。（B） 此轴突模型在不同破坏模式下的速度衰减和传导失败（橙色表示破坏节点，紫色表示健康节点，红色表示传导失败）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.s007

（畅通节能法）

S8图。传导失败所需的被扰乱的偏执狂的比例。

0.8μm直径的轴突内被破坏偏执狂比例的差异可能会导致传导故障和速度的不同程度降低。（A） 在直径为0.8μm的轴突模型中，当11个连续的节点被破坏（橙色）时，发生了传导故障，并且副交感和近交感神经周围间隙的宽度分别增加到0.022和0.22μm。（B） 此轴突模型在不同破坏模式下的速度衰减和传导失败（橙色表示破坏节点，紫色表示健康节点，红色表示传导失败）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.s008

（畅通节能法）

S1文本。

（A） 用于量化Caspr1-Kv或Caspr1-Na重叠信号的算法。（B） NEURON中生成的计算模型的代码。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001008.s009

（DOCX）

致谢

我们感谢帝国理工学院神经技术中心对PG博士研究的支持。尸检人体组织样本由帝国理工大学英国MS学会组织库提供。

工具书类

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