摘要
导致人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)阳性受试者突触简化和神经元凋亡的分子机制尚不清楚。HIV蛋白gp120与前神经营养素原脑源性神经营养因子(proBDNF)类似,减少了神经元过程的长度。有趣的是,p75神经营养素受体抑制剂阻断了前BDNF和gp120的作用,表明前BDNF-和gp120具有类似的神经毒性机制。因此,我们测试了gp120影响proBDNF释放的假设。使用大鼠初级神经元,我们观察到gp120促进依赖时间的细胞内和细胞外前BDNF的积累,同时成熟BDNF减少。在HIV阳性受试者的死后大脑中,确认了前BDNF/成熟BDNF的比例存在类似的不平衡。因此,可以设想HIV的神经毒性包括gp120介导的BDNF加工的改变。为了确定gp120产生前BDNF积聚的细胞机制,我们分别检测了细胞内和细胞外酶的水平,这些酶可以蛋白水解分解前BDNF-呋喃和组织纤溶酶原。在暴露于gp120的大鼠神经元中,细胞内furin水平在细胞死亡前下降,而组织纤溶酶原仅在凋亡期间发生变化。我们的数据表明,HIV通过gp120,通过影响弗林水平来减少前BDNF的加工,从而导致抗凋亡和促凋亡神经营养因子之间的平衡改变。我们的研究发现了一种新的机制,可以解释艾滋病病毒如何促进神经元损伤。
介绍
在人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)阳性受试者的大脑感染后期,可以看到不同程度的突触修剪和神经元凋亡(Ellis等人,2007年). 这些异常最终导致被称为HIV-相关神经认知障碍(HIV-associated neurocognitive disorders)的神经认知缺陷,尤其是其更严重的形式,即HIV-相关性痴呆(HAD)。然而,导致这些神经病理学特征的分子机制尚不清楚。
目前正致力于了解HIV如何促进神经元变性以及免疫激活所起的作用(Gartner和Liu,2002年)结合宿主细胞衍生因子的影响(Kaul等人,2001年)和病毒蛋白(Kerr等人,1997年). 然而,轴突和神经突起的萎缩往往先于细胞体的死亡。此外,突触脊髓炎损伤是一种退化形式,发生在其他没有免疫反应的神经退行性疾病中,如阿尔茨海默病(马萨利亚,1995年)或神经营养因子戒断(拉夫等人,2002年). 有趣的是,这两种HIV(Avdoshina等人,2011年)及其包膜蛋白gp120(Nosheny等人,2004年)已经证明可以降低脑源性神经营养因子(BDNF)的水平,BDNF是一种有效的生存前神经营养因子,在突触可塑性中发挥作用,包括调节树突分支和脊椎形态(Horch,2004年;田中等人,2008年)和神经发生(Li等人,2008年). 因此,似乎可以认为HIV可能通过多种机制促进突触-树突状变性,包括相关神经营养因子的减少。这一建议符合BDNF表达减少与神经退行性疾病有关的理论(Zuccato等人,2001年). 发现HIV如何减少BDNF应该有助于临床医生确定新的辅助疗法。
成熟BDNF(mBDNF)被合成为更大的糖基化前体,即前BDNF(Mowla等人,2001年)可以从神经元中释放出来(Yang等人,2009b). 当proBDNF未被裂解时,它介导与mBDNF相反的生物效应,包括神经元凋亡(Teng等人,2005年)和突触前末端回缩(Yang等人,2009a). 这些事件是由与低亲和力p75神经营养素受体(p75NTR)结合的前BDNF与辅受体sortilin共同启动的(Teng等人,2005年). 因此,神经元的存活/死亡取决于是否释放了前BDNF而不是mBDNF。ProBDNF通过纤溶酶或金属蛋白酶蛋白质组化加工为mBDNF(Pang等人,2004年). HIV已被证明能改变中枢神经系统内的金属蛋白酶(Conant等人,1999年); 因此,HIV可能通过改变proBDNF的处理来减少mBDNF,而proBDNF-反过来又可以通过p75NTR介导的机制促进轴突变性。在这项研究中,我们使用啮齿动物神经元培养物以及HIV阳性受试者的死后大脑来表征proBDNF是否参与HIV介导的神经元丢失的主要机制。我们观察到,在暴露于gp120的大鼠神经元和HIV受试者的大脑中,mBDNF水平下降,同时前BDNF增加。我们的研究确定了一种新的机制来解释HIV介导的神经毒性,并提供了实验数据来建议BDNF在HIV受试者神经退行性病变中的新的治疗用途。
材料和方法
试剂。
人类嗜T淋巴细胞病毒IIIB(HTLV-IIIB或HIV-1IIIB类)通过艾滋病研究和参考试剂计划获得(来自NIH NIAID艾滋病司R.Gallo博士)(Popovic等人,1984年;Ratner等人,1985年)并以1.5 ng/ml的p24浓度使用。Gp120IIIB和tat从免疫诊断学中获得,并以5和100 n的浓度使用米分别为。proBDNF从Alomone Labs购买,BDNF是Regeneron Pharmaceuticals赠送的礼物。TAT-Pep5购自EMD4 Biosciences。p75NTR抗体(克隆192-IgG)来自圣克鲁斯生物技术公司。
神经过程。
皮层神经元生长在盖玻片上,固定,并在4°C下用III类β-微管蛋白抗体(1:5000;Covance)染色。然后如前所述,将盖玻片与相应的二级抗体在室温下孵育1小时(Avdoshina等人,2010年). 细胞通过连接在Olympus IX-70立式显微镜上的FV300激光共焦扫描系统成像。通过2D Sholl分析(ImageJ)随机选择25个神经元,计算每个盖玻片的神经元突起长度。
细胞存活。
通过Hoechst 33342/碘化丙啶染色和3(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基四唑溴化铵(MTT)分析测定细胞存活率。这些分析如前所述进行(Bachis等人,2003年).
人体组织。
任何性别的脑组织/切片均来自国家神经艾滋病组织联合会(NNTC)和米兰大学(意大利米兰)的法律医学和保险科。在由1×Tris缓冲盐水(TBS)、1%NP-40、1%Triton X-100、1 m米PMSF、10%甘油和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma)冰块。匀浆在冰上培养5至10分钟,然后在14000×克收集上清液5分钟,并将其储存在−80°C下。总蛋白含量采用布拉德福德-考马斯蓝比色法测定。
ELISA法。
根据制造商的说明,分别使用Promega或R&D的ELISA测定BDNF、神经生长因子(NGF)和呋喃水平。按照前面所述进行分析(Nosheny等人,2004年). BDNF的ELISA与proBDNF具有可忽略的交叉反应性(~2.5%),这是通过与proBDNF平行运行标准曲线来确定的。
蛋白质印迹。
如上所述,通过在裂解缓冲液中均匀化人类样品或大鼠神经元制备裂解液。收集细胞培养基,以10000 rpm离心10 min,并使用Centricon管浓缩。培养基和裂解物样品进行免疫沉淀。使用precipHen(Aves Labs)或蛋白A-Sepharose珠(Sigma)预先分离样品,然后将上清液与抗BDNF Ab(Promega)或抗PA Ab(Millipore)在4°C下培养18小时。以5000 rpm离心5 min收集免疫沉淀物。在裂解缓冲液中清洗小球,并通过SDS-PAGE溶解免疫复合物。将蛋白质转移到PVDF膜上,并用TBS-T(25m米Tris和1%吐温),含5%奶粉。然后用抗原BDNF抗体(稀释度,1:500;Alomone Labs)或抗BDNF的抗体(稀释率,1:1000;Promega)或抗PA抗体(Millipore)孵育斑点过夜。用TBS-T清洗三次后,在室温下用过氧化物酶结合的抗兔二级抗体(稀释度为1:1000;Santa Cruz Biotechnology)培养印迹1小时。通过增强化学发光(Thermo Scientific)检测免疫反应性。
免疫组织化学。
人类皮层切片取自NNTC。去除石蜡后,用0.3%的H培养切片2O(运行)2室温下阻断内源性过氧化物酶,然后用0.25%Triton X-100和3%正常山羊血清在TBS中冲洗和阻断。切片在4°C下与兔抗原BDNF抗体(Alomone Labs)孵育过夜,在TBS中冲洗,并在室温下与生物素化抗兔二级抗体孵育1小时。然后冲洗切片,并在室温下用ABC Elite溶液(1:400;Vector Labs)培养1小时。使用TBS和0.05%3,3′-二氨基联苯胺和0.01%H对反应进行可视化2O(运行)2然后对切片进行冲洗、脱水并盖上盖子。
结果
Gp120增加神经元中的proBDNF
培养的出生后大鼠CGC以活性依赖的方式产生和释放mBDNF(Marini等人,1998年),释放proBDNF(Xu等人,2011年)对HIV和gp120的神经毒性作用敏感(Bachis等人,2009年). 因此,我们首先使用这些神经元来检测gp120是否改变proBDNF的处理。
CGCs暴露于5n米gp120IIIB(gp120)。mBDNF和proBDNF在免疫沉淀后用抗体在培养基中测定,该抗体可识别mBDNF-(~14 kDa)和proBDNF(~34 kDa。与对照组相比,经gp120处理的CGC培养基含有较少的mBDNF,但更多的proBDNF(图1A类,左)。用一种只识别前BDNF的抗体证实了前BDNF-的增加(图1A类,右侧)。时间进程分析表明,gp120在培养基中诱导1小时前的proBDNF的时间依赖性积累,在细胞裂解物中诱导6小时后的proBDNF积累(图1B类). 此外,mBDNF水平通过ELISA测定,该ELISA与proBDNF的交叉反应性可忽略不计(~2.5%)。该试验证实gp120引起mBDNF的暂时性减少(图1C类).
图1。 gp120增加proBDNF。将CGC暴露于gp120指定时间,并分别通过ELISA和Western blot测定培养基和细胞裂解液中mBDNF和proBDNF的水平。A类,用抗BDNF抗体免疫沉淀的CGC培养基的代表性Western blot分析。用BDNF抗体分析印迹,该抗体可识别BDNF物种(左)或仅识别前BDNF(右)。B类,通过密度分析对34kDa波段进行半定量。C类,通过ELISA测定的BDNF水平。以平均值±SEM表示的数据代表三个实验的平均值(n个=每个实验6个)。#第页< 0.05, *第页<0.001 vs对照组(ANOVA和Sheffe检验)。
培养的皮层神经元也释放BDNF(Ghosh等人,1994年)并在HIV或gp120存在时发生凋亡(Bachis等人,2009年). 因此,我们使用这些神经元来证实gp120促进了proBDNF的释放。细胞暴露于gp120的不同时间点,并在培养基中测定proBDNF和mBDNF的水平。对于CGC,gp120在1小时时诱导了proBDNF的增加。这一效应随后在3小时时mBDNF水平下降(图2). 因此,gp120似乎以相反的方式影响不同神经元群中mBDNF和proBDNF的释放。
图2。 gp120改变皮层神经元中mBDNF/proBDNF的释放。皮层神经元,如前所述制备(Avdoshina等人,2010年),在指定的时间内暴露于gp120。培养基中mBDNF和proBDNF的水平分别通过ELISA和Western blot测定,如图1.数据表示为平均值±SEM(n个=每个时间点6)。#第页< 0.05, *第页<0.001 vs对照组(ANOVA和Sheffe检验)。
HIV、gp120和proBDNF减少了神经元突起的长度
proBDNF激活p75NTR诱导细胞凋亡(Teng等人,2005年). CGC和皮层神经元同时表达Trk和p75NTR(Courtney等人,1997年;Yaar等人,1997年). 为了检测这些受体在gp120通过proBDNF的毒性作用中的作用,将皮层神经元暴露在不同时间点的gp120或一种不能被切割成mBDNF突变形式的proBDNF(Koshimizu等人,2009年)在存在或不存在TAT-Pep5的情况下,p75NTR的细胞内抑制剂(山下和东山,2003年). 然后通过测量神经元突起(轴突和树突)的长度以及细胞存活率来确定神经毒性。一种针对神经元特异性细胞骨架蛋白III类β-微管蛋白的抗体用于识别神经元过程。神经元暴露于任一gp120下6小时(图3B类)或proBDNF(图3E类)表现出比对照组更短的神经元过程(图3A类,D类,G公司,H(H)). gp120的作用是由HIV-IIIB复制的,但不是由转录tat的反式激活剂复制的(数据未显示),转录tat是另一种具有神经毒性的病毒蛋白(Eugenin等人,2007年). TAT-Pep5抑制gp120和proBDNF介导的神经元突起缩短(图3C类,F–小时)表明p75NTR激活在gp120神经毒性中起作用。
图3。 gp120诱导的轴突简化依赖于p75NTR。A–F,皮层神经元暴露于煮沸的gp120(A类)或中等(D类),gp120(B类)和前BDNF(50 ng/ml;E类)单独或与TAT-Pep5(100 n米;C类,如果)然后固定细胞并对其进行III类β微管蛋白染色。G公司,H(H),然后按照材料和方法中的描述对神经突突起进行量化。数据是25个神经元的平均值±SEM。#第页< 0.05, *第页<0.01 vs对照组(方差分析和舍夫检验)。比例尺,50μm。
为了确定gp120介导的突触病理学是否最终导致神经元丢失,将皮层神经元暴露于gp120(图4A类,B类)或proBDNF(图4C类,D类)在没有或存在TAT-Pep5的情况下。proBDNF和gp120都在18小时后促进了神经元存活率的显著下降,这是由神经元计数决定的(图4A类,C类)以及MTT分析(图4B类,D类). TAT-Pep5而非Trk酪氨酸激酶抑制剂K252a抑制了proBDNF和gp120的毒性作用(图4)表明proBDNF的毒性作用通过p75NTR发生(Teng等人,2005年). 结果(图4)经p75NTR阻断抗体(p75ab)证实。然而,TAT-Pep5在预防gp120毒性方面不如重组BDNF有效(图4)支持先前的数据,即TrkB激活也可能是限制HAD中神经元丢失的有效治疗工具(Bachis等人,2003年).
图4。 gp120的毒性作用是p75NTR介导的。A–D,皮层神经元暴露于gp120(A类,B类)或proBDNF(50 ng/ml;C类,D类)单独或存在K252a(100 n米),TAT-Pep5(100 n米)或p75ba(10μg/ml)。在A类和B类,在gp120前3 h添加BDNF(50 ng/ml)。18小时后通过细胞计数测定神经元存活率(A类,C类)或MTT(B类,D类)如前所述(Bachis等人,2003年). 数据表示为平均值±SEM。n个= 18.#第页<0.05 vs proBDNF或gp120*第页<0.001 vs对照组(ANOVA和Sheffe检验)。
我们之前表明,CGC对gp120的毒性作用比皮质神经元更敏感(Bachis等人,2009年). 因此,我们使用CGC来检查在皮层神经元中获得的数据的再现性。TAT-Pep5而非K252a可阻止gp120和proBDNF介导的神经元丢失(图5)进一步支持p75NTR在gp120神经毒性中的作用。
图5。 p75NTR依赖性神经元存活减少。A类,B类,CGC暴露于gp120(A类)或proBDNF(50 ng/ml;B类)单独或存在K252a(100 n米),TAT-Pep5(100 n米)或p75ba(10μg/ml)。在A类在gp120之前3小时加入BDNF(50ng/ml)。18小时后测定神经元存活率,如图4数据表示为平均值±SEM。n个= 18.p̂<0.05 vs proBDNF或gp120*第页<0.001 vs对照组(ANOVA和Sheffe检验)。
HIV受试者的mBDNF和proBDNF水平
为了确定HIV是否会改变人类的mBDNF/proBDNF水平,我们测定了死后人类额叶皮层(CX)、海马(HP)和尾核/壳核(ST)中mBDNF和proBDNF的含量。样本来自HIV阴性受试者、HAD受试者和HIV+具有正常神经认知诊断和HIV的受试者+患有一种或多种机会性感染但无痴呆症的受试者(表1). 通过ELISA检测,我们观察到HAD中mBDNF的水平与未患痴呆的HIV患者相比有所降低(图6A类). 我们还测定了同一脑区内另一种神经营养素NGF的水平,以检验这一发现的特异性。HAD与非HAD受试者之间的NGF水平没有显著差异(图6B类).
图6。 HAD患者大脑中BDNF水平降低。A类,B类、BDNF(A类)或NGF(B类)用ELISA法测定人类CX、HP和ST中的水平。样本来自HIV阴性受试者、神经认知诊断正常的HIV阳性受试者(HIV但不是HAD)、HAD的HIV阳受试者以及一种或多种机会性感染(如脑炎[HIV+OI(机会性传染病)])的HIV正受试者。数据是中描述的受试者的平均值±SEM表1*第页< 0.005;#第页<0.01 vs对照组(方差分析和舍夫检验)。C类,D类,分别用抗BDNF抗体或抗前BDNF抗体分析的来自HIV和HAD受试者的皮质裂解物的代表性蛋白质印迹。E类,通过34kDa谱带的密度分析确定的指示区域中的前BDNF的相对水平。数据表示为平均值±SEM(n个= 7). *第页<0.05 vs HIV,但不包括HAD(ANOVA和Sheffe's测试)。
为了确定HAD中proBDNF的水平是否改变,我们用Western blot分析了死后CX的裂解物。在HAD患者中,mBDNF对应的免疫反应性降低(图6C类)支持ELISA获得的数据,而34kDA免疫反应带增加(图6C类)提示proBDNF的积累。这些数据通过使用只识别BDNF前体的抗体得到了证实。事实上,该抗体显示HAD中34kDa物种比HIV阴性个体增加(图6D类). 与没有痴呆的HIV受试者相比,HAD受试者的CX、ST和HP中该条带的强度增加(图6E类).
为了确定哪些细胞表达proBDNF,将无痴呆症的HIV阳性受试者和HAD受试者的CX切片用proBDNF-抗体染色。非HAD患者的ProBDNF免疫反应主要定位于细胞体和突起(图7A类),表明神经元定位。此外,我们观察到HAD受试者中对proBDNF阳性的细胞数量增加(图7B类)与非HAD受试者相比。事实上,在对照组和HAD受试者中,每个切片的proBDNF阳性细胞分别为22±3和32±4 SEM(*第页与对照组相比<0.05;n个= 3). 总之,这些数据表明HIV减少了proBDNF的处理。这一事件可能导致突触脊髓炎损伤(Ellis等人,2007年)和突触功能障碍(McArthur等人,2005年)见于HIV相关的神经认知障碍。
图7。 人类大脑中前BDNF的神经元定位。A类,B类,来自HIV阳性受试者大脑皮层的切片(A类)和HAD(B类)按照材料和方法进行处理。切片与兔抗前BDNF抗体(Alomone Labs)孵育,在TBS中漂洗,并与生物素化的抗兔二级抗体孵育。然后冲洗切片并用ABC Elite溶液孵育。使用TBS和0.05%3,3′-二氨基联苯胺和0.01%H对反应进行可视化2O(运行)2然后对切片进行冲洗、脱水并盖上盖子。比例尺,200μm。请注意,HAD部分中有较多的前BDNF阳性神经元。
Gp120和HIV改变furin水平
ProBDNF被内质网和高尔基体中的呋喃裂解,产生C末端成熟神经营养素(Mowla等人,2001年). 因此,减少呋喃活性/合成可能对HIV/gp120增加proBDNF的能力起着关键作用。为了验证这一假设,我们测定了暴露于gp120的CGCs中弗林的细胞内水平。我们观察到细胞内呋喃水平从15分钟开始呈时间依赖性下降(图8A类). 因此,gp120可能通过降低呋喃水平增加proBDNF。为了支持这一发现,我们首先分析了HAD受试者脑组织中的呋喃含量。HAD大脑的几个区域的糠醛含量下降(图8B类). 另一方面,细胞外原BDNF也被纤溶酶蛋白水解为mBDNF。纤溶酶原是纤溶酶的前体,它被组织纤溶酶酶原激活物(tPA)分解,tPA是一种也从突触前小泡释放的蛋白酶。因此,我们检测了gp120是否改变tPA水平。CGC暴露于gp120的不同时间点。tPA水平仅在gp120后3小时开始下降(图8C类,D类). 因此,tPA的这种时间延迟不能解释gp120介导的1小时内proBDNF的积累。
图8。 HIV和gp120降低了呋喃水平。A类用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定暴露于gp120指定时间的皮层神经元的细胞内和细胞外呋喃水平。数据是六个样品的平均值±SEM(*第页与对照组、ANOVA和Sheffe检验相比<0.001)。B类,通过ELISA在所指示的人脑区域中测量Furin水平。数据是五个样品的平均值±SEM。#第页< 0.05; *第页<0.001 vs HIV阴性(ANOVA和Sheffe检验)。C类,神经元培养基暴露于gp120指定时间的Western blot分析示例。D类,通过63kDa波段的密度分析测定的介质中tPA的相对水平。以平均值±SEM表示的数据代表三个实验的平均值(n个=每个实验中4)*第页< 0.05, **第页<0.001 vs对照组(ANOVA和Sheffe检验)。
讨论
HIV阳性受试者认知障碍的严重程度与突触树突变性相关(Ellis等人,2007年). 本研究旨在深入了解HIV促进突触简化的新分子机制。这里我们显示,与对照组相比,暴露于gp120的神经元表现出较低的mBDNF浓度和较高的proBDNF水平。最重要的是,这些数据在人类受试者身上重现。事实上,HAD受试者中的proBDNF水平高于HIV阴性受试者和HIV阳性无痴呆症受试者。mBDNF在轴突分支中起关键作用,而proBDNF减少突触可塑性(有关综述,请参阅Greenberg等人,2009年). 因此,HIV受试者mBDNF/proBDNF比率的改变可能会损害突触连接和神经元存活。总的来说,我们的数据表明,艾滋病毒的神经毒性效应可能包括神经营养因子环境的减少。了解HIV如何抑制mBDNF的可用性对于新疗法的开发至关重要。
HIV的大多数神经毒性特性都归因于病毒和病毒蛋白的联合作用和/或宿主免疫反应(Kaul等人,2001年). 在这项研究中,我们发现患有HAD的HIV感染者的BDNF水平低于CX、ST和HP中非增强型HIV阳性者。BDNF在大脑皮层中生成,并传递到纹状体神经元,在那里它对神经元的生存和皮质纹状体突触的活动尤为重要(Zuccato和Cattaneo,2007年). 相反,BDNF的丢失被认为是基底神经节慢性疾病(如帕金森氏病)的危险因素(Nagatsu等人,2000年)和亨廷顿氏病(Zuccato等人,2001年). BDNF在HP中也很丰富,在维持树突状形态和突触功能方面很重要(Horch和Katz,2002年)以及神经元及其连接的存活(Xu等人,2000年). 事实上,证据表明BDNF的减少与海马神经元存活和记忆的减少之间有着密切的相关性(埃里克森等人,2010年). HAD受试者的这些脑区缺乏BDNF的病理特征也已被描述。事实上,HAD患者的皮层神经元以轴突损伤为特征(Ellis等人,2007年)以及细胞凋亡(Garden等人,2002年). HIV阳性女性也出现海马功能障碍(Maki等人,2009年). 此外,HIV促进基底神经节的病理变化。异常包括壳核中的神经元缺失(Everall等人,1995年)和苍白球(Fox等人,1997年),黑质纹状体多巴胺神经元缺失(Reyes等人,1991年;Itoh等人,2000年)和多巴胺能运输障碍(Wang等人,2004年). 这些相关性使我们推测,HIV诱发的BDNF减少有助于HAD中突触简化和神经元损伤的发展。
这里报道的一个重要发现是HIV及其可溶性包膜蛋白gp120对proBDNF的影响。在啮齿动物神经元的培养基中检测到ProBDNF,这与成熟神经元能够产生和释放ProBDNF的概念一致(Peng等人,2005年;Yang等人,2009b). 分泌型前BDNF对神经元可塑性的影响与mBDNF相反(Pang等人,2004年;Woo等人,2005年). 事实上,BDNF通过高亲和力受体TrkB促进神经元存活和突触棘的维持(Dorsey等人,2006年)而通过sortilin,proBDNF与p75NTR结合并诱导凋亡(Teng等人,2005年). 我们已经观察到,proBDNF降低了皮层神经元和CGC的存活率。此外,proBDNF减少了这些神经元培养物中神经元过程的长度。通过TAT-Pep5或p75ab阻断p75NTR活性,可以抑制proBDNF的这些毒性特性。相反,K252a,Trk信号的抑制剂(Berg等人,1992年;Ohmichi等人,1992年)未能逆转proBDNF毒性。相反,BDNF阻止了gp120的活性,证实了先前的结果(Bachis等人,2003年). 因此,我们的数据支持这样的观点,即mBDNF和proBDNF通过激活两种不同的受体Trk和p75NTR而产生相反的作用。最重要的是,gp120(或HIV)引发了类似的神经毒性特征。事实上,TAT-Pep5而不是K252a显著降低了gp120促进神经元损伤的能力。有趣的是,尽管TAT Pep 5抑制了gp120减少神经元过程长度的能力,但这种p75NTR拮抗剂不能完全逆转gp120介导的细胞死亡。这可能是由于一些机制造成的。例如,两项研究表明,DR6受体与p75NTR一样是肿瘤坏死因子受体家族的成员,可导致轴突变性(Nikolaev等人,2009年;Park等人,2010年). 因此,封锁p75NTR可能不足以完全防止gp120,因为它不会阻止DR6激活。此外,BDNF的丢失与促炎细胞因子的增加相结合(Medders等人,2010年)可能会加剧gp120的神经毒性。因此,我们不能排除gp120通过多种机制促进细胞死亡。总的来说,我们的数据支持这样一种假设,即艾滋病毒很可能通过gp120传播(Bachis等人,2009年)导致proBDNF与mBDNF的比率发生变化,最终导致proBDNF的释放增加。这种改变的比率促进了有利于p75NTR活化的环境。这可能是HAD中突触简化和神经元凋亡发展的风险因素。
ProBDNF可以通过furin等内蛋白酶在反式高尔基体中或通过前蛋白转化酶在未成熟分泌颗粒中在细胞内转化为mBDNF(Mowla等人,2001年). 然而,proBDNF也可以通过包括tPA在内的蛋白酶在细胞外裂解为mBDNF。tPA释放减少已被证明可通过p75NTR增强proBDNF信号传导,导致脊髓和突触丢失,继而导致神经元丢失(Head等人,2009年). 因此,我们检测了tPA和furin的水平,以揭示HIV对proBDNF加工影响的分子机制。我们的数据显示gp120减少tPA的释放。然而,这种减少在时间上与gp120介导的前BDNF增加无关,后者发生在神经元暴露于包膜蛋白后15分钟。与tPA相反,furin水平在gp120后15分钟即降低,表明furin是gp120介导的促BDNF前体的关键酶。gp120如何降低呋喃水平仍在调查中。Furin mRNA水平在3小时内没有变化(数据未显示),表明gp120可能不会影响Furin转录。另一方面,呋喃已被证明定位于早期内胚体中,以再循环至细胞表面或转运至转高尔基体网络(Molloy等人,1998年). Gp120在几分钟内被轴突内化并在内体中运输(Bachis等人,2006年). 因此,gp120可能改变呋喃的贩运,并可能通过泛素化促进呋喃降解。这可能与gp120对呋喃的快速(15分钟)作用以及随后未处理(1小时内)proBDNF水平的增加相一致。因此,调节呋喃活性/合成可能在决定哪些神经元死亡方面起着核心作用,即使它们没有被有效感染。然而,这一假设必须得到证实。
总之,我们的数据表明,病毒释放的gp120可以通过降低furin水平来抑制proBDNF向成熟BDNF的适当加工。反过来,前BDNF可引发神经元损伤,与其他神经毒素(如谷氨酸或TNFα)结合,可导致细胞凋亡和神经元丢失。我们的数据为抗HIV介导的神经元毒性的新药物提供了支持,这些药物能够增加mBDNF,并促进proBDNF的加工或抑制proBDNF-的活性。