人腭扁桃体：一种潜在的多潜能间充质祖细胞组织来源

摘要

介绍

间充质祖细胞（MPCs）是成人组织中的多潜能祖细胞，例如骨髓（BM）。BM衍生的MPCs临床应用的当前挑战包括供体部位的发病率和疼痛，以及与年龄相关的细胞数量和分化潜力下降相关的低细胞产量，这突出了确定MPCs替代来源的必要性。最近，MPC来源多样化；例如脂肪、胎盘、脐带、小梁骨、软骨和滑膜组织。在本研究中，我们报告了MPC在人类扁桃体组织中的存在。

方法

我们对BM-MPC与从这种淋巴组织中分离出的粘附细胞亚群（称为扁桃体衍生MPC（T-MPC））进行了比较和定量分析。通过荧光活化细胞分选分析来评估表面标记物的表达。通过组织化学和逆转录聚合酶链反应分析T-MPC的分化潜能，以表达谱系相关标记基因。测定MPC的免疫抑制特性在体外混合淋巴细胞反应。

结果

表面表位分析显示，T-MPCs的CD14、CD31、CD34和CD45表达为阴性，而CD29、CD44、CD90和CD105表达为阳性，这是BM-MPCs的一个特征表型。与BM-MPC类似，T-MPC可以被诱导进行成脂分化，并且在较小程度上可以进行成骨和软骨分化。T-MPC不表达II类主要组织相容性（MHC）抗原，与BM-MPC相比，T-MPC具有免疫抑制作用，通过吲哚胺2,3-双加氧酶依赖机制抑制异基因T细胞或非特异性有丝分裂刺激刺激刺激的T细胞增殖。

结论

人腭T-MPCs是一种新的祖细胞来源，可能适用于细胞治疗。

介绍

间充质祖细胞（MPCs）最初发现于骨髓基质中，支持造血，并能沿多个间充质谱系分化，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞[1–三]. 由于其分化能力，MPC已成为组织工程、细胞和基因治疗中一种很有前景的治疗应用工具。动物研究表明，MPC植入可以修复股骨节段性缺损大鼠模型的严重骨折[4]并且，在全身注射后，MPC定位于实验诱导骨折的部位[5]. 初步临床研究证明了异基因骨髓移植治疗成骨不全的可行性。骨髓来源的多能干细胞（BM-MPC）移植并产生供体来源的成骨细胞，可改善与疾病相关的临床症状并增加总体重[6]. 除了它们的多系潜能外，MPC还表现出免疫调节特性，这促使人们考虑将其用于骨髓移植。事实上，最近的一项研究报告称，一名患者在异基因造血干细胞移植后成功使用MPC治疗严重的IV级急性移植物抗宿主病[7]. 虽然确切的免疫抑制机制尚不清楚，但MPC抑制异基因淋巴细胞、树突状细胞和植物血凝素（PHA）刺激的T细胞增殖的能力已被充分证明[8]. 涉及细胞接触的机制。[9]以及可溶性因子[10,11]已经提出，特别是干扰素γ（IFN-γ）通过诱导吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）参与其中，IDO是一种参与色氨酸分解代谢的酶，色氨酸是蛋白质合成和T细胞增殖所需的一种必需氨基酸[12,13].

目前，BM被认为是成人MPC最容易获得的来源。然而，BM-MPC衍生具有并发症，包括疼痛、供体部位发病率和收获时细胞产量低。此外，BM-MPC的数量及其增殖率和分化潜能已被证明随着供体年龄的增加而减少。[14]. 鉴于MPCs的分化和扩张能力随着生理衰老而下降，确定年轻供体容易获得的MPCs潜在来源是目前细胞治疗的主要兴趣所在。[15]. 因此，寻找MPC的替代来源具有重要价值。迄今为止，已经从许多成人组织中分离出MPC，包括小梁骨[16]，脂肪[17,18]，滑膜。[19,20]，皮肤[21]，胸腺[22]牙周膜。[23]以及产前和围产期组织，如脐带血。[24]，脐带[25]和胎盘。[26].

这项研究探索了从人类腭扁桃体中识别和分离MPC的可能性。扁桃体上皮起源于第二咽囊（内胚层起源），在胎儿发育过程中受到淋巴组织（中胚层起源的）的侵袭。因此，从胚胎学角度来看，扁桃体可能是MPC的来源。由于扁桃体切除术的盛行，扁桃体很容易获得，尤其是年轻捐赠者，如有必要，在局部麻醉下可以很容易地进行扁桃体活检，而不会出现重大并发症。我们的结果表明，MPCs存在于腭扁桃体的基质中，可以在培养中分离和扩增。这些扁桃体衍生MPCs（T-MPCs）具有多潜能分化特性，与混合淋巴细胞反应（MLR）中的BM-MPC具有相似的免疫抑制特性。免疫抑制活性显著且呈剂量依赖性，尽管其水平低于BM-MPC。免疫抑制活性的差异与细胞表面IFN-γ受体（IFN-γR）水平以及IFN-γ与BM-MPC刺激IDO活性的差异性有关。

材料和方法

T-MPC和BM-MPC分离培养

在机构审查委员会的批准下（美国华盛顿特区乔治华盛顿大学），由于急性扁桃体炎复发而接受扁桃体切除术的患者（4至15岁）在知情同意后获得扁桃体。将组织切碎并在含有210 U/mL I型胶原酶（Invitrogen Corporation）和90 KU/mL DNase（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）的RPMI培养基（Gibco-BRL，现为Invitrogen Corporation的一部分，加利福尼亚州卡尔斯巴德）中37°C下消化30分钟。通过金属丝网过滤后，将细胞在20%正常人血清（NHS）-RPMI中清洗两次，并用10%NHS-RPMI清洗一次。通过Ficoll-Paque（Amersham，现为英国白金汉郡Little Chalfont GE Healthcare的一部分）对消化扁桃体组织进行密度梯度离心，获得单核细胞。24至48小时后，将细胞置于T-150 cm²组织培养瓶（Corning Incorporated，Corning，NY，USA）和非粘附细胞用膨胀培养基冲洗掉，膨胀培养基由Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（Invitrogen Corporation）和选定批次（HyClone，Logan，UT，USA，）的10%胎牛血清（FBS）和抗生素（50μg/mL链霉素和50 IU/mL青霉素；Invitrogen公司）。

对于BM-MPC，BM是在接受下肢重建手术的患者（39至58岁）的知情同意后获得的，并获得了机构审查委员会的批准（美国华盛顿大学、西雅图、华盛顿大学和乔治华盛顿大学），然后按照前面所述直接电镀处理。[27]. BM吸液在T-150 cm中放置过夜²在与T-MPCs相同的培养基中培养烧瓶，获得了类似的贴壁细胞。T-MPC和BM-MPC均在37°C和5%CO的基础培养基中培养扩增₂使用T-150三重烧瓶（Nunc，Roskilde，Denmark），每周进行两次中等更换。

细胞增殖、限制稀释试验和集落形成单位成纤维细胞试验

为了估计细胞增殖，在1×10⁴根据制造商（美国威斯康星州麦迪逊市Promega Corporation）的协议，在第3、4、7、10、12和14天使用MTS（甲硫代磺酸盐）分析基础培养基中12孔板中每平方厘米的细胞。将T-MPCs系列稀释液（1×10）镀入六孔板⁷, 1 × 10⁶, 1 × 10⁵、和1×10⁴每孔细胞，一式三份）在膨胀培养基中培养2周，用10%福尔马林固定，用Giemsa（Sigma-Aldrich）染色，并根据Castro-Malaspina及其同事描述的方法鉴定和计数成纤维细胞样细胞集落。[28]. 集落形成单位成纤维细胞（CFU-F）潜能，即产生一个集落所需的平均细胞数，通过将等分的T-MPCs（每平方厘米1000个细胞）在膨胀培养基中放置14天来测定，并按照前面所述进行分析[29].

细胞表面表位分析

对于免疫荧光，未分化细胞在磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Invitrogen Corporation）中清洗两次，用4%多聚甲醛在PBS（FD NeuroTechnologies，Inc.，Ellicott City，MD，USA）中固定15分钟，然后在含有300 mM蔗糖、3 mM MgCl的PBS溶液中渗透₂和0.5%（vol/vol）Triton X-100（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad Laboratories公司）在4°C下保持5分钟。使用特定的小鼠单克隆抗体（均从美国加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences获得）在0.5 ng/μL的浓度下对细胞进行细胞表面标记（阴性标记：CD14、CD34和CD45；阳性标记：CD29、CD44和CD105）染色2小时。用Alexa Fluor 488结合山羊抗鼠免疫球蛋白（1:400稀释）（Molecular Probes Inc.，现为Invitrogen Corporation的一部分）进行二次免疫染色1小时。用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Invitrogen Corporation）在12μg/30 mL PBS下进行5分钟的核复染。用Fluoromount-g（Southern Biotech，Bermingham，AL，USA）安装免疫染色培养物，并使用共焦激光扫描显微镜（Zeiss LSM 510；Carl Zeiss，Jena，Germany）进行观察。对于流式细胞术，T-MPCs（>1×10⁵细胞）被洗涤并重新悬浮在PBS+0.1%FBS（PF）中，其中含有以下结合小鼠IgG的饱和浓度（1:100稀释）_1,κ抗人单克隆抗体（BD Biosciences）：HLA-A、B、C-藻红蛋白（PE）（MHC I）、HLA-DR、DP、DQ-异硫氰酸荧光素（FITC）（MHC-II）、CD45-FITC、CD14-PE、CD31-PE、CDM4-PE、CD73-PE、CD90-FITC和CD105-PE以及IFN-γR1-PE（R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA），在4°C下保持1小时。将细胞悬液清洗两次，然后重新悬浮在PF中，以便使用CellQuest ProTM软件（BD Biosciences）在流式细胞仪（FACSCalibur；BD Biosciences。

体外区别

如前所述，诱导T-MPC和BM-MPC进行成脂、成骨和成软骨分化。[27]. 为了进行脂肪分化，将细胞以每平方厘米20000个细胞的密度接种到六孔组织培养板中，并用脂肪培养基处理3周，脂肪培养基由含有10%FBS的DMEM组成，并添加0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、1μg/mL胰岛素和1μM地塞米松（均来自Sigma-Aldrich）为了进行成骨分化，将细胞以每平方厘米20000个细胞的密度接种到六孔板（Corning Incorporated）中，并用成骨培养基处理3周，该成骨培养液由含有10%FBS的DMEM组成，并添加10 mMβ-甘油磷酸、10 nM地塞米松、50μg/mL抗坏血酸-2-磷酸、，和10 nM 1,25二羟维生素D_三（Biomol International L.P.，普利茅斯会议，宾夕法尼亚州，美国）。为了诱导软骨生成分化，将96微孔聚丙烯板（Nunc）每孔接种300000个细胞，并通过1100 rpm离心6分钟形成细胞颗粒。用软骨生成培养基处理颗粒培养物3周，该培养基由添加100 nM地塞米松、50μg/mL抗坏血酸-2-磷酸、100μg/mL丙酮酸钠、40μg/mL的高糖DMEM组成L（左）-脯氨酸、10 ng/mL重组人转化生长因子-β3（R&D Systems，Inc.）和50 mg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）-预混料（BD Biosciences）。

组织学和组织化学

油红O染色

MPC的三周产脂培养物用PBS冲洗两次，固定在4%的缓冲多聚甲醛中，在室温下用油红O（Sigma-Aldrich）染色5分钟，并用Harris-苏木精溶液（Sigma-Aldrich）复染以观察脂滴。

茜素红S染色

在成骨培养基中培养3周的MPC用60%异丙醇固定，并用2%（wt/vol）茜素红S（Rowley Biochemical Inc.，Danvers，MA，USA）在pH 4.2下染色3分钟，以检测矿化。

阿利新蓝染色

软骨细胞颗粒固定在4%的缓冲多聚甲醛中，用PBS冲洗，连续脱水，石蜡包埋，并在10μm厚处切片，用Alcian蓝（pH 1.0）对硫酸化蛋白聚糖进行组织学染色。

总RNA分离和实时逆转录聚合酶链反应

使用Trizol试剂（Invitrogen公司）从第21天单层和颗粒培养物中提取的总细胞RNA样品使用随机六聚体进行反向转录。使用10 ng cDNA和SYBR Green混合物（Bio-Read Laboratories，Inc.）进行实时聚合酶链反应。基于GenBank cDNA序列设计基因特异性引物（正向/反向），如表所示1脂肪生成基因：脂蛋白脂肪酶(低密度脂蛋白)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)，（b）成骨基因：碱性磷酸酶(碱性磷酸酶)和骨钙素(OC公司)和（c）软骨生成基因：II型胶原α1(COL2（二氧化碳）)和aggrecan(AGN公司). 通过与看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶的转录水平进行比较，使特定转录水平标准化(GAPDH公司). 用公式2表示表达水平为GAPDH的倍数增加^（ΔCt）式中，ΔCt=靶基因的Ct–GAPDH的Ct。

表1用于差异特异性基因表达分析的逆转录聚合酶链反应引物

初级混合淋巴细胞反应

将健康献血者的外周血收集到肝素化容器（BD Biosciences）中，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMC）。如前所述，在10 mL RPMI 1640培养基（Invitrogen Corporation）中分离小鼠脾细胞。[30]. 在含有10%FBS、2 mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素、0.1 mM非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、20 mM HEPES、，和50μM 2-巯基乙醇（Invitrogen公司）。脾细胞以1×10的比例分三次接种⁵细胞/100μL/孔，96周圆底板（BD Biosciences）。PHA以5μg/mL作为阳性对照丝裂原，诱导T细胞增殖。MPC（5×10⁴除非另有说明），以获得最终300μL的体积。孵育3天后，1μCi/孔[^三H] -将胸苷（GE Healthcare）加入过夜，并通过液体闪烁计数测定放射性掺入。所有实验均一式三份，并至少重复两次。

吲哚胺2,3-双加氧酶活性测定

在补充有L（左）-色氨酸（100μg/mL）。在一些实验中，向培养物中添加了一种中和抗体（抗IFN-γR1，1.5μg/mL；R&D Systems，Inc.）。如前所述，基于色氨酸到犬尿氨酸的转化，分光光度法测定培养上清液中的IDO酶活性。[20].

干扰素-γ测定

根据制造商的方案，使用商用酶联免疫吸附测定试剂盒（R&D Systems，Inc.）对培养上清液中的IFN-γ进行定量。

统计

使用Student对增殖、实时逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和IDO活性测定的数据进行统计分析t吨测试，统计显著性设置为P（P）值小于0.05。

结果

细胞活力、增殖和克隆形成

每个扁桃体的细胞产量为1至5×10⁹大多数为非粘连性，可能为造血起源。经过多次缓冲液洗涤和随后的培养基更换，发现约0.1%至1%的分离细胞粘附。初次电镀后约5至10天，加工扁桃体标本中的细胞集落开始出现。通常观察到三种不同的细胞形态：（a）成纤维细胞样纺锤状形态，（b）圆形形态和大细胞核（单核细胞污染），以及（c）非常小的多角形上皮细胞（图1a个). 在每一代胰酶消化后，圆形细胞群仍然附着在烧瓶上，第2代不再检测到，随后由骨髓单核细胞标记CD14的阴性表达证实。早在第1代，培养物中的小上皮样细胞就迅速消失。在随后的传代中，T-MPC呈均质成纤维细胞样，胞质突起延长。形态学上，这些细胞与传代数相似的BM-MPC无法区分（图1a个). 总的来说，T-MPC比BM-MPC小一些，细胞产量为7到10×10⁶与4至8×10相比，每80%汇合Nunc三烧瓶的细胞数⁶BM-MPC。T-MPC和BM-MPC的增殖曲线明显不同（图1亿). 在整个检测期间，与BM-MPC相比，以相同的初始细胞数电镀的T-MPC增殖速度更快。T-MPC和BM-MPC的群体倍增时间分别为37.1±3.4小时和58.2±2.3小时。到第14天，T-MPC和BM-MPC分别经历了2.70±0.13和1.69±0.06人口倍增。在CFU-F试验条件下的极限稀释平板上，T-MPC的初始分离物在菌落数和细胞数之间显示出线性关系，表明一个T-MPC对CFU-F有限制。扁桃体消化液中的CFU-F频率被确定为约为6000个平板细胞中的1个。

图1

扁桃体衍生间充质祖细胞（T-MPCs）的特征。（a）T-MPCs最初传代时的形态。在相控显微镜下可以看到两种不同类型的细胞形态：成纤维细胞样纺锤状形态和大核圆形形态（单核细胞污染）。显示培养的第2代骨髓源性间充质祖细胞（BM-MPC）和T-MPC的形态学。在第7天和第14天观察培养物。T-MPC公司（A、B）; BM-MPC公司（C、D）两种细胞类型显示出相似的成纤维细胞形态。棒材=20μm。（b）通过MTS（甲硫代磺酸盐）分析T-MPC和BM-MPC的增殖动力学。以相同的初始密度（1×10⁵每个板的电池）。观察到T-MPCs和BM-MPCs的增殖速率存在差异，在整个分析期间，T-MPCs+BM-MPCs+T-MPC+BM-MPC的增殖速率更快。数值为平均值±标准偏差（n=9）。

免疫荧光和流式细胞术分析

T-MPCs和BM MPCs表达相似的表面表位谱（即相同细胞标记物的阳性/阴性）。根据免疫荧光染色，T-MPC和BM-MPC的CD29、CD44和CD105均为阳性，而CD14、CD34和CD45均为阴性（图2a个). 与BM-MPC类似，在基础培养条件下，T-MPC对MHC I类分子呈阳性，对MHC II类分子呈阴性（数据未显示）。T-MPC的流式细胞术分析证实，T-MPC是非造血细胞，因为它们缺乏CD45，不太可能来源于内皮细胞（CD31阴性；数据未显示）。重要的是，T-MPC表现出与BM-MPC相似的细胞表面表位表型，特别表达CD105、CD73和CD90（图2亿和2厘米). 这些标记的荧光强度在两个细胞群之间没有统计学差异，这表明除CD90外，这两个细胞群体中的表达水平相似(P（P）=0.022），在T-MPC中较高。

图2

扁桃体衍生间充质祖细胞（T-MPCs）的表面表位谱。（a）T-MPC和骨髓源性间充质祖细胞（BM-MPC）细胞表面表位谱的免疫荧光分析。T-MPC显示在顶部两行面板中，BM-MPC显示在底部两行面板上。使用荧光标记的二级抗体（红色）检测表位。细胞核用DAPI（蓝色）染色。两种细胞群的CD14、CD34和CD45均为阴性，CD29、CD44和CD105均为阳性。棒材=20μm。（b）T-MPC和BM-MPC的流式细胞术分析。用荧光偶联抗体检测CD14、CD34、CD45、CD105、CD73和CD90。每个表位的表达水平表示为平均荧光强度±标准偏差（n=3）。（c）代表性流式细胞术直方图。控件表示由于同型控件而产生的荧光。DAPI，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐。

多系分化潜能

脂肪生成

第2-5代T-MPC接受成脂补充剂治疗，对照组包括同一代的T-MPC和BM-MPC在扩张培养基中维持和培养，BM-MPC培养在成脂培养基中。如油红O染色所示，BM-MPC和T-MPC的形态学变化以及细胞质脂滴的形成早在脂肪诱导1周时就明显可见（图3a年). mRNA表达低密度脂蛋白和PPARγ通过定量RT-PCR检测（表1)诱导21天后，并在T-MPCs和BMMPCs中显示出相似的两种标志物表达水平（图3亿). 有趣的是，T-MPC高代（P4和P5）中脂肪生成标记物的表达显著强于低代（P2和P3）（数据未显示）。

图3

扁桃体衍生间充质祖细胞（T-MPC）成脂、成骨和成软骨分化的组织学和实时逆转录聚合酶链反应分析。（a）组织学。诱导骨髓源性间充质祖细胞（BM-MPC）培养如上图所示；诱导的T-MPC培养物显示在底部面板中。在脂肪生成中，脂滴的形成通过油红O染色（条数=40μm）来观察；在成骨过程中，茜素红染色显示基质矿化（bars=40μm）；在软骨形成过程中，通过Alcian蓝染色（bars=300μm）检测富含硫酸化糖胺聚糖基质的积累。（b）T-MPC与BM-MPC的成脂、成骨和成软骨分化的基因表达分析。脂肪生成基因是脂蛋白脂肪酶(LPL公司)和增殖激活受体γ(PPARγ)，成骨基因是骨钙素(OC公司)和碱性磷酸酶(碱性磷酸酶)，软骨生成基因是聚集蛋白聚糖(AGN公司)和II型胶原α1(COL2（二氧化碳）). 在培养开始（d0）和3周（d21）时进行基因表达分析。表达水平根据3-磷酸甘油醛脱氢酶标准化(GAPDH公司)表达，结果以标记基因与GAPDH公司使用公式2^ΔCT(× 100). 数值为平均值±标准偏差（n=2）*P（P）与BM-MPC相比<0.05。

成骨作用

在成骨诱导后，T-MPC和BM-MPC的形态都从纺锤形变为扁平和扩散。定量RT-PCR分析显示OC公司和碱性磷酸酶T-MPC mRNA与BM-MPC的比较（图3亿). 根据ALP（未显示）和茜素红S（图3a年).

软骨发生

在无血清成软骨培养基中维持的高密度颗粒培养物中评估BM-MPC和T-MPC的成软骨潜能。培养3周后，通过阿尔西安蓝染色可检测软骨形成培养物中基质硫酸化蛋白聚糖的积累（图3a年). 定量RT-PCR分析显示AGN公司和COL2（二氧化碳）在T-MPC和BM-MPC中表达，尽管COL2（二氧化碳）与BM-MPC相比，T-MPCs颗粒的表达显著降低（图第3页).

抑制同种异体反应性T细胞的增殖

MLR用于测试T-MPC和BM-MPC的免疫抑制特性。最初，使用健康供体的人PBMC作为反应细胞，PHA作为有丝分裂原，添加BM-MPC和T-MPC都抑制了PHA诱导的PBMC增殖反应（图4a类). 在MLR中，BM-MPC和T-MPC也可以抑制异基因PBMC诱导的应答者PBMC的增殖（图4a类). 同时，反映T细胞增殖的IFNγ水平显示，在存在从两种组织中分离的MPCs的情况下，MLR成比例降低，但在T-MPCs的情况下，MLR显著降低，支持这些细胞的抑制活性较低（图4b个). T-MPC对增殖的抑制呈剂量依赖性，在T-MPC与应答细胞的比例为1:5时部分逆转，表明存在一种有效的效应机制（图4c类). 事实上，与BM-MPC类似，T-MPC抑制T细胞增殖对PHA刺激和MLR具有剂量依赖性。然而，T-MPC的免疫调节活性显著低于BM-MPC。人类BM-MPC和T-MPC的免疫抑制活性也跨越了物种屏障。当CD-1小鼠脾细胞被异基因A/J脾细胞刺激时，当添加异种人BM-MPC和T-MPC时，增殖反应受到剂量依赖性抑制（图第4天).

图4

扁桃体衍生间充质祖细胞（T-MPCs）以剂量依赖的方式抑制异基因和植物血凝素（PHA）诱导的增殖反应，而与T细胞的种类无关。反应性外周血单个核细胞（PBMC）（10⁵细胞）与5μg/mL PHA或异基因刺激PBMC（1×10）孵育3天⁵细胞）带有或不带有骨髓源性间充质祖细胞（BM-MPC）或T-MPC（5×10⁴或可变比率）。（a）细胞增殖基于[^三H] -胸腺嘧啶掺入。BM-MPC和T-MPC抑制T细胞受体依赖性（PHA）和依赖性（异基因）T细胞增殖反应。PHA诱导的T细胞增殖的增殖反应（每培养分钟计数）的值为100%。所有值均为三倍的平均值±标准偏差（SD）。（b）通过酶联免疫吸附试验测定干扰素-γ（IFN-γ）水平。使用5μg/mL PHA刺激的PBMC进行为期3天的增殖试验，获得上清液中的IFN-γ水平，以指示的比例加入或不加入BM-MPC和T-MPC。数值为平均值±SD（n=3）和*，P（P）与BM-MPC相比<0.05。（c）T-MPCs对PHA诱导的T细胞增殖的剂量依赖性抑制作用。T-MPCs对PHA诱导的T细胞增殖具有剂量依赖性抑制作用。结果（平均值±SD，n=3）表示为在没有T-MPC的情况下获得的T细胞增殖百分比。（d）在混合淋巴细胞反应（MLR）中，T-MPCs和BM MPCs对异种小鼠脾细胞诱导的T细胞增殖反应的剂量依赖性抑制作用。结果（平均值±SD，n=3）表示为在无MPC的情况下，应答器-刺激器对反应的百分比。T-MPC和BM-MPC以剂量依赖性方式抑制T细胞增殖反应。

干扰素-γ和吲哚胺2,3-双加氧酶在MPC介导的免疫抑制中的作用

最近研究表明，MPC免疫抑制需要IFN-γ（由T细胞和自然杀伤细胞产生）刺激MPC产生IDO，进而抑制活化的T或NK细胞的增殖。[13]. 此外，用中和抗IFN-γR抗体治疗完全消除了MPC的免疫抑制作用。对BM-MPC和T-MPC的分析表明，这两种细胞类型都表达IFN-γR1，前者的水平更高（图5a级). 用干扰素-γ孵育导致两种细胞群中IDO活性的诱导，T-MPC中的IDO活性水平较低（图5亿). 此外，通过中和抗IFN-γR1抗体，IFN-γ诱导的IDO活性被完全抑制。因此，这些发现有力地表明，BM MPCs和T-MPCs的免疫抑制活性都是通过IDO活性介导的，其中BM MPCs更具活性。与BM-MPC相比，这种差异抑制能力与T-MPC减少IFN-γ分泌以及诱导其IDO活性的能力降低相关（图5亿).

图5

骨髓源性间充质祖细胞（BM-MPC）和扁桃体源性间质祖细胞中干扰素γ受体-1（IFN-γR1）的表达和吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）活性。（a）IFN-γR1的基本表达水平。流式细胞术分析BM-MPC（n=4）和T-MPC（n=5）。（b）IDO活动。BM-MPC（n=3）和T-MPC（n=4）在没有或存在IFN-γ（100 ng/mL）的情况下培养72小时。在用IFN-γ培养的细胞上测试中和抗IFN-γR1抗体（1.5μg/mL）。IDO活性按材料和方法中所述进行分析。在没有IFN-γ的情况下未检测到IDO活性。在存在中和性抗IFN-γR1抗体的情况下，IFN-γ刺激的T-MPC和BM-MPC对IDO活性的差异诱导被逆转。OD，光密度；PE，藻红蛋白*，P（P）与对照组相比<0.05。

讨论

本研究的目的是双重的：（a）评估人腭扁桃体中MPCs的存在并表征其表型，（b）确定并比较这些细胞（T-MPCs）与从BM分离的特征良好的MPCs（BM-MPCs）的分化潜能和免疫调节活性。结果表明，人腭扁桃体中含有多能MPC群。通过标准程序，T-MPC可以成功隔离和扩展在体外初始细胞群（扁桃体后消化）受到非纤维母细胞组织培养粘附细胞类型的污染；特别是，即使在广泛胰蛋白酶化后，单核细胞仍然附着在聚苯乙烯烧瓶上，而上皮样细胞在用于生长BM-MPC的膨胀介质条件下无法存活。只有成纤维细胞群在两次传代后仍然存在。在我们的研究中，T-MPC的增殖曲线与BM-MPCs显著不同，与BM-MPC的58小时相比，T-MPCs的平均群体倍增时间为37小时。本研究中观察到的T-MPC和BM-MPC之间的差异可能部分与年龄有关，因为有充分的证据表明，来自老年供体的BM-MPC在细胞衰老的最初阶段增殖速度较慢[31,32]. 由于这里使用的BM-MPC来自老年供体，而T-MPC来自儿童，因此我们的观察结果与之前的年龄相关观察结果一致，尽管不能排除BM-MPC和T-MPC之间的内在差异。

用免疫荧光和流式细胞术对T-MPCs的CD表面表位谱进行了表征。共聚焦显微镜显示，BM-MPC和T-MPC均表达CD29、CD44、CD90和CD105，但缺乏造血表面标记物，包括CD14、CD34和CD45。此外，流式细胞术对T-MPC的分析证实，T-MPC分别缺乏CD45和CD31的表达，因此具有非造血和非内皮性质。综上所述，这些发现表明T-MPC与BM-MPC具有相似的表型特征。

T-MPCs的多谱系潜力是基于其分化为多种间充质谱系的能力，包括脂肪、骨骼和软骨。组织学分析清楚地显示，脂肪细胞中含有脂滴，细胞颗粒中硫酸化糖胺聚糖的基质堆积，以及分别在成脂、成软骨和成骨条件下培养的矿化区域。然而，与BM-MPC相比，成骨和软骨诱导的T-MPC分别在较低水平上表达骨和软骨相关的mRNA转录标记物。许多团体已经评估了MPC捐赠者年龄的影响在体外和体内，关于其分化潜力。Stenderup及其同事[33]发现年轻和老年供体MPC的成骨和成脂分化能力没有差异。然而，也有报道称，MPC的成软骨和成骨潜能与年龄相关的丧失[31,34]. 在我们的研究中，我们没有观察到年轻供体的T-MPC具有与年龄相关的更大分化潜能。我们推测，特定分化标记的低水平表达可能是由于先前的体内T-MPC暴露于高浓度炎性细胞因子中，这是此类组织来源的特征[35]. 在本研究中，所有T-MPC均来自因慢性扁桃体炎而接受扁桃体切除术的患者。扁桃体中的慢性细菌感染导致局部抗体的产生，B细胞和T细胞比率的改变，以及大量促炎细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）。最近，在人MPC中添加TNF-α可以抑制成骨介质诱导的从纺锤形到立方形的形态变化以及ALP增强。[36]. 为了解决这个问题，我们目前正在分析T-MPC培养基中促炎细胞因子的水平。为了支持我们的理论，即暴露于促炎细胞因子抑制T-MPC的分化能力，与同一患者的第2代细胞相比，第5代T-MPC显示出所有三个谱系的分化潜能显著增强；这一特征与BM-MPC观察到的相反（即，随着传代数的增加，分化能力降低）。我们推测，增加传代不仅消除组织塑性粘附炎性细胞（单核细胞），而且有助于减少原始环境外细胞产生的可能抑制分化的促炎细胞因子。

最近，MPC显示出免疫抑制特性在体外和体内[10,30,37,38]. MPC抑制异基因T细胞或非特异性有丝分裂刺激刺激的T细胞增殖[30,37]影响激活标记物的表达、抗原特异性增殖（针对原始和记忆T细胞）、细胞毒性T淋巴细胞的形成、Th1细胞产生IFN-γ和Th2细胞产生白细胞介素-4。[39,40]. 减少IFN-γ生成的能力是MPCs对T细胞增殖的强大抑制作用的特征，但与BM-MPC相比，T-MPCs的这种能力并不明显。这一发现与干扰素-γ的相对抑制降低相一致，干扰素γ是在存在T-MPCs和BM-MPCs的情况下检测T细胞群增殖活性的一种方法。有趣的是，最近有报道称IFN-γ水平影响MPC功能；也就是说，MPC作为抗原提呈细胞或免疫抑制细胞的双重作用取决于IFN-γ水平。Chan及其同事[41]结果表明，MPCs的抗原呈递特征发生在干扰素-γ水平的窄窗口内（10 U/mL），而在100 U/mL的干扰素γ水平下，MPC具有免疫抑制性。尽管是推测性的，但我们的观察结果与报道的低水平IFN-γ一致（25.6±7.9 IU/mL；P（P）与BM血清中记录的水平（41±23 IU/mL；P（P）<0.001），这可以部分解释BM MPCs和T-MPCs之间不同的免疫抑制特征[42–44].

虽然MPC的免疫抑制机制尚待阐明，但强烈建议通过可溶性因子（如IFN-γ）进行调节。首先，据报道MPCs免疫抑制外周血CRTH2^-CD4细胞⁺产生IFN-γ但不影响纯化CRTH2增殖的T细胞⁺CD4细胞⁺T细胞不能产生IFN-γ[13,45]. 此外，在MLR中通常不具有免疫抑制作用的胎儿MPC，当暴露于IFN-γ7天时，其抑制淋巴细胞增殖的程度与成人MPC相似。[38,46,47]. IFN-γ诱导MPCs对细胞增殖的抑制作用被认为部分与IDO活性的增强有关[12,13]. IFN-γ/受体结合导致随后的内吞作用和IFN-γ核定位序列（NLS）引导的与IFN-γ激活基因（如IDO）启动子区的IFN-γ激活序列（GAS）反应元件的结合。[48]. 一项研究表明，在用IFN-γR中和抗体治疗后，MPC的抑制潜能完全消失，IFN-γ刺激IDO活性的能力也完全消失，这一途径涉及IFN-γ、IFN-γR和IDO。[13]. 此外，对IFN-γ的反应与其受体水平相关且成比例；也就是说，IFN-γR表达增加导致IFN-γ信号传导增加和IDO基因激活增强。[49]. 因此，我们的研究结果与这些报告一致，即与BM-MPC相比，T-MPC的免疫抑制活性不太明显，与IFN-γR1的显著低四倍相关。此外，用IFN-γR1中和抗体治疗完全阻断了BM-MPC和T-MPC中IFN-γ刺激的IDO活性。这项研究首次表明，来自两种不同组织来源的MPC中IFN-γR1表达水平与其免疫抑制效力之间存在相关性。

次级淋巴器官——淋巴结、脾脏、扁桃体和派尔氏结——是启动针对微生物或抗原的免疫反应的场所。持续通过血液和次级淋巴器官再循环以遇到抗原或特异性识别扁桃体抗原并对其作出反应的B淋巴细胞被激活，并经历克隆扩张和体细胞过度突变，从而分化为记忆细胞和浆细胞。[50]. 扁桃体中MPC的鉴定提出了一个有趣的问题，即它们的免疫抑制功能及其对该淋巴器官中B细胞生物学的影响。很少有研究涉及BM-MPC对B淋巴细胞功能的影响。据报道，MPCs抑制B淋巴细胞增殖[51–53]这种活动需要可溶性因子[54]如IFN-γ。[13]. 值得注意的是，B细胞分化需要与基质细胞密切相关[55,56]和MPCs最近已被证明能产生完全功能的B细胞支持性纤维母细胞网状细胞（FRCs）[57]发现与次级淋巴器官内的滤泡树突状细胞（FDC）相关，在启动和维持有效免疫反应中发挥关键作用。FDC与活化的B细胞产生的淋巴毒素α1β2相互作用，从而与间充质来源的基质前体细胞分化。[58]. BM-MPC也被证明在TNF-α和淋巴毒素-α1β2的联合作用下获得完整的FRC表型[57]. 环境影响，尤其是与炎症有关的环境影响，对MPC的免疫抑制特性的重要性已在之前陈述过。[59]. 事实上，关于MPC调节B细胞功能的争议可能反映了MPC的分化状态（即分化为FRC或FDC）和/或可能是微环境信号的结果。因此，MPC对免疫系统的影响不仅受到细胞间相互作用的调节，还受到形成其表型和功能的环境因素的调节。因此，BM-MPC和T-MPC之间的功能差异，尤其是它们的免疫抑制效力，很可能反映了它们以前的环境就地.

MPC似乎绕过了免疫排斥反应，因此对同种异体移植具有吸引力。然而，体内，移植MPC的行为预计会受到其暴露于免疫细胞和介质的影响。MPC（尤其是T-MPC）临床应用的另一个具有挑战性的考虑因素是预测宿主组织如何影响MPC的特性，这些MPC是从经常感染并注入炎症介质的扁桃体组织中分离出来的。未来的研究有必要更好地了解炎症微环境对MPC的影响，以便将其应用于移植方案。

结论

上述问题是异基因MPCs在治疗应用中的核心问题。因此，最近的重点是寻找MPC的替代来源。根据本文报道的研究结果，人类腭扁桃体可以作为MPC的另一来源。更重要的是，MPC在次级淋巴器官中的存在强调了它们对支持启动和维持有效免疫反应的特殊微环境的潜在贡献。