樟脑代谢产物2,5-二酮樟脑1,2-单加氧酶的重组表达及纯化恶臭假单胞菌NCIMB 10007菌株

摘要

据报道，三种不同的Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMO）参与樟脑代谢恶臭假单胞菌NCIMB 10007。在（+）-樟脑降解过程中，形成2,5-二酮樟脑作为2,5-二酮樟脑1,2-单加氧酶的底物。这种酶编码在CAM质粒上，依赖辅因子FMN和NADH，因此属于II型BVMO。我们已经克隆并重组表达了2,5-二酮樟脑1,2-单加氧酶（2,5-DKCMO）的氧化亚基大肠杆菌其次是基于His-tag的亲和纯化。然后研究了代表不同BVMO底物类别的一系列化合物，但只有双环酮被2,5-DKCMO用作粗细胞提取物或纯化后转化。有趣的是，（-）-樟脑也被氧化了，但转化率比（+）-樟醇低约3倍。此外，在没有NADH脱氢酶亚单位的情况下，观察到纯化的2,5-DKCMO的活性。

介绍

酶促Baeyer-Villiger反应的发现与樟脑生物降解的探索密切相关(1)假单胞菌（图1)。微生物分解（+）的初步研究-1通过恶臭假单胞菌1959年已从污水污泥中分离出NCIMB 10007(Bradshaw等人，1959年)在接下来的十年中，对涉及的酶进行了分离和表征。中间体2,5-二酮基樟烷的酶促内酯化研究(三)从（+）-樟树红生物体中发现，两个酶组分负责Baeyer-Villiger-单加氧酶（BVMO）催化的反应步骤(Conrad等人，1961年)。第一种酶是一种FMN-偶联NADH-脱氢酶[EC 1.6.8.1]，而第二种亚基被认为是一种酮内酯酶。由于机理上与双环酮的化学Baeyer-Villiger氧化相似(Meinwald和Frauenglas 1960)经检测，酮内酯酶的命名改为BVMO。1965年，第二个乳化剂系统用于降解（-）-1已找到(Conrad等人，1965a)。因此，有人声称（+）-1其衍生物仅被（+）-樟脑诱导的2,5-二酮樟脑1,2-单加氧酶（2,5-DKCMO）转化，而（-）-1被（-）-樟脑诱导的3,6-二酮樟脑-1,6-单加氧酶转化(Jones等人，1993年)（图1)。后来有人声称，无论将樟脑的对映体给予生长培养基，二酮樟脑单加氧酶都会被诱导(Gagnon等人，1994年)。结果表明，在一些荧光假单胞菌中可以诱导分解樟脑的能力，其中大多数涉及的酶，包括II型单加氧酶，位于230 kb（165 MDa）质粒（CAM质粒，图2) (Chakrabarty 1976年).

图1

樟脑降解 恶臭假单胞菌 NCIMB 10007：在第一步中，樟脑（1）被P450羟基化_凸轮-单加氧酶(Unger等人，1986年)然后被5-exo-alkohol脱氢酶氧化(Koga等人，1989年)生成相应的二酮环丙烷（3）。（+）-1被2,5-二氯氨烷1,2-单加氧酶（a）降解，而（-）-1需要3,6-二酮环丙烷1,6-单加氧酶（b）。生成的两种内酯都不稳定，导致2-氧代-Δ3-4,5,5-三甲基环戊烯基乙酸自发形成，进一步转化为辅酶a衍生物（4），它再次是第三个涉及的BVMO（2-氧代–Δ3-4,1,5-三乙基环戊烯酸单加氧酶，通常被指定为MO2）的底物(Ougham等人，1983年).

图2

CAM-plasmid操作员：CamA：putidaredoxin还原酶（M12546.1）；CamB:putidaredoxin（J05406.1）；CamC:细胞色素P-450cam（M12546.1）；CamD:5-外醇脱氢酶（M13471.1）；CamP:1,2-二酮环丙烷-2,5-单加氧酶（AY450285.1）；CamQ：内酯水解酶（AY450285）；CamR：调节蛋白。本研究通过基因游走PCR鉴定了推测的3-酮酸-CoA转移酶A和B。

在20世纪90年代，一些关于使用整体转化环状和双环烷酮的研究恶臭假单胞菌对该生物体的细胞或部分纯化的酶进行了检测。关于参与樟脑代谢的三种BVMO的进化倾向，二酮樟脑单加氧酶以对映体发散和高度选择性的方式催化高效生产光学活性双环内酯(Gagnon等人，1994年)。特别是对双环[3.2.0.]酮和去甲樟脑衍生物进行了研究，从去甲樟衍生物获得的苄氧内酯成为昆虫拒食剂印楝素的重要前体(Gagnon等人，1994年;Gagnon等人，1995年b)。进一步探索了一系列单环酮，与全细胞转化相比，2-烷基环戊酮和3-取代环丁酮的转化具有互补的对映选择性钙醋酸不动杆菌最终归因于2-氧代-Δ3-4,5,5-三甲基戊烯基乙酸单加氧酶(Gagnon等人，1995年;Grogan等人，1993年)。这些研究是用细胞或无细胞提取物进行的，这些提取物包含所有三种BVMO或至少两种二酮坎烷单加氧酶。即使通过纯化尝试分离不同的活性，也不能排除杂质的存在。因此，为了准确表征这些酶，需要可重复且可靠的分离和纯化方法。

在BVMO催化的氧化中，例如通过来自博伊丁假丝酵母，也被利用。此外，利用马肝乙醇脱氢酶与2,5-DKCMO的偶联过程，从乙醇前体开始合成光学活性内酯(Gagnon等人，1994年;Gagnon等人，1995年b).

最近调查了几个新的BVMO，其中大多数为I型，与FAD和NADPH相关(Fraaije等人，2005年;Rehdorf等人，2007年;Völker等人，2008年;Rehdorf等人，2009年)到目前为止，只研究了少数含有FMN/NADH的II型BVMO。一个原因可能是这些酶在异源宿主中具有挑战性的过度表达，因为与I型BVMO相比，氧化和脱氢酶亚基是不同的蛋白质。

到目前为止，已使用野生型菌株的大规模培养进行了2,5-二酮樟脑1,2-单加氧酶的所有表征和生物催化实验恶臭杆菌NCIMB 10007以及随后涉及酶的多重纯化和分离步骤。我们在这里报道了首次重组过表达的氧化2,5-二酮樟脑1,2-单加氧酶恶臭杆菌NCIMB 10007英寸大肠杆菌随后通过亲和层析进行简化纯化并对酶进行表征。

材料和方法

酶、化学品和介质

Pfu公司⁺-聚合酶来自Roboclon（德国柏林）和Roth（德国卡尔斯鲁厄）的dNTPs。限制性酶从新英格兰生物实验室（美国马萨诸塞州贝弗利）获得。对于SDS-PAGE分析，使用了来自Fermentas（德国圣莱昂罗特）的预处理PAGE标尺plus。所有其他化学品均从Fluka（瑞士Buchs）、Sigma-Aldrich（德国慕尼黑）或Acros Organics（比利时Geel）购买。为了从PCR中纯化DNA，使用了德国希尔登Qiagen公司的MinElute PCR-纯化试剂盒。此外，使用来自Qiagen的Miniprep试剂盒进行质粒纯化。HisTrap 5 mL FF柱和Sephadex G25由GE Healthcare（瑞典乌普萨拉）获得。质粒pET-28b（+）来自Novagen（德国达姆施塔特）。BCA试剂盒是从Interchim（法国蒙卢松）购买的。

扩增和克隆

用含有CAM-plasmid的染色体DNA和补充有限制性内切酶位点的寡核苷酸对2,5-DKCMO基因进行扩增Nde公司I在N终点和Xho公司我在C终点站(Nde公司I_2,5-DKCMO_fw:5'-GGAATTCATAGAAATGCGGATTTTCCATACCC-3'；2,5-DKCMO公司_Xho公司I_rv:5'-CCGCTCGAGTCAGCCCCATTCGAACCTT-3'）。在95°C下初始变性5 min后，循环程序进行25个循环：45 s，95°C变性，45 s，58°C引物退火，70 s，72°C伸长率。最终伸长步骤在72°C下进行了10分钟。将产生的1092 kb片段用Nde公司我和Xho公司I和连接成pET-28b，用相同的酶消化。产生的带有N末端His-tag融合的质粒被称为pET-28_2,5-DKCMO（图三).

图3

表达重组2,5-DKCMO的载体2,5-DKCMCO_pET-28 恶臭杆菌 NCIMB 10007受T7启动子控制 大肠杆菌 BL21型使用限制性内切酶的位点引入2,5-DKCMO基因Nde公司我和Xho公司我赞成克隆。

菌种和培养条件

恶臭杆菌NCIMB 10007（相当于ATCC 17453）从德国国家生物材料资源中心（DSMZ）购买。用于培养恶臭杆菌，如前所述，使用不含抗生素的基础盐培养基(Gagnon等人，1994年).大肠杆菌细胞在极好的肉汤（TB）培养基中培养（12 g胰蛋白胨、24 g酵母、4 g甘油分别在1 L缓冲液中高压灭菌）。在Luria Bertani（LB）培养基（10 g胰蛋白胨，5个酵母，5 g NaCl，在1 L dest H中培养过夜培养物₂O） ●●●●。LB和TB培养基中添加100μg/mL卡那霉素。

的转换大肠杆菌菌株BL21-DE3（Novagen，基因型：[95 F-ompT hsdSB（rB-mB-）加仑dcmrne131（DE3）]）和pET-28_2,5-DKCMO通过以下描述的热冲击方法进行Chung等人（1989）.重组2,5-DKCMO在大肠杆菌BL21通过37°C至OD的培养进行₆₀₀0.5，然后将IPTG添加到0.1 mM的最终浓度，并将培养物转移到20°C和200 rpm，再培养16小时。

基因表达分析

用粗细胞提取物进行基因表达分析。在培养期间采集标准化细胞数量的样品。通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在磷酸钠缓冲液（50 mM，pH 7.5）中。细胞破碎由FastPrep完成（40 s，4 m/s；MP Biomedicals，Solon，OH，USA）。对于SDS-PAGE分析，上清液被Laemmli缓冲液取代(莱姆利1970)。在12%的分离凝胶上进行SDS-PAGE。蛋白质用考马斯R250/G250溶液染色。

酶纯化

通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在磷酸钠缓冲液（50 mM，pH 7.5）中。通过单一通道通过法国压力池进行细胞破坏。重组2,5-DKCMO通过亲和层析在自动化的Al-kta纯化系统上通过N-末端His-tag进行纯化。在（10000×g）离心破碎细胞45 min后，将含有重组2,5-DKCMO的上清液添加到柱中。带有结合镍的5 mL HisTrap FF粗柱²⁺用添加300 mM NaCl和30 mM咪唑的磷酸钠缓冲液（100 mM，pH 7.5）进行平衡。在通过粗提取物后，用三个柱体积的磷酸钠缓冲液（100 mM，pH 7.5）清洗色谱柱，补充300 mM NaCl和30 mM咪唑，然后用两个柱体积添加300 mM NaCl和60 mM咪唑啉的磷酸钠缓冲器（100 mM，pH 7.5。通过在添加有300 mM NaCl的磷酸钠缓冲液（100 mM，pH 7.5）中添加三个柱体积的300 mM咪唑进行洗脱。收集洗涤和洗脱步骤的馏分，通过SDS-PAGE分析纯度。为了从洗脱液中去除咪唑和NaCl，将混合洗脱部分加载到60 mL大小的排除柱（Sephadex G25基质）中，该排除柱之前使用磷酸钠缓冲液（50 mM，pH 7.5）进行平衡。蛋白质组分在280 nm处通过在线吸收测量识别并收集。使用BCA-kit测定纯化和脱盐蛋白质以及粗提物的蛋白质含量，并使用BSA在相同缓冲液中的标准曲线，范围为2-0.005 mg/mL。在三种不同的稀释液中测量三份样品。

生物催化反应和GC分析

对于生物催化，His-tag纯化的2,5-DKCMO、大肠杆菌使用BL21 pET28_2,5-DKCMO培养物和静止细胞。在磷酸钠缓冲液（50 mM，pH 7.5）中进行反应。底物的浓度为0.5-2 mM，辅因子FMN的最终浓度为0.3 mM。NADH的用量与底物的摩尔数相等。使用浓度为1.5-2 mg/mL的纯化2,5-DKCMO，浓度为12-15 mg/mL的粗提取物。在24孔MTP中以800-1000 rpm进行培养。样品体积为1 mL。随后用600μl和400μl乙酸乙酯对样品进行旋涡提取底物和产物。样品用无水硫酸钠干燥。通过离心分离水相和有机相。有机溶剂在真空离心机中蒸发。添加120μL新鲜EtOAc，并在QP 2010（德国杜伊斯堡Shimadzu Europa GmbH）上使用BPX5柱（德国达姆施塔特SGE GmbH，5%苯基-/95%甲基聚硅氧烷）通过GC-MS分析样品。注射温度设置为220°C。（+）的检测温度-1, (-)-1，13，14和1560°C持续5分钟，然后10°C/min到180°C的梯度保持3分钟16温度为120°C。对于17使用240°C持续5分钟，然后使用2°C/min到270°C的梯度并保持5分钟。6-8在60°C下进行分析。9和10在160°C下等温检测。检测温度11温度为90°C12100°C。

比活度以每毫克（U/mg）蛋白质的单位表示。一个单位被定义为每分钟催化1μmol底物氧化的酶量。

结果

2,5-二酮樟烷1,2-单加氧酶的克隆、表达和纯化

2,5-二酮樟脑1,2-单加氧酶（2,5-DKCMO）恶臭假单胞菌NCIMB 10007编码在可传递的230 kb CAM质粒上的CAM操纵子上(Rheinwald等人，1973年)。第一个染色体和质粒DNA是从恶臭杆菌以樟脑为唯一碳源培养的NCIMB10007菌株。然后使用来自相应基因的基因特异性引物通过梯度PCR扩增该基因[GenBank:AY450285]。然后将PCR产物连接到与N-末端His标签融合的表达载体pET-28b中，以使2，5-DCMO在大肠杆菌通过亲和层析进行蛋白质纯化。与C末端标记相比，N末端标记更受欢迎，因为我们使用4-氢乙酰丙酮单加氧酶（HAPMO）的经验来自恶臭杆菌JD1表示，使用C端子标签可以减少BVMO-expression(Rehdorf等人，2009年).

利用大肠杆菌作为表达宿主的BL21（DE3）在20°C的TB培养基中培养16小时后，主要产生可溶性2,5-DKCMO蛋白，而在30°C的培养基中产生不溶性包涵体（数据未显示）。粗细胞提取物的SDS-PAGE分析在图中所示的约40 kD处产生了清晰的条带4，其对应于His标记的蛋白质的42.9kD的理论估计分子量。

图4

2,5-DKCMO的SDS-PAGE分析：车道1：标记：150、130、100、70、55、35、25、15 kDa；第二道：粗提物（总蛋白41μg）；通道3：纯化蛋白（22μg）.

成功重组表达后，对His-tagged蛋白进行镍基亲和层析，然后在G25柱上通过尺寸排除色谱去除咪唑，得到纯蛋白（图4，车道3），净化系数为6（表1)。含有纯化蛋白质的组分是无色的，这证实了先前的研究，其中FMN不与酶共价结合(1986年卡车).

表1通过镍基亲和色谱和咪唑去除纯化2,5-DKCMO

2,5-DKCMO的底物特异性

为了确定2,5-DKCMO的底物特异性，在使用粗酶提取物的生物催化实验中研究了代表不同类别BVMO底物的各种化合物（图5)。在选定的条件下，含有2,5-DKCMO的粗提取物只能转化双环酮（表2)。对于所有单环酮(6-8)，芳香酮(9-11)，脂肪族2-癸酮(12)测试以及1-茚酮(16)和黄体酮(17)无法确定转换。使用纯酶进一步研究了转化的底物的生物催化作用，并在25°C下用2mM底物在1mL规模的生物催化实验中测定了比活性（表2).

图5

用于2,5-DKCMO催化Baeyer-Villiger氧化的基底.6-8表示单环酮，9-11个取代芳香酮，12个用作脂肪族酮的示例，13-16个用作双环酮。

表2几种双环酮的粗细胞提取物转化率和纯2,5-DKCMO的比活性

有趣的是，在我们的研究中（-）-1也被2,5-DKCMO转化，尽管从野生型菌株培养中分离的纯化酶声称对（+）-对映体具有特异性(Jones等人，1993年)。由于我们在大肠杆菌宿主没有自己的BVMO，并且用粗细胞提取物和His-tag纯化蛋白观察到（-）-樟脑的转化，我们只能推测Jones等人，1993年确实是同质的。诺坎普(13)和（±）-顺二环[3.2.0]庚-2-烯-6-酮(14)一般来说，作为基质比樟脑更容易接受，而且(R（右），R（右）)-双环[2.2.1]庚烷-2,5-二酮(15)，其结构类似于天然底物2,5-二酮氨基甲酸酯(三)，也被转换。此外14用表达2,5-DKCMO的静止细胞进行，其中在0.5 mM底物浓度下生物催化6 h后可观察到11%的转化率。

讨论

2,5-二酮环丙烷单加氧酶的氧化亚基被成功克隆并在大肠杆菌作为异源表达宿主。因此，这种酶现在很容易获得稳定的质量，蛋白质工程研究首次成为可能。使用N-末端His-tag通过镍基亲和色谱纯化证明是高效和快速的。虽然在之前从野生型培养物中纯化酶时，使用了大量培养物，但在本研究中，需要少量的异源培养物才能产生相当数量的纯蛋白。Conrad等人使用10 L培养液，获得240 mL粗提物，通过基于色谱的纯化方案，通过三个步骤生产52 mg纯蛋白，相当于回收率为15%(Conrad等人，1965a)。28年后，Jones等人将纯度和收率提高到19.5%。从10 L培养液中获得49 mg纯酶(Jones等人，1993年)。在这项工作中，从400 mL培养基中获得了8 mg纯蛋白，这突出了重组表达和酶与His-tag融合的优点。

先前对纯化蛋白的研究通过天然PAGE确定了78kDa的2，5-DKCMO的分子大小。在变性条件下，鉴定出两个分子量为37 kDa的相同亚基(1986年卡车)。根据2,5-DKCMO一个亚单位的氨基酸序列估计质量为40.7kDa，并与His-tag 42.8kDa融合。SDS-PAGE分析大肠杆菌粗提取物和纯蛋白产生对应于约40kDa的蛋白带，其对应于在SDS-PAGE方法的一定误差范围内在早期研究中确定的那些分子量。

用亲和色谱法收集的含有2,5-DKCMO的组分是无色的。先前已经证明FMN结合是非共价的(Conrad等人，1961年)因此，我们假设FMN在净化过程中丢失。为了获得更好的酶稳定性，立即将FMN添加到蛋白质溶液中。

非血红素铁的需要量²⁺过去也对用于充氧活性的离子进行了深入的讨论(Conrad等人，1965a)。铁²⁺被认为对生成BVMO反应所需的活性氧形式至关重要。事实上，酶中没有过渡金属离子的机械要求，这也可以通过在缺乏铁的情况下纯蛋白质的BVMO活性的可用性来证实²⁺在本研究中。

在这项工作中，2,5-DKCMO（一种氧化亚基）的重组表达和纯化产生了一种“脱氢酶缺失”的纯蛋白，可以证明该酶仍然能够氧化双环酮。以前，虽然在2,5-DKCMO的最终制备过程中未检测到NADH脱氢酶，但仍获得了边际BVMO活性，这最终是由杂质或氧气组分在FMN存在下能够作为其自身的NADH脱水酶运行，并从NADH中移除电子来催化反应的事实引起的(1986年卡车)。提纯的氧合组分的活性也较低，这可以通过上述亚基的弱耦合来解释体外(Conrad等人，1965b).

我们还观察到2,5-DKCMO的氧化活性在大肠杆菌与纯蛋白质相比，粗提取物或全细胞方法中的蛋白质含量更高。这一事实可以用以下几个方面来解释大肠杆菌可以替代缺失的NADH脱氢酶的细胞。使用合适的NADH脱氢酶进行共表达实验，可以进一步显著提高2,5-二酮樟烷1,2-单加氧酶的活性，因此可以为有机合成生成有价值的催化剂，从而获得工业价值的前体，例如印楝素。

关于在更大规模的应用中对辅因子再生的要求，2,5-DCMO也可以用于本报告中引入的表达系统的全细胞方法。