共溶剂在SDS蛋白质变性中的保护作用：结构研究

摘要

背景

最近，我们报道了一种在变性剂十二烷基硫酸钠（SDS）存在下保持某些蛋白质活性的独特方法。这是通过添加两亲性溶剂2,4-甲基-2-戊二醇（MPD）来实现的，MPD既用作这些蛋白质的保护剂，也用作它们的复性剂。尽管SDS/MPD混合物中蛋白质活性的持久性已明确确立，但其结构的保存到目前为止只是推测性的。

结果

在本文中，详细的X射线研究解决了悬而未决的问题。首次在MPD和变性浓度的SDS存在下生长了鸡蛋白溶菌酶晶体。根据结晶条件，收集与SDS或MPD络合物中的四方晶体。这两种结构的构象与天然溶菌酶非常相似，获得的SDS-溶菌酶和MPD-溶菌素复合物对蛋白质-SDS和蛋白质-MPD相互作用的相互作用提供了一些见解。

结论

本研究明确确立了SDS/MPD混合物中酶结构的保存。假设高浓度MPD会改变SDS的性质，降低或避免变性剂与蛋白质之间的相互作用。因此，这些结构数据支持这样一种假设，即MPD避免了SDS对酶结构的破坏，并可以保护蛋白质免受SDS变性的影响。

背景

十二烷基硫酸钠（SDS）是一种高效且应用广泛的蛋白质变性剂[1,2]. 我们以前的工作表明，两亲性溶剂，如2-甲基-2,4-戊二醇（MPD），是结晶研究中常用的沉淀剂[三]，可以保护蛋白质免受SDS变性，在一些情况下可以驱动从SDS变性状态过渡到功能折叠状态[4]. MPD的这种保护作用可以在包括膜蛋白和可溶性酶在内的多种蛋白质中观察到，如果蛋白质在胍或尿素（其他两种变性剂）中变性，则不适用。对于鸡蛋白溶菌酶，SDS浓度高于1.0 mM时，在没有MPD的情况下，酶的活性被抑制。然而，在2 M MPD中，活性在SDS存在下保持。此外，在添加MPD之前，当酶首次用SDS变性24小时时，再经过24小时的孵育期，在2 M MPD中恢复全部酶活性。尽管SDS/MPD混合物中酶活性的持久性已经明确确立，但其结构的保存到目前为止只是推测性的。

在本文中，详细的X射线研究解决了悬而未决的问题。首次在SDS/MPD培养基中生长出蛋清溶菌酶晶体，为在蛋白质中添加MPD避免SDS变性提供了支持。获得的SDS-溶菌酶和MPD-溶菌素复合物对蛋白质-SDS和蛋白质-MPD相互作用的相互作用提供了一些见解。先前的一份报告描述了浸泡在SDS溶液中的交联溶菌酶晶体的结构[5]. 在后者中，与本文描述的两种结构不同，SDS在蛋白质内部的三个不同位置被发现，导致溶菌酶内部的主要结构变形。

结果和讨论

结晶

与Yonath等人的研究相反，在4 mM SDS（通常是变性条件）和2 M MPD中溶解的鸡蛋白溶菌酶晶体得到了，没有任何交联[5]，在两种不同的条件下（参见材料和方法）。四方晶体，称为“I型”晶体，是从pH 4.6的经典醋酸钠溶液中获得的。在这种情况下，蛋白质滴与不含MPD的储液罐溶液平衡后，预计液滴中会残留少量稍有挥发性的MPD（表1). 提高滴液中SDS和MPD的浓度，并考虑文献中的结果[6]通过将蛋白质溶液与50 mM Tris pH8、70%MPD和6 mM SDS的储备溶液平衡，也可以得到晶体，从而形成“II型”晶体。这两种晶体属于同一四方空间群P4_三2₁2.晶型I晶体将X射线衍射到2.3，晶型II衍射到1.75Å。

表1数据收集和结构细化统计

结构概述

与Yonath等人[5]，两种结构的整体构象与天然溶菌酶（PDB代码1Z55）非常相似。使用C计算的RMSD值_α对于I型和II型晶体，原子与本征结构叠加后分别为0.27和0.20Ω（图。1). 没有观察到大的结构变化，酶的内部是完整的。在电子密度定义不太明确的环蛋白表面观察到最显著的变化（对于精氨酸和赖氨酸等柔性残基）。这些差异可能是由于模型或固有热行为的不确定性造成的。

图1

自然状态下（1Z55；橙色）的溶菌酶晶体结构重叠，与SDS（形态I；绿色）和SDS/MPD（形态II；蓝色）共结晶。

因此，高浓度MPD的存在可以避免SDS对酶结构的破坏。事实上，正如约纳所示[5]SDS通过与蛋白质的疏水核心深度结合，诱导溶菌酶的两翼分离。此外，I型晶体中的MPD预计不会残留在液滴中，这表明MPD能够在变性浓度的SDS（2 mM）存在下不可逆地诱导溶菌酶正确折叠。

SDS或MPD与溶菌酶的相互作用

根据使用的贮存溶液，发现不同的小分子与溶菌酶共结晶（表1). 由于SDS和MPD分子的特征形状，它们可以在密度图中明确识别。在条件II缓冲液中，第一个MPD分子以S构型占据由残基Asn59、Trp63、Ile58、Ala107和Trp108（图。2). 这也是乙醇、丙醇、丁醇和戊醇等醇分子的结合位点[7]和变性剂，用于非变性浓度，如二甲基亚砜、盐酸胍[8]和尿素[9,10]. 这与假设一致，即MPD分子通常倾向于结合到疏水位置，MPD结合是渗透性的，导致水分子在凹槽和空腔中的位移[三]. 分子的疏水部分与Trp108相互作用（接触≤3.5Ǻ），两个醇基团分别与Asn59和Trp63的主链H键合。第二个MPD分子以S构型结合在两个溶菌酶分子之间的表面，靠近Arg114（图。三). 电子密度图中未观察到SDS分子。

图2

C-亚网站中溶菌酶和MPD之间络合物的立体视图。电子密度2楼 _{O（运行）} -F类 _C 该地图在MPD的1σ水平上绘制等高线。

图3

蛋白质表面溶菌酶和MPD之间复合物的立体视图。电子密度2楼 _{O（运行）} -F类 _C 该地图在MPD的1σ水平上绘制等高线。

通过将轮廓水平降低到0.6左右，两种MPD分子的S构型非常清晰，但在此阶段，无法推断S-MPD比R分子更稳定。

上述结构与在无SDS的MPD存在下结晶的溶菌酶结构的比较（PDB代码1DPW，1.64Ǻ）[6]C叠加的RMSD为0.14Ǻ_α原子。本研究中第二个MPD分子的位置与之前描述的位置相匹配，但被切换的构型除外。MPD和Arg114之间的水分子也是保守的。此外，在与1DPW结构相同的结合位点中发现了两个氯离子。此外，还观察到钠离子与残基Ser60、Cys64、Arg73、Ser72侧链Oγ和两个水分子的主链羰基氧结合。在低浓度二甲基亚砜和氯化胍存在的情况下，这种钠离子结合位点存在于酶中[8].

与预期一样，在条件I缓冲液中，MPD没有观察到电子密度，而在溶菌酶表面暴露于溶剂中时发现SDS分子。正如Weiss等人所建议的，MPD可能只能在高pH值和/或高浓度下结合溶菌酶。SDS是松散结合的，如其温度因子所示（硫酸盐尾部为70–80℃）。硫酸十二烷基硫酸钠盐桥接至Arg73（图。4)并且烃尾与Ser60、Cys64-Pro70、Ser72-Asn74接触。结合位置与前面描述的SDS-溶菌酶复合物中的不同，SDS分子在复合物中与蛋白质深度结合[5]. 事实上，假设在MPD存在下，SDS与蛋白质核心的疏水相互作用降低。此外，SDS的结合不会改变溶菌酶的结构。在这种结构中，没有观察到钠离子或氯离子。值得注意的是，本研究展示了与变性浓度的SDS以天然形式共结晶的蛋白质的极少数结构之一。

图4

SDS和酶之间复合物的立体视图。电子密度2楼 _{O（运行）} -F类 _C SDS的地图在1σ水平上绘制等高线。图1至图4是使用PyMOL[17]生成的。

结论

本研究首次在两亲性溶剂MPD和变性浓度的SDS存在下生长溶菌酶晶体，明确确立了在SDS/MPD混合物中保存酶结构。据推测，高浓度的MPD会改变SDS的性质，从而降低（条件I）或避免（条件II）SDS与蛋白质之间的相互作用。事实上，在II型晶体中，尽管它含有比I型更高的SDS浓度，但MPD浓度也更高，但没有观察到SDS分子。这个假设与前面描述的尺寸排除色谱研究相一致[4]，证明该蛋白不再与MPD缓冲系统中的SDS强烈相互作用。因此，这些结构数据支持MPD可以保护蛋白质免受SDS变性的假设。

此外，值得注意的是，这一贡献显示了天然形式的蛋白质与SDS共结晶的极少数结构之一。

方法

结晶

将从Sigma获得的冻干鸡蛋白溶菌酶溶解在4 mM SDS、50 mM Tris pH8、150 mM NaCl和2 M MPD（外消旋形式）（约10 mg/ml蛋白质）中。在两种不同的条件下，采用悬挂滴气相扩散法在室温下生长晶体。将前4μl蛋白质溶液与4μl不含MPD的储备溶液混合，储备溶液含有100 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.6）和2 M甲酸钠（条件I），并与1 mL储备溶液平衡。在第二种条件下，储层溶液由50 mM Tris pH8、70%（~4.6 M）MPD（外消旋形式）和6 mM SDS（条件II）组成。

数据收集、处理和完善

直接从母液中获得的晶体在100K氮气流中闪速冷冻，无需添加冷冻保护剂。使用Bruker MICROSTAR发生器和Bruker Proteum X8 CCD X射线探测器收集I型晶体的衍射数据。晶体到探测器的距离为60 mm；收集了180张图像（振荡范围/图像为0.5°），每张图像的曝光时间为120秒；使用SAINT-Plus/Proteum处理数据。

对于II型晶体，使用了Gemini Ultra R系统（4圈卡帕平台、超增强铜源、红宝石CCD探测器）。晶体到探测器的距离为50 mm；收集了180张图像，每张图像曝光时间为90秒；使用CrysAlis CCD和CrysAlisRED处理数据。

使用Phaser找到了一种分子替代溶液[11]天然溶菌酶的分子模型（PDB条目1Z55）。使用Shelxl97（Form II）进行优化[12]或Refmac5（Form I）程序[13]. 使用图形程序Xtalview（表II）检查电子密度图[14]或Coot（表一）[15]，并使用程序Procheck分析了模型的质量[16]. 原子坐标和结构因子已保存在蛋白质数据库中(3B6升和3B72型).