1. 神经科学

用于神经活动成像的敏感红蛋白钙指示剂

  1. 霍德·达纳  是通讯作者
  2. 波阿斯·莫哈尔
  3. 孙毅
  4. 苏加塔·纳拉扬
  5. 安德鲁·戈杜斯
  6. 杰里米·帕·哈塞曼
  7. 盖塔洪·泽盖（Getahun Tsegaye）
  8. 格雷厄姆·T·霍尔特
  9. 胡美仪
  10. 迪皮卡·瓦尔皮塔
  11. 罗纳克·帕特尔
  12. 约翰·麦克林
  13. 科妮莉亚·巴格曼
  14. 米沙·B·阿伦斯
  15. 埃里克·施赖特
  16. 维韦克·贾亚拉曼
  17. 洛伦·卢格
  18. 卡罗·斯弗波达
  19. 道格拉斯·S·金  是通讯作者
  1. 美国霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
  2. 以色列魏茨曼科学研究所
  3. 美国洛克菲勒大学霍华德·休斯医学院
https://doi.org/10.7554/eLife.12727
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  1. 霍德·达纳
  2. 波阿斯·莫哈尔
  3. 孙毅
  4. 苏加塔·纳拉扬
  5. 安德鲁·戈杜斯
  6. 杰里米·帕·哈塞曼
  7. 盖塔洪·泽盖（Getahun Tsegaye）
  8. 格雷厄姆·T·霍尔特
  9. 胡美仪
  10. 迪皮卡·沃尔皮塔
  11. 罗纳克·帕特尔
  12. 约翰·麦克林
  13. 科妮莉亚·巴格曼
  14. 米沙·B·阿伦斯
  15. 埃里克·施赖特
  16. 维维克·贾亚拉曼
  17. 洛伦·卢格
  18. 卡罗·斯弗波达
  19. 道格拉斯·S·金
(2016)
用于神经活动成像的敏感红蛋白钙指示剂
电子生活 5：e12727。
https://doi.org/10.7554/eLife.12727
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摘要

基因编码的钙指示剂（GECI）可以测量大量神经元和小神经元隔室中毫秒至数月的活动。虽然基于GFP的GECI广泛用于体内神经生理学，但具有红移激发和发射光谱的GECI在体内成像方面具有优势，因为它减少了组织中的散射和吸收，从而降低了光毒性。然而，目前用于检测和量化神经活动的红色GECI不如基于GFP的GCaMP6指标。在这里，我们提出了基于mRuby（jRCaMP1a，b）和mApple（jRGECO1a）的改进的红色GECI，其灵敏度与GCaMP6相当。我们描述了新的红色GECI在培养神经元和小鼠中的表现，果蝇斑马鱼和秀丽线虫体内试验。红色GECI有助于深层组织成像、双色成像和基于GFP的报告员，以及将光遗传学与钙成像结合使用。

https://doi.org/10.7554/eLife.12727.001

eLife摘要

神经元用称为尖峰的短暂电脉冲编码信息。监测大量神经元中的峰值是研究神经元网络如何处理信息和产生行为的有力方法。这种活动可以用荧光蛋白指示剂或“探针”检测，当神经元活动时，探针就会亮起。

现有最好的探针产生绿色荧光。然而，红色荧光探针可以让我们深入大脑，也可以与绿色探针一起使用，同时成像不同类型神经元的活动和相互作用。然而，现有的红色荧光探针在检测神经活动方面不如绿色探针好。

通过优化现有的两种红色荧光蛋白，Dana等人现在生产了两种新的红色荧光探针，每种探针都具有不同的优势。新的蛋白质指示剂检测神经活动具有很高的灵敏度，使研究人员能够对以前未见过的大脑活动进行成像。测试表明，这种探针可以在培养的神经元中工作，并可以对小鼠、苍蝇、鱼类和蠕虫的神经元活动进行成像。

历史表明，加强用于研究生物过程的技术可以带来全新的见解。因此，在未来，Dana等人希望制作更灵敏的蛋白质指示剂，以便对大脑深处更大的神经元网络进行成像。

https://doi.org/10.7554/生活.12727.002

介绍

基因编码的钙指示剂（GECI）能够对体内神经元活动进行非侵入性测量。可以从突触跨多个空间尺度跟踪活动(Chen等人，2013b)成千上万的神经元(Ahrens等人，2013年;Peron等人，2015年). 神经动力学可以在毫秒内探测(Chen等人，2013a;O'Connor等人，2013年;Li等人，2015年)到个月(Huber等人，2012年;Margolis等人，2012年). 基于绿色荧光蛋白（GFP）的GECI(Tian等人，2009年;Akerboom等人，2012年;Ohkura等人，2012年;Chen等人，2013b)，例如GCaMP6(Chen等人，2013b)广泛用于神经活动成像。GCaMP6指示器显示出良好的信噪比，允许在许多情况下检测单动作电位（AP）(Chen等人，2013b;Peron等人，2015年).

GCaMP和其他广泛使用的GECI的应用受到其激发和发射光谱的限制。GCaMP很难用于已经表达其他GFP蛋白的转基因动物。标准宽视野显微镜中使用的蓝色激发光会造成光损伤，并在组织中高度散射。绿色GCaMP排放物被血液吸收(斯沃博达和布洛克，1994年)减少了脊椎动物体内成像的穿透深度。此外，GCaMP激发光谱与光敏离子通道的激发光谱重叠，包括通道视紫红质2（ChR2）(Nagel等人，2003年)这使得绿色GECI和光遗传学的同时使用变得复杂。因此，与基于GFP的传感器相比，红移GECI具有三个主要优势：增加最大成像深度，将红色GECI与光敏离子通道并行用于全光神经生理学实验，以及减少光损伤。此外，与现有的绿色GECI一起，红色GECI可以同时成像神经元电路的多个组件。

当前红色GECI与GCaMP传感器共享总体架构。它们基于循环置换红色荧光蛋白（RFP）、钙结合蛋白（钙调蛋白）和结合肽（M13或ckkap）。RCaMP1型(Akerboom等人，2013年)源自mRuby(Kredel等人，2009年)，而R-GECO(Zhao等人，2011年;Wu等人，2014年)和R-CaMP2(Inoue等人，2015年)源自mApple(Shaner等人，2008年). R-GECO比RCaMP1更敏感。然而，基于mApple的GECI，如R-GECO和R-CaMP2，在蓝光照射下表现出光开关，导致红色荧光的短暂增加，使其在光遗传学中的应用复杂化(Akerboom等人，2013年;Wu等人，2013年). 在这里，我们进行了大规模的结构导向突变和基于神经的筛选(Wardill等人，2013年)从RCaMP1h开始，开发改良的红色GECI(Akerboom等人，2013年)和R-GECO1(Zhao等人，2011年). 我们报告了基于mRuby的jRCaMP1a和jRCaMP 1b，以及基于mApply的jRGECO1a，与它们的父支架相比，所有这些都显示出检测神经活动的灵敏度提高了几倍。

结果

蛋白质工程

R-GECO1和RCaMP1基于循环置换mApple(Shaner等人，2008年)和mRuby(Kredel等人，2009年)分别与钙调素（CaM）和钙调素相互作用M13肽融合(克里维奇和Ikura，1995年). 在钙存在下，CaM发生构象变化，并与M13结合，在RFPβ-桶内的发色团附近形成复合物(Akerboom等人，2009年;2013). 构象的改变改变了生色团的环境，调节了溶剂的进入，生色团pK一吸收和量子产率，从而提高RFP亮度。基于神经的分析中的结构导向突变和筛选已成功提高GCaMP敏感性和动力学(Akerboom等人，2012年;Chen等人，2013b). 在这里，我们对红色GECI应用了类似的方法。

我们将突变集中在RFP和CaM之间的界面、CaM和M13之间的界面以及CaM本身内部（RCaMP1h和R-GECO1中的78/442和87/451氨基酸位置分别突变为接近饱和，参见补充文件1–2) (图1a). 这些区域在结构上与先前在GCaMP6工程中探索的区域相似(Chen等人，2013b). 单突变变异体（934 RCaMP1h；689 R-GECO1，补充文件1–2)在自动神经元测定中进行了测试(Wardill等人，2013年) (图1b–d). 用表达红色GECI变体（RCaMP1h变体或R-GECO1变体）的质粒转染96周板中分离的大鼠海马神经元。为了使表达水平正常化，质粒还表达了定位于细胞核的GFP。R-GECO1和RCaMP1h均在细胞质和细胞核中表达（数据未显示）。为了选择性地感知细胞质中的钙，我们在R-GECO1、RCaMP1h及其所有变体的N末端添加了一个核输出序列（NES）。正如预期的那样，NES的添加限制了细胞质的表达(图1b). R-CaMP2在没有NES的情况下被排除在细胞核之外。

图1
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分离神经元中jRCaMP1和jRGECO1的突变和筛选。

(一)RCaMP1h和R-GECO1结构以及在jRCaMP1a、jRCaMP 1b和jRGECO1a中引入的突变。M13肽（黄色）、连接器1（灰色）、cpmRuby或cpmApple（红色）、连接器2（灰色）和CaM（蓝色）。jRCaMP1a（绿色）、jRCaMP 1b（青色）、jRGECO1a（绿）的突变位置。(b)培养神经元分析示意图。场电极（灰色，上面板）刺激培养的神经元表达胞浆红色GECI变体和核GFP。记录并分析荧光变化（下面板）。给出了jRGECO1a表达神经元在3动作电位（AP）刺激后的反应轨迹示例。(c)855个R-GECO1变异体的筛查结果。顶部，响应1个动作电位的荧光变化（垂直条，ΔF/F0振幅；黑条、单个R-GECO1突变和组合突变；红色条，R-CaMP2左侧，jRGECO1a右侧）。中间，不同AP刺激的显著性值（彩色图）。10次AP后的底部一半衰减时间。黑线表示R-GECO1性能水平。(d日)1070个RCaMP1h变异体的筛查结果。顶部，荧光变化响应1个AP（顺序与中相同b; 红色条，R-CaMP2左侧，jRCaMP1a和jRCaMP 1b右侧）。中间，不同AP刺激的显著性值（彩色图）。10次AP后的底部一半衰减时间。黑线表示RCaMP1h性能水平。

https://doi.org/10.7554/eLife.12727.003

场电极触发每个孔内所有神经元的动作电位序列（材料和方法[Wardill等人，2013年]). 延时图像（800μm x 800μm视场；35Hz）。从单个神经元提取荧光变化，以计算对不同系列AP反应的灵敏度、动态范围和动力学。将单个红色GECI变异体与父代构建物和已发布的GECI进行比较，包括R-CaMP2(Inoue等人，2015年)、GCaMP6和GCaMP6f(Chen等人，2013b).

大量单一突变（353/934 RCaMP1h；187/689 R-GECO1，补充文件1–2)与母体蛋白相比，灵敏度提高（ΔF/F更高0对一个AP的响应幅度；p<0.01，Wilcoxon秩和检验）(图1c、d). 例如，与RCaMP1h相比，T46W、I60N和I60T表现出更强的灵敏度和加速动力学。I109K对R-GECO1的影响相似。M339F加速了动力学，但不影响R-GECO1的响应幅度。根据改善的反应幅度（对1、3和10个AP序列的反应）和/或更快的动力学对有益突变进行分类，而160个AP引起的最大荧光变化没有显著减少。

在第二轮突变中合并了有益的突变（136个RCaMP1h和166个R-GECO1变体）(图1c、d). 根据与上述标准类似的标准，选择了两个新的基于mRuby的传感器jRCaMP1a和jRCaMP 1b，以及一个基于mApply的传感器jRGECO1a进行深入分析（直方图中的红色条图1c、d). 这些传感器彼此及其母结构具有相似的吸收和发射光谱，但在检测神经活动、动力学和其他生物物理特性（−图2,图2——图补充1–2,图2-源数据1).

图2含4种补充剂查看所有内容
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jRGECO1和jRCaMP1在分离神经元中的表现。

(一)RCaMP1h（9479个神经元，605孔）、R-GECO1（8988个神经元，539孔）、R-CaMP2（265个神经元，22孔）、jRGECO1a（383个神经元，26孔）、JRCaMP1（599个神经元，38孔）和jRCaMPlb（641个神经元，31孔）对一个动作电位的平均反应。(b)10个AP响应相同。(c–f)比较jRGECO1和jRCaMP1传感器以及其他红色GECI，作为AP数量的函数（颜色代码如一). (c)响应幅度，ΔF/F0. (d日)信噪比SNR，定义为基线以上的荧光信号峰值除以刺激前的信号标准偏差。(e（电子）)衰减时间减半。(（f）)一半上升时间。误差线对应于s.e.m（n=605口井，RCaMP1h；539，R-GECO1；22，R-CaMP2；38，jRCaMP1a；31，jRCa MP1b；26，jRGECO1a）。

https://doi.org/10.7554/eLife.12727.004
图2-源数据1

纯化的jRGECO1和jRCaMP1传感器的生物物理性质。

独立纯化蛋白质样品（材料和方法）的红色GECI生物物理性质总结，平均值±标准差（如有指示）。

https://doi.org/10.7554/eLife.12727.005

jRGECO1a是最灵敏的指标，ΔF/F是其8.5倍01AP刺激的振幅和比R-GECO1更快的上升时间(图2). 衰减时间和最大ΔF/F0振幅与R-GECO1相似。振幅提高和上升动力学加快与更紧密的表观钙亲和力有关(图2-源数据1). jRGECO1a的响应幅度和动力学与1–10个AP的短序列的GCaMP6f相当(Chen等人，2013b). 与其他基于mApple的指示器类似，jRGECO1a也能对蓝光进行光开关(图2——补充图3).

与其父传感器相比，jRCaMP1a和jRCaMP 1b也有了很大改进（检测1个AP刺激的灵敏度提高了24倍和13倍）(图2). jRCaMP1a比jRCaMP 1b具有更高的灵敏度和较慢的衰减动力学。jRCaMP1b具有更大的动态范围，在1-160 AP范围内没有饱和(图2c). jRCaMP1a和jRCaMP 1b的钙亲和力均高于RCaMP1(图2-源数据1). 然而，jRCaMP1a在培养神经元和溶液中的动态范围非常有限（分别为160±25%和320±10%，平均值±s.d.）。jRCaMP1a和jRCaMP 1b在钙结合状态下比jRGECO1a亮两倍(图2——补充图2). 与RCaMP1h类似，jRCaMP1 a和jRCaMP 1b不显示光开关(图2——补充图3). 这允许在共同表达ChR2和jRCaMP1a/b的神经元中进行独立的光刺激和成像(图2——图补充4).

小鼠V1中的红色蛋白质钙指示剂

我们测试了jRGECO1a、jRCaMP1a、JRCaMPlb及其父代指标和R-CaMP2(Inoue等人，2015年)在小鼠体内初级视皮层（V1）(Chen等人，2013b) (图3a,视频1). 大多数V1神经元可以被驱动到火动作电位以响应漂移光栅(Mrsic-Flogel等人，2007年;Niell和Stryker，2008年). V1神经元被腺相关病毒（AAV）感染，该病毒在人类突触蛋白1启动子（AAV-SYN1-red GECI变体）下表达一种红色GECI变体，并于16-180天后成像。使用可调谐超快激光器（Insight DS+；Spectra-Physics）在1040 nm或1100 nm下进行双光子激发。L2/3神经元胞浆内可见红色荧光。视觉刺激包括向对侧眼睛的八个方向呈现的移动光栅(Akerboom等人，2012年;Chen等人，2013b). 与单个神经元相对应的感兴趣区域显示了视觉刺激诱发的荧光瞬变，这些瞬变在试验中是稳定的，并可调节到刺激方向(图3b). 所有测试结构的方向调整都类似(图3-图补充1). 荧光瞬态跟踪感觉刺激的动力学(图3b–d,视频1). 基于应用的指标比基于mRuby的指标更准确地跟踪，因为它们的动力学更快（刺激结束后，R-GECO1，175个细胞的信号半衰变时间为300±22 ms；jRGECO1a，395个细胞为390±20 ms；R-CaMP2，310个细胞为330±16 ms；jRCaMP1a，347个细胞为640±30 ms；jRC aMP1b，95个细胞为500±45 ms；表达RCaMP1h的细胞活性较弱，难以可靠表征，平均值±标准偏差，材料和方法）。

图3含2种补充剂查看所有内容
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jRGECO1a和jRCaMP1a以及jRCaMP 1b在小鼠初级视觉皮层的表现。

(一)上图，实验示意图。底部，表达jRGECO1a的V1 L2/3细胞图像（左），以及根据神经元的首选方向（色调）和响应幅度（亮度）进行彩色编码的相同视野。(b)表达jRGECO1a（左）和jRCaMP1a（右）的三个L2/3神经元的踪迹示例。叠加单个试验（灰色）和5个试验的平均值（jRGECO1a和jRCaMP1a分别为蓝色和黑色）。八个光栅运动方向由箭头指示，如上图所示。首选的刺激是引起最大反应的方向。jRGECO1a记录道与面板中指示的单元格相对应一（另请参见视频1). (c)神经元对其首选刺激的平均反应（175个细胞，R-GECO1；310，R-CaMP2；395，jRGECO1a；347，jRCaMP1a；95，jRCa MP1b。对于jRGECOIa和jRCaMP 1a，n=4只小鼠，对于所有其他结构，n=3只小鼠。面板c-f基于相同的数据集(d日)用RCaMP1h、R-GECO1、R-CaMP2、jRGECaMP1a、jRCaMPlb和jRGECO1a转导的1 Hz漂移光栅驱动的神经元的傅里叶谱归一化为0 Hz振幅。1 Hz响应振幅的插入放大视图。(e（电子）)当表达不同的钙指标时，检测到对视觉刺激有反应的细胞分数（ANOVA测试，p<0.01）。与RCaMP1h相比，jRCaMP1a和jRCaMP 1b的这一分数分别高出8倍和6倍，与R-GECO1相比，jRGECO1a的这一比例高出60%（Wilcoxon秩和检验；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001）。误差条对应于s.e.m（26个视场，RCaMP1h；45，jRCaMP1a；31，jRCa MP1b；30，R-GECO1；40，jRGECO1a；33，R-CaMP2；23，GCaMP6s；29，GCaMP 6f）(（f）)首选刺激的ΔF/F振幅分布。右移曲线，如jRGECO1a vs.R-GECO1或jRCaMP1a/b vs.jRCaMP 1h，表明响应幅度增强（jRCaMPa 1a和jRCa MP1b vs.RCaMP1的75个百分位值分别为0.36和0.27 vs.0.18，jRGECO3a vs.GCaMP6f的0.66 vs.0.38）。（1210个细胞，R-GECO1；861，RCaMP1h；1733，R-CaMP2；1605，jRGECO1a；1981，jRCaMP1 a；971，jRCa MP1b；907，GCaMP6f；672，GCaMP 6s），颜色与e（电子）.

https://doi.org/10.7554/eLife.12727.010
视频1
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小鼠V1中的jRGECO1a L2/3功能成像。

将小鼠麻醉，并向对侧眼睛八个方向移动光栅。光栅显示4s（通过光栅传播方向上的箭头显示），然后显示4s空白。视野大小为250x250μm2，以15 Hz采集，并用5帧移动平均值进行滤波。

https://doi.org/10.7554/eLife.12727.013

我们使用标准指标比较了红色GECI的性能(Chen等人，2013b). 灵敏度的一个衡量标准是在视觉皮层中检测到的反应性神经元的比例(图3e). 对于jRCaMP1a和jRCaMP 1b，该分数比RCaMP1高8倍和6倍（p<10-6Wilcoxon秩和检验），与GCaMP6f相当。jRGECO1a的分数比R-GECO1高60%（p=0.012），比R-CaMP2高40%（p=0.03），比GCaMP6f高30%（p=0.1），但比GCaMP 6s低40%（p<10-4). 平均ΔF/F0在首选视觉刺激（材料和方法）下，与RCaMP1h相比，jRCaMP1和jRCaMP 1b的灵敏度也有所提高(图3f). 体内jRGECO1a反应大于其他红色GECI和GCaMP6f，但仍小于GCaMP6反应。

据报道，GCaMP的长期高表达会影响神经元健康(Tian等人，2009年;Chen等人，2013b). GCaMP6核填充细胞对感官刺激的反应减弱，衰变时间变慢，定向选择性降低(Tian等人，2009年;Chen等人，2013b). 我们在小鼠V1中表达了超过130天的jRGECO1a、jRCaMP1a和jRCaMP 1b。与GCaMP指标不同，未观察到核填充(图3-图补充2a)可能是由于红色GECI序列中的NES。红色GECI随着时间的推移表现出稳定的性能，尽管在表达180天后观察到jRCaMP1b的定向选择性略有下降(图3——补充图2b–d). 有趣的是，与GCaMP6相比，测试的红色GECI的长期表达似乎更稳定(Chen等人，2013b). 这些数据表明，jRGECO1a和jRCaMP1a/jRCaMP 1b可以用于需要长期表达的实验。

根据培养神经元的测量结果，视觉皮层中测得的jRGECO1a和jRCaMP1a反应小于预期值(图2a,图4c)并且低于GCaMP6生产的产品(Chen等人，2013b). 固定脑组织切片的高分辨率显微镜显示，用jRGECO1a标记但不用jRCaMP1a/b标记的神经元中有明亮的荧光点状。jRGECO1a点状与溶酶体标志物LAMP-1共同定位(图4-图补充1a) (Katayama等人，2008年). 在培养的神经元中也发现类似的点状突起，但数量较少（Wilcoxon秩和检验，p<0.001，图4——补充图1b). 在体内成像时，含有点状突起的ROI的基线荧光高达90%，但峰值ΔF/F较低0与周围的胞体（10个细胞和39个穿孔，图4-图补充1c). 这意味着溶酶体中荧光、无反应的jRGECO1a的积累降低了体内成像的信噪比。

图4含3种补充剂查看所有内容
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小鼠视觉皮层的联合成像和电生理学。

(一)同时从表达jRGECO1a（顶部，蓝色）和jRCaMP1a（底部，黑色）的神经元测量荧光动力学和峰值。每个脉冲的峰值数量显示在轨迹下方（单个峰值用星号表示）。左插图，一个用记录吸管（绿色）表达jRCaMP1a的神经元。(b)根据动作电位爆发进行缩放（对应于中的方框一). 顶部，jRGECO1a；底部，jRCaMP1a。(c)jRGECO1a荧光变化响应1个AP（顶部，来自11个细胞的199个峰，n=6只小鼠），jRCaMP1a荧光改变响应2个AP（底部，来自10个细胞的65个峰，n=5只小鼠）。蓝色（顶部）和黑色（底部）线是中间记录道。(d日)峰值荧光变化的分布与一个时间段内动作电位数量的关系（jRGECO1a，蓝框：199 1AP事件；2 AP:100 ms时间段内70个事件；3 AP:29125 ms；4 AP:34150 ms；5 AP:35175 ms；6 AP:22200 ms；7 AP:14225 ms；8 AP:21250 ms。jRCaMP1a，黑框：135 1 AP事件；2个AP：65150毫秒；3个AP：71200毫秒；4个AP：52250毫秒；5个AP：33300毫秒；6个AP：20、350毫秒；7个AP:14350毫秒；8个AP:11350毫秒）。每个框对应第25到75个第个分布的百分位数（q1和q三分别），晶须长度达到极限数据点或1.5我（问题3-问题1）。(e（电子）)jRGECO1a和jRCaMP1a的接收机工作特性（ROC）曲线，用于对1个和2个AP进行分类（jRGECO 1a:320个4s舱内无AP发射事件，jRCaMP 1a:274个5s舱内没有AP发射事件、1个AP和2个APs数据与d日). (（f）)检测灵敏度指数（d'）是一个时间段内峰值数量的函数（与中的参数相同）d–e日). (克)比较2 AP反应的jRGECO1a和jRCaMP1a的平均半上升（左）和衰减（右）时间。误差条对应于s.e.m。

https://doi.org/10.7554/生活.12727.014

我们还在V1成像的所有红色GECI体内图像中检测到绿色荧光（500–550 nm）。绿色荧光在900 nm激发下可见，但在1040 nm激发下不可见，这表明红色GECI至少分为两种。绿色荧光在细胞质中分布不均匀，没有钙离子报告(图4——补充图2,3a–b段). 事实上，在900 nm处分数荧光强度较大的jRGECO1a神经元表现出较低的响应幅度。jRGECO1a的较长表达时间增加了900nm处的相对强度，并与较低的峰值ΔF/F类似地相关0(图4补充图3c–dF检验，p值<0.002）。这些数据表明，哺乳动物大脑中的长期表达会降低红色GECI的敏感性。

与基于GFP的传感器相比，红色探针成像受激发光散射和荧光吸收的影响较小(图2——图补充1)可以在体内进行更深入的成像(Horton等人，2013年). 为了估计荧光如何随成像深度衰减，我们对第（L）5层细胞的顶端树突进行成像(图5a). 我们对作为深度函数测量的荧光信号进行了指数衰减拟合。红色GECI荧光衰减较慢（130±30μm；感染RCaMP1h、R-GECO1或jRGECO1a的小鼠中位值±s.d.，19个树突，n=3只，GCaMP6荧光（75±15μm；中位数±标准日，14个树突，n=2只感染GCaMP6s或GCaMP6的小鼠；p<0.0001，Wilcoxon秩和检验）(图5b).

图5
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使用红色GECI进行深层组织成像。

(一)左，测量示意图。在不同深度（FOVs 1-n）对L5神经元顶端树突进行成像。右，来自L5顶端树突（红点）的RCaMP1h荧光作为成像深度的函数。对于固定激发光，由于散射和吸收损失，亮度随成像深度而降低。衰减的特征是对信号拟合指数函数（实心黑线）。(b)从表示绿色（GCaMP6s或GCaMP6 f）或红色（RCaMP1h、jRCaMP1 a和jRGECO1a）GECI的枝晶测得的指数衰减系数。红色GECI信号衰减系数显著长于绿色GECI（Wilcoxon秩和检验，p<0.0001；红色GECI有3只小鼠和19个树突；绿色GECI有2只小鼠和14个树突）。(c)L6神经元，软脑膜下850μm。NTSR1-cre鼠标(Gong等人，2007年)感染了FLEX-SYN1-NES-jRCaMP1a AAV。(d日)来自三个示例L6神经元的示例轨迹。叠加单个试验（灰色）和5个试验的平均值（黑色）。八个光栅运动方向由箭头指示，如上图所示。

https://doi.org/10.7554/eLife.12727.018

这增强了成像深度，例如可以在L6中进行深层成像。我们通过将AAV-SYN1-FLEX-jRCaMP1a病毒注射到大鼠的视皮层来感染L6神经元NTSR1号机组-cre（L6特异性标记）小鼠(Gong等人，2007年). 感染四周后，我们可以检测到L6细胞（至软脑膜下方900μm处）对视觉刺激的定向调节性体细胞瞬变(图5c、d).

红色GECI的光谱特性允许与绿色GCaMP6指示剂一起进行双色成像。为了演示空间混合神经元突起的双色功能成像，将FLEX-SYN1-jRGECO1a AAV注射到L5神经元特异表达cre重组酶的小鼠株V1中（KJ18-cre）[Gerfen等人，2013年])将SYN1-GCaMP6s AAV注射到皮质LM中，LM将轴突发送到V1(安德曼等人，2011年;Oh等人，2014年). 使用1000 nm的单一激励源激励两个指示器。在V1的L1进行成像，可以可靠地检测到来自重叠轴突和树突的信号(图6,视频2). 我们注意到，当成像相对较大的细胞隔室，如细胞体或顶端树突时，红色GECI的漂白程度较低(视频1–2)，但薄轴突明显漂白。更大的隔室更宽容，因为成像分子的漂白和扩散之间的动态平衡。

图6
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小鼠视觉皮层的双色成像。

(一)钙饱和GCaMP6s、jRCaMP1a和jRGECO1a的双光子作用光谱。对纯化蛋白进行测量（材料和方法）。(b)KJ18-cre小鼠L1（软脑膜下50μm）L5顶端树突（红色）和LM轴突（绿色）的图像。(c)ΔF/F0轴突（绿色）和树突（红色）ROI的痕迹，如b(视频2). (d日)中虚线框对应的放大c.

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视频2
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小鼠V1 L1中轴突和顶端树突的双色成像。

jRGECO1a标记的L5树突顶端（红色）和GCaMP6s标记的LM轴突（绿色）在V1的L1（左侧）成像。ΔF/F0来自4个ROI的记录道(图6b)（右）。视野大小为40x40μm2以15 Hz采集并用5帧移动平均值进行滤波。

https://doi.org/10.7554/生活.12727.020

尖峰与荧光动力学的关系

我们通过结合成像和松散密封、细胞贴附记录来表征L2/3细胞中体细胞荧光变化和峰值之间的关系(图4a、b). 视觉刺激在线调整，以便记录每个细胞的大范围瞬时放电率。以高变焦进行成像，以检测具有最高信噪比的瞬态(Peron等人，2015年). jRGECO1a荧光变化允许相对稳健的活性检测(图4c、d). 单棘波检测准确率为82%（5%假阳性率，n=11个来自6只动物的细胞，199个棘波）(图4e、f). 在100 ms的时间段内检测到两个AP，准确率为96%（假阳性率为5%，70个事件）。jRCaMP1a的荧光变化较小，1AP和2AP事件的检出率分别为65%和80%（5%假阳性率，n=10个来自5只动物的细胞，分别为135和65个事件）。jRGECO1a的ΔF/F较高0在整个AP突发范围内，振幅和检测能力均优于jRCaMP1a(图4d–f). jRGECO1a也具有更快的动力学(图4g). jRGECO1a和jRCaMP1a的上升和下降时间分别与GCaMP6f和GCaMP6相似(Chen等人，2013b).

红色蛋白质钙指示剂果蝇斑马鱼和秀丽线虫

接下来，我们在苍蝇、斑马鱼和蠕虫中测试了红色GECI。红色GECI在转基因果蝇（R57C10-Gal4）中以泛神经方式表达。电刺激后，在幼体神经肌肉接头（NMJ）上拍摄到波顿(图7a、b; 材料和方法）(亨德尔等人，2008年). 与培养的神经元数据一致，我们发现jRGECO1a、jRCaMP1a和jRCaMP 1b变异体与其父代指标相比，单个AP敏感性显著提高（所有比较p<0.008；Wilcoxon秩和检验；图7c,图7-补充图1–2,图7——源数据1–2). jRGECO1a和jRCaMP1a的峰值响应幅度在1-5 Hz的刺激范围内优于GCaMP6s（单个APΔF/F0振幅分别为11.6±0.9%、8.6±0.5%和4.5±0.3%，平均值±s.e.m；图7c,图7-图补充3,图7-源数据3; jRGECO1a的12辆FOV；11，jRCaMP1a；12，GCaMP6f；n=所有构件7次飞行）。jRGECO1a的衰变动力学（160 Hz时的半衰变时间：0.42±0.02 s，平均值±s.e.m）与GCaMP6f相似（0.43±0.01 s；图7d,图7-图补充3,图7-源数据3). jRGECO1a的高灵敏度和快速动力学相结合，可检测高达10 Hz的刺激响应包络顶部的单个尖峰(图7b,图7-图补充1).

图7含3种补充剂查看所有内容
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中的图像活动果蝇带有红色GECI的NMJ boutouns幼虫。

(一)的示意图果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）测定。当对突触前神经束中的钙反应进行光学成像时，对分割的运动神经进行电刺激（绿色箭头）。(b)多个红色和绿色GECI对5 Hz刺激的响应瞬态（平均值±s.e.m.）（持续2 s）。jRGECO1a的反应幅度分别是GCaMP6f和GCaMP6的4倍和60%（p<10-4和p=0.01，Wilcoxon秩和检验），jRCaMP1a的响应幅度是GCaMP 6f的3倍（p=10-4），并且与GCaMP 6相似（jRGECIa的12只FOV；11只jRCaMP 1a；13只jRCa MP1b；12只GCaMP6-s；12只GC aMP6F；所有结构的n=7只苍蝇）(c)频率调谐响应的比较（峰值ΔF/F01、5、10、20、40、80和160 Hz刺激（2 s持续时间）下红色和绿色GECI的平均值±s.e.m.）。对于1Hz的刺激，jRGECO1a和jRCaMP1a的反应幅度比GCaMP6s和GCaMP6高2-3倍（p<0.001，Wilcoxon秩和检验），但对于20Hz和更高的刺激频率，则更低（jRGECO3a的12个FOV；10，R-GECO1；11，jRCaMP 1a；13，jRCa MP1b；10，RCaMP1；12，GCaMP 6f；对于R-GECO1，n=5只苍蝇；对于所有其他构造，n=7只苍蝇）(d日)160 Hz刺激下红色和绿色GECI的半衰变时间（平均值±s.e.m.）（FOV和苍蝇与c；***，p<0.001，Wilcoxon秩和检验）。

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图7-源数据1

结果摘要如所示图7-图补充1.

p值采用Wilcoxon秩和检验。

https://doi.org/10.7554/生活.12727.022
图7-源数据2

结果摘要如所示图7-图补充2.

p值采用Wilcoxon秩和检验。

https://doi.org/10.7554/eLife.12727.023
图7-源数据3

结果摘要如所示图7-图补充3.

p值采用Wilcoxon秩和检验。

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红色GECI也在elavl3/HuC启动子（elavl3:GECI）下的转基因斑马鱼中以泛神经方式表达。选择受精后3-4天三叉神经（Tg）神经元中表现出强表达的鱼类进行成像。Tg神经元通常是沉默的，对触摸会发出一个或几个棘波(道格拉斯等人，2008年). 短串电刺激脉冲（每个20 ms；1、5和10个20 Hz的脉冲），已知可刺激Tg神经元(Akerboom等人，2013年)，用于激发这些细胞的反应，并成像钙瞬变(图8a; 宽场单光子成像，材料和方法）。与培养的大鼠海马神经元、小鼠和果蝇jRGECO1a是本试验中检测到的最敏感的红色GECI：它对一个和五个脉冲的反应优于所有其他GECI，包括GCaMP6f和GCaMP6(图8b、c). 对于较高数量的刺激脉冲，jRGECO1a反应部分饱和。与母体指示剂RCaMP1h相比，jRCaMP1和jRCaMP 1b的灵敏度有了很大的提高，并且比R-CaMP2的灵敏度更高，其中jRCaMPa 1b的动力学速度比jRCa MP1快(图8d).

图8
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带有红色GECI的斑马鱼三叉神经细胞的成像活性。

(一)斑马鱼三叉神经细胞分析示意图。斑马鱼幼虫（受精后3-4天）瘫痪，包埋在琼脂糖中，并用电极刺激（20毫秒脉冲；20赫兹下的1、5和10脉冲；材料和方法）。(b)五脉冲刺激的反应瞬态（R-GECO1的平均值±s.e.m；n=5个fish；7，jRGECO1a；6，R-CaMP2；6，RCaMP1h；7，JRCaMP1 a；6、jRCaMPb；6，GCaMP6s；6，GC aMP6f）。jRCaMP1a和jRCaMP 1b的反应幅度分别是RCaMP1的7倍和8倍，jRGECO1a的反应幅度是R-CaMP2的4倍（Wilcoxon秩和检验，p<0.01）。(c)平均峰值ΔF/F0（与中的鱼相同b)响应于一个、五个和十个脉冲刺激。(d日)不同红色和绿色GECI的半衰变时间（10脉冲刺激，平均值±s.e.m.，与b；*，p<0.05；**，p<0.01，Wilcoxon秩和检验）。

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最后，在ASH和AWC神经元中检测红色GECI秀丽隐杆线虫，两种具有不同分级信号特性的感觉神经元(Akerboom等人，2012年;Kato等人，2014年). ASH神经元对钙增加的有害刺激作出反应，在与缓冲液交替的1秒脉冲中暴露于高渗甘油(图9a、b). 所有受试GECI的荧光初始增强，其中jRCaMP1b、jRCEGO1a和R-GECO1的荧光最强（ΔF/F0振幅~250%，图9b)然后是荧光信号的调制和缓慢衰减。jRGECO1a和jRCaMP1b在跟踪1s刺激方面表现最佳(图9b、c)而RCaMP1h、jRCaMP1 a和R-GECO1表现出较小的信号调制；R-CaMP2的微弱荧光使其用处不大。将具有张力活性并被气味抑制的AWC神经元暴露于92μM异戊醇与缓冲液交替作用的一分钟脉冲中(图9d). jRGECO1a和jRCaMP1b有力地检测到气味反应的三个已知成分：气味诱导的钙减少，去除气味的钙过量，以及恢复到基线水平(图9e). 对钙亲和力较弱的R-GECO1和RCaMP1h没有很好地检测到气味诱导的钙降低，而jRCaMP1在去除气味后截短了过冲量(图9d，e)动力学最慢(图9f). 总之，jRCaMP1b在检测分级钙信号方面表现最佳，而jRGECO1a在响应速度方面具有优势。

图9
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中的图像活动秀丽线虫带有红色GECI的ASH和AWC神经元。

(一)的示意图秀丽隐杆线虫成像分析。瘫痪的动物被限制在微流体装置中，鼻子暴露在流体通道中。刺激物（S）或缓冲物（B）的传递由来自控制通道C1和C2的交替侧流间接控制。(b)ASH神经元响应1M高渗甘油1s脉冲的平均荧光瞬变（蠕虫间平均值，jRGECO1a；8，jRCaMP1a；9，jRCaMP1b；8，R-GECO1；12，R-CaMP2；9，RCaMP1h）。(c)通过1 s甘油脉冲的信号调制的量化（所有2 s周期的平均峰谷差，除以缓冲液中前10 s的信号平均荧光（平均值±s.e.m，与b). 星号表示显著差异（Wilcoxon秩和检验；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001）。(d日)暴露于92µM异戊醇一分钟后，AWC神经元的平均荧光瞬变（n=19只蠕虫，针对jRGECO1a；7，jRCaMP1a；8，jRCa MP1b；15，R-GECO1；6，RcaMP1h）。Epochs 1–3在e（电子）和（f）. (e（电子）)第1阶段（臭气添加）、第2阶段（臭味去除）和第3阶段（恢复基线）AWC荧光变化的比较，与d日每个方框对应于第25到75个第个分布的百分位数（q1和q三分别），晶须长度达到极限数据点或1.5 我 (q个三-q个1)（f）添加气味后AWC中的衰变率比较（第1阶段），与d日.

https://doi.org/10.7554/eLife.12727.029

讨论

基于GFP的GECI是研究许多模型生物神经元活动的成熟工具。当前最先进的绿色GECI，如GCaMP6，具有足够的灵敏度来检测不同类型细胞的单动作电位，甚至检测单个突触的活动。它们可以针对特定的细胞类型和亚细胞隔室。红色GECI可以以类似的方式使用，并具有其他优势。例如，它们受组织散射和吸收的影响较小。此外，基于视紫红质的光遗传学工具在波长光谱的蓝色区域有大量吸收，这与GFP的激发光谱重叠。红色GECI可以在不刺激ChR2的情况下成像。我们开发了红色GECI，在检测神经活动的灵敏度方面与同类最佳绿色GECI竞争，从而缩小了红色和绿色GECI之间的显著性能差距。

新的基于mApple的jRGECO1a和基于mRuby的jRCaMP1a和jRCaMP 1b都比其上级指标提高了几倍。jRGECO1a的表现与GCaMP6指标类似。jRCaMP1a和jRCaMP 1b的灵敏度较低，但在蓝光照射后不显示光开关，这使得它们适合于结合钙成像和光遗传学的实验。jRCaMP1a和jRCaMP 1b也比jRGECO1a略红。这种改进的性能将使红色GECI得到广泛应用，例如，双色成像，其中绿色和红色GECI并行使用，以研究神经电路两个组件之间的关系。

红色GECI将用于全光神经生理学实验，特别是当神经回路的受刺激部分和成像部分之间存在空间重叠时。ChR2活化光谱与红色GECI激发光谱的大光谱分离(Akerboom等人，2013年)在使用红移光敏离子通道和绿色GECI产生串扰的情况下更可取(Rickgauer等人，2014年;Packer等人，2015年). 红色GECI的双光子吸收光谱峰值在1040 nm左右，这与成本效益高且功率大的光纤激光器的输出重叠。

红色GECI仍面临挑战。首先，与GCaMP6指标相比，所有测试的红色GECI在钙结合时的最大荧光变化较小（减少3-4倍）。这限制了红色GECI的整体动态范围。其次，红色GECI的吸收截面相对较低(图2——图补充1)进一步降低体内成像的可实现信噪比。第三，红色GECI表现出复杂的细胞内行为，如在小鼠大脑中长期表达的溶酶体（jRGECO1a）中的积累。所有测试的GECI中都存在绿色荧光，这表明存在多种蛋白质，其中一些不会产生功能信号(图4——补充图2–三). 这些问题似乎与传感器的红色荧光蛋白成分有关（例如，参见，补充文件1在里面蔡等，2013). 因此，设计红色GECI以产生较少的非生产性荧光可能需要更换或重新设计RFP本身(Moore等人，2012年)，这是我们计划在未来追求的方向。

材料和方法

所有手术和实验程序均符合HHMI Janelia研究校园机构动物护理和使用委员会和机构生物安全委员会批准的协议。

神经培养屏

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GCaMP指标自然被排除在细胞核之外，可能是由于一个隐秘的核排除序列（NES）基序。这就产生了典型的环形标记。RCaMP和R-GECO都在整个细胞中表达，包括细胞核。GECI反应在细胞质中比在细胞核中更大、更快（未公布的数据）。因此，我们包含了NES基序，以限制细胞质的表达。对于R-CaMP2，源自R-CaMP1.07(Ohkura等人，2012年;Inoue等人，2015年)，看来C端子F2A序列作为NES起作用，因此没有添加额外的NES。

使用不匹配的寡核苷酸制造突变的红色GECI，并使用基因组装将其克隆到表达载体中。表达载体包含用于神经特异性表达的人类突触蛋白-1（SYN1）启动子、核输出信号（N末端MLQNELALKLAGLDINKTG，源自cAMP依赖性蛋白激酶抑制剂α亚单位）、红色GECI变体、内部核糖体进入位点、核靶向GFP、，和土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件（WPRE）以增加表达。氨基酸位置在jRGECO1和jRCaMP1变体中编号(补充文件1–2)从GGSHHHHGHGMASM开始。。。(1–14...). NES位置不包括在编号中，以符合脚手架的公布编号。

使用Lonza Nucleofector系统（P3 primary Cell 96-well Kit，Lonza，Walkersville，MD）通过电穿孔转染大鼠初级海马神经元（P0）后，表达红色GECI变体。将转染的神经元置于96个玻璃底板（MatTek，Ashland，MA）中，并按所述进行培养(Wardill等人，2013年).

在刺激和成像方面，谷氨酸和GABA受体拮抗剂抑制了突触传递，使钙的变化完全依赖于电压敏感性钙通道的开放。如前所述，通过场刺激诱发AP（83 Hz）(Wardill等人，2013年)除了96周的改良电极板的刺激和成像外。照明由暖白色LED和TxRed（样品平面处7mW，激发：540–580 nm；二向色：585 nm长通；发射：593–668 nm）和GFP（激发：450–490 nm；双向色：495 nm长通过；发射：500–550 nm）滤波器组提供。成像条件和分析与之前的实验类似(Chen等人，2013b). 用于表达jRGECO1a的神经元的光开关测量(图2——图补充4)，我们通过使用蓝色LED并用561 nm短程滤波器取代绿色激发滤波器，增加了蓝光刺激（高达33 mW）（纽约州罗切斯特市塞姆洛克）。

蛋白质表达和纯化

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对传感器进行纯化，并按照所述进行钙滴定(Chen等人，2013b). 在570nm（5nm带通）的激发和600nm（5nm带通）的发射下测量红色荧光。对于k远离的测量时，将100µM钙中的蛋白质样品与10 mM EGTA溶液在一个停流装置（英国应用光物理）中快速混合，该停流装置与带有560 nm激发/580 nm发射滤波器（瓦里安，20 nm带通）的荧光计耦合。在室温下用50 mM MOPS pH 7.2和100 mM KCl缓冲溶液。荧光衰减符合单指数曲线。按说明测定pKa(Chen等人，2013b). 发色团消光系数（ε阿波罗和ε坐)按照说明进行测量(Akerboom等人，2012年). 除另有说明外，对于独立纯化的蛋白质样品，数值为平均值±标准偏差。

纯化蛋白质的光谱

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纯化的蛋白质在含有10 mM CaEGTA（钙缓冲液）或10 mM EGTA（EGTA缓冲液）的30 mM MOPS、100 mM KCl、pH 7.2（钙校准缓冲液C3008MP，ThermoFisher，Waltham，MA）中进行表征。吸收光谱在UV/VIS光谱仪上进行（Lambda 35，PerkinElmer，Waltham，MA）。在带有5 nm狭缝的LS-55荧光仪（Perkin-Elmer）上测量荧光发射和激发光谱，激发/发射波长为555 nm/600 nm。使用Quantaurus-QY积分球光谱仪（日本滨松C11374型）测量绝对量子产率。Dim解决方案(例如在Quantaurus上无法测量EGTA缓冲液中的jRGECO1a或GCaMP6s），因此，与参考荧光团mCherry（测量的绝对QY为0.22）相比，通过UV/VIS光谱仪中测量的吸收和荧光计中测量的积分荧光来确定相对量子产率或荧光素（在pH 9.5硼酸盐缓冲液中QY=0.93）用于红色或绿色GECI。假设RGECO变体的变性消光系数与变性mCherry（37000 M）相同，则使用碱变性法测定RGECO变异体的消光系数-1厘米-1455 nm，pH 13(Zhao等人，2011年). 对于RCaMP变体，变性吸收光谱因383 nm处的吸收峰而变得复杂，该吸收峰首先在pH 11.5时随着pH值的增加而出现，并且是不可逆形成的。因此，对于RCaMP变体，我们使用荧光相关光谱（FCS），如下所述，通过计数荧光团来量化浓度(Haustein和Schwille，2003年)，使用mCherry作为浓度参考。在10–100 nM蛋白质溶液上，在低激光功率（1–3 mW）下使用1060 nM激发进行FCS，以确定荧光信号的自相关函数G（τ）。光束体积内荧光团的数量从1/G（0）开始计算。束体积是从已知浓度下对参考蛋白mCherry的相同FCS测量中发现的。为了一致性，使用这两种方法测量了jRGECO变体，结果相似。

光开关和光教学的宽场荧光测量

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在辛醇中分离纯化蛋白的水滴上进行了测量(Kremers等人，2009年)夹在两张盖玻片之间。我们使用了一个带有20x0.8NA空气物镜（蔡司）的外照射显微镜（AxioImager，德国蔡司公司）。对于光切换实验，使用光束组合二向色和计算机控制的快门确定的曝光序列，在488nm（Sapphire 488，Coherent，Santa Clara，CA）和561nm（Sapphire 561，Coherent）向显微镜提供共线激光激发。物镜收集的荧光通过二向色和带通滤波器（Di02-R561和625/90，Semrock），并由光纤耦合雪崩光电二极管（SPCM-AQRH14，Pacer，UK）检测。在物镜输出处测量激光功率，并使用CCD相机（CoolSnap EZ，Photometrics，Tucson，AZ）成像和测量焦平面中的激光束面积，以确定激光强度。利用上述设置和561 nm激光激发（4.2 W/cm）进行光漂白实验2或Hg灯激励（550/25带通，Semrock），产生5.6 W/cm2在样品上。

双光子光谱学

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如前所述，进行了双光子光谱和FCS(Akerboom等人，2013年). 简而言之，在倒置显微镜上使用60x1.2 NA水浸物镜（Olympus）测量盖玻片底皿中的蛋白质溶液。700–1500 nm范围内的近红外激光激发由钛宝石激光器（变色龙Ultra II，相干）或OPO（变色龙紧凑OPO，相干）提供。重叠范围1000–1080 nm用于连接两个不同激发源产生的荧光光谱。钛宝石光束经过长程滤波（715/LP，Semrock），以去除钛宝石激光腔发出的污染可见红色自发辐射。使用单个二向色反射镜（675DCSPXR、Omega、Brattleboro、VT）将Ti:Sapphire或OPO光束带到物镜。用雪崩光电二极管检测器（SPCM_AQRH-14，Excelitas，Waltham MA）检测从蛋白质样品中采集的荧光，经二色镜、720/SP短程和625/90带通滤波器（Semrock）过滤。探测器的输出脉冲被送入自相关器（Flex03LQ，Correlator.com，Bridgewater，NJ），该系统在计算机控制下运行，具有自动数据采集功能。

根据在低激光功率（0.5 mW）下获得的1微摩尔蛋白质溶液的激发光谱确定了双光子作用光谱，并将这些光谱与在相同条件下测量的参考染料荧光素和罗丹明B的光谱进行了比较，我们使用了已发表的双光子截面数据(Xu和Webb，1996年;Makarov等人，2008年)测定红色GECI的作用光谱。该装置还用于执行FCS，以测量低激光功率下的生色团浓度和双光子峰值亮度(Mütze等人，2012年)在高激光功率下。峰值亮度是实验确定的给定聚焦几何形状下每个分子的最大荧光速率，是对荧光团在双光子激发下的亮度和光稳定性的测量。为了确定峰值亮度，在1070 nM或1140 nM处以增加的激光功率照射钙缓冲液中的20–100 nM蛋白质溶液，其中在每个功率设置下，平均荧光速率F和激光束体积中荧光团N的平均数量由FCS确定(Mütze等人，2012年). 然后，随着激光功率的增加，从数量F/N的最大值中发现了双光子峰值亮度。

双光子漂白测量

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使用共振galvo扫描2光子显微镜（MPM-200，Thorlabs，Newton，NJ）从分离的蛋白质水滴中获得绿色和红色GECI的双光子漂白测量。显微镜配备有40x 1.15 NA水浸物镜（尼康）、一级二向色器（680–1600 nm长通滤光片，Thorlabs）和二级二向色器（FF562-Di03，Semrock），二级二向色器带有绿色（530/43，Semrock）和红色（605/70，Chroma，Bellows Falls，VT）滤光片，每个滤光片后面都有GaAsP PMT（H7422PA-40，滨松）。红色GECI的激光激发波长为1000 nm或1070 nm，GCaMP6的激光激发频率为940 nm。为了完全漂白蛋白液滴（厚度为5μm），重复进行z堆叠。光束扫描面积为160μm x 160μm，扫描速度为8帧/秒。在整个测量过程中，光强保持不变(图2——补充图2). 然而，由于使用不同的波长，这些测量中的激光光斑大小，因此强度分布略有不同。

AAV介导的GECI在小鼠V1神经元中的表达

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用于产生AAV的构建物包括pGP-AAV-SYN1-red GECI-WPRE和cre-recombinase-activated构建物pGP-ADV-FLEX-SYN1-red GECI-WPRE。病毒（滴度：~0.7-3x1013基因组/ml，R-CaMP2启动子为CaMKII）通过一个变薄的颅骨缓慢注射（5分钟内25–30 nl）到初级视皮层（1–2个不同深度的注射部位；lambda缝合线外侧2.7 mm，前方0.2 mm；L2/3成像的深度为250μm，L4成像的深度分别为250和450μm，而L5成像的深度则分别为500μm和650μm和900μm）。

颅骨窗植入术

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注射病毒后16至180天，用异氟醚对小鼠进行麻醉（3%用于诱导，1.5-2%用于手术），并在V1以上（围绕注射部位）进行2-3 mm圆形开颅手术。开颅手术用1%琼脂糖覆盖（超纯琼脂糖，ThermoFisher）。将一个圆形的3mm玻璃盖玻片（#1厚度，华纳仪器公司，哈姆登，CT）粘在颅骨上，以减少暴露的大脑的运动(Huber等人，2012年). 使用黑色牙科水泥（伊利诺伊州惠林市现代Ortho-Jet，Land dental，Contemporary Ortho-Jet）将一个定制钛合金头桩固定在颅骨上。为了同时进行成像和细胞贴附记录，暴露的大脑覆盖了厚厚的1%琼脂糖层，部分覆盖了D形盖玻片。然后将动物置于显微镜下的温暖毯子上（37°C），用0.5%异氟醚麻醉，并用氯丙噻嗪（20–40μl，0.33 mg/ml，i.m.）镇静(Niell和Stryker，2008年).

V1成像

请求详细协议

使用配备共振扫描仪的定制双光子显微镜进行成像。光源为Insight DS Dual 120飞秒脉冲激光器（Spectra-Physics，Santa Clara，CA），jRGECO1a和jRCaMP1指示器分别以1040 nm和1100 nm的波长运行。目标是一个16x0.8NA水浸镜头（日本尼康）。使用ScanImage 5（vidriotechnologies.com）获取图像(Pologruto等人，2003年). 对于L2/3、L4和L5成像，功能图像（512x512像素，250x250μm2)采集频率为15 Hz。L2/3、L4和L5成像物镜前孔径的典型激光功率分别为15–60、30–75和50–100 mW。对于L6成像，功能图像（512x512像素，165x165μm2或125x125μm2)采集频率为5 Hz。物镜前孔径处的激光功率为100–150 mW。

对于双色成像，我们使用了绿色和红色检测通道（分别为525/50 nm和600/60 nm滤波器，由565 nm LP二向色镜Chroma隔开）。红色信号进入绿色通道的穿透可以忽略不计，而绿色信号进入红色通道的穿透通过线性解混进行校正。

视觉刺激

请求详细协议

使用心理物理工具箱生成移动光栅刺激(布雷纳德，1997年;佩利，1997年)MATLAB（马萨诸塞州纳蒂克市Mathworks）。每个刺激试验包括4s空白期（平均亮度下的均匀灰度），然后是4s漂移正弦光栅（0.05周期/度，1 Hz时间频率）。使用了八个漂移方向，以45°分隔，每个方向记录了5个试验，每个记录会话总共有40个刺激试验（320 s记录时间）。光栅配有液晶显示器（30 x 40厘米），放置在小鼠右眼中心前25厘米处。监视器在水平方向上与老鼠的眼睛成±38°角，在垂直方向上与眼睛成±31°角。用于细胞连接记录的实验(图4)，移液管的使用需要在右眼前方10厘米处放置一个较小的液晶显示器（12 x 16厘米）。在同步成像和电生理过程中，重复播放最佳光栅刺激，但在线调整刺激光栅的对比度以记录可变尖峰频率。为了将红色检测通道中的刺激污染降至最低，在小鼠眼睛前面放置了一个绿色有机玻璃过滤器（500–555 nm FWHM）。

V1功能成像分析

请求详细协议

表达GECI小鼠16至64天的数据用于以下分析(图3c–f). 使用ImageJ中的TurboReg插件校正成像平面中的机械漂移(Thévenaz等人，1998年). 所有剩余分析均在MATLAB中进行。使用半自动算法选择与可识别细胞体相对应的感兴趣区域（ROI）(Akerboom等人，2012年;Chen等人，2013b). 根据神经元的外观，将环形或圆形ROI放置在每个细胞的细胞溶质区域。校正神经膜污染后，通过平均ROI内的所有像素来测量荧光时间进程(Kerlin等人，2010年). 神经纤毛信号F神经纤维（t） 通过平均细胞中心20μm圆形区域内所有像素的信号（不包括所有体细胞）来测量每个细胞周围的信号。细胞体的荧光信号估计为

F类ce（电子）我我_t吨第页u个e（电子） (t吨) = F类ce（电子）我我_米e（电子）一秒u个第页e（电子）d日(t吨) - 第页.F类n个e（电子）u个第页o（o）第页我我(t吨),

r=0.7。Neuropil校正仅适用于基线荧光（F0)信号比周围神经膜信号强3%以上；其他细胞（约15-20%）被排除在分析之外，因为F0无法可靠估计。神经膜校正后，ΔF/F0每个试验的计算公式为（F-F0)/如果0，其中F0在光栅刺激开始前1s内取平均值。视觉反应神经元被定义为具有ΔF/F的细胞0>在至少一个刺激周期内为0.05，在空白和八个方向周期内使用方差分析（p<0.01）。

我们计算了首选刺激结束后荧光的衰减时间。对于每个细胞，我们平均了五次试验的反应；从刺激开始前1s开始计算基线荧光和标准偏差。仅分析在刺激的最后1秒内具有荧光响应峰值的细胞，该峰值为基线标准偏差的4倍以上。通过线性插值计算每条记录道达到其峰值一半所需的时间（减去基线荧光）。使用相同的细胞绘制平均反应图3c由于每个细胞的反应时间稍有不同，这取决于其感受野结构，因此每个轨迹都会移动以对齐最大值。为了便于显示，使用3个样本的移动平均核对轨迹进行平滑处理。

定向选择性指数（OSI，图3-图补充2)是为视觉反应细胞计算的(Niell和Stryker，2008年). 首先，首选方向（θ首选)被确定为激发最大反应的刺激物。通过测量平均ΔF/F来构建定向调谐曲线0，每个方向的刺激期平均值。然后，我们用以θ为中心的两个高斯数之和拟合调谐曲线首选和θ首选+π/2，宽度σ，振幅A1和A2，以及恒定基线B。OSI定义为OSI=（R首选-R（右）正交的)/（右首选+R（右）正交的)，其中R首选和R正交的是首选（θpref）和正交方向（θ首选+π/2）。

V1的同时电生理学和功能成像

请求详细的协议

使用玻璃移液管（约7–12 MΩ）进行体内细胞附着记录，移液管内填充（单位：mM）：125 NaCl、5 KCl、10葡萄糖、10 HEPES、2 CaCl2、2 MgSO4和0.1 Alexa Fluor 488；pH值7.4）。使用AxoPatch 200B放大器（加利福尼亚州桑尼维尔的分子器件公司）放大信号，在5 kHz下过滤，在10 kHz下数字化。使用电流钳模式记录峰值。ScanImage 5的帧触发脉冲也被记录下来，并离线用于将各个帧与电生理记录同步。建立低电阻密封（15–50 MΩ）后，使用记录的尖峰快速优化单个神经元的刺激方向。以可变对比度重复最佳光栅刺激以获得一定范围的尖峰速率。

图像（512x512像素，通常为40x40μm2)分别以30 Hz和15 Hz的频率采集jRGECO1a和jRCaMP1a。将环形ROI放置在细胞的胞质区域，并去除神经膜污染。量化单个AP检测的保真度(图4e)对于jRGECO1a和jRCaMP1a，我们分别在100和150 ms的时间窗内，识别出与其他AP隔离的单个AP事件>1 s，识别出2个AP事件，与其他AP分离的时间窗>1 s。从没有AP的时段中提取噪声痕迹。F类0数值计算为第一次AP前10帧的平均值，以及峰值ΔF/F0计算为ΔF/F的最大值0第一次尖峰放电后的轨迹，或最大ΔF/F0噪波轨迹的噪波值。对于d-素数计算和接收器工作特性（ROC）曲线，通过平均响应轨迹来计算各种AP的响应模板。通过减去平均值并对向量进行归一化，从模板中计算出单位向量。测量的n-AP响应被投影到单位向量上，其中n表示时间段中的AP数量以及噪声轨迹(Chen等人，2013b). 将响应和噪声轨迹投影到酉响应模板上的标量结果用于计算d-素数和ROC曲线。

激发AP的时间窗口随峰值数量和GECI而变化（jRGECO1a:2AP为100 ms，每增加一个AP增加25 ms，8AP最多增加250 ms；jRCaMP1a:2AP为150 ms，每多增加一个AP增加50 ms，6-8个AP最多增加350 ms）。选择时间段来反映大量AP的钙信号积累（较慢的jRCaMP1a/b较长，较快的jRGECO1a较短）。根据2个AP反应计算一半上升和下降时间。只使用了孤立的反应（在记录的峰值前2秒没有APs）。对每条轨迹拟合指数衰减曲线。只选择了拟合误差较小的记录道（两个指示器都有16个记录道）。

固定组织分析和免疫染色

请求详细协议

用异氟醚对小鼠进行深度麻醉，并经心灌注10 ml 1X Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS，ThermoFisher），然后在0.1 M磷酸盐缓冲液中灌注50 ml 4%多聚甲醛。灌注后，取下大脑并在4°C下过夜固定。将大脑嵌入DPBS中5%的琼脂糖中，并用振动棒切割成50µm厚的冠状切片（德国莱卡VT 1200S）。因为DPBS含有饱和钙（0.9 mM），所以红色GECI亮度最大。用Vectashield安装介质覆盖切片（H-1400，Vector实验室）。共聚焦图像（LSM 710，蔡司）是使用20x 0.8 NA空气物镜采集的。使用共聚焦显微镜的λ扫描模式对发射光谱进行表征，并对背景发射进行校正。

对于LAMP-1免疫染色，如上所述对脑进行灌注、固定（固定后4小时，室温）和切片。将切片浸泡并用DPBS清洗两次，然后在室温下用封闭缓冲液（2%BSA，0.4%Triton X-100 in DPBS）封闭1小时。然后在4°C下将切片在与Alexa Fluor 488（克隆1D4B，在德克萨斯州达拉斯Santa Cruz Biotechnology的封闭缓冲液中稀释1:200）偶联的抗LAMP-1抗体中培养过夜，然后用0.1%Triton X-100在DPBS中清洗3次，然后用DPBS再次清洗。最后，用Vectashield防褪色安装介质（H-1500，Vector laboratories，Burlingame，CA）安装并覆盖各节。

果蝇NMJ成像

请求详细协议

我们做了w个1118;; PBac公司{20XUAS-IVS-GECI-p10}VK00005转基因苍蝇并与之杂交w个1118;; VK00020中的R57C10-Gal4，VK00040中的R47C10-Gal泛神经驱动线。改进的表达可以降低激发光剂量，并有助于防止光漂白。NMJ分析与之前使用的类似(Chen等人，2013b). 简单地说，主动爬行的雌性3第个在最小光照强度下解剖幼虫。在HL-6盐水中对A3-A5节段肌肉13上的Ib型Bouton进行宽视野成像，同时使用定制刺激器驱动的抽吸电极对相应的轴突进行电刺激。成像期间监测温度和pH值。使用汞灯（X-CITE exacte，Excelitas）光源进行激发，在物镜前孔处使用小于5 mW的功率。校准光强度，以便在每次试验期间未检测到明显的光漂白。jRGECO1和jRCaMP1成像滤波器为：激发：543/22 nm；二向色性：562nm；发射：593/40nm。发射的光收集在EMCCD上，以30 fps的速度冷却至-70°C。数据在MATLAB（MathWorks）中进行分析。

斑马鱼三叉神经细胞成像

请求详细协议

米特法−/−（珍珠层）斑马鱼在标准条件下保持在28°C和14:10小时的光：暗循环。在（近）泛神经元elavl3/HuC启动子（elavl3:GECI）的控制下，向胚胎（1-2细胞期）注射编码红色GECI变体的20 ng/μl DNA质粒，并在E3培养基中用0.025%酚红稀释40 ng/μl Tol2转座酶mRNA。受精后第三天和第四天，在分离的三叉神经细胞中有表达的胚胎用1mg/ml的α-银环蛇毒素处理30分钟，以阻止尾部运动。将幼虫侧向安装在1.5%的低熔点琼脂糖中，并使用带有20×，NA=1物镜（日本奥林巴斯）和sCMOS相机（哈马松Orca Flash 4）的显微镜进行成像。使用位于浴缸内的两个网状电极和一个刺激器（Grass SD9，Warwick，RI），施加1、5和10系列场刺激（每个20 ms；20 Hz）。对刺激电压进行校准，以在表达GCaMP6f的神经元中引发对单个脉冲的可识别反应。三叉神经细胞中的一个棘突之前已经被证明足以引起尾巴运动(道格拉斯等人，2008年). 使用Hamamatsu HCImage（4.2.5.0）软件处理图像采集和刺激控制。人工选择ROI，并使用MATLAB（MathWorks）分析数据。

秀丽隐杆线虫ASH和AWC神经元成像

请求详细协议

红色GECI表达于秀丽线虫ASH和AWC感觉神经元sra-6型和街道-2启动子。动物被限制在定制的微流体室中(Chronis等人，2007年)S基本缓冲区(布伦纳，1974年)，并在数据采集期间使用1mM盐酸四咪唑（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）麻痹，以减少运动。在ASH成像中，以1秒的间隔将1 M甘油交替注入动物的鼻子，持续4分钟，如(Kato等人，2014年). 对于AWC成像，在缓冲液中暴露一分钟后，输送92μM异戊醇一分钟。用固态灯（Lumencor SOLA-LE，Beaverton，OR，560/40 nm激发滤波器）照亮蠕虫，并使用40x，NA=1.4物镜（蔡司）和EMCCD相机（Andor iXon3，Metamorph Software，250 x 140像素，覆盖104μm x 58μm）以10 fps的速度采集荧光图像（630/75 nm发射滤波器）。

试剂分配

请求详细协议

DNA构建物、AAV颗粒和果蝇带有红色GECI的变体存放在Addgene进行分发(网址：http://www.addgene.org)宾夕法尼亚大学矢量核心(http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore)和布卢明顿果蝇库存中心(http://flystocks.bio.indiana.edu)分别是。

细胞附加记录和功能成像数据保存在CRCNS.org（doi:10.6080/K0W37T87）。

工具书类

    1. 布伦纳S
    (1974)
    秀丽隐杆线虫的遗传学研究
    遗传学 77:71–94.

文章和作者信息

作者详细信息

  1. 霍德·达纳

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    HD、概念和设计、数据采集、数据分析和解释、起草或修改文章
    用于通信
    danah@janelia.hhmi.org
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  2. 波阿斯·莫哈尔

    1. 美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    2. 以色列Rehovot魏兹曼科学研究所
    贡献
    BM，数据采集
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  3. 孙毅

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    YS、概念和设计、数据采集、数据分析和解释、起草或修改文章
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  4. 苏加塔·纳拉扬

    美国阿什本霍华德休斯医学院Janelia研究院
    贡献
    SN，数据采集，数据分析和解释，起草或修改文章
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  5. 安德鲁·戈杜斯

    美国纽约洛克菲勒大学霍华德·休斯医学院
    贡献
    AG，概念和设计，数据采集，数据分析和解释，起草或修改文章
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  6. 杰里米·帕·哈塞曼

    美国阿什本霍华德休斯医学院Janelia研究院
    贡献
    JPH，执行蛋白质分析
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  7. 盖塔洪·泽盖（Getahun Tsegaye）

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    GT，执行蛋白质分析
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  8. 格雷厄姆·T·霍尔特

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    GTH，执行蛋白质分析
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  9. 胡美仪

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    AH，数据采集
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  10. 迪皮卡·瓦尔皮塔

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    DW，数据采集
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  11. 罗纳克·帕特尔

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    RP、数据采集、数据分析和解释
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  12. 约翰·麦克林

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    JJM，概念和设计，数据采集，数据分析和解释，起草或修订文章
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  13. 科妮莉亚·巴格曼

    美国纽约洛克菲勒大学霍华德·休斯医学院
    贡献
    CIB，概念和设计，数据分析和解释，起草或修改文章
    竞争性利益
    未申报竞争利益。
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-8484-0618

  14. 米沙·B·阿伦斯

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    MBA，概念与设计，数据分析与解释，起草或修改文章
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-3457-4462

  15. 埃里克·施赖特

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    ERS、数据采集、数据分析和解释、起草或修订条款
    竞争性利益
    ERS:DSK、ERS、LLL和KS已就与红色GECI变体相关的材料和方法申请专利（申请号US 14/974483）。

  16. 维维克·贾亚拉曼

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    VJ，概念与设计，数据分析与解释，起草或修改文章
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益。

  17. 洛伦·卢格

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    LLL，概念与设计，数据分析与解释，起草或修改文章
    竞争性利益
    LLL:DSK、ERS、LLL和KS已就与红色GECI变体相关的材料和方法申请专利（申请号US 14/974483）。

  18. 卡罗·斯弗波达

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    KS，概念和设计，数据分析和解释，起草或修改文章
    竞争性利益
    KS:DSK、ERS、LLL和KS已就与红色GECI变体相关的材料和方法申请专利（申请号US 14/974483）。
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-6670-7362

  19. 道格拉斯·S·金

    美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院
    贡献
    DSK、概念和设计、数据采集、数据分析和解释、起草或修订文章
    用于通信
    kimd@janelia.hhmi.org
    竞争性利益
    DSK:DSK、ERS、LLL和KS已就与红色GECI变体相关的材料和方法申请专利（申请号US 14/974483）。
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0001-029-314X

基金

霍华德·休斯医学研究所

  • 霍德·达纳
  • 波阿斯·莫哈尔
  • 孙毅
  • 苏加塔·纳拉扬
  • 安德鲁·戈杜斯
  • 杰里米·帕·哈塞曼
  • 格塔洪·泽加耶
  • 格雷厄姆·T·霍尔特
  • 胡美仪
  • 迪皮卡·瓦尔皮塔
  • 罗纳克·帕特尔
  • 约翰·麦克林
  • 科妮莉亚·巴格曼
  • 米沙·B·阿伦斯
  • 埃里克·施赖特
  • 维维克·贾亚拉曼
  • 洛伦·卢格
  • 卡罗·斯弗波达
  • 道格拉斯·S·金

资助者不参与研究设计、数据收集和解释，也不参与将研究成果提交出版的决定。

致谢

我们感谢R Campbell就红色GECI溶酶体积聚提供的建议，感谢J Akerboom提供的试剂，感谢K Ritola、J A Rouchard、S Coffman、B Sharp和K Hibbard提供的技术援助。

伦理学

动物实验：所有实验方案均按照美国国立卫生研究院动物研究指南进行，并经Janelia研究园区动物护理和使用委员会批准（方案13-95）。

版本历史记录

  1. 收到日期：2015年11月1日
  2. 接受日期：2016年3月24日
  3. 已出版的接受手稿：2016年3月24日（第1版）
  4. 发布的记录版本：2016年4月26日（第2版）

版权

©2016，Dana等人。

本文根据知识共享署名许可协议，它允许不受限制的使用和重新分配，前提是原始作者和来源都是可信的。

韵律学

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  1. 霍德·达纳
  2. 波阿斯·莫哈尔
  3. 孙怡
  4. 苏加塔·纳拉扬
  5. 安德鲁·戈杜斯
  6. 杰里米·帕·哈塞曼
  7. 盖塔洪·泽盖（Getahun Tsegaye）
  8. 格雷厄姆·T·霍尔特
  9. 胡美仪
  10. 迪皮卡·瓦尔皮塔
  11. 罗纳克·帕特尔
  12. 约翰·麦克林
  13. 科妮莉亚·巴格曼
  14. 米沙·B·阿伦斯
  15. 埃里克·R·施雷特
  16. 维维克·贾亚拉曼
  17. 洛伦·卢格
  18. 卡罗·斯弗波达
  19. 道格拉斯·S·金
(2016)
用于神经活动成像的敏感红蛋白钙指示剂
电子生活 5：e12727。
https://doi.org/10.7554/eLife.12727

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