1. 细胞生物学
  2. 神经科学

局部和全局对神经元和胶质细胞蛋白质周转的影响

  1. 阿琳·Rörrbaum
  2. 丽莎·科钦
  3. 朱利安·德兰格  是通讯作者
  4. 埃林·舒曼  是通讯作者
  1. 德国马克斯·普朗克大脑研究所
  2. 德国法兰克福歌德大学
  3. 德国马克斯·普朗克生物物理研究所
https://doi.org/10.7554/eLife.34202
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  1. Aline Rörrbaum公司
  2. 丽莎·科钦
  3. 朱利安·德兰格
  4. 埃林·舒曼
(2018)
局部和全局对神经元和胶质细胞蛋白质周转的影响
电子生活 7：e34202。
https://doi.org/10.7554/eLife.34202
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6数字和4其他文件

数字

图1含4种补充剂
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神经元中的蛋白质周转。

(A类)通过动态SILAC方法结合MS测定蛋白质半衰期。细胞在含有天然氨基酸（‘轻’）的培养基中培养18–19天，然后切换到含有重同位素标记精氨酸（R10）和赖氨酸（K8）的培养液。改变培养基后，“重”氨基酸被并入新合成的蛋白质中，而“轻”预先存在的蛋白质部分则随着时间的推移而腐烂。在更换培养基后1、3和7天以及更换培养基前（t0)新合成的蛋白质和预先存在的蛋白质的组分由质谱测定。蛋白质半衰期是根据预先存在蛋白质组分随时间的一级指数拟合确定的。(B类)初级海马培养物中蛋白质半衰期的分布范围为<1天到>20天。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.002
图1——图补充1
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动态SILAC样本的数据处理工作流。

解释动态SILAC样品质谱数据的数据处理、过滤和分析的流程图。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.003
图1—图补充2
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营业额估算的准确性。

蛋白质半衰期是根据预先存在的蛋白质分数随时间的线性拟合来确定的。显示了每个蛋白质组的速率常数k（拟合斜率的负值）和SE（斜率的标准误差）。(A类)混合培养物(B类)富含神经元的培养物和（C）富含胶质细胞的培养物。每种文化类型斜率的平均SE以黑线表示。决定系数（R2)（D）混合培养物的线性拟合(E类)神经富集培养物和（F）胶质富集培养物。方框表示上四分位数（Q3）、中位数和下四分位数，天线表示上限（最大值）和下限（Q1-1.5*IQR）。

https://doi.org/10.7554/生活.34202.004
图1——图补充3
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与的比较体内研究。

我们测定的蛋白质半衰期的比较在体外之前报告的研究（混合培养）和半衰期体内小鼠脑内研究。390个基因的半衰期（在两项研究中确定）具有显著相关性（斯皮尔曼秩相关=0.62；p<0.001）。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.005
图1-图补充4
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蛋白质衰变簇。

使用层次聚类（K-Means方法）将所有蛋白质组（来自混合培养物、富含神经元培养物和富含胶质细胞培养物）的衰变曲线分配给20个簇中的一个。单个蛋白质组的衰变曲线显示为灰线，每个簇的平均衰变行为显示为黑线。分配给簇6和簇7的蛋白质组被排除在半衰期测定之外，因为大多数预先存在的蛋白质在1天后已经降解，导致不准确的指数拟合。对于下游分析，这些蛋白质的半衰期小于1天。簇20中的蛋白质组是长寿命蛋白质。由于在7天的测量过程中变化最小，它们的半衰期（通过指数拟合确定）仅为粗略估计。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.006
图2
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通过代谢标记和可视化验证质谱结果。

用FUNCAT-PLA测定GM130和LaminB1的蛋白质半衰期。对新合成的蛋白质的降解（在2小时AHA脉冲后）进行监测，GM130的降解时间为0天（无追赶）、1天、2天和3天，层蛋白B1的降解时间分别为0天、1天和7天。(A类)神经元的代表性图像，显示新合成的LaminB1和GM130（绿色）、胞体和树突（MAP2，红色）、细胞核（DAPI，蓝色）。点滴扩张仅用于可视化目的。比例尺=10μm。(B类)对实验进行分组分析，显示了单个细胞（灰点）和平均值（黑线）的每个神经元的点刺数。蛋白质半衰期是根据每个细胞的平均点刺数的指数拟合确定的。(C类)FUNCAT-PLA和MS测定的蛋白质半衰期表现出高度和显著的相关性（皮尔逊相关系数（r）=0.983）；TrkB和巴松管的数据来自汤姆·迪克等人，2015年.

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.007
图2-源数据1

FUNCAT-PLA结果。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.008
图3有1个补充
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具有不同细胞位置和功能的蛋白质的半衰期。

(A类)不同细胞隔室中蛋白质的半衰期分布（LocTree注释；得分≥50）和突触蛋白质的半寿期分布（根据UniProt GO注释提取）。括号中给出了分配给每个隔间的蛋白质组数量。与完整的定量半衰期相比，线粒体蛋白质的寿命显著延长。除了线粒体外，膜蛋白的寿命往往比每个隔室中的可溶性蛋白短。蜂窝组件的选定GO术语(B类)以及生物过程、分子功能和Panther蛋白质类(C类)这在不同半衰期段中表现得过多（p值<0.05）。下面给出了一套完整的过度代表GO术语和缩写GO术语的全名（标记为*）图3-来源数据2.

https://doi.org/10.7554/生活.34202.009
图3-源数据1

蛋白质在不同亚细胞定位下的半衰期。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.011
图3-源数据2

半衰期段的GO分析。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.012
图3-图补充1
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N末端序列分析。

包含一个蛋白质的蛋白质组的N末端序列分析。未考虑引发剂蛋氨酸。(A类)短寿命蛋白质（半衰期最短的10%）的N末端（位置1；红线表示p<0.05）的单个氨基酸没有显著的过表达或欠表达。所有其他蛋白质组用作参考。(B类)长寿命蛋白质也是如此（10%半衰期最长）。(C类)N端含有不稳定氨基酸（R、K、H、F、W、Y、I、L）的蛋白质的百分比。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.010
图4
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突触蛋白的半衰期。

位于谷氨酸能突触的蛋白质(A类)和甘氨酸能或GABA能突触(B类). 半衰期由从红色（短期）到绿色（长期）的颜色代码表示。同一蛋白质名称的多个圆圈显示不同的亚型。相互作用的蛋白质显示得更接近。具有相似功能的蛋白质被分组在一起，突触囊泡周期由箭头指示。蛋白质的缩写名称在图4——源数据1.

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.013
图4——源数据1

突触蛋白的半衰期。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.014
图5带1个补充
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多蛋白复合物中的蛋白质半衰期。

(A类)多蛋白复合物中半衰期的标准差（SD）与随机取样的蛋白质之间的SD相比。(B类)剪接体的结构（PDB代码：5O9Z）(C类)核糖体（PDB代码：3J7R）(D类)核孔复合体（多个PDB代码，见材料和方法）和(E类)ATP-合酶（PDB代码：5LQX）根据蛋白质半衰期进行颜色编码。对于核孔复合体(D类)只显示一个重复单元。整个复合体显示为一个插件（右下角）。未确定半衰期的RNA分子和蛋白质以灰色显示。(F类)复杂成分的半衰期分布和相应的色标。(G公司)复杂构件SD与复杂拆装动力学之间的关系。复合物的平均半衰期由所示色标表示。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.015
图5-源数据1

蛋白质复合物成分的半衰期。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.017
图5-源数据2

核糖体、ATP合成酶、剪接体和核孔复合体成分的半衰期。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.018
图5——图补充1
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蛋白质复合体内半衰期变异性与复合体大小的相关性。

314个多蛋白复合物的半衰期与测定半衰期的复合物成分数量的标准偏差。未发现显著相关性（皮尔逊相关=0.01；p值=0.84）。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.016
图6含5种补充剂
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不同细胞类型在不同细胞环境中的蛋白质周转率。

(A类)研究了不同的细胞培养类型和蛋白质周转的环境。(B类)不同原代神经元培养类型（混合培养、富含神经元培养和富含胶质细胞培养）的蛋白质半衰期分布。(C类和D类)显示胶质细胞富集培养物与混合培养物中蛋白质的蛋白质半衰期比较，以及神经细胞富集培养液与混合培养液中蛋白质的半衰期对比。具有显著调节周转率的蛋白质（3个时间点中≥2个时间点的p<0.05，Bonferroni校正）以颜色突出显示。(E类)与富含神经的培养物相比，混合培养物中蛋白质周转率明显更快的GO过度表达分析。选定的过度代表GO术语（p<0.05）及其对数2-显示了折叠过度表示。(F类)与混合培养相比，在富含神经元的培养物中，蛋白质的周转率明显更快，这与E相同。(G公司)提出了解释富含神经元的培养物中糖酵解酶周转增加的机制。在没有神经胶质细胞的情况下，神经元不能通过星形胶质细胞-神经元-乳酸穿梭器提供乳酸，因此丙酮酸的产生完全依赖于糖酵解。糖酵解酶的使用频率可能更高，损坏频率更高，更换更早。(H（H）)在涉及突触过程的富含神经的培养物中，具有明显更快周转率的选定蛋白质。(我)在有条件培养基或无条件培养基的情况下，对富含神经细胞的培养物中的蛋白质进行蛋白质向周转率的比较。周转率显著调节的蛋白质（p<0.05，Bonferroni校正）以颜色突出显示。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.019
图6——源数据1

不同培养类型的相对蛋白质丰度。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.025
图6——源数据2

不同培养类型之间的蛋白质半衰期比较。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.026
图6——源数据3

混合培养物和富含神经元培养物中不同周转率蛋白质的GO分析。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.027
图6——源数据4

在有条件培养基和无条件培养基的富含神经的培养物中具有不同周转率的蛋白质。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.028
图6——图补充1
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不同文化类型的比较。

(A类)不同培养类型中确定的蛋白质组数量。(B类)在富含神经元的培养物中，已建立的胶质细胞标记物被去富集。条形图显示日志2富含神经元培养物和混合培养物之间的折叠变化以及误差条表明了扫描电镜(C类)已建立的神经元标记物在富含胶质细胞的培养物中去富集。条形图显示日志2富含胶质细胞培养物和混合培养物之间的折叠变化以及误差条显示了扫描电镜(D类)胶质细胞富集培养物与混合培养物中定量星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞标记蛋白的数量。(E类)胶质细胞富集培养物与混合培养物中星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞标记物相对蛋白表达水平的比较。误差条显示标准偏差。(F类)725个“神经相关”蛋白质组的GO过度代表性分析（在富含神经的培养物中检测到≥2个生物复制品，而在富含胶质细胞的培养物上从未检测到）。(G公司)1355个“胶质相关”蛋白组的GO过度表达分析（在富含胶质细胞的培养物中检测到≥2个生物复制品，而在富含神经细胞的培养液中从未检测到）。(H（H）)在主成分分析（PCA）中，不同的培养类型形成不同的聚类。对于PCA，记录2使用3214个蛋白质组的转化相对丰度，这些蛋白质组在所有培养类型的所有生物复制品中检测到。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.020
图6——图补充2
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在富含神经元的培养物中，糖酵解酶的蛋白质周转更快。

糖酵解途径。与混合培养物相比，富含神经的培养物中周转更快的蛋白质以紫色突出显示。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.021
图6——补充图3
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有条件培养基和无条件培养基的富含神经细胞培养物的比较。

(A类)文氏图显示了在有条件培养基和无条件培养基的富含神经细胞的培养物中检测到的蛋白质组的数量。(B类)相对蛋白质丰度的比较。日志2比较了在有条件培养基和无条件培养基的情况下，从富含神经细胞的培养物中获得的独立样本的LFQ强度。所有成对样本比较的皮尔逊相关性（每个图的左上角）都非常高（≥0.962）。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.022
图6——补充图4
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从皮层和海马制备的富含胶质细胞培养物的蛋白质组比较。

从皮层和海马制备的富含胶质细胞的培养物之间的蛋白质组比较显示了这些培养物之间高度的相似性。(A类)维恩图显示了分别来自大脑皮层和海马体的富含胶质细胞培养物的每两个培养皿中定量蛋白质的数量。97%的蛋白质在两种培养物中都得到了定量。(B类)日志的相关性2转化蛋白LFQ强度。LFQ强度在皮质和海马富含胶质细胞的培养物之间显示出非常高的相关性（皮尔逊相关系数≥0.949）。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.023
图6——补充图5
下载资产 未结资产
原代培养中细胞分裂的估计。

(A类)动态SILAC实验期间（7天）混合培养物中胶质标记蛋白的相对表达水平。日志的平均值2显示了43个星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞标记物相对表达水平的倍数变化（每个时间点相对于t0）。晶须显示标准偏差。尽管不同的标记显示出不同的趋势，但在SILAC实验的时间过程中，胶质标记蛋白没有系统性增加。(B类)细胞分裂相关组蛋白H3.1在不同培养类型中的蛋白质半衰期。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.024

其他文件

补充文件1

所有培养类型中所有蛋白质的半衰期、速率常数、标准误差和测定系数。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.029
补充文件2

MS参数。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.030
补充文件3

示例表和MaxQuant参数集。

https://doi.org/10.7554/eLife.34202.031
透明的报告表
https://doi.org/10.7554/eLife.34202.032

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  1. 阿琳·Rörrbaum
  2. 丽莎·科钦
  3. 朱利安·德兰格
  4. 埃林·舒曼
(2018)
神经元和神经胶质细胞蛋白质周转的局部和全局影响
电子生活 7：e34202。
https://doi.org/10.7554/eLife.34202