1. 结构生物学和分子生物物理学

常规单粒子CryoEM样品和层析网格表征

  1. 亚历克斯·J·诺布尔
  2. 文卡塔·P·丹迪
  3. 惠伟
  4. 朱莉娅·布拉什
  5. 吉利安·蔡斯
  6. Priyamvada Acharya公司
  7. 永子潭
  8. 张振宁
  9. 劳拉·Y·金
  10. 乔瓦娜·斯卡宾
  11. 迈卡·拉普
  12. Edward T工程师
  13. 威廉·赖斯
  14. Anchi Cheng先生
  15. 卡尔·J·黑人
  16. 劳伦斯·夏皮罗
  17. 彼得·德光
  18. 大卫·杰鲁扎尔米
  19. Amedee des Georges公司
  20. 克林顿·S·波特
  21. 布里吉特·卡拉格  是通讯作者
  1. 美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心
  2. 美国哥伦比亚大学
  3. 美国纽约城市学院
  4. 美国纽约城市大学研究生中心
  5. 美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所
  6. 美国默克公司
https://doi.org/10.7554/生活34257
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  1. 亚历克斯·J·诺布尔
  2. 文卡塔·P·丹迪
  3. 惠伟
  4. 朱莉娅·布拉什
  5. 吉利安·蔡斯
  6. Priyamvada Acharya公司
  7. 永子潭
  8. 张振宁
  9. 劳拉·Y·金
  10. 乔瓦娜·斯卡宾
  11. 迈卡·拉普
  12. Edward T工程师
  13. 威廉·赖斯
  14. Anchi Cheng先生
  15. 卡尔·J·黑人
  16. 劳伦斯·夏皮罗
  17. 彼得·德光
  18. 大卫·杰鲁扎尔米
  19. Amedee des Georges公司
  20. 克林顿·S·波特
  21. 布里吉特·卡拉格
(2018)
常规单粒子CryoEM样品和层析成像网格表征
电子生活 7：e34257。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257
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摘要

单粒子低温电子显微镜（cryoEM）通常是在假设粒子不会吸附到空气-水界面和薄玻璃质冰中的情况下进行的。在本研究中，我们对50多个不同的低温电磁网格/样品制备进行了无基准断层扫描，以确定冰中的颗粒分布和网格孔中冰的整体几何结构。令人惊讶的是，通过从1000多张断层图像中研究3D中的空穴中的粒子，我们已经确定绝大多数粒子（约90%）被吸附在空气-水界面上。这一观察的意义是广泛的，可能会对蛋白质变性、构象变化和择优取向产生影响。我们还表明，单粒子网格上的无基准低温电子层析成像可用于确定冰厚、最佳单粒子收集区域和策略、粒子异质性以及模板拾取和单粒子对齐的从头计算模型。

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.001

引言

几十年来，单粒子低温电子显微镜（cryoEM）网格通常是在这样的假设下进行成像和处理的：大多数成像的粒子并没有吸附到空气-水界面上，而是在被冻结时处于单层中。用于单颗粒收集的理想网格和样品应使孔中的大部分区域最大限度地被非吸附、非相互作用的颗粒占据，距离空气-水界面10 nm或更远，颗粒方向随机，玻璃冰薄到足以容纳颗粒，再加上约20 nm的额外空间，其中没有粒子在光束方向重叠，并且光束方向与感兴趣区域垂直(图1). 这样，在网格的理想区域中进行收集将是对资源的最有效利用，并将为给定数量的粒子、收集硬件和收集参数提供尽可能高的分辨率结构。

图1
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包含理想粒子区域和单粒子低温EM采集冰行为的网格孔横截面示意图。

(A类)一个网格孔，其中所有区域的粒子和冰都表现出理想的行为。(B类)网格孔，其中有显示理想粒子和冰行为的区域。绿色箭头表示具有理想粒子和冰行为的区域。所示的通用颗粒是低通过滤全酶EMDB-6803(Yin等人，2017年). 使用UCSF Chimera渲染粒子(Pettersen等人，2004年).

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.002

实际上，在单粒子网格准备和数据收集过程中，有许多问题会导致样本无法遵循这种理想行为。如所示图2在不考虑表面冰污染的情况下，每个孔和每个孔内的区域都可能存在空气-水界面、颗粒和冰行为的多种组合。每个空气-水界面可能：（i）不含样品溶液成分(图2（A1），（ii）由变性颗粒（A2）覆盖一层一级、二级和/或三级蛋白质结构（分离或形成蛋白质网络），或（iii）由制备过程中存在的一层或多层表面活性剂覆盖（A3）。很难区分清洁的、被初级蛋白质结构覆盖的或被表面活性剂覆盖的空气-水界面，因为它们很可能无法通过低温电子显微镜或低温电子断层扫描（cryoET）进行区分分析时无需进行无样本对照比较（如果收集到高倾斜角，则cryoET可能能够在空气-水界面上分解脂质层[Vos等人，2008年]). 空穴区域中的大块颗粒行为可能包括以下任意组合：（i）无优先取向的非吸附颗粒（B1），（ii）无优先定向的空气-水界面上的颗粒（B2），（iii）N优先取向的空气-水中界面上的粒子（B3）空气-水界面上的部分变性颗粒具有M择优取向（B4），和/或（v）空气-水接口上的显著变性颗粒（B5）。A2中的蛋白质降解可能被认为是B4和B5变性的延续。空气-水界面上相邻粒子之间的相互作用可能导致B3和B4中不同的择优取向，特别是在高浓度下。每个孔的空气-水界面处的冰行为可以由凸冰（C1）、扁冰（C2）、中心比颗粒的短轴厚的凹冰（C3）和/或中心比颗粒的短轴薄的凹冰（C4）的任意两种组合来表征。在凸起的空气-水界面的情况下，粒子的短轴可能大于孔边缘的冰厚度。

图2
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基于图6来自(Taylor和Glaeser，2008年).

孔的区域可以通过以下一个选项的组合来描述(A类)对于每个空气-水接口和一个或多个选项(B类). 可以通过一组区域和一个或多个选项来描述整个孔(C类). (A类)每个空气-水界面可以用（1）、（2）或（3）来描述。请注意，cryoET可能只能解析空气-水界面上的第三和第二蛋白质结构/网络元素。(B类)空气-水界面之间以及每个界面上的颗粒行为可能由（1）到（5）的任意组合组成，有或没有聚集。例如，如果易于变性的粒子在变性开始之前或之后冻结，则B3与B4不同，从而可能改变优选取向集。在足够高的浓度下，由于相邻的蛋白质相互作用，B3和B4中可能会出现额外的择优取向。(C类)通过孔中心横截面的冰厚变化可以用一个选项来描述，一个选项用于一个空气-水界面，另一个选项则用于对应的界面。请注意，在C1中，粒子的短轴可能大于冰的厚度。在C1和C4中，如果粒子是可压缩的，则粒子仍可能位于比其短轴薄的区域。鼓胀或隆起等现象(Brilot等人，2012年)可以表示为C1-4的组合。

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.003

最常见的低温电磁网格制备技术，由罗伯特·格莱泽实验室首创(Jaffe and Glaeser，1984年;泰勒和格莱瑟，1974年;泰勒和格莱瑟，1976年)和雅克·杜博切特(Adrian等人，1984年;Dubochet等人，1985年;Dubochet等人，1982年)包括将溶液中约3微升纯化蛋白涂敷在由发光多孔基质覆盖的金属网格上-

排放后使其具有亲水性，用滤纸吸干格栅，然后将格栅与剩余样品一起放入制冷剂中冷冻，形成玻璃冰。印迹前后的培养时间约为秒，考虑到蛋白质因布朗运动而吸附到空气-水界面的可能性。文献中经常讨论有关有害的空气-水界面与蛋白质相互作用的问题。例如，雅克Dubochet等人，1988年观察到少量样品的空气-水界面和颗粒取向问题。在罗伯特·格莱泽（Robert Glaeser）最近的一篇评论中(Glaeser和Han，2017年)，证据(特鲁尼，1960年)使用Langmuir-Blodgett（LB）水槽(朗缪尔，1917年)被用来提出，在与清洁的空气-水界面接触时，溶液中的蛋白质会变性，形成不溶的变性蛋白质膜。该膜降低了空气-水界面的表面张力，并可能在溶液中的剩余颗粒和空气之间起到屏障作用。然后，溶液中的颗粒可能会吸附到蛋白质变性层上，这取决于与界面的局部颗粒亲和力，从而形成优选取向的集合。溶液中质量为100 kDa至1 MDa的粒子首次到达空气-水界面（体扩散）所需的时间估计范围为1 ms至0.1 s(Naydenova和Russo，2017年;Taylor和Glaeser，2008年).

最近的文献使用LB波谷证实，缓冲液中10–1000 mL体积的各种蛋白质（通常为10–1000 kDa和≲1 mg/mL）通常吸附在空气-水界面上，形成<10 nm厚(Gunning等人，1996年;Vliet等人，2002年)变性粘弹性蛋白质网络膜(伯迪，1972年;Damodaran和Song，1988年;de Jongh等人，2004年;Dickinson等人，1988年;格雷厄姆和菲利普斯，1979年;亚诺，2012). 由于体积扩散，开始吸附所需的时间大约为0.1到1毫秒，具体取决于蛋白质(Kudryashova等人，2005年). 对于在空气-水界面变性的蛋白质（表面扩散），表面扩散时间可能约为几十毫秒(Kudryashova等人，2005年)取决于蛋白质和浓度、表面疏水性、无序结构量、二级结构、分子内二硫键浓度、缓冲液和温度等因素。高体积蛋白质浓度已被证明会增加蛋白质网络的厚度(Meinders等人，2001年). 当溶液中的几种蛋白质和/或表面活性剂暴露于清洁的空气-水界面时，可能会发生竞争性和/或顺序吸附(Ganzevles等人，2008年;Le Floch-Fouéré等人，2010年;Stanimirova等人，2014年). 使用LB蛋白质膜的原子力显微镜（AFM）成像表明，这些蛋白质网络膜可能不会完全变性为单个氨基酸：向已经在空气-水界面形成蛋白质网络膜的蛋白质溶液中添加表面活性剂将置换蛋白质层（脱附[MacRitchie，1998年]) (Gunning and Morris，2018年;Mackie等人，1999年;王尔德等人，2004年)由此产生的蛋白质网络片段可能在溶液中部分重新折叠(Gunning和Morris，2018年;Mackie等人，1999年;莫里斯和冈宁，2008年). 特定蛋白质β-乳球蛋白和不同表面活性剂吐温20和吐温60的时间分辨AFM表面活性剂-蛋白质置换实验表明，表面活性剂对蛋白质网络膜的置换发生在等效的表面压力下，导致表面活性剂结构域不均匀增长，这意味着蛋白质网络是不均匀的(Gunning等人，2004年). 当只改变蛋白质时，观察到不同的表面活性剂置换行为和模式，其中，对于更有序的球状蛋白质，表面活性剂对蛋白质网络的置换各向同性程度降低(Mackie等人，1999年). 通过放置在云母上的β-乳球蛋白LB蛋白质网络膜的3D AFM成像，也可以观察到蛋白质网络的不均匀性(Gunning等人，1996年;莫里斯和冈宁，2008年). 使用LB槽进行的类似实验也表明，具有β-片的蛋白质部分展开，疏水性β-片在空气-水界面保持接触，并且在空气-水中界面下方可能有一层或多层非结构但相连的亲水氨基酸链(Yano等人，2009年). β-片在蛋白质变性后仍能存活的可能性可能是由于β-片通常由交替的疏水性和亲水性（极性或带电）侧链组成(Zhang等人，1993年)，疏水侧链朝向空气。分子间β-片也可以结合在一起，加强蛋白质网络(Martin等人，2005年;雷诺等人，2002年). 此外，当引入疏水性环境时，散装溶液中蛋白质的随机卷曲、α-螺旋和β-片的数量可能会增加或减少(Reddy和Nagara，1989年;Zangi等人，2002年)，包括空气-水界面(Martin等人，2003年;亚诺，2012)这意味着蛋白质吸附到空气-水界面时的构象可能与溶液中的构象不同(Lad等人，2006年;Vance等人，2013年;亚诺，2012). 蛋白质网络膜的剪切应力和压缩性与组成蛋白质的内部内聚力的测量显示出相关性：蛋白质在体溶液中越稳定，在空气-水界面上形成的蛋白质网络膜越坚固(Martin等人，2005年). 在足够高的表面浓度下，根据表面电荷分布，相邻的球状蛋白可能相互作用，诱导额外的择优取向，如表面蛋白研究所示(Billsten等人，1995年;Rabe等人，2011年;Tie等人，2003年). 这种最近邻的蛋白质相互作用可能反过来降低蛋白质对界面的亲和力并增加解吸。在蛋白质-空气-水界面上也可能发生类似的作用。

考虑到投入低温电磁分析网格之前通常允许的孵化时间长度，上述跨学科研究表明，低温电磁网格上薄膜中的一些粒子将在空气-水界面形成粘弹性蛋白质网络膜。所得蛋白质网络膜的组成和表面轮廓将根据本体蛋白质的结构完整性和本体蛋白质浓度而变化。体蛋白对蛋白质网络膜的亲和力将根据膜和蛋白质之间的局部亲和力而变化。为了更好地了解低温电磁网格孔中空气-水界面的粒子行为范围，需要在三维中研究网格和样品制备的代表性集合。

研究单粒子低温电磁网格的一种方法是使用低温ET。CryoET通常通过向样品制备中添加金基准来进行倾斜系列校准，这需要额外的优化步骤，并且可能无法代表没有金基准制备的相同样品。为了避免黄金基准带来的问题，我们采用了Appion-Protomo的无基准倾斜序列对齐方法(Noble和Stagg，2015年)，允许对我们尝试的所有单粒子低温电磁网格进行低温ET分析。我们使用这种无基准cryoET方法研究了来自数十个用户的50多个单粒子cryoEM样品，并使用传统网格制备技术或新的Spotiton制备的网格(Jain等人，2012年)方法。我们的目的是确定玻璃冰中颗粒的位置以及网格孔中冰的整体几何形状（与图2).

我们还发现，在单粒子低温电磁网格上执行低温ET的有用性超出了理解冰中粒子排列的目标。CryoET可用于确定最佳收集位置和策略、单粒子后处理建议、了解粒子结构异质性、了解病理性粒子以及从头开始的模型构建。我们主张，应在单粒子低温电磁网格上定期进行低温ET，以充分了解网格上样品的性质，并协助完成整个单粒子采集和处理工作流程。我们已经提供了Appion-Protomo无基准倾斜系列校准套件的独立Docker版本，该套件用于https://github.com/nysbc/appion-protomo.

结果和讨论

由Leginon组成的纽约结构生物学中心（NYSBC）的无基准断层扫描管道(Suloway等人，2005年;Suloway等人，2009年)或SerialEM(Mastronarde，2003年)用于tilt-series收集和Appion-Protomo(Noble和Stagg，2015年;Winkler和Taylor，2006年)对于倾斜序列对齐，可以对为三维单粒子低温EM制备的网格和样品进行常规研究。结果分析揭示了长期存在的问题，即如何使用传统方法（手动、Vitrobot和CP3注入）或使用Spotiton新的自动注入方法制备单颗粒样品(Jain等人，2012年)，相对于空气-水界面的行为。在下面的章节中，我们报告并讨论了如何确定和分析层析成像采集区域，观察到绝大多数颗粒位于空气-水界面的局部，以及与潜在变性有关的含义，与网格正交的方向上重叠颗粒的普遍性，观察到大多数低温EM成像区域和粒子相对于电子束倾斜几度，低温ET用于确定最佳收集位置和策略的价值，使用低温ET了解病理性粒子行为的益处，以及使用无基准低温ET生成各向同性从头计算模型。

确定层析成像采集位置

这里研究的单颗粒样品来源于不同的网格、样品和制备技术。网格基板包括碳和金多孔薄膜，无论是蕾丝还是具有各种规则间距的孔，以及各种纳米线网格(Razinkov等人，2016年)使用Spotiton准备。网格类型还包括碳Quantifoil(Ermantraut等人，1998年)，金色Quantifoil(Russo和Passmore，2014年)和金属上的C平面碳(Quispe等人，2007年). 俯冲方法包括手动俯冲，使用Vitrobot（FEI Company，Hillsboro，OR）或CP3（Gatan，Inc.，Pleasanton，CA）和Spotiton(Jain等人，2012年). 由于样品和制备技术的多样性，我们确定，分析几十种制备过程中的颗粒和冰行为的最可行和最具代表性的收集策略是在样品所有者打算收集或已经收集单颗粒显微照片的典型区域进行收集。对于典型的网格，收集低放大率的网格图谱或蒙太奇，以增加的放大率对有希望的正方形进行成像，并以高放大率检查潜在的暴露位置，直到样本所有者确定足够的颗粒对比度和浓度。然后，在单个粒子采集之前或之后，通常会按照“材料和方法”中的描述采集三个或更多倾斜系列。Tilt-series通常从−45°到45°收集，倾斜增量为3°，离焦约5微米，总剂量约为100 e-/2，像素化介于1和2°之间。对于大多数格栅，在典型孔的中心收集一个或两个倾斜系列，在典型洞的边缘收集一个或者两个倾斜序列，如果格栅基底为碳，则通常包括孔的边缘。Tilt-series随后与Appion-Protomo对齐(Noble和Stagg，2015年;Winkler和Taylor，2006年)用于材料和方法中所述的分析。

单粒子层析成像分析

中所述样品的单粒子层析图表1是否使用IMOD包中的3dmod对每一项进行了可视化分析(Kremer等人，1996年). 在确定层析图的方向，使其中一个空气-水界面大致平行于可视平面后，通过层析图的切片可以确定相对粒子位置、方向、孔洞中冰厚的变化，以及测量空气-水界面的最小颗粒距离。对于此处显示并在数据沉积中提供的许多样品，可以通过直接可视化明确确定粒子方向。空气-水界面表面的污染物用于确定界面的大致位置和测量冰厚度。在分析了数百个单粒子层析图后，我们得出结论，孔洞中的蛋白质隔离层始终对应于空气-水界面，从而提供了确定界面位置的第二种方法。

表1
冰层厚度测量、颗粒层数量、优选方向估计以及颗粒层与空气-水界面的距离，由不同样品46个网格制备的单颗粒低温电磁网格的低温ET测定。

该表是按粒子质量增加的近似顺序排列的。由于尚未公布，有几个粒子未命名。如果已知，溶液中的样品浓度包含在样品名称中。距离测量的精度为几纳米，这是因为将层析图分为4倍，并使用污染层或颗粒层估计空气-水界面位置。网格类型包括碳和金多孔网格，以及使用传统方法或Spotiton插入的花边和多孔纳米线网格。在距离孔边缘约100 nm处进行边缘测量表示这些值不可测量。用蓝色突出显示的样品包含接近理想状态的冰区域（<100 nm冰，没有重叠粒子，很少或没有首选方向）。以绿色突出显示的样品包含理想条件下的冰区域（非理想加上无颗粒-气-水界面相互作用）。放置前格栅上样品的培养时间约为1s或更长。

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.004
样品#样品名称网格类型冰层厚度
（中心、边缘、，
基板）英寸
nm±几nm		#层（共层）
（中间，
边缘，
基底）		明显
首选
方向
在层中？		最小颗粒/层
与空气的距离-
水界面

（nm±几nm）
1*32kDa激酶碳斑点6545--000未知<5
232kDa激酶黄金斑点30----0----未知<5
三胰岛素受体黄金斑点55----1–2----不5
4*†血凝素碳斑点25–95100–210--0或22--一些5
5*HIV-1 Trimer复合物1碳斑点75–210----2----是的5–10
6*HIV-1 Trimer复合物1黄金斑点20----1----一些5
7*HIV-1 Trimer复合物2碳斑点190265--222是的5
8147kDa激酶黄金斑点15----1----未知<5
9150kDa蛋白质钻孔碳点3570--222一些<5
10*粘蛋白1‡碳斑点80----1----不<5
11粘蛋白2
（150 kDa）‡		碳CFlat100100--11--未知5
12*粘蛋白2‡黄金斑点135–190----1----一些5
13*神经受体‡碳斑点60–90----1----是的5
14*神经受体‡碳斑点80–90100–140135111是的5
15200 kDa蛋白质CFlat碳纤维+金色网布40–6095110112不5
16小而受欢迎的蛋白质碳斑点3070--122不5
17*含结合脂质的糖蛋白（脱糖基）碳斑点1590130122是的<5
18含结合脂质的糖蛋白（脱糖基）‡黄金斑点155----2----一些<5
19*脂蛋白霍利碳素0–9585–100--均匀分布在冰中未知5
20*全球采购控制报告碳斑点25----12--不5
21*†兔肌肉醛固酶（1 mg/mL）黄金斑点1550--12--不<5
22*†兔肌肉醛固酶（6 mg/mL）碳斑点60–11075–13085222一些5
23未命名蛋白质多孔碳纤维35--601--2是的5
25*纳米圆盘中的蛋白质
（0.58毫克/毫升）		黄金斑点3065--1–22--不5–10
26集成电路设备碳斑点256095122未知5
27*集成电路设备黄金斑点40----1----不5-10个
28小型螺旋蛋白黄金斑点5075--12--一些5
29300 kDa蛋白质碳斑点30100--122不5
30*†GDH公司多孔碳纤维308510011三一些5
31*†GDH公司多孔碳纤维6012014012三是的5
32*†GDH（2.5 mg/mL）+0.001%DDM碳斑点5018019012--是的<5
33*†DnaB直升机装载机黄金Quantifoil50–5580–100--12--不5
34*†载脂蛋白黄金斑点25–30----1----不5
35*†载脂蛋白黄金斑点25----1----不5
36*†载脂蛋白钻孔碳点30125135122不5
37*†去铁蛋白（1.25 mg/mL）霍利碳点30–50100105122不5
38*†去铁蛋白（0.5 mg/mL）Holey Gold Spotiton公司25–3055--12--不<5
39*†含0.5mM TCEP的载铁蛋白碳斑点40–90145–175--1–221不5
40带碳孔的蛋白质碳四分之一11070–100--11--一些5–10
41蛋白质和DNA链
孔洞上方的碳		碳四分之一60----1----一些5–10
42*†T20S蛋白酶体多孔碳纤维3511512012三一些<5
43*†T20S蛋白酶体多孔碳纤维125140–160150222一些5
44*†T20S蛋白酶体黄金Quantifoil50–75----1----一些5
45*†Mtb 20S蛋白酶体碳斑点3580115011不5–10
46链霉亲和素上的蛋白质多孔碳纤维20–10080–120--0–21–2--不10

  1. *本示例包含一段视频。

    †为该样本保存数据集。

  2. 故意厚冰。

表1以单颗粒样品质量大致按降序排列。在一年的时间里，收集了超过50种不同样品制备的1000多张单粒子层析图。这里报告了这些样品中的大多数。这些样品包括广泛研究的样品，如谷氨酸脱氢酶（GDH）、脱铁蛋白和T20S蛋白酶体（分别为样品30–32、34–39和42–44），以及各种独特的样品，例如神经受体、脂蛋白和亲和网格上的颗粒（分别为样本13、14、19和40、41、46）。尚未具体命名的样本尚未发布。一半以上的样品是在金或碳纳米线网格上制备的，而其余的样品是使用常见的冷冻泵机器和技术在各种碳和金多孔网格上制得的。显示网格孔中冰区域的样品在接近理想条件下（冰厚度小于100 nm，没有重叠粒子，很少或没有首选方向）以蓝色突出显示（46个样品中的21个；46%）表1和2。显示网格孔中具有理想条件（近理想条件加上无颗粒-气-水界面相互作用）的冰区域的样品以绿色突出显示（46个样品中的2个；4%）。一半以上的样品仅包含不适合收集的区域，因为冰厚大于100 nm，粒子重叠，和/或优选方向。

表2
相同样品的表观气-水界面、颗粒和冰行为表1使用中的描述图1.

Tilt-series使用相同的工作流程进行对齐和重建，因此朝向相同的方向。然而，相对于示例应用程序的方向尚不清楚。底部的空气-水界面对应于较低的z切片值，以及从IMOD包中以3dmod呈现的从上到上的z切片值(Kremer等人，1996年). ‘A’表示空气-水界面明显干净，无法从视觉上区分A1、A2（主要结构）或A3。括号中的百分比是颗粒层饱和度估计值。报告的角度是粒子层法线和电子束方向之间的角度（绝对值），使用“切片器”以3dmod测量。通常很难区分空气-水界面上的扁平冰和弯曲冰（例如。图2，‘C1或C2’或‘C2或C3’），因为大多数视野都不跨越整个孔‡'表示对象的顶层与底层是同一层。'-'表明这些值是不可测量的。

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.005
样品#样品名称空气-水界面、颗粒行为和层/冰角
（底部，中间）		空气-水界面、颗粒行为和层/冰角
（底部、边缘）		结冰行为（底部）空气-水界面、颗粒行为和层/冰角
（顶部，中间）		空气-水界面、颗粒行为和层/冰角
（顶部、边缘）		结冰行为
（顶部）		笔记
1*32kDa激酶A、 B1或B2或B3（50%），8°A、 B1或B2或B3（50%），10°指挥与控制A、 B1或B2或B3‡(50%), 8°A、 B1或B2或B3‡(50%), 10°指挥与控制粒子聚集成云。
232kDa激酶A、 B1或B2或B3
(50%), 4–8°		--C1或C2A、 B1或B2或B3‡(50%), 4–8°--C1或C2金珠是辉光放电污染物。
三胰岛素受体A、 B1或B2或B3（100%），3-5°--C2或C3A、 B1或B2或B3‡（100%），3-5°--C2或C3金珠是辉光放电污染物。
4*†血凝素A2，无颗粒，3–7°A、 B3（40%），5°或
A、 B3（40%），3°		C3或C4A2类‡，无颗粒，3–7°或
A、 B3（50%），7°		A、 B3（50%），5-7°C3或C4在洞中央的薄冰不包括颗粒的地方，蛋白质碎片仍然存在。
5*HIV-1 Trimer复合物1A2、B1、B3（30%），1-5°--C1、C2或C3A2、B1、B3（30%），1-5°--C1、C2或C3Trimer结构域和/或未结合受体被吸附到空气-水界面上。
6*HIV-1 Trimer复合物1A2、B3（80%），6°--指挥与控制A2、B3‡(80%), 6°--指挥与控制Trimer结构域和/或未结合受体被吸附到空气-水界面上。
7*HIV-1 Trimer复合物2A、 B2或B3（50%），1°A、 B2或B3（50%），3°C1或C2A、 B2或B3（70%），1°A、 B2或B3（70%），3°C1或C2
8147kDa激酶A、 B2或B3（50%），0°--C2或C3A、 B2或B3‡(50%), 0°--C2或C3金珠是辉光放电污染物。
9150kDa蛋白质A、 B2或B3（60%），7-10°A、 B2或B3（60%），8°C2或C3A、 B2或B3‡(60%), 7°A、 B2或B3（40%），9°C2或C3
10*粘蛋白1A和A2，B4和B5（1%），10°--指挥与控制A2、B4和B5（50%），10°--指挥与控制
11粘蛋白2
（150千Da）		A2、B3、B4和B5（70%），7°A2、B3、B4和B5（70%），7°--A2、B3、B4和B5‡(70%), 7°A2、B3、B4和B5‡(70%), 7°--由于过度聚焦和最小倾斜角，测定不准确。
12*粘蛋白2A2、B3（80%），0°--C2或C3A2、B3（1%），0°--C2或C3注1。注2。
13*神经受体A2、B3（80%），3–10°--C2或C3A2，无颗粒，3–10°--C2或C3注1。注2。
14*神经受体--A2，无颗粒，2-7°或A2，B3（70%），5°C3类--A2、B3（70%），7°或A2，无颗粒，7°C3类注1。注2。两张断层照片有一个方向，一张方向相反。
15200 kDa蛋白质A、 B2或B3（60%），2°A、 B2或B3（50%），4°C3类无颗粒或A、B2或B3‡(60%), 2°A、 无颗粒，11°C3类
16小而受欢迎的蛋白质A、 B2或B3（90%），6°A、 B2或B3（90%），9°指挥与控制A、 B2或B3‡(90%), 6°A、 B2或B3（90%），1°C3类
17*含结合脂质的糖蛋白（脱糖基）A、 B3（70%），4°A、 B3（80%），10°C3类A、 B3级‡(70%), 4°A、 B3（80%），11°C3类脂质膜在中央与蛋白质分离。
18具有结合脂质的糖蛋白（糖基化）A、 B3（50%），10°--C2或C3A、 B3（60%），4°--C2或C3
19*脂蛋白无颗粒或A、B2、3°A、 B3，11°C3、C4无颗粒或A、B2‡, 5°A、 B3，11°C3、C4粒子在冰中均匀分布。
20*全球采购控制报告A、 B2或B3（70%），3°A、 B2或B3（60%）--C3类A、 B2或B3‡(70%), 3°A、 B2或B3（60%）--C3类
21*†兔肌肉醛固酶（1 mg/mL）A、 B2或B3（90%），3–9°A、 B2或B3（80%），6°C3类A、 B2或B3‡(90%), 3–9°A、 B2或B3（80%），10°C3类
22*†兔肌肉醛固酶（6 mg/mL）A、 B1、B2或B3（90%），5°A、 B1、B2或B3（90%），5°C2或C3A、 B1、B2或B3（90%），5°A、 B1、B2或B3（90%），5°C2或C3
23未命名蛋白质A、 B3（40%），0-3°--C2或C3A、 B3层‡（40%），0–3°--C2或C3
24未命名蛋白质A、 B3（80%），2°A、 B3（60%），4-6°C3类A、 B3级‡（80%），2°A、 B3（60%），4-9°C3类
25*纳米圆盘中的蛋白质
（0.58毫克/毫升）		A、 B2（80%），8-10°A、 B2（80%），8-10°C2或C3A、 B2层‡(80%), 8–10°A、 B2（80%），8-10°C2或C3
26集成电路设备A2、B2或B3以及B4和B5（50%），0°A2、B1、B2或B3以及B4和B5（50%），5°C3类A2、B2或B3、B4和B5‡(50%), 0°A2、B1、B2或B3以及B4和B5（50%），2°C3类注1。
27*集成电路设备A、 B2或B3（95%），0-4°--指挥与控制A、 B2或B3（95%），0-4°--指挥与控制
28小螺旋蛋白A、 B2或B3（80%），5°A、 B2或B3（70%），3°C3类A、 B2或B3‡(80%), 5°A、 B2或B3（70%），7°C3类
29300 kDa蛋白质A或A2、B2或B3（70%），7°A或A2、B2或B3（50%），13°C3类A或A2、B2或B3‡（70%），7°A或A2、B2或B3（50%），9°C3类
30*†GDH公司A、 B3（70%），10°A、 B1、B3（50%），1°指挥与控制A、 B3级‡(70%), 10°A、 B1，B3（50%），16°C3类注2。一些非吸附颗粒堆积在层间。
31*†GDH公司A、 B3（40%）--A、 B1、B3（40%）、10°C3类A、 B3级‡(40%), --A、 B1、B3（40%），2°指挥与控制
32*†GDH（2.5 mg/mL）+0.001%DDMA、 B3（40%），4°A、 B1、B3（40%）、7°指挥与控制A、 B3级‡(30%), 4°A、 B1、B3（30%）、6°C3类一些非吸附颗粒堆积在层间。
33*†DnaB直升机装载机A、 B2或B3（90%），1°A、 B2或B3（90%），4°C3类A、 B2或B3（<5%），1°A、 B2或B3（<5%），1°指挥与控制Quantifoil的金片在上面。
34*†载脂蛋白A2、B2或B3（50%），4-6°--C2或C3A2、B2或B3‡(50%), 4–6°--C2或C3注1。注2。
35*†载脂蛋白A2、B2或B3（60%），4-12°--C2或C3A2、B2或B3‡(60%), 4–12°--C2或C3注1。注2。
36*†载脂蛋白A2、B3（50%），5°A2、B1、B3（50%），10°C3类A2、B3‡(70%), 5°A2、B1、B3（60%），3°C3类注1。注2。
37*†去铁蛋白（1.25 mg/mL）A2、B2或B3（50%），4-7°A2、B1、B2或B3（50%），6°C3类A2、B2或B3‡(40%), 4°A2、B1、B2或B3（30%），4°C3类注1。注2。
38*†去铁蛋白（0.5 mg/mL）A2、B2或B3（20%），5°--C2或C3A2、B2或B3‡(20%), 1°--C2或C3注1。注2。
39*†含0.5mM TCEP的载铁蛋白A、 B2或B3（40%），--或
A、 B2或B3（50%），3°		A、 B1、B2或B3（40%），5-9°C3类A、 B2或B3（40%），--或
A、 B2或B3‡(50%), 3°		A、 B1、B2或B3（40%），2-8°C3类注1。注2。
40带碳孔的蛋白质碳、B1（30%）、B3（60%）、5°碳，B1（30%），B3（60%），5-9°指挥与控制A、 B3（5%），5°A、 B3（5%），5°C1或C2注释3。
41带碳孔的蛋白质和DNA链A、 无颗粒，2–3°--C2或C3碳、B1（20%）、B3（60%）、2–3°--指挥与控制一些非吸附颗粒与颗粒层接触。大多数非吸附颗粒附着在DNA链上。
42*†T20S蛋白酶体A、 B3（80%），3°A、 B1（5%），
B3（80%），14°		C3类A、 B3级‡(80%), 3°A、 B1（5%），
B3（20%），3°		指挥与控制注2。注释3。
43*†T20S蛋白酶体A、 B3（10%），2-5°A、 B3（10%），2-5°指挥与控制A、 B1（20%），
B3（90%），5–7°		A、 B1（20%），
B3（95%），5-7°		C3类注释3。
44*†T20S蛋白酶体A、 B1（10%）、B3（80%）、11°--C3类A、 B3（2%），11°--指挥与控制注2。注释3。
45*†Mtb 20S蛋白酶体--A、 B1、B2或B3（30%），6°C3类--A、 B1、B2或B3（30%），11°C3类严重污染。
46链霉亲和素上的蛋白质链霉亲和素B2（10-30%），0°或
链霉亲和素，无颗粒，12°		链霉亲和素或A2，2（10-30%），12°C1、C2或C3链霉亲和素，
B2（10-30%），0°或
链霉亲和素‡，无颗粒，12°		链霉亲和素，2（10–30%），13–14°C1、C2或C3注1。有些洞只在顶部有一层链霉亲和素，有些洞在顶部和底部有一层。颗粒附着在链霉亲和素上，有时附着在紧贴的空气-水界面上。

  1. *其中包括一段视频作为示例。

    †存放数据集用于采样。

  2. 注1：表观蛋白质片段/结构域被吸附到空气-水界面上。

    注2：存在部分颗粒。

  3. 注3：非吸附颗粒与颗粒层接触。

冰层厚度

计算了网格孔中心和边缘附近最小冰厚度的平均值±（一个标准偏差和测量误差）。在中心，用Spotiton制备的金纳米线栅（N=11）的冰厚度约为30±13 nm，用Spotiton制备的碳纳米线栅（N=17）的冰厚度约为47±40 nm，使用传统方法制备的碳多孔栅的冰厚度约为56±35 nm（N=10）(图3A). 对于使用Spotiton（N=4）制备的金纳米线网格，距离网格孔边缘约100 nm的冰厚约为61±11 nm，对于使用Spotton（N=16）制备碳纳米线网格的冰厚为107±54 nm，而对于使用常规方法制备的碳多孔网格，冰厚为99±24 nm（N=8）(图3B).

图3
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使用最小测量值、平均颗粒层倾斜度（实线）±（1个标准偏差和测量误差）（虚线）的平均冰厚（实线，以及具有单颗粒层和/或双颗粒层（定义为“1”和/或“2”）的样品百分比表1)在孔的中心(A类)距离空穴边缘约100nm(B类).
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.006
图3-源数据1

冰层厚度和角度测量图3.

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.007

表2根据以下方面对每个样本进行分类图2在可能的情况下，已通过目视检查对A、B和C进行分类。外观清洁的空气-水界面用“A”表示图2由于A1、A2（初级结构）和A3无法通过低温ET进行区分，而没有收集高倾斜角，这在本研究中没有进行。对于小于约100kDa的颗粒，通过低温ET无法区分A1/A3和A2。

如果网格孔中的区域包含相对于空气-水界面（可能为B1–B4）的颗粒层，则相应层的颗粒饱和度记录为表2括号中的近似百分比，其中100%表示没有其他粒子可以放入该层。如果适用，记录每个区域的粒子层相对于电子束的角度。孔中心各层的平均倾斜度±（一个标准偏差和测量误差）为4.7±3.0°，孔边缘为6.9±3.5°(图3). 显微镜和倾斜方向或幅度之间没有明显的相关性。大约83%的样品在孔的中心含有单颗粒层（N=30），而大约22%的样品含有双颗粒层（N=8；一些样品具有不同的孔，在其中心含有单层和双层颗粒）。在孔洞边缘附近，约7%包含单颗粒层（N=2），而约75%包含双颗粒层（N=21）。最后，在表2使用中的选项指定每个空气-水界面的冰曲率图2C。对于这些测量，每个层析图的底部被定义为具有比3dmod中观察到的顶部更低的z切片值，但由于网格上相对于EM阶段的未知样本应用方向，每个记录样本的相对方向未知。因此，无法从本研究中得出气-水界面行为与网格上样品应用方向之间的相关性。

跨部门描述

由cryoET测定的颗粒横截面和冰在孔中的行为的几个示意图如所示图4用于选定的样本和层析图。冰的厚度测量和颗粒大小大致符合比例。每个横截面的倾斜与层析图的倾斜相对应，层析图是根据层析图相对于电子束得出的。首选方向分布反映在横截面描述中。所描述的横截面特征不一定代表平均值，因为只描述了几个采集的断层图中的一个。

图4
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根据对单个断层图像的分析，选择孔中颗粒和冰行为的横截面示意图。

准确描述了横截面中冰的相对厚度。每个图都与导出它的层析图相对应地倾斜；即，所描绘的倾斜表示视场中物体在零度标称舞台倾斜时的方向。如果已知溶液中的样品浓度，则已将其包含在样品名称下方。示意图边缘上的黑线是网格胶片。此处描述的横截面特征不一定代表骨料。星号（*）表示该样本包括示意图的视频以及通过视频的相应断层图像切片。匕首(†)指示存储数据集以进行采样。一种通用粒子，全酶EMDB-6803(Yin等人，2017年)，用于代替一些机密样本（样本#40、41和46）。

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.008

包含的视频中显示了来自样本代表成像区域的几个层析切片视频。大多数视频都包含相应的孔放大图像，该图像的放大倍数比曝光放大倍数低一个数量级，并且指定了目标区域的位置。还规定了倾斜系列收集范围、网格类型和收集设备。层析成像也可以在孔放大的情况下进行，以便在多个尺寸的孔中确定颗粒位置、确定冰厚和局部网格倾斜(视频1-样品#20）。对于样品#20（颗粒范围约为5nm的GPCR），在孔放大率（约20°像素）下进行层析分析足以定位冰污染、颗粒层，并以约10nm的精度测量冰厚度。为了使读者了解这个单粒子层析成像数据，图5显示了选择厚冰样品时吸附和非吸附颗粒的层析切片。

图5
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层析切片，约7纳米厚，显示了几个样品中吸附和非吸附颗粒的颗粒取向变化。

右侧显示了显示切片近似位置的横截面示意图。(A类)HIV-1三聚体复合物1对吸附到空气-水界面的颗粒显示出高度的择优取向，而对非吸附颗粒则没有明显的择优定向。(B类)兔肌肉醛缩酶显示了吸附颗粒的几种视图和非吸附颗粒的非参考视图。(C类)DnaB螺旋装药器对吸附颗粒没有明显的优先取向。(D类)T20S蛋白酶体主要对吸附颗粒显示一种观点，对吸附到颗粒初级层的颗粒显示相同的观点，而对非吸附颗粒显示较少的观点。比例尺为100 nm。

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.009
视频1
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样本20。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.010

绝大多数粒子局限于空气-水界面

从50多个不同网格/样品制备的1000多个单粒子层析图中收集到的主要结果是，绝大多数粒子（约90%）都位于空气-水界面上。如所示表1,表2,图4，和视频，大多数粒子

在网格上以1s为单位的样品培养时间制备的样品在空气-水界面的5-10nm范围内（即在表2). 这一观察表明，不仅在本研究中，而且在低温EM单粒子研究中，大多数粒子都吸附在空气-水界面上。

颗粒吸附有时意味着优先定向

吸附在清洁的空气-水界面上并有时间平衡的隔离颗粒可能会相对于空气-水接口定向，从而最大限度地暴露颗粒的局部表面疏水性，假设颗粒不容易在界面处变性。如果颗粒容易在界面处变性，并且界面已经被蛋白质变性层覆盖，那么相同隔离颗粒在蛋白质膜-气-水界面上的优选取向可能会改变。如果粒子没有被隔离，而是处于蛋白质浓度高的环境中，那么相邻的粒子-粒子相互作用可能会改变粒子可能的优先取向。对于每一种情况，通过扩散到达的空气-水界面上的粒子集合，与大多数单粒子低温EM数据集的情况一样，将显示所有可能的粒子方向。然后，可以将每个首选方向上的粒子百分比映射回所有可能的相对局部粒子-气-水界面亲和力。与在空气-水界面上有更多的时间平衡相比，观察前（例如，骤降冻结前）平衡时间较短的粒子在系综中可能有更多的实现方向。在空气-水界面处和远离空气-水接口处具有不同数量的明显优先取向的样品的几个示例层析图切片如所示图5和6.

图6
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样品的气-水界面上的层析切片，约10 nm厚，显示清晰的蛋白质片段（示例用蓝色箭头表示）和/或部分颗粒（示例用绿色箭头表示），大致按照减少整体碎片的顺序呈现。

(A类)神经受体显示了主要由β片和部分颗粒组成的片段化13kDa结构域的组合。(B类)脱铁蛋白显示出明显的断裂链和结构域以及部分颗粒。(C类)血凝素显示出一条清晰的分界线，用蓝色标记，冰变得太薄，无法支撑完整的颗粒，但厚度足以支撑蛋白质片段。(D类)HIV-1三聚体复合物1显示了几个10kDa级的蛋白片段；然而，这些可能是在冻结前有意引入溶液的受体。(E类)GDH显示蛋白质片段散布在颗粒之间。(F类)T20S蛋白酶体显示部分颗粒，通过测量它们在z方向上的高度确定，位于其他干净的空气-水界面上（参见视频10对于样品#42）。对于此处所示的示例，尚不清楚观察到的蛋白质片段和部分颗粒是否是由于不干净的制备条件、溶液中的蛋白质降解、或在空气-水界面上的展开，或是一种组合；由于竞争性吸附和顺序吸附，预计所有情况都会产生相同的观察结果。比例尺为100 nm。

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.011

蛋白质在空气-水界面上的吸附对蛋白质变性、数据收集和图像处理有潜在影响。在本节的其余部分中，我们将讨论蛋白质吸附对蛋白质变性的影响，并提供来自cryoET的空气-水界面变性的可能证据。

用cryoET观察变性蛋白质

几个样品在空气-水界面显示出清晰的蛋白质片段（样品#4-6、10-14、26、30、34-38和46；图6A–E，蓝色箭头）。神经受体、血凝素、HIV-1三聚体复合物1、脱铁蛋白和GDH样品（分别为样品#13、#35、#4、#5和#30）在空气-水界面上显示蛋白质片段和结构域(图6A-E以及相应的视频、蓝色箭头）。对于神经受体（样品#13），空气-水界面上的密度在大小上与构成蛋白质的13kDa类Ig结构域有明确的关系。一些脱铁蛋白样品（样品编号34-38）在空气-水界面也显示出明显的蛋白质片段(图6B和视频2——7对应于样品#34–38）。一个血凝素样本中有一些小孔，在那里冰变得太薄，整个粒子无法驻留，而只被蛋白质碎片占据(图6C和视频7对应于样品#4）。HIV-1三聚体样本也在每个空气-水界面上显示出清晰的蛋白质片段，尽管这些可能是在骤冻前有意引入溶液的受体(图6D和视频8对应于样品#5）。GDH同样显示，在空气-水界面颗粒附近的开放区域中存在隔离的蛋白质片段(图6E和视频9对应于样品#30）。

视频2
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样本34。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.012
视频3
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样品35。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.013
视频4
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样品36。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.014
视频5
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样品37。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.015
视频6
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样品38。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.016
视频7
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样品04。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.017
视频8
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样品05。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.018
视频9
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样品30。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.019

一些样品在空气-水界面上显示出清晰的部分颗粒（样品10–14、34–39和46；图6A、B、F，绿色箭头）。可以看到神经受体（样品#13）颗粒碎片吸附在空气-水界面上(图6A，绿色箭头）。13号样品由两个不同的空气-水界面组成，如图所示图6A，其中底部界面被颗粒和蛋白质碎片覆盖，而顶部界面被蛋白质碎片和少量部分颗粒覆盖（另请参见视频11对应于样品#13）。图中所示的部分T20S蛋白酶体颗粒图6F和视频10（样品#42）可能是在空气-水界面处蛋白质变性的一个例子。在该样品中，观察到的部分颗粒被定向为罕见的颗粒俯视图，而不是大量的颗粒侧视图，并且存在于空气-水界面的不包含吸附颗粒的区域附近。同样值得注意的是，神经受体的所有结构域以及脱铁蛋白、血凝素、HIV-1三聚体复合物1和GDH的一些结构域都由一系列β-片组成，这些β-片有可能在空气-水界面上不变性。这一观察结果可能与引言中的跨学科文献相关，这些文献表明β-片可能在空气-水界面相互作用中存活(Martin等人，2005年;雷诺等人，2002年;Yano等人，2009年). 然而，尚不清楚这些不干净的空气-水界面是否是由于不干净的制备条件造成的(Glaeser等人，2016)蛋白质在溶液中降解，在空气-水界面上展开，或这些因素的组合。

视频10
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样品42。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.020
视频11
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样品13。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.021

虽然上述观察结果可能与引言中概述的食品科学和表面物理文献的研究相关，本研究不清楚颗粒是吸附在气-水界面变性蛋白膜上，还是一些颗粒直接吸附在气/水界面上。从引言中介绍的跨学科文献中，我们推测，在空气-水界面上首次变性的蛋白质的吸附速率将不同于直接吸附到空气-水接口上的蛋白质。对于在空气-水界面发生变性的蛋白质，表面扩散可能需要额外的扩散时间，大约几十毫秒。直接吸附在空气-水界面上的蛋白质仅受样品制备的体积扩散时间的时间限制。体扩散时间可能比表面扩散时间小几个数量级。蛋白质吸附到蛋白质网络膜上的速率取决于该蛋白质膜和体颗粒之间的亲和力。根据网格制备和颗粒行为，额外的表面扩散时间以及对变性蛋白质膜的额外体蛋白吸附时间可以加快样品应用的速度，并超过对空气-水界面上变性蛋白质的体蛋白吸附。次要影响，例如体粒子流——在传统的网格制备中，当使用吸墨纸时，以及在使用Spotiton的纳米线网格制备中，当蛋白质溶液到达网格条上的纳米线并吸走时——以及由于热对流而流动——可能由于与镊子的接触和吸墨过程——可能会发生变化空气-水界面附近大块颗粒的有效浓度。

蛋白质网络膜可能不利于颗粒

引言中的文献证据表明，蛋白质在空气-水界面发生变性，并明显依赖于蛋白质浓度和结构刚性。本研究的证据表明，一些空气-水界面确实含有蛋白质片段和/或部分颗粒，这可能是由于空气-水接口导致变性的额外例子。LB槽法研究小而无序的蛋白质β-酪蛋白的证据还表明，将溶液中体积蛋白质的浓度从0.1 mg/mL增加到100 mg/mL会导致空气-水界面处变性蛋白质膜的厚度从5 nm增加到50 nm(Meinders等人，2001年). 这一观察结果表明，体蛋白不仅可以在空气-水界面变性，而且可以在随后形成的蛋白质网络膜界面变性，这取决于体蛋白浓度。这反过来意味着吸附到蛋白质膜上的蛋白质发生构象变化，至少在较高浓度下是如此。因此，如果在高浓度下观察到特定蛋白质的蛋白质网络膜厚度增加，则可能需要担心吸附到蛋白质网络膜上的大块蛋白质正在发生构象变化。我们推测，如果粒子在蛋白质-气-水界面或蛋白质-蛋白质网络界面上发生构象变化，那么在2D和3D分类后可能会出现异常结构，这些结构与标称结构几乎无法区分。这些异常结构可能有助于人工3D重建、低分辨率和/或导致3D重建边缘的低密度贡献。在最后两种情况下，重建边缘的较低分辨率也可能是对准中的径向误差造成的，因此，在得出结论之前，需要在每个样本的基础上对这两个分辨率分解因子进行解耦。载脂蛋白，如所示图6B和视频2——6（样品34–38），如果观察到的颗粒降解确实是由空气-水界面变性引起的，则可能是由于空气-水接口观察到的构象变化的明确示例。

空气-水界面对称性和不对称性

一些样品显示，顶部和底部空气-水界面的颗粒饱和度之间存在不对称。例如，样品#10、12-15、33和44的颗粒覆盖一个空气-水界面，而另一个界面没有显示颗粒，样品#4、7、9、18、32、36、39、42和43的颗粒覆盖的一个空气/水界面多于另一个，样品#1、8、9、16、17、20–22、24–31、39、，和45在每个空气-水界面上的粒子数大致相等(图6). 仅在一个空气-水界面上分层的颗粒表明，它们要么粘附在第一个可用的空气-水接口上（对于传统网格制备技术而言，吸附之前网格背面的接口，或者对于Spotiton来说，粘附在应用动量方向的接口），或到第一个形成的蛋白质网络膜。在使用样品分配器创建第一个空气-水界面后，第一次形成的蛋白质网络膜可能几乎在瞬间形成。对于在空气-水界面变性的粒子，由于体扩散时间比表面扩散时间小一个或多个数量级，如果在第一个空气-水接口被体粒子饱和之前形成了第二个可用的空气-水表面，并且如果蛋白质浓度足够高，然后可能会在第二个空气-水界面发生变性。这将允许一层颗粒吸附到每个空气-水界面上。在考虑样品应用方向性的同时，使用cryoET进一步研究此类样品行为，可能会得出一个更清晰的模型，解释为什么颗粒优先吸附在一个空气-水界面上而不是另一个。

理想的样品很罕见

只有两个样品表现出理想的特性，即#25：纳米圆盘中的蛋白质和#46：链霉亲和素上的蛋白质，冰的厚度小于100纳米，没有重叠的粒子，很少或没有优先取向，以及没有粒子-气-水界面相互作用的区域。25号样品包含纳米盘中的单层颗粒区域，在30纳米冰中没有优先取向（参见相应的视频12). 虽然颗粒层位于孔边缘附近较厚区域的空气-水界面上，但缺乏择优取向意味着部分颗粒含有不与空气-水接口接触的蛋白质，因此满足理想条件。46号样品含有分散在链霉亲和素上的颗粒，链霉亲和素用于随机定向颗粒，并避免至少一个空气-水界面(图4). 大多数有颗粒的区域由足够薄的冰组成，以满足理想条件。

视频12
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样品12。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.022

主要由吸附颗粒到空气-水界面组成的单颗粒数据集不仅如本节所述开启了蛋白质和降解构象变化的可能性，而且还对数据收集和图像处理产生了影响，如接下来的三节所述。

空穴中很大一部分区域在电子束方向上有重叠的粒子

此处研究的样品中，很大一部分包含孔中的成像区域，通常局限于孔的边缘附近，在空气-水界面上包含一层颗粒，其中含有额外的非吸附颗粒，或两层颗粒中含有或不含有额外的未吸附颗粒（表示为表1孔中有1+、2或2+层）(图3). 发生这种情况时，通常在这些区域收集的投影图像将包含重叠的粒子(图7A、中间和右侧）。这些重叠的粒子可能会导致几个问题。首先，在后处理过程中，需要丢弃作为一个粒子拾取的重叠粒子（未圈出的粒子图7). 如果这些粒子没有被丢弃，那么包含这些粒子的任何3D细化都可能会出现异常结果，特别是在使用最大似然方法（如Relion）的细化模型中(Scheres，2012年)，冷冻SPARC(Punjani等人，2017年)和Xmipp(Scheres等人，2007年;Scheres等人，2008年)–从而降低细化结果的可靠性和准确性。其次，重叠的粒子降低了全图像散焦估计的准确性（如图7). 例如，垂直于电子束的曝光区域包含两层浓度相同的平行粒子，将导致位于两层中间的全图像散焦估计，从而根据粒子与中点的距离限制每个粒子的分辨率。对于离焦范围为1至2微米且偏离中点10 nm的此类图像，粒子的分辨率极限约为2.5º。偏离中点50 nm将导致分辨率极限约为6º。第三，重叠的粒子可能会降低每粒子或局部离焦估计的准确性。如果重叠粒子的浓度过高，则局部和潜在的每粒子离焦估计可能包含与感兴趣粒子不同高度的粒子碎片。第四，重叠的粒子降低了数据处理的效率，从而降低了数据收集的效率。如果通过复制每个粒子、CTF校正一个粒子来知道冰的厚度，上述第二和第三个问题可能会部分解决

图7
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冰厚变化对收集和处理的限制(A类)和颗粒层倾斜(B类)考虑到传统低温电磁网格上孔中的绝大多数粒子都被吸附到空气-水界面上。

(A类)孔内和孔间冰层厚度的变化可能会限制投影图像中非重叠粒子的数量（采集和处理的效率）、整个图像和局部散焦估计的准确性（处理的准确性）、较厚冰层区域的信噪比（采集和处理的效率），以及由于重叠颗粒被作为单个颗粒处理而导致的颗粒排列的可靠性。(B类)如果视场不被认为是倾斜的，则给定粒子层的倾斜角度的变化可能会影响散焦估计的准确性，但如果粒子表现出优选的方向，则会增加数据集中粒子的观测方向。黑色虚线表示如果在散焦估计期间未考虑样本倾斜，则投影横截面上的散焦估计高度。粒子相对于其与整个图像散焦估计的距离进行着色，以指示冰厚度和粒子层倾斜的影响。灰度粒子受到全图像CTF校正的影响最小，而红色粒子则受到全图像CT校正的严重影响。在相应投影图像中唯一可识别的粒子用绿色圈出。

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使用（中途散焦+厚度/2）和另一个使用（中途离焦-厚度/2），然后通过单粒子对齐部分丢弃高频互相关值较低的粒子。以上提出的问题可能是平均滤波、CTF置信度滤波、2D分类和3D分类期间丢弃颗粒的主要来源。

大多数空气-水界面相对于电子束是倾斜的

我们已经表明，所研究的大多数样品在一个或两个空气-水界面上都含有颗粒(表1和2,图3). 层析成像还允许我们研究每个空气-水界面法线相对于电子束方向的方向，从而研究每个空气/水界面局部粒子的倾斜。我们发现，当标称级倾角为0°时，空气-水界面相对于电子束倾斜0°至16°(表2). 孔中心颗粒层的平均倾斜度±（一个标准偏差和测量误差）为4.8°±3.1°（N=89），孔边缘颗粒层的倾斜度为6.9°±3.5°（N=61）(表2,图3,图4). 这些倾斜可能是由于舞台方向、局部网格变形和/或局部空气-水界面曲率中的错误组合造成的。在大多数情况下，这些倾斜相对于冰中粒子的方向而言是不系统的，因此有助于粒子角覆盖。

如前所示，大多数颗粒被吸附到空气-水界面上(表1和2,图3,图4和视频）。值得注意的是，单颗粒显微照片中缺乏明显的择优取向并不意味着颗粒不会吸附到空气-水界面上。事实上表1和2没有明显择优取向的吸附在空气-水界面上。图5显示了具有和不具有优先取向的吸附颗粒的选择。应区分颗粒的择优取向和表面择优取向。粒子在网格上可能具有N和/或M个优先方向，如所示图2B。在具有非零倾斜的给定网格上进行收集可有效增加粒子的成像首选方向数。根据数字N和/或M、粒子上首选方向的位置、粒子的对称性以及网格上非零倾斜的范围，优先定向的粒子在完整的单个粒子数据集中可能没有明显的首选方向。作为一个假设的例子，T20S蛋白酶体和脱铁蛋白可能各有两个优先取向，然而T20S酶体可能看起来有少量优先取向，而当以零度的标称倾斜收集显微照片时，脱铁蛋白似乎没有优先取向，但非零度局部气水界面倾斜。这可能是因为脱铁蛋白具有大量均匀分布的不对称单元，并且在暴露区域有~6°的倾斜。

倾斜粒子层对单粒子低温EM数据集的CTF估计的潜在影响，以及由此产生的分辨率限制，几乎与每个空气-水界面上存在一层粒子层一样有害，如前一节所述和图7.图7B描述了空气-水界面施加的附加效应，从而使颗粒层倾斜。使用整个视场上的离焦估计对单个粒子进行CTF校正将限制校正离焦上方和下方粒子的分辨率(图7B，左和中），将减轻较厚区域中某些粒子的分辨率限制(图7B、中间和右侧）。此外，倾斜的厚冰区域可能会改变哪些颗粒是唯一可识别的(图7，右）相对于未倾斜。作为一个假设的例子，考虑在离焦范围为1至2微米的4k×4k相机上以1°像素密度采集的曝光区域中有单个颗粒层且颗粒层倾斜度为10°的显微照片。如果在整体图像的基础上估算并校正该显微照片的CTF，则校正最差的粒子的分辨率极限约为4º。在处理过程中，这些颗粒可能会向下移动或移除，从而有效降低收集效率。

中的多个数据集表1和2展示本节和前一节中描述的两个问题：电子束方向上的重叠粒子和倾斜曝光区域(图4,图7B). 这些位置大多靠近洞口边缘，那里的冰通常是弯曲的，而且更厚。为了最大化每个孔的收集面积，避免孔中心潜在的更大的光束诱导运动，和/或避免暴露期间更容易撕裂的孔中心薄，用户在孔边缘附近收集单粒子显微照片并不罕见。如果之前没有使用cryoET对网格孔中的样品进行表征，这些区域的采集可能会严重限制投影重叠导致的可对准粒子数量、CTF估计和校正误差导致的分辨率以及冰厚导致的信号。因此，对于许多样品，建议首先确定与要采集的典型网格孔边缘的距离，以便可靠地成像薄冰中的单层颗粒。这样做将增加由于冰厚而产生的信号，以及由于没有重叠粒子而提高单粒子排列和分类的可靠性和效率。CTF估计和校正也应在视场相对于电子束倾斜的假设下进行（参见图3)通过使用全图像CTF倾斜处理、本地CTF处理或逐块CTF处理执行估计和校正(Grigorieff等人，2018年;胡，2018;张，2016). 如果孔洞中心较薄区域的冰容易撕裂，那么一种解决方案可能是以较低的剂量率成像。

无基准低温ET可用于确定最佳单粒子收集区域和策略

如所示表1和图3孔中的冰厚度通常在边缘大于中心。大多数具有这种结冰行为的样品在一个空气-水界面上有一层颗粒，在对置的空气-水接口上有第二层颗粒，或有额外的非吸附颗粒，或两者兼而有之(图3). 在距离孔洞边缘一定距离处（通常距离孔洞边缘100至500纳米），冰通常变得足够薄，只有一层粒子可以容纳在其中——通常是粒子的短轴加上粒子与空气-水界面之间10至20纳米的空间。如果颗粒浓度足够高，可以准确估计CTF，样品漂移足够低，可以进行足够的校正，并且颗粒几乎没有明显的择优取向，那么距离这些孔边缘一定距离的收集将是最有效的资源利用。与在投影中有重叠颗粒的较厚区域收集相比，在这些区域收集不太可能导致异常结构(图8，左）。如果在相同的情况下

图8
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无基准低温ET可能揭示的典型单粒子和冰行为示例，以及此类特征如何影响单粒子收集策略。

左图：对于在孔边缘附近出现厚冰，而在孔中心有冰的样品，冰的厚度足以容纳一层粒子，则最好在距离孔边缘d的距离处采集单粒子显微照片。中间：显示出高度优先取向的样品可能需要倾斜的单粒子收集，方法是故意将载物台倾斜一组角度α，以恢复更各向同性的粒子投影集(Tan等人，2017年). 右图：对于由穿过孔洞的多层颗粒组成的样品，样品所有者可以决定继续采集，因为他们知道效率将受到每层颗粒饱和度的限制，分辨率将受到因冰厚t而导致的信号减少的限制，以及CTF估计和校正的准确性。给定单粒子低温电磁网格上的低温ET结果也可能导致样品所有者决定整个网格不值得收集，可能是由于此处描述的情况或观察到的粒子退化。由于描述限制，中间列中粒子的单一方向被描述为仅在一个方向上，实际上粒子可能在空气-水界面的平面上旋转。

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粒子在层析成像中显示出优选的方向，那么第二种最有效和准确的收集方法是在有意倾斜台的同时进行收集(Tan等人，2017)前提是样品漂移足够低，浓度不太高，相邻粒子开始在倾斜投影中重叠(图8，中间）。

然而，如果穿过孔洞和格栅的冰一直很厚，和/或在电子束方向上有大量重叠的粒子，那么可以从低温电子技术中确定样品不适合高分辨率采集(图8，右侧）。如果使用的网格类型是网状的，则可以使用成像区域包含多个孔径的孔放大层析成像来确定含较薄冰的孔尺寸，并确定这些区域中是否存在一个或两个颗粒层(视频1样品#20的沉积数据、样品#36的沉积数据）。在cryoEM网格上常规执行cryoET可以让样本所有者确定在何处以及如何最有效地收集最佳数据，或者确定网格是否可以收集到所需的分辨率。收集、处理和分析一张断层图大约需要30到45分钟。因此，常规的单粒子网格和由cryoET进行的样品表征不仅可以为优化特定样品的网格制备提供信息，还可以提高显微镜效率。

无基准冷冻ET可用于了解关键蛋白质行为

在本研究过程中，单粒子低温EM栅的低温ET对于理解粒子的化学计量和反常行为是有价值的，甚至是至关重要的。例如，低温ET已用于几种带有受体的HIV-1三聚体制剂，通过直接在3D中可视化单个粒子来了解结合受体的化学计量比（样品#5-7对应于视频8,13和14). 在另一个示例（样品#17）中，“带结合脂质的糖蛋白”颗粒的大小随距孔边缘的径向距离而离散变化(图4和视频15). 在单粒子冷冻电镜显微照片中，该观察结果无法立即解释，需要收集单粒子数据，然后进行比对和分类，才能得出可靠的结论。取而代之的是，收集了样品的一张层析照片，观察到在孔的边缘附近，空气-水界面处的两层中存在含有脂质的颗粒。在距离约300 nm边缘的径向距离之外，冰变薄约15 nm，颗粒和脂质分离，颗粒仍保留在一个单层中（参见视频1对于样品20）。这个问题的解决方案是使用Spotiton在有意制造厚冰的条件下制备糖基化颗粒(图4，样品#18）。另一个强调使用cryoET了解网格上样本行为的重要性的例子是样本#40(图4). 该样品由溶液中浓度很低的颗粒组成，溶液中的碳层覆盖在孔洞上，以增加孔洞中的浓度。CryoET显示，颗粒在碳上形成了两层：一层直接在碳上，饱和度约为60%，另一层分散在第一层顶部，饱和度约30%。这一观察清楚地表明，颗粒重叠将是单颗粒处理中的一个问题，并引入了一种可能性，即由于颗粒层直接接触，这可能会导致一些颗粒的构象变化。类似于41号样品(图4)用碳覆盖孔制备的粒子和DNA链上的低温ET显示，由于一些非吸附粒子附着在DNA链上，相当一部分投影区域由重叠的粒子组成。在这种情况下，已确定在此样品上进行的单粒子低温EM对于研究感兴趣的复合物将是非常低效的。在这里描述的情况下，低温测定是一种测定粒子行为的权宜之计，有时也是不可或缺的方法。

视频13
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样品6。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.025
视频14
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样品7。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.026
视频15
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样品17。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.027

无信托SPT可以在无需额外准备的情况下生成从头开始的初始模型

能够在单粒子网格上执行无基准低温ET的一个有用且有时是关键的好处是，可以通过单粒子层析成像对齐和分类来处理生成的层析图像，以便生成用于单粒子显微照片拾取的从头模板，并用作单粒子显微图像中的初始模型粒子对准(Cong和Ludtke，2010年). 中的不一致从头算如文献所示，重构会导致细化过程中的结构不确定性(Ludtke等人，2011年). 在这里报告的一个示例中（样本#33和相应的视频16)从单粒子显微照片中对DnaB螺旋装药器粒子进行高斯粒子拾取和2D分类，显示出一个具有明显C6对称性的优势取向，几乎没有不同取向(图9A). 努力生成从头算用公共线方法重建(埃尔姆隆和埃尔姆隆，2012年;Ludtke等人，1999年)失败(图9A). 我们怀疑，由于缺少许多低对比度的侧视图，无法生成可靠的模板，并且如果没有可靠的模板，就无法进行更完整的粒子拾取——这是经典的第二十二条军规。

图9
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无教育标准贯入试验的从头开始初始模型。

(A类)DnaB螺旋装药器单粒子数据集的高斯拾取无法识别粒子的许多低对比度侧视图，顶视图的2D分类错误地暗示了C6对称性，导致初始模型生成不可靠，并阻碍了进一步处理数据集的努力。(B类)采用用于单粒子采集的相同网格上的无基准单粒子层析成像（SPT）生成从头开始的初始模型，然后将其用作拾取单粒子显微照片中粒子的所有视图的模板和单粒子对齐的初始模型，导致DnaB螺旋装药器的4.1°各向同性结构（手稿正在准备中）。这体现了在cryoEM网格上应用这种潜在关键的无基准SPT工作流程的新颖性。显微照片和层析照片的比例尺为100 nm，2D类为10 nm，3D重建为5 nm。

https://doi.org/10.7554/eLife.34257.028
视频16
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样品33。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.029
视频17
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样品01。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.030
视频18
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样品10。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.031
视频19
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样品14。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.032
视频20
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样品19。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.033
视频21
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样本21。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.034
视频22
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样本22。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.035
视频23
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样本25。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.036
视频24
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样本27。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.037
视频25
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样本31。
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视频26
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样本32。
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视频27
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样本39。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.040
视频28
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样品43。
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视频29
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样本44。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.042
视频30
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样本45。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257.043

为了改善这一问题，在单个粒子收集会话结束时收集了代表区域的五个倾斜序列，并在Appion-Protomo中对齐(Noble和Stagg，2015年;Winkler和Taylor，2006年)使用Dynamo对约1000个粒子进行了亚层析成像对齐、分类和多参考比对(Castaño-Díez等人，2012年;Castaño-Díez等人，2017年). 这导致了三个从头开始的初始模型，每个模型都显示了不对称裂纹环(图9B)与二维分类和共线性方法确定的C6对称重建相矛盾。然后，使用单粒子层析成像（SPT）中填充最多的类来选择Relion中的单粒子显微照片(Scheres，2012年)作为单粒子排列的初始模型，DnaB螺旋装药器的结构为4.1°（手稿正在准备中）(图9B). 在这个例子中，cryoET揭示了在高斯选取的2D类平均数中所看到的流行俯视粒子的表观对称性实际上是全局不对称粒子的投影。与基于基准的低温ET相比，执行无基准低温ET以生成从头开始的初始模型有两个关键好处：（1）与传统的基于基准的倾斜序列校准相比，不需要额外的金珠+样品制备和优化；（2）使用采集单粒子显微照片的准确样品，从而消除了样品在网格制备过程中发生变化的可能性。

结论

我们已经表明，在广泛的单粒子低温EM样品中，粒子和冰的行为差异很大，但使用传统技术和Spotiton与纳米线网格制备的网格上的绝大多数粒子最终吸附到空气-水界面上。这些不同的行为显示在表1和2–粒子变性、粒子优先取向、粒子在光束方向上的重叠、粒子层倾斜、冰厚和跨孔冰厚变化都不同，这为研究人员在其单粒子低温电磁网格上常规进行低温ET提供了动力。低温EM格栅的常规特性可用于确定颗粒行为、单个颗粒样品是否会产生理想的结果、最佳收集区域和策略，从而提高显微镜和单个颗粒的处理效率。此外，单粒子低温EM网格上的低温ET可以通过单粒子亚层析成像对齐和分类生成从头开始的初始模型。

绝大多数颗粒被吸附到空气-水界面的观察结果，为进一步研究避免空气-水接口的方法提供了依据。可能的方法包括使用非离子表面活性剂制备网格、使用亲和网格、将颗粒封装在碳层中、将颗粒包裹在支架中，以及可能采用更快的下落技术来超越气-水界面吸附。提出并使用了在冷冻前向单颗粒样品/网格制备中添加表面活性剂，以保护大块蛋白质免受空气-水界面的影响(Frederik等人，1989年)但在CMC下方添加非离子表面活性剂可能会再次出现。或者，在网格制备过程中，在空气-水界面的表面涂敷一层表面活性剂（离子或非离子），既可以减少溶液中的表面活性剂-蛋白质相互作用以及竞争吸附，也可以增加空气-水接口上形成的表面活性层的机械强度(莫里斯和冈宁，2008年)（可能使用与[Vos等人，2008年]). 亲和底物，如碳、链霉亲和素或孔上的离子脂质单层，可用于逃离空气-水界面，并可能具有要求溶液中蛋白质浓度较低的额外好处。然而，亲和网格的使用需要进一步优化网格，以便仅在冰层厚度足以覆盖吸附到亲和基质上的颗粒的区域进行收集，并且信号因亲和基质而退化。成功地将二维晶体封装在碳层之间，以避免由于开放的空气-水界面而导致的过度脱水(Yang等人，2013)，打开了将颗粒封装在碳层或石墨烯层之间的可能性，以避免空气-水界面相互作用。利用蛋白质支架进行颗粒包裹(科德沙和罗马，1986年)或合成DNA结构(Martin等人，2016年)还提出了避免空气-水界面和首选方向问题的建议。最后，随着技术的进一步发展，减少样品应用和冷冻之间的时间，以完全超过空气-水界面吸附可能是可能的(Arnold等人，2017;Feng等人，2017年;弗兰克，2017;Jain等人，2012年;Noble等人，2018年). 粒子扩散到空气-水界面、扩散到空气/水界面以及随后的大块粒子吸附到产生的粘弹性蛋白质网络膜上所需的时间可能大约为几十毫秒或更长。这一过程似乎在很大程度上取决于蛋白质表面疏水性、蛋白质浓度和蛋白质结构。避免空气-水界面对于获得更脆弱蛋白质的更高分辨率结构至关重要。

材料和方法

网格准备

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约三分之一的特征网格是使用样品所有者确定的传统技术制备的。一般来说，购买的多孔格栅（大多数是Quantifoil（Quantifol Micro Tools，GmbH，Jena，Germany）或C-flat（Protochips，Inc.，Morrisville，North Carolina）碳或金）被辉光放电，样品在适当的条件下应用，按1到10秒的顺序进行培养，格栅被吸污（最常见的是面部吸污），进一步进行1s左右的孵育，然后将格栅插入液体乙烷中。

其余网格使用Spotiton进行准备(Jain等人，2012年). 一般来说，一个自制的蕾丝或多孔碳或金纳米线网格(Razinkov等人，2016年)对样品进行辉光放电，将样品喷在网格上，形成条纹，根据校准的自吸时间或机器人的最大下落速度，进行1s或更短的孵育，然后将网格插入液体乙烷中。

Tilt-series系列

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NYSBC使用Titan Krios显微镜（FEI公司，Hillsboro，OR）和Gatan K2（Gatan，Inc.，Pleasanton，CA），或Tecnai F20（FEI公司，Hillsporo，AR）和DE-20（Direct Electron，San Diego，CA）或Tietz F416（TVIPS GmbH，Gauting，Germany），采集了Tilt系列。使用Gatan Bioquantum能量过滤器（Gatan，Inc.，Pleasanton，CA）收集了几个倾斜系列，少量使用Volta相位板（FEI公司，Hillsboro，OR）收集。大多数倾斜序列是使用Leginon收集的(Suloway等人，2005年;Suloway等人，2009年)在Krios显微镜和F20上，剩下的用SerialEM收集(Mastronarde，2003年)20层。大多数倾斜序列都是使用100 ms帧为每个倾斜图像收集的，并使用MotionCor2进行全帧对齐(Zheng等人，2017年). 大多数倾斜系列都是双向采集的，倾斜范围为−45°至45°，倾斜增量为3°。大多数倾斜系列是在4至6微米的标称离焦下采集的。收集的大多数倾斜系列的剂量率约为8e-/pixel/s，入射剂量在1.5至3.0e-/Å之间2对于零度倾斜图像，根据倾斜角度的余弦，随着更高倾斜角度的剂量增加，总剂量在50和150 e-/Å之间2大多数tilt系列都是在1到2.2°之间的像素级采集的。孔放大倾斜系列通常以−60°至60°的倾斜范围收集，倾斜增量为1°，像素化约为20°，剂量可忽略不计。每个高倍率倾斜序列通常在15分钟左右采集，而孔放大倾斜序列大约需要30分钟。大多数倾斜序列都是在没有硬件装箱的情况下采集的。使用超分辨率采集了两个样本。

倾斜系列对齐

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使用Leginon收集的倾斜系列可自动在Appion中进行处理(Lander等人，2009年)，而使用SerialEM收集的倾斜序列(Mastronarde，2003年)在校准之前上传到Appion。使用Appion-Protomo对所有倾斜序列进行校准(Noble和Stagg，2015年). 简单地说，大多数倾斜序列都是使用(格兰特和格里戈里夫，2015年)粗对齐，必要时手动对齐，使用一组对齐厚度进行细化，然后使用Tomo3D SIRT重建最佳对齐迭代以进行可视化分析(阿古莱罗和费尔南德斯，2011年;阿古莱罗和费尔南德斯，2015年). 未执行CTF校正。倾斜序列通常在20-60分钟内对齐良好。几乎所有倾斜序列都可以对齐。

CTF分辨率限制

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结果和讨论中报告的离焦估计误差导致的分辨率极限是通过绘制两条离焦约1.5微米但因离焦误差不同的CTF曲线，并在曲线偏离相位90°时定位近似分辨率来确定的。

估算和测量误差

请求详细协议

冰厚测量按如下方式进行：将一个由四个高倍体层摄影仪（像素大小约为8º）或一个无标洞放大体层摄影机（像素大小大约为20º）组成的箱子定向到3dmod后，使一个空气-水界面大致与视野平行，利用冰表面的局部污染或吸附颗粒层来定位两个空气-水界面，并测量了两个界面之间的距离。如果使用了污染物，则使用距离玻璃冰最近且仍含有污染物的层析切片来定位界面。如果使用颗粒，则使用距离空气最近且仍含有颗粒的层析切片来定位界面。对于这些测量，高倍率下测量冰层厚度和颗粒层与空气-水界面距离的估计误差为几纳米，而孔倍率约为10纳米。

测量的统计和系统误差图3传播方式如下。报告冰层厚度和颗粒层倾斜的每个报告值都带有一个估计误差，即标准偏差和传播的测量误差求积下的总和。使用所有测量值（以N大小表示）计算标准偏差。对于测量误差，每次测量的冰厚测量误差约为5 nm，颗粒层倾斜误差约为1°。平均值的测量误差图3通过使用以下方程假设独立的随机误差来传播：

δq个=∑((δx个)2)N个

哪里δq个是传播的测量误差，δx个是每个独立的测量误差，N是样本量。大多数传播的测量误差比标准偏差小一个数量级。

所示冰面的平滑度是近似值。

数据存储和软件可用性

请求详细协议

数据集中的几个代表性倾斜序列已以4或8张断层图的形式存储在电子显微镜数据库（EMDB）中，并以未对齐倾斜序列图像（其中一张包括超分辨率帧）的形式存储到电子显微镜先导图像档案（EMPIAR）中，Appion-Protomo倾斜序列校准运行，以及对齐的倾斜系列堆叠。其加入代码为：

样品#样品名称EMDB（断层扫描）EMPIAR（断层扫描）EMPIAR公司
（单颗粒）
4血凝素713510129--
21兔肌肉醛固酶（1 mg/mL）713810130--
22兔肌肉醛固酶（6 mg/mL）71391013110187
25纳米圆盘中的蛋白质
（0.58毫克/毫升）		7140----
30GDH公司71411013210132
31GDH公司714210133--
32GDH（2.5 mg/mL）+0.001%DDM71431013410134
33DnaB直升机装载机714410135--
34载脂蛋白714510136--
35载脂蛋白714610137--
36载脂蛋白71471013810138
37载脂蛋白
（1.25毫克/毫升）		714810139--
38载脂蛋白
（0.5毫克/毫升）		714910140--
39载脂蛋白
0.5毫米TCEP		715010141--
42T20S蛋白酶体715110142--
43T20S蛋白酶体71521014310143
44T20S蛋白酶体71531014410188
45Mtb 20S蛋白酶体715410145--

基于冰中粒子的倾斜系列排列的本地冰法线方向的原始估计，包括潜在的系统级和束轴误差，可在所有沉积的EMPIAR数据集中获得，如图所示：Protomo_alignments/tiltseries###/media/angle_refinement/series##_orientation.gif

Appion-Protomo无基准倾斜系列校准的基于Docker的版本可在https://github.com/nysbc/appion-protomo.

视频

请求详细的协议

每个视频（样本#20除外）显示中给定样本的一个层析图的切片（底部/顶部方向如文本所述）表1和表2旁边是样品和冰的横截面示意图。大多数层析图的方向都是使其中一个粒子层的平面与观察平面平行。20号样品的视频中显示了孔放大层析图。使用IMOD软件包中的3dmod绘制断层图(Kremer等人，1996年)使用UCSF Chimera渲染了示意性粒子(Pettersen等人，2004年).

数据可用性

数据集中的几个代表性倾斜序列已以4或8张断层图的形式存储在电子显微镜数据库（EMDB）中，并以未对齐倾斜序列图像（其中一张包括超分辨率帧）的形式存储到电子显微镜先导图像档案（EMPIAR）中，Appion-Protomo倾斜序列校准运行，和对齐的tilt系列堆栈。基于冰中粒子的倾斜序列排列的局部冰法线方向的原始估计，包括潜在的系统级和束轴误差，可在所有存放的EMPIAR数据集中作为一个位于以下位置的绘图使用：protomo_alignments/tiltseries###/media/angle_refinement/series##1#_orientation.gif Appion-protomo无基准tilt-series校准的基于Docker的版本可在http://github.com/nysbc/appion-protomo.

生成了以下数据集

参考文献

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    个人通信
    个人沟通。
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    3. Renkema M公司
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    植物生物聚合物科学
    241–252，sy甘氨酸在本体和界面上形成凝胶，植物生物聚合物科学。

文章和作者信息

作者详细信息

  1. 亚历克斯·J·诺布尔

    美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    贡献
    概念化、数据管理、软件、形式分析、验证、调查、可视化、方法论、撰写初稿、项目管理、撰写审查和编辑
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0001-8634-2279

  2. 文卡塔·P·丹迪

    美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    贡献
    调查
    与
    惠伟
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  3. 惠伟

    美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    贡献
    调查
    与
    文卡塔·P·丹迪
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  4. 朱莉娅·布拉什

    1. 美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    2. 美国纽约哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理系
    贡献
    调查、写作审查和编辑
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  5. 吉利安·蔡斯

    1. 美国纽约市纽约市立学院化学与生物化学系
    2. 美国纽约城市大学研究生中心生物化学专业
    贡献
    形式分析、调查、可视化、写作审查和编辑
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  6. Priyamvada Acharya公司

    1. 美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    2. 美国马里兰州国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所疫苗研究中心
    贡献
    调查、写作审查和编辑
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  7. 永子潭

    1. 美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    2. 美国纽约哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理系
    贡献
    调查、写作审查和编辑
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0001-6656-6320

  8. 张振宁

    美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    贡献
    调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  9. 劳拉·Y·金

    美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    贡献
    调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  10. 乔万娜·斯卡平

    1. 美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    2. 美国新泽西州默克公司结构化学和化学生物技术部
    贡献
    调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  11. 迈卡·拉普

    1. 美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    2. 美国纽约哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理系
    贡献
    调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  12. Edward T工程师

    美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    贡献
    调查、写作审核和编辑
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-8014-7269

  13. 威廉·赖斯

    美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    贡献
    调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  14. Anchi Cheng先生

    美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    贡献
    软件，调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  15. 卡尔·J·黑人

    美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    贡献
    软件
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  16. 劳伦斯·夏皮罗

    美国纽约哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理系
    贡献
    资源、监督、资金获取
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  17. 彼得·德光

    美国马里兰州国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所疫苗研究中心
    贡献
    资源、监督、资金获取
    竞争性利益
    未申报竞争利益

  18. 大卫·杰鲁扎尔米

    1. 美国纽约市纽约市立学院化学与生物化学系
    2. 美国纽约城市大学研究生中心生物化学专业
    3. 美国纽约城市大学研究生中心生物课程
    4. 美国纽约城市大学研究生中心化学课程
    贡献
    资源、监督、资金获取
    竞争性利益
    未申报竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0001-5886-1370

  19. Amedee des Georges公司

    1. 美国纽约市纽约市立学院化学与生物化学系
    2. 美国纽约城市大学研究生中心生物化学专业
    3. 美国纽约城市大学研究生中心化学课程
    4. 美国纽约城市大学研究生中心高级科学研究中心
    贡献
    资源、监督、资金获取、写作审查和编辑
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  20. 克林顿·S·波特

    1. 美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    2. 美国纽约哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理系
    贡献
    概念化、资源、监督、资金获取、项目管理、写作审查和编辑
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0003-2394-0831

  21. 布里吉特·卡拉格

    1. 美国纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心自动化分子显微镜国家资源
    2. 美国纽约哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理系
    贡献
    概念化、资源、监督、资金获取、项目管理、写作审查和编辑
    用于通信
    bcarr@nysbc.org
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-0624-5020

基金

西蒙斯基金会（SF349247）

  • 克林顿·S·波特
  • 布里吉特·卡拉格

纽约州科学、技术和创新基金会

  • 克林顿·S·波特
  • 布里奇特·卡拉格

国家普通医学科学研究所（GM103310）

  • 克林顿·S·波特
  • 布里吉特·卡拉格

阿古龙研究所（F00316）

  • 克林顿·S·波特
  • 布里吉特·卡拉格

美国国立卫生研究院（S10 OD019994-01）

  • 克林顿·S·波特
  • 布里吉特·卡拉格

国家少数民族健康与健康差异研究所（5G12MD007603-30）

  • 大卫·杰鲁扎尔米

国家过敏和传染病研究所（疫苗研究中心的内部资助）

  • 彼得·德光

科学、技术和研究机构

  • 永子潭

美国国立卫生研究院（R01-MH1148175）

  • 劳伦斯·夏皮罗

国立卫生研究院（R01 GM084162）

  • 大卫·杰鲁扎尔米

作者声明，资助者在这项工作中没有任何作用，包括实验设计、数据收集或数据分析。

致谢

作者感谢Robert Glaeser教授（劳伦斯伯克利国家实验室）和Pete Wilde教授（Quadram研究所）的有益讨论。作者希望感谢Neil Voss（罗斯福大学）为Appion CentOS7 Docker提供的基本图像。作者希望感谢几个未命名的样本来源。Mtb 20S蛋白酶体样本是范安德尔研究所李惠林赠送的礼物。其中一些工作是在西蒙斯电子显微镜中心和位于纽约结构生物中心的自动分子显微镜国家资源中心进行的，得到西蒙斯基金会（SF349247）、NYSTAR和NIH国家普通医学研究所（GM103310）的资助在阿古龙研究所（F00316）和NIH（OD019994）的额外支持下。国家卫生研究院（R01-MH1148175）部分支持了对粘性颗粒和神经受体的研究。Jeruzalmi实验室的科学得到了国家卫生研究院（R01 GM084162）和国家少数民族健康与健康差异研究所（5G12MD007603-30）的支持。NIH NIAID疫苗研究中心的校内资助部分支持了对HIV-1妊娠期的研究。新加坡科学技术与研究局（Agency for Science，Technology and Research Singapore）部分支持了对纳米光盘中蛋白质的研究。

版本历史记录

  1. 收到日期：2017年12月12日
  2. 接受日期：2018年5月17日
  3. 接受手稿出版日期：2018年5月29日（第1版）
  4. 发布的记录版本：2018年6月13日（第2版）

版权所有

这是一篇开放获取的文章，没有任何版权，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传输、修改、构建或以其他方式使用。该作品在知识共享CC0公共领域奉献.

韵律学

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  1. 亚历克斯·J·诺布尔
  2. 文卡塔·P·丹迪
  3. 惠伟
  4. 朱莉娅·布拉什
  5. 吉利安·蔡斯
  6. Priyamvada Acharya公司
  7. 永子潭
  8. 张振宁
  9. 劳拉·Y·金
  10. 乔瓦娜·斯卡宾
  11. 迈卡·拉普
  12. Edward T工程师
  13. 威廉·赖斯
  14. Anchi Cheng先生
  15. 卡尔·J·黑人
  16. 劳伦斯·夏皮罗
  17. 彼得·德光
  18. 大卫·杰鲁扎尔米
  19. Amedee des Georges公司
  20. 克林顿·S·波特
  21. 布里吉特·卡拉格
(2018)
常规单粒子CryoEM样品和层析网格表征
电子生活 7：e34257。
https://doi.org/10.7554/eLife.34257

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