J癌症2021; 12(6):1846-1852. doi:10.7150/jca.46868这个问题 引用

研究论文

靶向SATB1的溶瘤腺病毒联合多西紫杉醇治疗去势耐药前列腺癌

毛立军^1#、于海源^1#、赛马^1#，徐紫阳¹，福建伟¹、杨春华²、郑俊年²

1.徐州医科大学附属医院泌尿外科，徐州，221000，中国。
2.江苏省肿瘤生物治疗重点实验室，徐州医学院，徐州221002，中国。
#这些作者对这项工作做出了同样的贡献。

✉ 通讯作者：杨春华，邮箱：杨春花820203通用域名格式；郑俊年，电子邮箱：mljmlj05教育网。

摘要

背景：溶瘤病毒治疗是一种结合病毒治疗和基因治疗优点的新型肿瘤根除策略。沉默SATB1对前列腺癌的生长具有较强的抑制作用。多西紫杉醇（DTX）是前列腺癌化疗的金标准，但其副作用降低了患者的生活质量。因此，迫切需要开发联合治疗来提高其抗肿瘤效果。

方法：构建了靶向SATB1的溶瘤腺病毒，命名为ZD55-SATB1。用ZD55-SATB1或/和DTX处理人前列腺癌细胞DU145和PC-3以及人前列腺基质细胞WPMY-1。体外检测细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡。此外，将PC-3细胞皮下注射到裸鼠体内，裸鼠接受ZD55-SATB1或/和DTX治疗。监测肿瘤生长体内.

结果：ZD55-SATB1联合DTX抑制DU145和PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭，同时比单一治疗更有效地促进DU145及PC-3细胞凋亡。ZD55-SATB1对WPMY-1细胞无杀伤作用。在动物模型中，与其他治疗组相比，ZD55-SATB1+DTX联合内分泌治疗有效抑制了异种移植瘤的生长，同时增加了caspase-3和caspase-8的表达，降低了Bcl-2和血管生成标记物CD31的表达。

结论：溶瘤腺病毒ZD55-SATB1与化疗的结合为前列腺癌的有效治疗提供了一种新的途径。

关键词：SATB1、多西他赛、溶瘤腺病毒、前列腺癌

介绍

前列腺癌的发病率已上升到男性恶性肿瘤的第二位，其死亡率居世界第五[1]。由于前列腺特异性抗原（PSA）的筛查，前列腺癌的诊断率最近有所提高。晚期前列腺癌的最佳治疗方法是内分泌治疗。许多前列腺癌患者最初对内分泌治疗敏感，并经历暂时的肿瘤消退，但几乎所有患者都发展为去势耐受性前列腺癌（CRPC），并伴有骨转移或远处转移[2]。多西紫杉醇（DTX）是治疗CRPC的有效化疗药物之一[三]。DTX治疗后前列腺肿瘤体积平均减少三分之一，但由于DTX的耐药性，报告肿瘤缓解[4].

SATB1（特殊AT-rich序列结合蛋白1）是一种全局染色质组织者，可以调节基因表达和染色质结构[5]。SATB1在多种癌症中异常过度表达，并被认为是促进肿瘤生长和侵袭的癌基因[6-10]。因此，SATB1成为癌症治疗的靶点。

肿瘤的基因病毒治疗是一种结合病毒治疗和基因治疗优点的肿瘤根除新策略。溶瘤腺病毒可以在肿瘤细胞中自我复制，溶解肿瘤细胞并感染邻近的肿瘤细胞。溶瘤腺病毒具有较高的抗肿瘤疗效和安全性[11]。特别是，E1B55-kDa基因缺陷溶瘤腺病毒（Ad-ZD55）不仅能有效感染和复制肿瘤细胞，而且能扩增IL-24基因以增强IL-24在肿瘤微环境中的表达和功能，而不影响邻近正常细胞[12].

在本研究中，我们构建了携带SATB1的溶瘤腺病毒Ad-ZD55-SATB1，并将其与化疗药物DTX结合，以探讨其对前列腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响在体外和体内.

材料和方法

细胞培养

人前列腺癌细胞系DU145和PC-3以及人前列腺基质细胞系WPMY-1是从中国科学院获得的，并在37°C的含10%胎牛血清的RPMI-1640或DMEM培养基（美国吉布科）中在含5%CO的湿化培养箱中培养₂DTX来自江苏恒瑞医药有限公司。

重组腺病毒

ZD55-SATB1和ZD55-EGFP由江苏省生物肿瘤治疗重点实验室提供，使用腺病毒纯化迷你试剂盒（美国加州Biomiga公司）纯化病毒，并保存在4°C下。使用QuickTiterTM试剂盒（Cell Biolabs，CA，USA）测量病毒滴度。

细胞活力测定

通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞增殖。将DU145、PC-3和WPMY-1细胞接种在96个平皿中并培养24 h。然后用DTX（1 ng/mL）或/和ZD55-SATB1或ZD55-EGFP在10次感染（MOI）下处理细胞24、48、72和96 h。用CCK-8溶液培养后，测量450 nm处的吸光度。

细胞侵袭和迁移检测

PC-3和DU145细胞接种在基质涂层和未涂层（BD Biosciences；Bedford，MA，USA）跨阱腔室（Corning，Corning，NY，USA。孵育24小时后，将侵入或迁移到下腔室的细胞固定在4%多聚甲醛中，并用结晶紫染色。染色细胞在显微镜下计数。

细胞凋亡测定

处理48小时后采集PC-3和DU145细胞，并使用Annexin V-FITC/碘化丙啶双重染色试剂盒（Keygen Biotech；中国南京）进行染色。染色细胞立即进行流式细胞术。

蛋白质印迹分析

用蛋白酶抑制剂在裂解缓冲液中裂解细胞，用SDS-PAGE分离等量的裂解产物并转移到膜上，将其与SATB1（Abcam，UK，#ab109122）、MMP-2（Abcam-2，UK，caspase-3（英国Abcam，#ab197202）、caspase-8（英国Abcam，#ab108333）、GAPDH（英国Abcam，#ab 37168）。清洗印迹，与二级抗体孵育（英国Abcam），并使用增强化学发光（ECL）系统（美国伊利诺伊州罗克福德Pierce）进行培养。

小鼠皮下肿瘤模型

从Vital River实验室（中国北京）购买雄性BALB/c裸鼠（5周龄），并隔离一周。实验程序由徐州医科大学实验动物护理和使用委员会批准。1×10⁶每只小鼠皮下注射PC-3细胞，小鼠随机分为8组（n=8）：（1）对照组（Con）：腹腔注射PBS；（2） 内分泌治疗组（ET）：手术切除双侧睾丸；（3） 单药组（DTX）：每周腹腔注射DTX（10mg/kg）一次；（4） 腺病毒治疗组（ZD55-SATB1）：瘤内注射ZD55_SATB1（1×10⁹pfu）每三天；（5） ET+ZD55-SATB1组：手术去势，瘤内注射ZD55-SATB1；（6） ET+DTX：手术去势，每周腹腔注射DTX（10 mg/kg）一次；（7） ZD55-SATB1+DTX组：瘤内注射ZD55_SATB1，腹腔注射DTX；（8） ET+ZD55-SATB1+DTX组：手术去势，瘤内注射ZD55-SATB1，腹腔注射DTX。每三天测量一次肿瘤体积，使用公式：V（mm^三)=长度×宽度²×0.5. 在注射后第28天，处死小鼠并解剖异种移植物肿瘤。按照标准方案用苏木精-伊红染色，并使用caspase-8、caspase-3、CD31和Bcl-2抗体（英国Abcam）和DBA试剂盒（中国北京ZSGB-Bio）进行免疫组织化学染色。

统计分析

数据显示为平均值±标准差（SD）。两组采用T检验进行比较，多组采用单因素方差分析。P<0.05为显著性。

结果

联合治疗有效且特异性地抑制前列腺癌细胞的活性

我们选择了三种细胞系：高转移潜能的PC-3人前列腺癌细胞；具有中等转移潜能的DU145人前列腺癌细胞和WPMY-1人前列腺基质细胞作为对照。细胞分为五组：PBS处理为正常对照；化疗组给予DTX治疗；溶瘤治疗组给予ZD55-EGFP；ZD55-SATB1作为溶瘤治疗和SATB1靶向治疗组；用ZD55-SATB1+DTX作为溶瘤治疗和SATB1靶向治疗联合化疗进行治疗。CCK-8检测显示，ZD55-SATB1（10MOI）加DTX（1ng/mL）组48 h后PC-3细胞存活率（35.16±2.17%）显著低于ZD55-SATB1（10 MOI）组（57.13±2.02%）；ZD55-EGFP（10 MOI）组（72.25±5.49%）和DTX（1 ng/mL）组（50.16±3.27%）。ZD55-SATB1（10 MOI）加DTX（1 ng/mL）组48 h后DU145细胞存活率（37.27±3.62%）显著低于ZD55-SATB1（10MOI）组（65.16±5.49%）；ZD55-EGFP和（10 MOI）组（70.45±6.71%）；DTX（1 ng/mL）组（47.19±3.56%）。最后，ZD55-SATB1联合DTX对WPMY-1细胞几乎没有或没有明显的影响（图1).

联合治疗有效抑制前列腺癌细胞的侵袭和迁移

Transwell分析显示，PBS、DTX、ZD55-EGFP、ZD550-SATB1和DTX+ZD55-SATB1组侵袭PC-3细胞数分别为172.2±14.5、61.1±4.8、54.4±4.4、37.1±2.2、25.7±3.6；PBS、DTX、ZD55-EGFP、ZD550-SATB1和DTX+ZD55-SATB1组侵袭DU145细胞数分别为201.7±15.4、87.7±9.9、67.6±8.5、70.6±6.7、37.5±4.1；PBS、DTX、ZD55-EGFP、ZD550-SATB1和DTX+ZD55-SATB1组PC-3细胞迁移数分别为217.1±14.2、141.7±4.4、115.3±4.6、72.7±6.2、50.2±3.1；PBS、DTX、ZD55-EGFP、ZD550-SATB1和DTX+ZD55-SATB1组迁移的DU145细胞数分别为301.2±17.3、125.5±9.6、197.2±8.7、49.7±6.6、32.4±4.7（图2A、 B）。这些结果表明，与单一治疗组相比，ZD55-SATB1+DTX在抑制前列腺癌细胞迁移和侵袭能力方面表现出更大的潜力。

联合治疗有效诱导前列腺癌细胞凋亡

基于Annexin-V-FITC/碘化丙啶双重染色的流式细胞术显示，与ZD55-SATB1（28.17±2.31%）、ZD55-EGFP（25.86±3.53%）、DTX（22.58±2.24%）、，而对照组的细胞凋亡百分比显著降低（5.32±1.28%）（图三A、 C）。同样，与ZD55-SATB1（28.79±3.04%）或DTX（23.33±2.47%）相比，ZD55-SATB1和DTX联合治疗显著提高了DU145细胞的凋亡百分比（图三B、 D）。这些结果表明，与单一疗法相比，ZD55-SATB1联合DTX能有效诱导前列腺癌细胞凋亡。

联合治疗有效抑制前列腺癌细胞的上皮-间充质转化

上皮间充质转化（EMT）与肿瘤侵袭性和迁移性相关。为了检测前列腺癌细胞迁移和侵袭是否与EMT相关，我们检测了EMT相关蛋白的表达，包括MMP-2、波形蛋白和E-cadherin在PC-3和DU145细胞中的表达。与ZD55-SATB1或DTX单药治疗组相比，ZD55_SATB1和DTX联合显著下调MMP-2、Vimentin和SATB1的表达水平，上调E-cadherin的表达（图4，均P<0.05）。这些数据表明，ZD55-SATB1和DTX联合治疗通过抑制EMT抑制前列腺癌转移和侵袭。

联合治疗有效抑制裸鼠移植瘤的生长

基于以上内容在体外数据，我们进一步评估了ZD55-SATB1联合DTX对前列腺癌生长的治疗效果体内将PC-3细胞皮下注射到裸鼠体内，一周后8组接受不同的治疗。28天后采集肿瘤（图5A） ●●●●。肿瘤生长曲线显示，ZD55-SATB1联合DTX和ET导致异种移植瘤生长最慢（图5B） ●●●●。苏木精-伊红染色显示ZD55-SATB1联合DTX和ET组肿瘤减轻（图5C） ●●●●。

联合治疗可有效诱导裸鼠移植瘤细胞凋亡并抑制血管生成

免疫组织化学染色显示，ZD55-SATB1、DTX或ET单独增加caspase-3和caspase-8的表达，降低Bcl-2的表达。然而，与其他治疗组相比，ZD55-SATB1+DTX+ET导致caspase-3和caspase-8的表达增加，Bcl-2的表达减少。此外，与其他治疗组相比，ZD55-SATB1+DTX+ET导致血管生成标记CD31的表达更大程度的降低（图6).

讨论

大多数前列腺癌是雄激素依赖性的，雄激素剥夺疗法（ADT）成为晚期前列腺癌的首选治疗方法。尽管ADT在早期治疗中是有效的，但大多数患者在ADT后约1-3年出现CRPC[13]。基于DTX的化疗被推荐为前列腺癌的一线治疗。然而，DTX的副作用，如骨髓抑制、液体潴留、过敏、低血压、呕吐或腹泻，严重影响患者的生活质量[14].

在本研究中，我们将DTX与携带SATB1的溶瘤腺病毒（ZD55-SATB1）结合，以增强DTX的疗效，减少DTX的剂量和可能的副作用。体外实验表明，联合治疗（ZD55-SATB1加DTX）对抑制前列腺癌细胞的生存、侵袭和迁移的效果最好，而对正常前列腺细胞的生存能力没有显著影响。此外，联合治疗对诱导前列腺癌细胞凋亡的疗效最高。

EMT是肿瘤侵袭和转移的关键过程[15]。E-cadherin和vimentin均为EMT相关蛋白，MMP-2在肿瘤侵袭转移中起重要作用[16,17]。因此，我们进行了Western blot分析，以检测PC-3和DU145细胞中MMP-2、波形蛋白和E-cadherin的表达。与其他组相比，ZD55-SATB1加DTX处理的细胞中，MMP-2、波形蛋白和SATB1的表达水平显著下调，而E-cadherin的表达显著上调。总之，这些结果表明，ZD55-SATB1联合DTX可能通过诱导凋亡抑制前列腺癌生长，并通过逆转EMT抑制前列腺癌的侵袭和转移。

为了进一步验证联合治疗的抗肿瘤疗效，我们采用了前列腺癌细胞异种移植的裸鼠模型。裸鼠肿瘤生长监测显示，ZD55-SATB1联合DTX和ET组肿瘤最小。免疫组织化学染色显示，与其他联合治疗组和单一治疗组相比，ZD55-SATB1+DTX+ET组凋亡相关蛋白的表达水平变化最为显著。这些结果与在体外联合治疗诱导前列腺癌细胞凋亡的数据。

CD31（也称血小板内皮细胞粘附分子-1）在血管和淋巴管内皮细胞中表达，参与血管生成和肿瘤转移[18]。因此，我们通过免疫组织化学染色检测CD31在裸鼠肿瘤组织中的表达。与其他联合治疗组和单药治疗组相比，ZD55-SATB1+DTX+ET组CD31水平显著降低。这些数据补充了在体外数据显示ZD55-SATB1+DTX可以抑制前列腺癌细胞的侵袭。

综上所述，ZD55-SATB1与DTX联合应用对前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移具有协同抑制作用，同时诱导前列腺癌细胞凋亡。联合治疗的抗转移机制与抑制EMT有关。ZD55-SATB1和DTX联合内分泌治疗可能为前列腺癌的治疗提供新途径。

致谢

基金

本研究得到了科教兴医项目（CXTDA2017034）的资助。江苏省医学青年人才（编号：QNRC2016794）。

竞争性利益

提交人声明，不存在竞争利益。

工具书类

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作者联系人

通讯作者：杨春华，邮箱：杨春花820203通用域名格式；郑俊年，电子邮箱：mljmlj05教育网。

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收到日期：2020-4-10
2020-12-26年验收
发布日期：2021-1-25

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