J癌症 2016; 7(13):1755-1771. doi:10.7150/jca.15170 这个问题 引用
研究论文
咖啡酸苯乙酯的分子表征及γ-环糊精增强其抗癌活性 雷努·瓦德瓦 1 努普尔·尼甘姆 1,2 ，Priyanshu Bhargava 1,2 贾斯普雷特·考尔·丹贾尔 三 、苏克里蒂·戈亚尔 4 阿比纳夫·格罗弗 4 、杜蕾·桑达尔 三 ，石田佳之 5 、Keiji Terao 5,6 ，Sunil C Kaul 1
1.DBT-AIST高级生物医学国际实验室（DAILAB），国立高级工业科学技术研究所（AIST），日本筑波东1-1-1中央5-41，305 8565； 2.茨城筑波大学生命与环境科学研究生院-305 8575，日本； 3.印度新德里理工学院生物化学工程与生物技术系-110 016，印度； 4.印度新德里贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学生物技术学院，邮编：110 067。 5.CycloChem有限公司，7-4-5 Minatojima-minamimachi，Chuo-ku，Kobe-650 0047，日本； 6.神户大学医学研究生院，7-5-1，Kusunoki-cho，Chuo-ku，Kobe-650 0017，日本。
引用： Wadhwa R，Nigam N，Bhargava P，Dhanjal JK，Goyal S，Grover A，Sundar D，Ishida Y，Terao K，Kaul SC.γ-环糊精对咖啡酸苯乙酯抗癌活性的分子表征和增强。 J癌症 2016; 7(13):1755-1771. doi:10.7150/jca.15170。 https://www.jcancer.org/v07p1755.htm
复制 其他样式 摘要 咖啡酸苯乙酯（CAPE）是新西兰蜂胶的关键成分，具有多种促进健康和治疗潜力。 我们研究了CAPE抗癌和抗转移活性的分子机制。 在对照组和CAPE治疗的乳腺癌细胞上进行的cDNA阵列显示，DNA损伤信号的激活涉及GADD45α和p53抑癌蛋白的上调。 分子对接分析表明，CAPE能够破坏mortalin-p53复合物。 我们提供了实验证据，并证明CAPE诱导的mothalin-p53复合物的破坏导致核移位和p53激活，导致癌细胞生长停滞。 此外，CAPE处理的细胞表现出莫特林和其他几个细胞迁移的关键调节因子的下调，这些调节因子与CAPE的抗转移活性有关。 值得注意的是，我们发现，尽管CAPE在培养基中不稳定（因为它被分泌的酯酶降解为咖啡酸），但它与γ-环糊精（γCD）的复合物在抗肿瘤和抗转移检测中显示出高效性 在体外 和 体内 （通过腹腔或口服给药时）。 数据表明，CAPE-γCD复合物是一种有效的抗癌和抗转移试剂。
关键词 ：蜂胶、CAPE、γCD、复合物、上调、p53、抗癌、抗转移。
介绍 癌症诊断和治疗工具的最新进展提高了癌症患者的成功率和生存率。 然而，转移性癌症的治疗仍然是一个挑战。 癌症转移涉及癌细胞从其原发部位扩散，并通过细胞外基质（ECM）或血液/淋巴流侵入周围或远处组织。 这是一个复杂的多步骤现象，涉及多种因素的相互作用，使癌细胞具有侵袭性并注入循环系统，在血液或淋巴循环中存活，形成微血管和外渗，在远处器官形成肿瘤块[ 1 - 三 ]. 这些涉及细胞水平的几个过程的激活，包括上皮-间充质转化（EMT）、运动性、粘附性和侵袭性，这些过程由癌基因、蛋白酶和其他肿瘤微环境成分的激活以及肿瘤抑制蛋白和凋亡介导因子的失活调节[ 4 - 7 ]. 化疗药物以这些促癌信号通路为靶点。 然而，大多数可用药物也针对体内非癌正常分裂细胞，导致不良副作用，包括免疫力低下、脱发、疲劳、恶心和激素失衡。 此外，大多数抗癌药物对转移癌细胞的疗效较低，导致治疗失败或复发。 癌细胞的耐化学性和抗放射性以及化学药物对正常细胞的非特异性毒性是癌症治疗的主要障碍。 一些流行病学研究表明，食用水果和蔬菜可以降低癌症风险。 因此，研究了几种植物源多酚，包括姜黄素、染料木素、水飞蓟素、咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇、绿茶多酚、黄哌啶醇、大黄素和胡椒碱的化学治疗和预防性能，以及肿瘤细胞对化学和放射治疗药物的敏感性[ 8 - 14 ]. 由于其安全性、可用性和经济性，天然化学品在旨在了解其癌症预防和治疗活性及其作用机制的研究中越来越受到关注。
蜂胶是蜜蜂通过将植物材料与蜡和树脂混合来建造蜂巢而产生的天然汞合金。 在民间医学中，它被用于抗菌、抗炎、伤口愈合、皮肤感染、胃肠疾病、免疫调节和心血管益处。 咖啡酸苯乙酯（CAPE）是从蜂胶中分离出来的一种活性酚类化合物。 它被认为具有多种活性，之前在蜂胶中检测到，并被认为是一种抗有丝分裂和抗癌的天然药物[ 15 , 16 ]. 一些研究表明，CAPE及其衍生物对转化细胞/癌细胞具有选择性毒性[ 17 - 23 ]. 富含CAPE和Artepillin C（ARC）的蜂胶提取物被认为是天然抗PAK1抑制剂和NF1/NF2药物[ 24 , 25 ]. CAPE被证明能抑制TPA（12-O-十四烷酰基佛波-13-乙酸酯）诱导的肿瘤[ 26 , 27 ]，建议作为治疗结直肠癌的抗癌药物[ 28 ]，肝癌[ 29 ]和胃癌[ 30 ]. β-连环蛋白下调介导CAPE诱导的细胞周期阻滞和凋亡[ 31 , 32 ]和p38MAPK[ 33 ]发送信号。 它被证明能抑制NF-kappaB、COX-2[ 34 , 35 ]并刺激人体抗氧化反应元件介导的NAD（P）H：醌氧化还原酶（NQO1）基因的表达[ 36 ]. CAPE被证明可以（i）通过缝隙连接恢复细胞间通讯，由连接蛋白43磷酸化调节[ 35 ]，（ii）导致肌动蛋白细胞骨架重排和局部黏附斑块丢失，导致细胞侵袭减少[ 37 ]. 通过下调p21抑制软琼脂中癌细胞的生长 ras（拉斯维加斯） 蛋白质[ 38 ]. 与 在体外 据报道，CAPE的抗癌活性得到了 体内 小鼠研究[ 39 - 41 ]. CAPE及其衍生物咖啡酸苯丙酯（CAPE）可抑制PI3-K/Akt、AMPK和m-TOR信号级联 在体外 和 体内 [ 41 ]. 尽管这些报告提出CAPE是一种用于癌症预防和治疗的天然药物，但分子研究有必要阐明其作用机制并合理设计其衍生物。
环糊精（CD）是由淀粉通过酶转化过程产生的。 它广泛应用于食品、农业、制药、化工和环境工程。由于其内部具有疏水性，外部具有亲水性的结构，增强了化合物的溶解性和生物利用度，因此也用于药物输送。 γCD，广泛用于食品、制药、农业和化学工业，由8种以环状排列的葡萄糖单体组成。据报道，它可以提高辅酶Q10等疏水性成分的生物利用度[ 42 - 44 ].
在本研究中，我们生成了CAPE和γCD的偶联物，并利用多种癌细胞研究了它们的抗癌和抗转移潜力 在体外 和 体内 .
材料和方法 细胞培养 人类肺癌（A549）、纤维肉瘤（HT1080）、黑色素瘤（G361）、骨肉瘤（U2OS）、乳腺癌（MCF-7和MDA-MB-231）均来自日本研究生物资源收藏。 如前所述，通过逆转录病毒驱动的莫他林过表达获得莫他林过度表达的转移性衍生物[ 45 ]. 细胞在DMEM（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）中培养，在37°C的温度下，在5%CO2和95%空气的环境中，在加湿培养箱中添加10%胎牛血清。 将CAPE（咖啡酸苯酯）和CAPE-γCD（咖啡酸苯酯-γ-环糊精复合物）溶于二甲基亚砜（DMSO）中以制备1mM的原液，并添加到完整的细胞培养基中以获得所示的工作浓度。 所有生化和成像分析均在亚融合培养物（60-70%）上进行。
CAPE-γ-CD复合物的制备 在γCD水溶液中，以25 o（o） C.将混合物孵育20 h，并持续搅拌，然后生成CAPE-γCD作为沉淀。 通过离心从所得混合物中去除上清液后，用水和氯仿清洗粗CAPE-γCD并干燥 真空中 本研究中使用了由此获得的CAPE-γCD。
细胞毒性和生长抑制试验 利用依赖于活细胞线粒体活性的定量比色MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化]分析法测定CAPE和CAPE-γCD对细胞活力的影响（Sigma-Aldrich，日本）。 单元格（5 X 10 三 )/井被镀成96块钢板。 过夜培养后，如图所示，用CAPE和CAPE-γCD处理细胞。 在处理结束时将MTT（0.5 mg/ml）添加到细胞培养基中，并在加湿培养箱（37℃和5%CO）中培养4 h 2 ). 在每个孔中用DMSO（100µL）替换含MTT的介质，以溶解紫色甲霜晶体。 使用分光光度计（瑞士TECAN）在550 nm处测量吸光度。 实验分三次进行。 使用GraphPad软件通过非配对t检验确定数据的标准偏差和统计显著性。
形态学观察 将细胞培养在12孔板中，当达到60%融合时，用不同浓度的CAPE、CAPE-γCD和γCD处理。 48-72小时后，用相差显微镜记录形态学变化。
集落形成分析 500个细胞被放置在一个六孔板中。 过夜培养后，用补充CAPE的培养基处理细胞。 处理后的细胞在接下来的10-15天内形成菌落，每隔三天定期更换培养基。 菌落在甲醇中固定，用0.1%结晶紫溶液染色，拍照并计数。
细胞周期分析 将MCF-7和MDA-MB-231细胞以2 X 10的密度放置在6孔板中 5 细胞/孔。 接种24小时后，用CAPE处理细胞24-36小时，然后用胰蛋白酶收获细胞。 细胞颗粒用冰镇70%乙醇固定并储存在-20 0 C直到再次使用。 固定细胞在500xg下离心5分钟，用冷PBS洗涤两次以去除乙醇，然后用RNase A（5μL，10 mg/ml）重新悬浮0.25 ml PBS，以避免假DNA-PI染色。 细胞在37℃孵育1小时 0 C，然后以500倍离心 克 5分钟。将颗粒重新悬浮在番石榴细胞周期试剂（EMD Millipore Corporation）中，并在黑暗中孵育5分钟。使用番石榴PCA流式细胞仪（Millipore）和flow Jo软件（7.6版，flow Jo，LLC，USA）分析染色的细胞。
细胞凋亡测定 以2×10的密度接种MCF-7和MDA-MB-231细胞 5 细胞/孔在6孔板中放置24小时，然后进行CAPE处理24小时至36小时。采用制造商推荐的程序，使用Guava Nexin试剂（EMD Millipore Corporation）检测凋亡分析。 采用Flow Jo软件对凋亡细胞进行定量。
cDNA阵列 按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Gibco BRL，Grand Island，NY）制备总RNA，并使用低输入快速安培标记试剂盒（安捷伦科技公司）标记Cy3或Cy5，与人类cDNA阵列载玻片杂交，并使用安捷伦2100生物分析仪系列II（日本北海道系统科学公司）进行分析。 与对照组相比，共有22932个基因的cDNA阵列数据在CAPE处理的细胞中上调了2倍以上，使用基因注释工具帮助解释关系（收集）来确定最有潜力的途径[ 46 ]和Advaita Bio的iPathway指南( http://www.advaitabio.com/ipathwayguide ). 软件分析工具实施了“影响分析”方法，该方法考虑了路径上所有信号的方向和类型、基因的位置、作用和类型[ 47 ]. 基因绘制在KEGG通路数据库中[ 48 ].
所得复合物的对接研究和分子动力学模拟 AutoDock 4.2套件用于CAPE与莫他林的分子锁定。 咖啡酸苯乙酯（CAPE）的三维结构检索自PubChem数据库（CID:5281787）。 检测CAPE的根，使6个键可旋转，并使用AutoDock Tools将坐标保存为PDBQT文件格式（用于存储坐标和原子部分电荷的扩展PDB格式）。 从PDB中获得了莫来林[PDB ID:4KBO]的晶体结构( 网址：http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do ). AutoDock工具用于通过添加所有氢原子制备晶体结构，以确保正确计算部分原子电荷，然后计算Gasteiger电荷。 在莫他林（残基253-282）上的p53结合位点周围生成一个60 x 60 x 60点的三维网格图。 采用拉马克遗传算法（GA），种群规模为150个码头，能量评估为2.5 x 10 6 用于执行对接步骤。 在所有对接结构中，选择对接复合体的最稳定或最低能量构象进行进一步分析。
为了评价莫他林活性位点内CAPE的动态稳定性，使用薛定谔套件的Desmond模块和Maestro作为界面，对对接的复合物进行了分子动力学模拟[ 49 , 50 ]. 应用OPLS 2005分子力学力场进行MD模拟。 首先，蛋白质被制备用于修复复杂结构中错误的原子表示。 制备步骤包括添加和优化氢原子、生成二硫键和封端。 然后将制备的蛋白质溶解在SPC水分子的三斜周期盒中，并通过添加适当数量的反离子进行中和。 为了消除不切实际的键距、键角和扭角等几何问题，进行了能量最小化。 使用带约束的最速下降法将系统最小化，直到未达到25 kcal/mol/O的梯度阈值。 在压力和温度恒定、时间步长为2 fs的条件下，对平衡系统进行了40 ns的MD模拟。 计算了迫击炮-CAPE复合体在整个仿真轨迹中相对于第一帧的均方根偏差。
对接复杂分子前后动力学模拟的MM-GBSA分析 在复杂的生物分子体系中，经常使用各种计算方法来计算结合自由能。 利用分子对接的记分函数预测蛋白质与蛋白质的相互作用和结合自由能来识别特定分子靶点的潜在先导化合物就是这样一种方法[ 51 ]. 尽管它们速度很快，但仍有一些缺点需要改进，例如缺乏对蛋白质柔韧性和水分子的处理，对溶剂化、熵和极化率的解释不正确，以实现较高的评分准确性。 MM-GBSA方法使用一个单一的最小化蛋白键结构，而不是从MD轨迹导出的各种框架，是一种有效的细化和重新筛选对接结果以及计算自由结合能的方法[ 52 ]. ΔG 结合 使用滑翔机Prime模块中可用的MM-GBSA分析计算迫击炮-CAPE复合物[ 53 ].
CAPE在人体内的药代动力学预测 为了确定CAPE的药物相似性和药代动力学，分析其三维结构以评估各种物理化学性质。 计算其吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET 生物信息学 使用Schrodinger套件的Qikprop模块和在线开放访问服务器admetSAR[ 54 ].
蛋白质印迹 对照细胞和处理过的细胞在RIPA裂解缓冲液（美国伊利诺伊州赛默飞世尔科学公司）中进行裂解，该缓冲液含有完整的蛋白酶抑制剂混合物（德国曼海姆罗氏应用科学公司），在冰上裂解20分钟。 将裂解物以15000rpm离心15分钟，并将上清液用于蛋白质印迹。 通过BCA（Bicinchonic Acid）分析（美国伊利诺伊州赛默飞世尔科学公司）测定细胞裂解物的蛋白质浓度。 在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上解析裂解产物（20µg蛋白质），并使用半干转移吸墨纸（日本ATTO公司）将其转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，MA）上。 用3%的BSA/TBST封闭膜，然后用指示的抗体进行探测：莫他林[ 45 ]、GADD45α（H-165）、p53（DO-1）、MMP-2（H-76）、波形蛋白（H-84）（加州圣克鲁斯生物技术公司）在4点过夜 o（o） C，然后用HRP结合二级抗体孵育（加州圣克鲁斯生物技术公司），并由ECL PLUS检测（英国GE Healthcare公司）。 用抗β-肌动蛋白抗体（Abcam，UK）检测细胞膜，作为内部负荷控制。 使用ImageJ软件（美国国家卫生研究院）对蛋白质信号进行量化。 数据的标准偏差和统计显著性分别通过Microsoft office excel（Microsoft Corporation，WA，USA）和QuickCals t-test计算器（GraphPad Software，Inc.，CA，USA。 数据的统计显著性表示为 * P<0.05， ** P<0.01和 *** 显著、非常显著和高度显著分别为P<0.001。
免疫荧光 对于免疫荧光，细胞（1 X 10 三 /孔）被镀在放置在12孔培养皿中的玻璃盖玻片上。 用PBS清洗对照和处理过的细胞两次，将其固定在预冷甲醇：丙酮（1:1）中的冰上5分钟，然后用0.1%Triton X-100在PBS中渗透15分钟。样品用1%牛血清白蛋白在PBS内封闭，然后在抗磨砂剂中孵育[ 45 ]p53（DO-1）和GADD45α（H-165）、MMP-2（H-76）、波形蛋白（H-84）（加州圣克鲁斯生物技术公司）p53BP-1一级抗体。 免疫染色通过用Alexa-488或Alexa-594缀合的抗体（分子探针）进行二次染色而显现。 用0.2%Triton X-100在PBS（PBST）中洗涤三到四次后，用Hoechst对细胞进行反染，以进行核染色，并用Fluoromount（Difco）覆盖。 细胞在蔡司Axiovert 200 M显微镜上进行检查，并通过AxioVision 4.6软件（卡尔蔡司）进行分析。
免疫沉淀分析 用dyna珠培养对照细胞和CAPE处理细胞的细胞裂解物（500μg） ® 蛋白A与抗莫特林多克隆抗体结合[ 45 ]4点过夜 o（o） C（Thermofisher Scientific，奥斯陆生命技术公司）。 免疫复合物（IC）用PBST（含0.2%Triton X100的PBS）洗涤三次，然后在变性SDS负载缓冲液（25μL）中通过70℃加热洗脱 o（o） 将IC与对照品（包括细胞裂解物（20μg）、IgG和Dyna珠）在7.5%SDS-PAGE上溶解10分钟，并使用半干转移系统（Bio-Rad）将其电印在PVDF膜（Millipore公司）上。 用抗p53（DO-1；SC126）和抗莫特林单克隆抗体探测膜。 使用ECL（增强化学发光；Amersham Pharmacia Biotech）检测蛋白质。 通过与IC中IgG和莫他林对照物的量进行标准化，定量莫他林-IC中p53的量。
伤口划痕试验 这个 在体外 采用创伤划痕试验检测细胞对CAPE和CAPE-γCD处理的迁移能力。 细胞在单层中生长，并用200µl移液管尖端均匀划伤细胞。 用PBS洗涤细胞以去除细胞碎片或漂浮细胞，并分别在对照或补充CAPE或CAPE-γCD的培养基上培养。 划伤时间指定为时间0。 在接下来的24小时内，在带有10倍相位物镜的相差显微镜下记录细胞向受伤区域的移动。 通过测量6-10张随机采集图像中的开放面积百分比来计算迁移能力。
体外 趋化性试验 将60-70%汇合的细胞用冷PBS洗涤，胰蛋白酶消化，并在5X10下重新悬浮于补充有0.5%牛血清白蛋白（Sigma）的DMEM中 4 细胞/ml.2.5 X 10 4 细胞被镀在BioCoat中 TM（TM） Matrigel公司 TM（TM） 侵入室（8-mm孔，BD Biosciences），在有无药物的情况下，按照制造商的说明进行侵入分析。 用10%乙酸提取侵入Matrigel和过滤器的细胞，并使用微孔板阅读器（瑞士TECAN）在590 nm处通过吸光度进行定量。
体内 抗肿瘤和抗转移检测 分别使用裸鼠皮下异种移植和尾静脉注射模型评估CAPE和CAPE-γCD的肿瘤和转移抑制作用。 Balb/c裸鼠（4周龄，雌性）购自日本东京的Nihon Clea。 动物在实验室中驯化一周。 皮下注射细胞（1 X 10 7 悬浮在0.2 ml生长培养基中）进入裸鼠腹部和尾静脉（1 X 10 6 悬浮在0.2 ml培养基中）。 每隔一天注射CAPE或CAPE-γCD（如图所示，通过腹腔或口服途径），从注射细胞后的第1天开始。 每隔一天监测小鼠的肿瘤形成和体重。 皮下肿瘤的体积计算为 V=长x宽 2 /2，其中 L（左） 长度和 W公司 分别是肿瘤的宽度。 数据的统计显著性由三个独立实验计算得出（每个实验3个）。 为了进行转移试验，在注射后30天处死小鼠，并筛选是否存在肿瘤。 记录对照组和治疗组小鼠的肺部肿瘤数量。 所有程序均按照日本筑波国家先进工业科学技术研究所（AIST）安全与环境管理部动物实验与伦理委员会的要求进行。
结果 CAPE和CAPE-γ-CD结合物的抗癌和抗转移活性 我们检测了CAPE对包括A549、HT1080、G361、U2OS、MCF-7和MDA-MB-231在内的多种人类癌细胞株的细胞毒性，发现它对5-100μM范围内的所有癌细胞都具有细胞毒性（图。 1 A、 B）。 然而，大多数显示的IC50为10-20μM，A549显示出显著的抗性（IC50-100μM），MCF-7显示出高灵敏度（IC50-5μM）（图。 1 B） ●●●●。 为了确定CAPE是否可以用于治疗侵袭性和转移性癌症，我们使用了具有不同细胞迁移和转移潜能的基因同源乳腺癌细胞。
图1 CAPE对人癌细胞的细胞毒性。 显示了经CAPE处理的细胞中细胞活力的剂量依赖性损失。 A549、HT1080、G361和U20S的IC50分别为~100、5、20、60μM（A）。 CAPE对MCF-7、MDA-MB-231细胞及其高表达mortalin的转移衍生物的细胞活力（B）和集落形成效率（C）的影响表明，CAPE在短期（A）和长期（B）活力分析中均抑制细胞增殖。 （D） 对照组和CAPE处理的细胞的细胞周期分析显示，低剂量CAPE（分别为2μM和10μM CAPE）处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中G1期阻滞。 （E） 高剂量（分别为10μM和40μM CAPE）导致细胞凋亡。
这些是由逆转录病毒介导的压力伴侣莫特林过度表达产生的[ 45 , 55 ]. 在短期和长期存活试验中，我们发现CAPE抑制了亲本及其转移衍生物的生长，达到了可比较的水平（图。 1 B和1C）。 此外，我们将对照组和CAPE（低剂量和高剂量）处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞进行FACS分析，发现低剂量（分别为1-2μM和5-10μM）的CAPE导致细胞周期G1期阻滞，而高剂量（分别是5-10μM和25-50μM）处理导致细胞凋亡（图。 1 D和1E）。 在亲代和转移性乳腺癌细胞系中都获得了类似的结果，这表明CAPE也可用于治疗侵袭性和恶性细胞。
为了研究CAPE诱导细胞毒性的分子机制，我们对对照细胞和CAPE处理的细胞进行了延时观察。 当用CAPE（10μM）处理MCF-7细胞时，约24小时后出现凋亡。然而，约48至60小时时出现分裂细胞，超过了凋亡细胞群（图。 2 A和未显示的数据）表明CAPE的短期影响可能是由于其不稳定的特性[ 56 - 58 ]. 我们通过定期（每24小时）更换细胞培养基和新鲜添加CAPE来证实这一点。 在这种治疗方案下，生长停滞/凋亡（10μM）持续存在（图。 2 A和数据未显示）。 数据证实，CAPE的短期效应至少部分是由于其不稳定特性。 CAPE具有酯键、α和β-不饱和羰基和邻苯二酚基团等反应位点，这是CAPE在生理条件下不稳定的原因，导致其水解、Michael加成和氧化（图。 2 B） ●●●●。
图2 CAPE在细胞培养基及其与γCD复合物中的不稳定性。 （A） 用CAPE处理MCF-7细胞一次或定期（每24小时一次）共72小时的相位对比图。当只处理一次的培养物中出现健康分裂细胞时，定期处理的培养物显示生长停滞/凋亡。 （B） 结果表明，CAPE的酯键、α、β-不饱和羰基和邻苯二酚基团等反应位点是导致其不稳定性的原因。 （C） 绑定常数( K（K） )对于CAPE与βCD的络合，显示了紫外/可见分光光度滴定法。 滴定曲线分析表明，1:1络合提供了一个 K（K） （2.52±0.04）x 10的值 三 M（M） -1 （插图）。 （D） 绑定常量( K） CAPE与αCD或γCD的复合物的值。
为了提高CAPE的稳定性，我们以1:1的摩尔比制备了它与γCD的配合物。 绑定常数( K（K） )对于CAPE-γCD复合物，在1 X 10中测定 -1 pH 7.4和25的M磷酸盐缓冲液 o（o） C采用紫外/可见分光光度法。 首次记录到CAPE的光谱变化，支持其与γCD形成络合物（图。 2 C） ●●●●。 用1:1共轭的理论方程分析滴定曲线提供了一个 K（K） （2.52±0.04）x 10的值 三 M（M） -1 （图。 2 C插图）。 类似 K（K） 获得了CAPE与αCD或γCD的共轭值（图。 2 D） 。 通过在140℃下培养CAPE和CAPE-γCD来检测它们的热稳定性 o（o） 与预期一样，在CAPE的情况下观察到颜色变化和熔化。 另一方面，CAPE-γCD保持其固态，仅显示出轻微的颜色变化。 热处理样品中CAPE的HPLC定量也证实了CAPE-γCD的热稳定性增强（图。 三 A） 。
图3 CAPE-γCD复合物的表征及其在各种不利条件下的稳定性。 （A） 140℃下的热稳定性分析 o（o） 24小时C显示CAPE变色和熔化，但不显示CAPE-γCD。 通过HPLC对热处理样品中CAPE含量的分析，也观察到热稳定性增强。 （B） 在pH 7.4和25下，CAPE和CAPE-γCD抵抗α-糜蛋白酶（ChT）水解3 h的稳定性 o（o） C.同时观察到CAPE的降低和咖啡酸的增加（a）。 CAPE-γCD显示出比CAPE更高的稳定性。 γCD对CAPE与半胱氨酸Michael 1,4-加成反应的稳定性（如（b）所示）。 （C） 通过添加碘酸钾和紫外/可见光谱法监测CAPE和CAPE-γCD的抗氧化稳定性。 大部分CAPE（80%）在培养过程中与碘酸钾反应。 对于CAPE-γCD，在相同条件下，40%的CAPE发生反应，60%受到保护。
为了检测CAPE和CAPE-γCD对胰腺分泌的蛋白酶α-糜蛋白酶（ChT）水解的稳定性，将CAPE（50μM）和ChT在pH 7.4和25的条件下培养3h o（o） C在没有或存在γCD（20μM）的情况下。 如图所示。 三 B、 用HPLC同时监测CAPE的减少和咖啡酸的增加（图。 三 B-a）。 数据表明，CAPE会被α-糜蛋白酶（肠道中存在的消化酶）水解。 值得注意的是，CAPE-γCD对ChT的消化有抵抗力，表明其稳定性。 在检测Michael 1,4-与半胱氨酸加成反应中CAPE和CAPE-γCD稳定性的试验中观察到类似的结果（图。 三 B-B）。 为了检查CAPE和CAPE-γCD的抗氧化稳定性，将碘酸钾（一种已确定的氧化剂）添加到CAPE（50μM）溶液中，不存在或存在γCD（20 mM）。 通过紫外/可见光谱法监测氧化反应（图。 三 C） ●●●●。 没有观察到醌衍生物的产生，这通常通过峰（约400nm）的增加来指示。 因此，在这种条件下观察到的CAPE随时间变化的光谱变化可能表明醌衍生物与一些亲核试剂（例如H）的Michael 1,4-加成反应迅速 2 O或OH - 以氧化反应为限速步骤。 值得注意的是，尽管80%的游离形式的CAPE在3小时内与碘酸钾反应，但在相同的实验条件下，当与γCD络合时，只有40%的CAPE反应，这表明γCD可以稳定CAPE抗氧化（图。 三 C） ●●●●。
接下来将等量的游离形式的CAPE和γCD复合物用于细胞活性研究。 如图所示。 4 A、 其中γCD本身对细胞无毒，CAPE表现出短期毒性，CAPE-γCD复合物表现出持续的生长停滞或凋亡，表明CAPE-βCD比CAPE更有效。 定量细胞活性分析还表明，与游离形式相比，在其与γCD的复合物中等效剂量的CAPE具有更强的细胞毒性。在乳腺癌细胞系及其转移衍生物中也获得了类似的结果（图。 4 A和4B，数据未显示）。 接下来，我们使用亚毒性剂量的CAPE，并检查其对细胞迁移的影响（图。 4 C） ●●●●。 对MCF-7和MDA-MB-231细胞及其转移性高表达迫害素衍生物的创伤和侵袭试验表明，CAPE-γ-CD复合物具有较强的抗迁移活性（图。 4 C和4D）。 在细胞侵袭试验中也获得了类似的结果（图。 4 E和4F）。
CAPE导致DNA损伤反应上调 为了确定CAPE诱导的生长停滞和抗迁移活性的分子机制，我们对对照组和经CAPE（10μM）处理的MCF-7细胞进行cDNA阵列分析。 我们发现CAPE在转录水平上引起了几种蛋白质的上调和下调。 顶部上调的信号通路参与细胞周期阻滞和细胞周期负调控，包括GADD45α（生长抑制和DNA损伤诱导的α）、CDKN1A（细胞周期依赖性激酶抑制剂1a（p21）、DDIT3（DNA损伤诱导转录物3）、， SKIL（Ski-Like癌基因，TP53INP1（肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1，GATA3（Gata结合蛋白3）和RHOB（Ras同源家族成员b））（图。 5 A和5B）。 根据这些数据，我们对GADD45α在蛋白和mRNA水平的表达进行了分析。 蛋白质印迹和免疫染色显示，在CAPE处理的细胞中，GADD45α上调（图。 5 C和5D）。 此外，在处理过的细胞中GADD45α转录物增加了两倍，表明CAPE可能触发癌细胞的DNA损伤反应（图。 5 E） ●●●●。 53BP1和γγ-γγγ-谷朊病毒2αX染色进一步证实了这一点，显示CAPE、CAPE-γCD上调，但γCD处理的细胞没有上调（图。 5 F和数据未显示）。
CAPE通过靶向mothalin-p53相互作用导致p53功能上调 基于GADD45α是p53抑癌剂的下游效应器，参与细胞对DNA损伤的生长抑制，我们假设CAPE诱导的GADD45β的增加可能是通过激活p53介导的。 对对照细胞和CAPE处理细胞中p53的检测确实揭示了p53的上调和核移位，以及其下游效应物p21的增加 WAF1（加权平均1） 在MCF-7、U2OS以及A549细胞中（图。 6 A和数据未显示）。 p53和p21增加 WAF1（加权平均1） Western blotting证实了处理后的细胞（图。 6 B） ●●●●。 此外，p53依赖性报告分析显示，CAPE处理细胞中p53的转录激活功能增加（图。 6 C） ●●●●。 我们接下来预测，p53的增加可能是由于靶向莫他林所致，莫他林是一种已知的抑制p53活性的应激伴侣[ 45 , 55 , 59 - 62 ]由CAPE提供。 使用生物信息学和分子对接工具，我们检测了CAPE是否可以与莫他林结合并干扰莫他林-53的相互作用，如下所示。
图4 CAPE和CAPE-γCD复合物的抗癌潜力。 （A） CAPE、γCD和CAPE-γCD对MCF7和MDA-MB-231细胞存活、迁移和侵袭的影响。 显示了相位对比图像（A）、细胞存活率（B）在伤口划痕（C&D）和细胞侵袭试验（E&F）中的迁移。
图5 通过cDNA阵列分析表征CAPE的细胞毒性。 （A） cDNA阵列分析的通路； 与对照细胞相比，CAPE中的基因上调（红色）和下调（绿色）。 （B） 通过cDNA阵列分析确定CAPE处理细胞中的基因上调。 （C） 对照组和CAPE处理的细胞中GADD45α的免疫染色显示后者增加。 通过Western blotting（D）和RT-PCR检测到CAPE和CAPE-γCD处理细胞中GADD45α的增加。 （E） 53BP1免疫染色显示CAPE-γCD树突状细胞增加。
使用AutoDock Tools的Lamarckian遗传算法（GA）将CAPE的三维结构停靠在所需的蛋白质分子网格坐标处。 该化合物与莫他林p53结合域表现出良好的结合亲和力，对接分数为-5.72 kcal/mol，即结合能约为-23.93 kJ/mol。 258到282个莫他林残基与p53相互作用。 发现CAPE通过氢键和疏水相互作用与许多这些重要的残基相互作用（图。 7 A） ●●●●。 残基Lys 135的氮（NZ）分别与CAPE的第三和第四氧原子形成了2.59和3.32 Au的两个氢键，而Thr 271的氧原子（OG1）与CAPE第三氧形成了2.61 Au的一个氢键。 参与与CAPE保持疏水接触的残基涉及Tyr 196、Phe 250、Asp 251、Thr 267、Asn 268、Gly 269、Asp 270和Phe 272。 由于配体分子CAPE占据了p53结合的mortalin腔，因此强烈暗示mortalin-CAPE相互作用会阻碍mortalin-p53界面，从而抑制p53在细胞质中的隔离，导致其核移位和活化。 将CAPE与mortalin对接后获得的大师姿势查看器文件用作MM-GBSA分析的输入。 在对接的复合物上使用MM-GBSA方法，结合的自由能（ΔG 结合 )使用以下公式计算：ΔG 结合 =最小络合物的能量-（最小配体的能量+最小受体的能量）。 用MM-GBSA方法估算了对接配合物的结合自由能为-9.74 kcal/mol，表明CAPE与莫特林的结合是一个热力学有利的过程。
在40 ns长的MD模拟运行中，通过对mortalin-CAPE复合物的热力学稳定性分析，揭示了相互作用模式的变化。 在模拟运行的前5 ns期间，复合物中的蛋白质骨架偏离其初始状态约2.0º，然后在其余35 ns内获得稳定构象（图。 7 B） ●●●●。 图 7 C说明了在40 ns模拟运行过程中CAPE位置的变化。 尽管配体的位置相同，但为了达到最终的能量稳定状态，它获得了不同的构象。 获得了表示过去30 ns内所有帧平均值的帧，并用于进一步分析。 观察到配体向蛋白质结构的一个埋藏腔移动得更深。 在疏水性和范德瓦尔相互作用的帮助下，CAPE与蛋白质稳定地相互作用。 参与该结合的莫他林氨基酸残基包括Tyr 196、Phe 250、Asp 251、Thr 267、Asn 268、Gly 269、Asp 270、Thr 271（图。 7 C） ●●●●。 许多这些残基甚至在MD模拟之前就已经相互作用，并且是莫他林关键的p53结合域的一部分。 计算并估计MD后复合物的结合自由能为-17.87 kcal/mol，证实CAPE与莫特林蛋白的结合是热力学上有利的过程。 基于这些数据，我们强烈预测CAPE靶向mothalin-p53复合物并导致p53功能的重新激活，如图所示。 6 此外，我们通过在对照细胞和CAPE处理细胞中共同免疫染色和共同免疫沉淀莫特林和p53来验证这一预测。 与对照组相比，CAPE处理的细胞显示出强烈的核染色（图。 7 D） 并且在mortalin-p53复合物中具有减少的p53量（图。 7 E和数据未显示）。
CAPE导致转移信号下调 Mortalin在癌细胞中富集，并已被证明可促进致癌和转移信号[ 45 , 55 , 59 - 62 ]. 接下来，我们检测了对照细胞和CAPE处理细胞中莫他林的表达水平。 如图所示。 8 A-C，在CAPE处理的细胞中，莫他林在蛋白质和转录水平上都有所下降。 我们检测了这些细胞中细胞迁移关键调控因子的表达水平，发现波形蛋白、MMP-2、MMP-3、β-catenin、TGF-β和WNT-3α转录物减少（图。 8 C和8D）。 值得注意的是，CAPE-γCD处理的细胞表现出更高的减少（图。 8 A和8B）。
图6 CAPE激活p53-p21通路。 （A） 对照细胞和CAPE处理细胞中p53和p21的免疫染色显示其增加。 （B） 用特异性抗体免疫印迹法测定p53和p21的增加。 （C） p53依赖性报告分析显示CAPE处理的细胞中p53的转录激活功能比对照细胞中增加。
图7 CAPE和mortalin的分子对接分析。 （A） mortalin的氨基酸残基在分子对接后与CAPE一起参与氢键（粉红色）、疏水性和范德华相互作用（橙色）。 （B） 显示在整个模拟运行期间停靠综合体与其初始构造的偏差的图表。 （C） 模拟后莫他林和CAPE之间的分子相互作用模式。 残留物主要涉及疏水和范德瓦尔相互作用（以橙色显示）。 可以观察到CAPE位置的变化。 配体显示出取向的变化，因此使用来自稳定时间框架的平均代表性结构进行相互作用分析。 （D） MCF7对照细胞和CAPE处理细胞的p53免疫染色在后者显示出强烈的核染色。 （E） 对照组和CAPE处理的细胞中mothalin-p53复合物中p53的相对量显示后者中mothlin-p53复合物减少。
图8 CAPE下调莫他林和其他转移调节蛋白。 CAPE对莫他林和细胞迁移调节蛋白的影响。 通过Western blotting（A）、免疫染色（B）和RT-PCR（C）观察到莫他林、波形蛋白、MMP-2的降低。 qPCR测定的莫他林、波形蛋白、β-catenin、TGF-β和Wnt-3α的减少如图所示（D）。
体内 CAPE和CAPE-γCD复合物的抑癌和抗转移活性 最后，我们研究了CAPE和CAPE-γCD复合物的抗癌和抗转移潜力 体内 裸鼠肿瘤试验。 建立的模型细胞系（人类纤维肉瘤，HT1080）用于皮下异种移植（用于肿瘤生长）和尾静脉注射（肺转移）（图。 9 ). CAPE在皮下异种移植物中显示出显著的肿瘤抑制作用。 尽管γCD本身没有任何作用，但无论是腹腔注射还是灌胃给药，CAPE-γCD的活性都高于CAPE。 对对照组、CAPE和CAPE-γCD处理小鼠的肺转移检测显示，CAPE-βCD复合物具有更强的抗转移活性。 在两种给药途径中，尽管CAPE治疗的小鼠肺转移显著减少，但CAPE-γCD治疗的效果显著增强。
CAPE的理化性质和药代动力学 QikProp预测有机分子的物理意义描述符和药学相关属性。 它还提供了将这些分子特性与95%已知药物的分子特性进行比较的重要范围。 它给出了一个描述符“#star”，表示有机分子的属性数量，这些属性不在已知药物相同属性的值范围内。 根据这种预测算法，数值越低，小分子的药物相似性越好。 CAPE的#star值为0。 因此，计算的属性都不在要求的范围之外，并且与已知药物的属性非常相似。 利宾斯基的五法则是一个经验法则，它利用四种分子特性来确定药物的可能性。 分子质量为284.31 g/mol的CAPE，2个氢键供体，3.5个氢键受体，辛醇/水分配系数为3.18，完全满足五法则的所有条件。
图9 体内 CAPE和CAPE-γCD复合物的抗肿瘤和抗转移活性。 CAPE和CAPE-γCD对 体内 裸鼠皮下异种移植或尾静脉注射HT1080产生肿瘤的进展。 经CAPE和CAPE-γCD复合物（腹腔注射或灌胃）治疗的小鼠肿瘤体积减少。 CAPE-γCD治疗的小鼠在两种模型中均表现出较高的肿瘤抑制程度。 没有观察到对体重的影响。
众所周知，溶剂可及表面积（SASA），特别是极性表面积（PSA）与通过膜的被动分子转运有很好的相关性，因此可以估算药物的转运特性。 CAPE的总SASA为607.45欧 2 疏水性成分为97.271欧 2 亲水成分为162.901Å 2 。这些值在QuickProp给出的范围内。 它还使用一些基于知识的规则集计算药物在人体中口服吸收的概率百分比。 该值已被证明与人类口腔吸收密切相关。 CAPE具有较高的口服吸收率，百分比值为89.30%。 据预测，它对中枢神经系统也不起作用。 使用在线免费平台AdmetSAR预测了其他一些与毒性相关的影响。 血脑屏障（BBB）是一个调节系统，它将大脑环境与循环系统的直接接触隔开，从而保护大脑不受有害溶质颗粒的影响。 CAPE呈BBB阴性，确保其给药对大脑安全。 P-糖蛋白（P-gp）是一种外排转运蛋白，其诱导会导致口服药物的生物利用度降低，从而降低治疗效果。 或者，它的抑制也会导致生物利用度增加，从而增加不良副作用的风险。 因此，一般来说，药物既不应是P-gp的底物，也不应是其抑制剂。预计P-gp不会成为CAPE全身暴露的屏障，因为它被预测为P-gp非底物和非抑制剂。它还被证明是非致癌的，易于生物降解，在一定程度上具有毒性 梨形四膜虫 鱼和蜜蜂。
讨论 γCD可提高CAPE的抗肿瘤和抗转移效力 这个 在体外 CAPE对多种肿瘤细胞株的细胞毒性试验表明，CAPE具有抗癌活性； 不同癌细胞系的细胞毒性剂量范围与其他报告一致[ 15 , 18 , 26 , 29 , 41 , 58 ]. 总之，这表明CAPE的毒性是广泛的，而不是特定于某些癌细胞系。 此外，通过使用转移细胞，我们发现CAPE不仅对抑制癌细胞生长有效，而且对转移也有效（图。 4 , 8 和9）。 计算和分子分析表明，CAPE靶向肿瘤细胞特异性的mothalin-p53相互作用[ 45 , 46 ]因此，在一些早期的研究中，CAPE对癌细胞的选择性毒性可能是部分原因[ 17 - 20 ]. 早先的研究表明，莫他林可以相互作用，使野生和突变的p53蛋白失活。 这些相互作用的消除分别导致野生和突变p53蛋白的生长停滞和凋亡活性的激活[ 60 , 61 ]. 综上所述，CAPE可用于治疗野生型和突变型p53癌细胞。 此外，CAPE处理的细胞显示了莫特林的下调，莫特林在癌细胞中富集，并已被证明有助于致癌和转移，这表明它是一种适合癌症和转移细胞治疗的抗莫特林分子[ 55 , 59 - 62 ].
据报道，辅酶Q10、生育三烯醇和姜黄素等几种亲脂成分的生物利用度可以通过与γCD的偶联/复合物来提高， Terao及其同事报告说，这种生物利用度的提高是由于γCD在胶束溶液中增加了亲脂成分的水溶性[ 63 ]. 胆汁酸的主要成分牛磺胆酸钠（Na TCA）在小肠中也显示出通过类似的机制增加CAPE-γCD的水溶性[ 63 ]. 综上所述，这些数据表明，CAPE的不稳定性可以通过与γCD生成复合物来补偿，从而提高其溶解性、保护性和生物利用度。 接下来，我们通过以下方式研究了该假设 在体外 和 体内 实验。
CAPE抗肿瘤活性的机制尚未阐明。 结果表明，它通过p53依赖性和p53非依赖性途径抑制12-O-十四烷酰基激素-13-乙酸酯诱导的细胞转化并诱导小鼠表皮细胞凋亡[ 64 ]. 研究表明，它能抑制脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFN-γ）诱导的一氧化氮和iNOS蛋白表达（参与炎症和自身免疫介导的组织破坏）的产生，并具有抗炎、抗病毒和抗癌作用[ 65 ]研究表明，CAPE治疗诱导的细胞周期阻滞和生长抑制是通过激活Skp2、p53、p21Cip1和p27Kip1蛋白介导的[ 66 ]. 结果表明，它能抑制NFkB，激活MAPK家族蛋白p38和JNK，导致细胞凋亡[ 67 ]. 早期研究支持CAPE（基质金属蛋白酶表达减少）的抗转移活性[ 68 - 71 ]. 除这些报道外，我们还证明了CAPE靶向应激伴侣mortalin，导致（i）通过p53-GADD45α-p21信号传导激活生长停滞，以及（ii）通过基质金属蛋白酶抑制细胞迁移。 此外，保护其不被降解的CAPE-γ-CD复合物可以显著增强这些活性。 在 体内 抗肿瘤试验，CAPE-γ-CD复合物（通过腹腔注射或口服使用）在 体内 因此它被认为是一种有效的抗癌试剂。
致谢 作者感谢Navjot Shah、Tomoko Nakamoto和Tomomi Toda的技术援助，感谢Nashi Widodo对cDNA阵列数据的分析。
作者的贡献 概念和设计：RW、SCK、KT
数据采集（提供的动物、采集的、提供的设施等）：NN、YI、SG、PB、AG
手稿的撰写、审查和/或修订：RW、PB、YI、AG、JKG、DS、SCK、，
行政、技术或物质支持（即报告或组织数据）：RW、NN、YI
竞争性利益 提交人声明，不存在竞争利益。
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作者联系人 通讯作者：Sunil C Kaul，日本国立高级工业科学技术研究所（AIST），日本筑波东1-1-1中央5-41，305 8565。 电话：+81 29 861 6713，传真：+81 29861 2900，电子邮件：s-kaul go.jp Or Keiji Terao，CycloChem Co.，Ltd.，7-4-5 Minatojima-minamimachi，Chuo-ku，Kobe 650-0047，Japan。 电子邮件：keiji.terao 通用域名格式。
2016年2月1日收到 接受日期：2016年6月29日 发布日期：2016年8月11日
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