本文在以下内容中提到：

引言

双特异性磷酸酶6（DUSP6）是一种丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶发挥作为MAPK通路负调控因子的关键作用(1,2). 这个MAPK通路控制着大量的生理过程，包括细胞增殖、细胞周期停滞、细胞存活和细胞运动性(三–6). 具体来说，DUSP6脱磷细胞外苏氨酸和酪氨酸残基信号调节激酶（ERK）1/2，并使ERK1/2失活反馈回路(7–9). 此反馈回路的中断可能增加了对生长因子的接触，导致肿瘤甚至恶性转化(2,10,11).

在不同类型的肿瘤中，DUSP6具有不同的作用取决于肿瘤类型和致癌阶段。先前的研究表明DUSP6是一种肿瘤几种肿瘤中的抑制基因(12–23).在胰腺癌中，DUSP6的表达下调，过度激活ERK，最终导致改善癌症的发展和进展(12–14).DUSP6的下调是由DUSP6基因内含子1的CpG序列在糖尿病进展中的作用胰腺癌(15). DUSP6表达与生长活性呈负相关肺癌的组织学分级(16). 在卵巢癌中，DUSP6表达丢失，尤其是在蛋白质水平，导致ERK1/2过度激活，最终导致人卵巢癌细胞的致瘤性和耐药性(17). 值得注意的是，DUSP6具有在某些其他肿瘤类型中有相反的作用。DUSP6上调骨髓瘤(18)、黑色素瘤(19)，神经胶质瘤(20)、胶质母细胞瘤(21)，角质形成细胞(22)和乳腺癌(23). 在胶质母细胞瘤中，过度表达DUSP6降低肿瘤细胞对抗癌的敏感性DNA损伤药物顺铂(21).DUSP6过度表达导致雌激素受体阳性乳腺癌细胞对生长抑制作用产生耐药性三苯氧胺(23). 此外，DUSP6甲基化在子宫内膜癌中并不常见(24). 因此，DUSP6的静音可能不会参与ERK激酶的组成性激活子宫内膜癌的级联反应(24).

然而，很少有研究报告DUSP6的作用食管癌。食管鳞状细胞癌这是一种潜在的致命疾病，在全球范围内发病率很高，尤其是在中国(25).尽管最近在食管鳞状细胞癌的诊断和治疗方面取得了进展ESCC患者的生存率仍然很低。因此，有一个研究ESCC肿瘤发生相关新基因的要求和进展，以开发更安全、更快的诊断和改善本病治疗后的疾病预后预测危险的疾病。

此前的一项调查显示DUSP6在香港ESCC(26).此外，我们之前的研究表明DUSP6的过度表达证实了ESCC的生长抑制单元格(27). 在本研究中，我们关注DUSP6表达与临床病理特征，DUSP6影响的机制ESCC细胞及其可能的表观遗传机制ESCC细胞中DUSP6的废除。

材料和方法

细胞系和初级组织

食管鳞癌与正常食管组织19对是从河南省癌症手术患者身上获得的医院（中国郑州）。购买了组织微阵列来自Biomax（美国马里兰州罗克维尔；ES1202和ES8010）。阵列共包括89个良性食管组织样本和95个局部食管癌样本。两人食管鳞状上皮细胞癌细胞系EC9706和KYSE150用于研究。Han建立并研究了EC9706细胞系等(28)，而岛田博士（First京都大学医学院外科，日本）。这两种细胞系按照其原始方法(28,29). 本研究由癌症研究所和医院的机构审查委员会，中国医学科学院和北京协和医疗学院（中国北京）。已获得书面知情同意书从病人那里。

细胞转染

空载体（pCMV-AC）和质粒包含人类DUSP6的互补DNA序列（pCMV-DUSP6）购自OriGene（中国北京）。ESCC公司瞬时转染EC9706和KYSE150细胞pCMV-AC或pCMV-DUSP6，根据制造商说明（Invitrogen Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）。免疫印迹用全细胞裂解物为在转染后24小时收集以确认合适的质粒DUSP6表达。

定量PCR

从每个样品中收集的总RNA为根据制造商的要求，使用TRIzol试剂提取说明（Invitrogen Life Technologies）。总RNA为用于使用PrimeScript Rtase（Takara，Shiga，日本）。RT产物被用作模板来扩增DUSP6。正向和反向引物为5′-AAC AGG GTT CCA GCA CAGCAG-3′和5′-GGC CAG ACA CAT TCC AGC AA-3′。GAPDH公司被用作内部控制。产品由解决3%琼脂电泳，溴化乙锭染色。DUSP6型使用StepOne实时PCR通过qPCR评估表达水平系统（应用生物系统公司，中国北京）。数据是由GAPDH强度归一化。

蛋白质印迹

按说明进行蛋白质印迹以前(30). 这些细胞是在1%NP-40裂解缓冲液中进行裂解，并在12000×g，持续20分钟。上清液作为蛋白质回收提取物。含有等量蛋白质的提取物为用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离电泳并转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Billerica，MA，美国）。这些膜是在0.01 M/l Tris-buffered生理盐水中与脱脂干乳孵育含有0.1%吐温-20以阻断非免疫特异性蛋白结合，然后与DUSP6（OriGene）的一级抗体结合磷酸化ERK（p-ERK；圣克鲁斯生物技术，圣克鲁斯，加利福尼亚州、美国）。用过氧化物酶偶联物孵育后仿射山羊抗兔IgG二级抗体（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA），蛋白质信号可视化增强化学发光（Pierce，Rockford，IL USA）。

免疫组织化学

福尔马林固定组织切片（4μm）脱蜡、再水化，并用3%的氢气孵育过氧化物，然后进行抗原回收处理，煮沸柠檬酸缓冲液（0.01 M/l，pH 6.0），以恢复被掩盖的表位。山羊血清（10%）用于阻断内源性过氧化物酶活性和非免疫特异性蛋白结合。这些部分当时是与DUSP6（OriGene）一级抗体孵育过夜温度为4°C。用1%的磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗后吐温-20，切片与次生辣根孵育过氧化物酶结合抗体在室温下保持30min。用新制备的样品观察免疫反应二氨基联苯胺底物和细胞核用苏木精。

DUSP6在食管癌细胞中的表达水平被细分为四类，阴性（0），微弱(1)，中等(2)和强大(三). 阴性（0）定义为组织没有染色。昏迷(1)表达被定义为轻微染色或中度染色的组织<25%的细胞呈强染色。中等(2)被定义为中度或重度25-50%的细胞染色。强大(三)被定义为>50%的细胞。定义高和低DUSP6的截止点表达25%。

使用5-氮杂-2′-脱氧胞苷

ESCC细胞系首先培养于10 cm平板和细胞保持到30%汇流。随后，用10μmol/l的5-氮杂-2′-脱氧胞苷（西格玛，圣路易斯，密苏里州，美国）5天，如前所述(16).采集这些细胞进行进一步研究。

甲基化特异性PCR分析

据报道胰腺癌中DUSP6基因高度甲基化(15)，我们为这两种产品设计了底漆非甲基化（正向：5′-GTA GGG GTT GTG AAT TGT GT-3′和背面：5′-AC CAC CAA TAC CCA CAA CCA-3′）和甲基化（正面：5′-GTA GGG GTC GCG AAT CGC GC-3′和反向5′-ACC GCC GAT ACC CGC内含子1中甲基化程度最高的AAC CG-3′）序列DUSP6。PCR条件如前所述(15).

膜联蛋白/碘化丙啶分析

EC9706和KYSE150细胞暂时用质粒构建体转染的两种细胞系及其通过胰蛋白酶消化收集转染子并用PBS洗涤，随后用annexin/PI染色。样品分析方法FACScan流式细胞术（美国新泽西州富兰克林湖区Becton Dickinson），根据制造商的说明。

统计分析

所有统计分析均使用SPSS进行软件（版本17.0；SPSS Inc.，中国上海）。中的差异正常和ESCC标本之间DUSP6蛋白表达，以及DUSP6表达与临床病理的关系ESCC患者的特征，通过χ2测试。DUSP6表达与组织芯片分析中ESCC患者的病理分级采用Spearman秩相关分析进行分析。学生的用双侧t检验比较试验值和对照值样品。P<0.05被认为是统计学上的差异显著。实验结果描述为平均值±SD。

结果

ESCC下调DUSP6

在本研究中，DUSP6的表达在ESCC中的mRNA和蛋白质水平。DUSP6蛋白表达水平通过ESCC组织芯片免疫组织化学染色进行测量(图1C). DUSP6蛋白是主要见于细胞质。发现正常食管上皮呈中等或强阳性染色，然而，癌组织显示阴性或弱免疫反应。总计，89个（91%）正常食管样本中的81个显示DUSP6蛋白表达和95例（64.2%）ESCC标本中的61例研究显示DUSP6蛋白表达降低。统计学分析显示DUSP6蛋白存在显著差异正常和ESCC标本之间的表达（P<0.000）。qPCR是评估19对正常人DUSP6 mRNA水平和来自相同患者的肿瘤组织(图1A). 总的来说，68.4%（13/19）肿瘤活检中DUSP6的表达水平低于相应的正常对应物；占肿瘤的36.8%（7/19）活检显示DUSP6至少下调两倍与配对的正常对应物进行比较。DUSP6蛋白ESCC细胞系及其转染物中的水平进一步升高用western印迹法评价(图。1B年). 结果显示，两种ESCC细胞系（EC9706）和KYSE150）及其pCMV转染体表现出极低的DUSP6蛋白表达，而它们的pCMV-DUSP6转染子DUSP6蛋白表达显著增高。这些结果表明下调的DUSP6表达可能在ESCC的肿瘤发生。

图1 DUSP6在食管中的表达癌症。（A） DUSP6在正常食管上皮中的表达及意义免疫组化检测原发性ESCC肿瘤。正常食管上皮显示在面板N和初级食管癌如T1、T2和T3所示（放大倍数：左×40；右×100）。（B） DUSP6在中的表达通过qPCR对来自相同患者的正常组织和肿瘤组织进行配对。在总共，36.8%（7/19）的活检显示至少有两倍与相应正常值相比，DUSP6下调相对应的人。虚线表示两个折叠下调阈值。（C） Western blot分析用于测定转染空载体的EC9706中DUSP6的表达EC9706、pCMV-DUSP6（DUSP6）转染EC9706，KYSE150，空载体转染KYSE150和pCMV-DUSP6转染KYSE150细胞。（D） Western blot分析用于检测DUSP6和p-ERK在EC9706、空载体转染的EC9706和pCMV-DUSP6（DUSP6）转染EC9706细胞。DUSP6，双特异性磷酸酶6；食管鳞状细胞癌肿瘤；p-ERK，磷酸化细胞外信号调节激酶。

人们普遍认为DUSP6是阴性的MAPK途径中的反馈调节器去磷酸化活化ERK(1). 在本研究中，DUSP6和在EC9706中检测到磷酸化ERK蛋白表达用western blotting检测ESCC细胞系及其转染体。作为如所示图1D，p-ERK表达降低，而DUSP6在亲代pCMV AC中的表达增加转染和pCMV-DUSP6转染EC9706细胞。强迫EC9706中DUSP6的表达显著抑制p-ERK表达，表明DUSP6表达增加与p-ERK下调相关在体外在里面ESCC公司。

DUSP6表达与临床病理特征

我们进一步分析了DUSP6与食管鳞癌的蛋白表达与临床病理特征(表一). 年龄、性别和原发性肿瘤大小与DUSP6的表达。值得注意的是，显著的相关性是食管鳞癌中DUSP6表达与病理分级的关系（r=−0.257，P=0.015）。还发现上调表达DUSP6与区域淋巴结显著相关转移。我们推测这一观察可能是由p-ERK对致瘤信号的负反馈回路淋巴结转移。

表一 DUSP6表达之间的关联食管鳞癌的临床病理特征。

表一

DUSP6表达之间的关联食管鳞癌的临床病理特征。

	DUSP6染色，n（%）
变量	−	+	++	相关性（P值）
年龄，年
<60	21 (37.5)	30 (53.6)	5 (8.9)	0.114 (0.275)
≥60	13（34.2）	16（42.1）	9 (23.7)
性别
男性	22 (34.9)	33 (52.4)	8 (12.7)	0.009 (0.930)
女性	12 (38.7)	13 (41.9)	6 (19.4)
TNM公司分类
pT型
pT型1	3 (60)	2 (40)	0（0）	0.170 (0.104)
pT型2	10 (40)	13 (52)	2 (8)
pT型三	20 (31.7)	31 (49.2)	12 (19.0)
N个
N个0	33 (39.8)	40 (48.2)	10 (12.0)	0.253 (0.014)
N个1	1 (10.0)	5 (50.0)	4 (40.0)
N个2	0 (0.0)	1 (100.0)	0 (0.0)
等级
G公司1	2 (15.4)	8 (61.5)	3 (23.1)	−0.257 (0.015)
G公司2	12 (27.9)	24 (55.8)	7 (16.3)
G公司三	17 (51.5)	12 (36.4)	4（15.7）

[i]DUSP6，双特异性磷酸酶6；食管鳞状细胞癌癌症。

启动子高甲基化抑制DUSP6表达

在本研究中，我们评估了DUSP6转录抑制中的超甲基化。这个用DNA处理两个ESCC细胞系（EC9706和KYSE150）甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷不同浓度（20和50μM）。恢复的DUSP6当药物浓度较高时，表达上调，如所示图2A.结果表明启动子的高甲基化很重要ESCC中DUSP6转录的病理抑制。

图2 DUSP6的甲基化状态启动子和内含子1。（A） Western blot分析显示修复DUSP6在两个ESCC（EC9706和KYSE150）细胞系中的表达5-氮杂-2′-脱氧胞苷二次脱甲基后不同浓度（20和50μM）。恢复的DUSP6表达在两种ESCC细胞系中5-氮杂-2′-脱氧胞苷浓度。（B） 甲基化特异PCR分析：DUPS6内含子1中从+544到+627的区域该基因用甲基化的特异引物进行PCR扩增或未甲基化的DNA作为模板。产品由解决3%琼脂电泳，溴化乙锭染色。DUSP6，双特异性磷酸酶6；食管鳞状细胞癌细胞癌；5-氮杂，5-氮杂-2′-脱氧胞苷；U、 非甲基化；M、，甲基化。

为了确定是否存在超甲基化发生在DUSP6的表达调控区，我们进行甲基化特异性PCR分析。高甲基化DUSP6内含子1中+544和+627之间的区域是报告，解释了DUSP6在先前显示的胰腺癌(15). 因此，本研究的重点是在这个地区。相同的甲基化特异性PCR分析是如前所述使用(15). 两者中的甲基化特定产品如预期，观察到ESCC细胞系（EC9706和KYSE150）(图2B).

在这种情况下，证明了内含子1中CpG岛的超甲基化可能是一个主要原因食管鳞状细胞DUSP6沉默的机制癌症。

DUSP6表达促进细胞凋亡ESCC公司

过度表达的DUSP6对转染检测DUSP6基因。

用质粒转染后，细胞被用annexin V-FITC和PI染色，分析ESCC细胞系及其各自的早期和总凋亡细胞转染剂(图3A). 是的发现两种pCMV-DUSP6转染体均显示出annexin/PI分析显示早期和总凋亡增加。这个平均早期凋亡细胞比例分别为3.40±0.28、2.40±0.46和父母中8.05±0.56%，pCMV-AC转染和pCMV-DUSP6分别转染EC9706细胞父母为5.85±0.79、6.08±0.41和14.45±0.05%，pCMV-AC转染和pCMV-DUSP6转染的KYSE150细胞，分别(图3B).

图3 DUSP6过度表达增加了ESCC通过PARP途径实现细胞凋亡。（A–C）Annexin/PI分析：EC9706和KYSE150细胞瞬时转染EV或pCMV-DUSP6质粒（DUSP6），用Annexin V-FITC和PI染色，然后用流式细胞仪进行分析。结果（含细胞百分比）为每个象限列出：左下角，有活力的细胞；右下方，细胞早期凋亡；右上角，细胞处于晚期凋亡状态。（A）具有代表性的流量直方图。（B） 显示百分比的条形图通过两种细胞系及其转染剂诱导细胞早期凋亡。（C） 显示细胞在总凋亡中所占百分比的条形图细胞系及其转染剂。（D） PARP检测：细胞凋亡DUSP6-过度表达EC9706和KYSE150转染体89-kDa PARP裂解产物的免疫印迹检测。DUSP6，双特异性磷酸酶6；食管鳞状细胞癌肿瘤；PI，碘化丙啶；EV，空向量；FITC、，异硫氰酸荧光素。

平均总凋亡细胞比例为父母为7.78±0.76、8.8±1.21和17.68±0.0.99%，pCMV-AC转染和pCMV-DUSP6转染EC9706细胞，分别为13.2±1.08、14.3±1.10和24.73±1.45%亲本、pCMV-AC转染和pCMV-DUSP6转染的KYSE150单元格，分别(图3C).统计分析显示早期和对照组和实验组之间的总凋亡比例两种ESCC细胞系的组及其转染子（P<0.001）。

随后，PARP的细胞表达及其在两个ESCC细胞中通过免疫印迹分析裂解产物细胞系及其转染剂。存在劈开的PARPcaspase介导的细胞凋亡标志物product被发现是在两个pCMV-DUSP6转染体中表达，与亲本和pCMV转染EC9706和KYSE150细胞，进一步证实DUSP6在这些细胞中的表达诱导了细胞凋亡单元格(图3D).

讨论

DUSP6是唯一的负反馈调节器正常发育过程中激活的ERK(1,31). 在目前的研究表明，DUSP6是一种候选肿瘤ESCC中的抑制基因。最初，ESCC细胞系和初级对肿瘤标本进行筛选，证明DUSP6mRNA和蛋白质水平下调表达水平在ESCC中。使用Spearman的秩相关分析，DUSP6表达与病理学呈负相关等级，表明DUSP6在人类ESCC中很重要致癌，尤其是在肿瘤进展和分化。随后，我们证明了启动子高甲基化导致了相反，去甲基化处理恢复了DUSP6在ESCC细胞中表达。最后，我们发现外源性DUSP6两种ESCC细胞系中的表达均显著诱导细胞凋亡。总之，这些结果表明DUSP6可能是一种肿瘤ESCC中的抑制基因和DUSP6的丢失可能在ESCC中起重要作用肿瘤发生。

DUSP6是DUSP家族之一对ERK起关键作用的选择性磷酸酶在各种疾病的发展和病理中。累计研究表明DUSP6与肿瘤有关进展和阻力。在各种类型的癌症中，DUSP6起作用以一种矛盾的方式。在胰腺癌中，DUSP6基因是在绝大多数胰腺中未发现表达癌细胞系与浸润性原发性胰腺癌组织(12,13). DUSP6有明显肿瘤抑制作用，是肿瘤的有力候选抑制基因(13,32). 与我们的调查结果一致组织学观察到DUSP6表达频繁缺失肺癌的肿瘤分级增加。DUSP6是一种潜在的肺癌抑癌基因(16). 然而，DUSP6过度表达在某些其他类型的癌症中充当癌基因(21,23).在本研究中，我们评估了mRNA和ESCC细胞系和原发肿瘤标本中的蛋白质水平。它证明DUSP6在ESCC中下调。组织微阵列分析表明DUSP6的表达与之相反与组织学分级相关，这表明DUSP6的表达与肿瘤进展和分化。我们假设DUSP6可能是一个有前途的食管鳞癌的预后生物标志物。需要进一步研究验证DUSP6蛋白作为生物标志物的临床实用性ESCC预后。

失活肿瘤抑制因子的关键机制基因是基因启动子高甲基化、编码外显子突变和杂合性缺失（LOH）。以前的研究已经证明DUSP6被内含子1的高甲基化下调(12,15)、LOH(16)或泛素化/蛋白酶体退化，退化(17). 在ESCC中，肿瘤抑制基因，如FHIT、ECRG4和DIRAS1下调基因启动子超甲基化(30,33,34).在目前的研究中，我们对DUSP6的初步调查下调集中于表观遗传基因沉默对癌症的发生和发展具有重要意义(35,36).观察到ESCC细胞中的甲基化特异性产物通过甲基化特异性PCR产生株系。进一步药物去甲基化治疗恢复了DUSP6表达式。这些结果表明，启动子超甲基化可能是导致丢失的一个重要因素在ESCC中表达DUSP6。与我们的结果一致先前的研究表明，超甲基化在香港ESCC下调DUSP6(37).

在功能上，DUSP6表现出抑制作用ESCC对肿瘤形成和癌细胞迁移的影响以前的研究(27,37). DUSP6在以下方面发挥了重要作用在先前的研究中诱导细胞凋亡；下调监管一氧化氮对DUSP6 mRNA的抑制作用内皮细胞(38). 这个DUSP6/MKP-3的外源表达已被证明诱导胰腺ERK激活减弱引起的细胞凋亡肺癌(13,39). 在本研究中，我们调查了DUSP6对ESCC细胞凋亡的影响。符合先前的研究(39)，我们的数据表明外源性DUSP6表达在早期和总凋亡在体外进一步支持了以下事实DUSP6可能是一个重要的候选抑癌基因ESCC公司。

据报道MEK/Erk通路可能抑制细胞凋亡(40–42)ERK的抑制对于诱导细胞凋亡(43). 鉴于ERK1/2在抗凋亡防御网络和DUSP6诱导细胞凋亡和ERK下调在体外在ESCC中，我们推测ESCC中的DUSP6可能是由ERK激活的减弱引起的。更多需要进行全面调查，以确定DUSP6、ERK与细胞凋亡的关系。

总之，目前的研究表明DUSP6在食管鳞癌中的表达随着浸润深度的增加而减少，独立于肿瘤分级预测肿瘤进展。已强制执行DUSP6表达诱导细胞凋亡在体外在里面ESCC公司。我们希望我们的数据可以提供新的证据来改进了解ESCC的致癌作用，这将有助于为治疗ESCC公司。

致谢

本研究得到了国家重点基础中国973研究计划（2009CB521803）。作者会比如感谢曹燕博士对肿瘤。

参考文献