本文在以下内容中提到：

介绍

结直肠癌（CRC）是最常见的癌症之一恶性肿瘤的类型和第三大病因全球癌症相关死亡率(1). 取得了巨大进展关于CRC治疗，包括靶向治疗和免疫治疗；然而，晚期CRC患者的预后仍然很穷。肿瘤转移和进展是主要原因CRC患者的癌症相关死亡率(2); 然而，分子机制潜在的肿瘤转移和进展是复杂的不清楚的。因此，发现CRC进展和转移的机制，以便开发新的抗癌治疗方案。

人类基因组测序表明我们绝大多数的基因组被转录以产生非编码基因RNA（ncRNAs），包括小的和长的ncRNA（lncRNA）(三). lncRNAs被定义为一类非编码RNA转录物>200个核苷酸长很少或没有蛋白质编码能力(4). 此前有报道称lncRNAs在调节多种生物包括细胞增殖、细胞侵袭、细胞分化与染色体失活(5). lncRNA可分为多种类别，包括转录物、反义lncRNA、长基因间ncRNAs和假基因，根据它们的结构和功能(6,7). 它们可以充当脚手架、向导、，其他分子的诱饵和系绳来调节其他基因(4). lncRNAs是考虑癌症研究中的新因素，并积累证据表明，它们可能作为致癌基因或肿瘤抑制基因，这取决于环境。

HOX基因家族，首次报道于同源异形研究果蝇属，包含一系列进化上保守的基因在胚胎发育(8). 这个lncRNA HOXD簇反义RNA 1（HOXD-AS1），位于HOXD1和HOXD3基因之间，由编码HOX转录反义RNA（HOTAIR）的同一基因家族(9). 与HOTAIR、HOXD-AS1类似在肿瘤进展和转移中也起着重要作用(10,11). 最近的一项研究表明HOXD-AS1在膀胱癌中上调，并影响肿瘤细胞的凋亡与转移(12). 然而，角色和基础HOXD-AS1在大肠癌发生和转移中的分子机制有待阐明；因此，本研究旨在探索HOXD-AS1在CRC进展和转移。

材料和方法

临床样本

人CRC组织和邻近正常组织本研究中使用的样本来自136名患者西安交通大学附属3201医院（中国汉中）。本研究由医学部批准机构审查委员会道德委员会西安交通大学附属3201医院。书面本研究获得了所有参与者的知情同意研究。没有患者接受化疗或放疗手术前。136例患者的临床病理信息在附属3201医院接受手术的患者2010年3月至2013年5月，西安交通大学，包括性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤深度、分化程度、T分期、淋巴结浸润和远处转移记录。

逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析

使用以下方法从组织和细胞中提取总RNA三唑®试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，根据制造商的协议。使用上标III将RNA反向转录成cDNA转录酶，根据制造商的协议（Invitrogen；赛默飞世尔科技公司）。qPCR分析为如前所述，用于检测HOXD-AS1表达(13). qPCR使用FastStart Universal SYBR-Green大师（#4913914001；罗氏Diagnostics，Basel，Switzerland）基于ABI QuantStudio 6 Flex系统（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）作为如下：在95°C下变性10分钟，然后在95°C持续5秒，60°C持续40秒，72°C持续45秒。使用GAPDH作为内源性控制使HOXD-AS1表达水平正常化。对microRNA（miRNA/miR）-217的表达进行qPCR分析根据前面描述的方法(14). qPCR分析检测波形蛋白、N-钙粘蛋白、蛞蝓、E-钙粘蛋白，α-钙粘蛋白和β-钙粘素，分化簇（CD）44、CD133、CD24、CD166、，八聚体结合转录因子4（Oct4），富含亮氨酸重复性G蛋白偶联受体5（Lgr5），性别根据到前面描述的方法(15). qPCR的所有引物列于表一.相对量化使用2-ΔΔCq方法(16). 每个样品都在一式三份。

表一 反向使用的底漆转录定量聚合酶链反应的现状研究。

表一

用于反向的底漆转录定量聚合酶链反应的现状研究。

基因	引物序列(5′-3′)
lncRNA	传真：5′-GGCTCTCCCTAATGTGTGG-3′
HOXD-AS1型	回复：5′-CAGGTCCAGCATGAAACAGA-3′
N-钙粘蛋白	传真：5′-GGTGGAGAGAGAAGAAGACCAG-3′
	回复：5′-GGCATCAGGCTCCACAGTG-3′
波形蛋白	传真：5′-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3′
	回复：5′-GCTTCCCTGTAGGTGCAATC-3′
蜗牛	传真：5′-CCTCCTGTCAGATGAGC-3′
	回复：5′-CCAGGCTGGAGGTCCTTG-3′
鼻涕虫	传真：5′-GGGGAGAGCTTTTTG-3′
	回复：5′-TCCTCATGTGTGTGCAGGAG-3′
E-钙粘蛋白	传真：5′-TGCCCAGAAAAATGAAAAAGG-3′
	回复：5′-GTGTATGGGCAATGCGTTC-3′
α-连环蛋白	传真：5′-AGCGAATTGGGCAGAGTGT-3′
	回复：5′-GTCTACCGCAAGTCCCTGGTC-3′
β-连环蛋白	传真：5′-ACAACTGTTTTGAAAATCCA-3′
	回复：5′-CGAGTCATTGCATACTGTCC-3′
CD44细胞	传真：5′-TTGCAGTCAACAGTCGAAGAAGA-3′
	回复：5′-CCTTGTTCACCAATGCACCA-3′
10月4日	传真：5′-cttgctgcagaagtgtgtgggaggaa-3′
	回复：5′-ctgcagtgtgtgttcgggca-3′
CD133型	传真：5′-TGGATGCAACACTGT-3′
	回复：5′-ATACCTGCTACGACAGTCGGT-3′
CD24型	传真：5′-TGAGAACATGTGAGGTTAC-3′
	回复：5′-GAAACTGAATCCCATCCACAA-3′
CD166型	传真：5′-TCCTCGCCGTCTGCTCTTCT-3′
	回复：5′-TTCTGAGGTACAGTCAGTCAGTG-3′
Lgr5级	传真：5′-TATCTGGCTCCGAGTGCTTGCC-3′
	回复：5′-ATCATAGCAGAGAGATGATACC-3′
Sox2系统	传真：5′-GCCGAGTGAAACTTTTGTCG-3′
	回复：5′-GGCAGCGTGACTTACCTCT-3
纳克	传真：5′-AATACTCCAGCCTCCCAGCAGATG-3′
	回复：5′-TGCGTCACACCATTGTATTCTC-3′
GAPDH公司	传真：5′-TGCACCACACTCGCTTAGC-3′
	回复：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′
U6型	F： 5′-CTCCGCTTCGGCA公司GCACA-3′
	回复：5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′
miR-217型	传真：5′-TACTCAACTCACTACATGCATCAGGA-3′
	回复：5′-TATGGTGTTCTGCTCTCTGTC-3′

[一]CD，组区别；HOXD-AS1，HOXD簇反义RNA 1；Lgr5、，富含亮氨酸的重复性G蛋白偶联受体5；lncRNA，长非编码RNA；miR-217，microRNA-217；10月4日，八聚体结合转录因子4；Sox2，性别决定区域Y框2。F、 向前；R、 相反。

细胞培养

CRC细胞系[HCT116，美国典型培养物采集（ATCC）-CCL-247；SW620，ATCC-CCL-227；SW480，ATCC-CCL-228；DLD-1、ATCC-CCL-221；HT-29、ATCC-HTB-38；LoVo、，ATCC-CCL-229]和人类正常结肠上皮细胞系CCD-112CoN（ATCC-CRL-1541）从ATCC（马纳萨斯，美国弗吉尼亚州）。根据制造商的要求培养细胞方案：HCT116和HT-29细胞在McCoy的5A中培养，SW620和SW480细胞在Leibowitz L-15，LoVo细胞中培养在F12K中培养，在DMEM中培养CCD-112CoN细胞DLD-1细胞在RPMI-1640中培养（均来自Gibco；Thermo费希尔科学公司）。所有媒体都补充了10%胎牛血清（FBS）（Gibco；Thermo Fisher Scientific，股份有限公司）。

质粒构建和细胞转染

HOXD-AS1全长片段来自HCT116细胞并亚克隆到pcDNA3.1（+）载体（Thermo FisherScientific，Inc.）用于HOXD-AS1过度表达（正向，5′-GGTCGAGTTTGTGCCGCGC-3′和背面，5′-CGCGCCGCTGACACTTGAA-3′）；该矢量随后被命名为pcDNA-HOXD-AS1载体。SW480细胞生长到70-80%的汇合处感染pcDNA-HOXD-AS1载体（150 nM），使用脂多糖胺®2000年（Invitrogen；Thermo FisherScientific，Inc.）。在此外，HCT116和LoVo细胞生长到70-80%的汇合处用小干扰RNA（100 nM）转染脂多糖胺®2000年（Invitrogen；Thermo FisherScientific，Inc.）来敲低HOXD-AS1，根据制造商的协议。靶向HOXD-AS1及其相关基因的siRNA阴性对照（NC）siRNA（5′-GGCGAGC AGCAGGCCC-3′）分别为由上海基因制药有限公司（中国上海）提供。这个本研究中使用的靶序列如下：siRNA1，5′-GAAGAAGGACCAAAGTAA-3′；和siRNA2，5′-GCACAAAGGAACAG AAA-3′。检测转染后HOXD-AS1的表达水平RT-qPCR；转染后48小时，细胞进一步实验。

细胞增殖分析

使用MTT试剂盒测定细胞增殖（Sigma-Aldrich；德国达姆施塔特默克公司）制造商协议。对于集落形成分析，CRC细胞胰蛋白酶化，单细胞悬浮液中含有3×10三细胞被镀入6孔板并培养辅以10%FBS的RPMI-1640（Gibco；Thermo Fisher科学公司）。将平板在37°C的温度下培养含有5%CO的大气2持续14天。的图像然后捕获包含≥50个细胞的集落，并将其由ImageJ（V.1.8.0）软件计算[美国国立卫生研究院（NIH），马里兰州贝塞斯达，美国]。数据表示为平均值±五个随机评分字段的标准偏差。

侵入性分析

通过Transwell分析评估细胞侵袭（科宁公司，美国纽约州科宁），根据制造商的协议。膜插入物涂有稀释的Matrigel（BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）。电池（1×105)英寸向上室中添加100µl无血清培养基培养24h，每个孔插入物的下室为填充600µl含20%血清的培养基。随后取出膜插入物并用0.1%结晶紫染色室温下放置15分钟；侵袭细胞的数量为在倒置显微镜下计数并采集图像。

成球分析

根据以前发布的方法(15)稍作修改。简单地说，细胞悬液(1.0×10三细胞/孔）接种在6孔超低中无血清Dulbecco改良型连接板（Corning，Inc.）Eagle's medium/F12（Gibco；赛默飞世尔科技公司）含20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，20 ng/ml表皮生长因子（均来自Miltenyi Biotec，Inc.）和2 mML-谷氨酰胺（Mediatech，Inc.，弗吉尼亚州马纳萨斯，美国）。培养后连续7天，评估肿瘤球的大小和数量使用光学显微镜（日本东京奥林巴斯公司）。

免疫荧光分析

免疫荧光分析根据到前面描述的方法(17). 使用了以下抗体在本研究中：E-钙粘蛋白（#3199S）和N-cadherin（#14215S）（均来自Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA）。A类山羊抗兔二级抗体免疫球蛋白（Ig）G（A21537）和山羊抗鼠IgG（A21538）（均来自EMD Millipore，贝德福德，马萨诸塞州，美国）。然后在共焦激光显微镜（奥林巴斯公司）。

RNA免疫沉淀（RIP）分析

RIP是使用Magna RIP™RNA-Binding进行的蛋白质免疫沉淀试剂盒（EMD Millipore），根据制造商协议。简单地说，细胞裂解物与含有与负极共轭磁珠的RIP缓冲器对照正常小鼠IgG或人抗精氨酸2（Ago2）抗体。然后将样品与蛋白酶K孵育以分离最后提取纯化的RNA通过qPCR分析以确认结合的存在目标。

慢病毒的产生和感染

通过稳定敲除HOXD-AS1根据先前发表的研究(18). 简言之，短发夹（sh）RNA针对人类HOXD-AS1（靶序列，5′-GAAGAAGGACCAAAGTAA-3′）或打乱的寡核苷酸连接到LV-3（pGLVH1/GFP+Puro）载体（上海基因制药有限公司）。共转染了293个细胞慢病毒载体（或对照慢病毒载体）和Lenti-Pac HIV表达包装混合物使用脂多糖胺®2000年（Invitrogen；Thermo Fisher科学公司）。48小时后，慢病毒颗粒进入收集上清液并通过500倍离心过滤g持续10分钟。然后细胞感染慢病毒或阴性控制（NC）慢病毒。为了选择稳定转染的细胞用嘌呤霉素处理细胞（2µg/ml）持续2周。绿色荧光蛋白阳性细胞命名为sh-HOXD-AS1和sh-NC和用于后续分析。

肿瘤发生和转移检测

共40只雌性BABL/c裸鼠（年龄，5周；重量为15.4–17.2 g），取自北京生命River Laboratory Animal Technology Co.，Ltd.（中国北京），以及被保存在西安交通大学动物设施中，经中国实验室认可协会批准动物护理。小鼠的维护条件如下如下：温度，26–28°C；湿度，40–60%；通风，10–15次/h；10小时光照/14小时暗循环；随意访问食物和水。食物和水来自北京Keao Cooperation Feed Co.，Ltd.（中国北京），根据中国实验动物护理认证协会。肿瘤发生分析，1×106sh-HOXD-AS1和将sh-NC细胞接种到每只小鼠的右侧。每周测量肿瘤直径（mm），肿瘤体积使用以下公式计算：体积=（最短直径）2×（最长直径）×0.5。7周后，处死小鼠，切除肿瘤。对于转移分析，2×106细胞接种到每只老鼠的尾静脉。6周后，小鼠处死，切除肺和肝，固定4%室温下多聚甲醛30min和石蜡嵌入的。连续组织切片（4µm） 制造完成苏木精和伊红染色；微转移酶在解剖显微镜下对肺和肝进行评估。全部根据NIH指南进行动物实验关于实验动物的使用。这个体内实验由机构审查道德委员会批准西安交通大学附属3201医院董事会动物实验。

载体构建与荧光素酶报告分析

HOXD-AS1的3′端片段含有从HCT116细胞中提取预测的miR-217结合位点用PCR扩增并亚克隆到pmirGLO荧光素酶靶Expression Vector（美国威斯康星州麦迪逊市Promega Corporation）成立HOXD-AS1野生型（pmirGLO-HOXD-AS1-wt）载体。此外构建了突变的miR-217结合序列子克隆到表达式向量中以形成pmirGLO-HOXD-AS1-mt载体。293T细胞在6孔中培养平板培养，生长至70-80%汇合处进行细胞转染。单元格与pmirGLO（50 nM）、pmirGLO-HOXD-AS1-wt（50nM）或pmirGLO-HOXD-AS1-mt（50 nM）和miR-217模拟物（5′-UACUGCAUCAGGAACUGAUGGA-3′）（100 nM）或NC（5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′）（100 nM）使用脂质体胺®2000年（Invitrogen；Thermo FisherScientific，Inc.），并在潮湿的环境中培养含5%CO2在37°C下放置24小时。最后使用双荧光素酶测量相对荧光素素酶活性报告者检测试剂盒（Promega公司）48小时后，根据制造商的协议。用于过度表达或敲除miR-217、HCT116和LoVo细胞生长到70-80%的融合率转染miR-217模拟物（100 nM）或NC模拟物（100nM），以及miR-217抑制剂（5′-UACUGCAUCAGGAACUGAUGUGGA-3′）（100 nM）或抑制剂NC（5′-GCCCUCCGGCCUUCGCACCUCU-3′）（100 nM）使用脂多糖胺®2000年（Invitrogen；Thermo FisherScientific，Inc.）。PCR引物序列列于表我.

蛋白质印迹分析

用于星形胶质细胞升高基因-1的免疫印迹（AEG-1），zeste同源物2（EZH2）和GAPDH的增强子，兔EZH2抗体（#5246）购自Cell Signaling Technology，Inc.、兔AEG-1抗体（abs124058）和小鼠GAPDH抗体（ab127428）来自Absin Bioscience，Inc。（中国上海）。如前所述进行蛋白质印迹描述(19).

统计分析

使用SPSS进行所有统计分析版本16.0（SPSS，Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）或GraphPad 5.0（GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）软件。数据为表示为平均值±标准偏差；这些实验是重复三次。两者之间的显著差异各组通过Student t检验进行分析各组通过单因素方差分析和纽曼-凯尔斯多重比较试验。。之间的关联分析临床病理参数和HOXD-AS1表达使用χ2根据需要进行测试。总生存率为使用卡普兰-迈尔法和对数秩检验确定。使用单变量和多变量Cox评估生存数据比例风险模型。P<0.05表示具有统计学显著性差异。

结果

HOXD-AS1在CRC中过度表达与CRC患者预后不良相关

本研究检测了配对CRC组织和邻近正常组织中的HOXD-AS1。作为如所示图1A，HOXD-AS1是与邻近组织相比，CRC组织中的表达显著上调正常组织（7.656±0.755 vs.5.888±0.472；P<0.001）。此外，HOXD-AS1的表达水平显著高于远处转移的组织比远处转移的高无远处转移（9.350±0.836对6.396±0.515）；P<0.001）(图1B). 在此外，HOXD-AS1表达在晚期患者与早期患者的比较(图1C). 要探索HOXD-AS1对CRC患者预后的影响根据HOXD-AS1在肿瘤组织（7.12）；即高表达组和低表达组表达组。结果表明高HOXD-AS1表达组表现为明显更差总生存率和无进展生存率HOXD-AS1低表达组（P<0.01）(图1D和E）。特别是HOXD-AS1表达与分化显著相关（P<0.001）、远处转移（P<0.001）和TNM分期（P=0.009）(表二). 单变量分析表明HOXD-AS1表达（P=0.006）转移（P=0.005）和TNM分期（P=0.011）显著与预后相关。然而，多元分析表明只有HOXD-AS1表达（P=0.018）是独立的CRC患者的预后因素(表III).

图1 lncRNA HOXD-AS1显著CRC组织中上调。（A） RT-qPCR分析表明lncRNA HOXD-AS1在大肠癌组织中显著上调与邻近正常组织相比（*P<0.001）。（B） RT-qPCR分析表明lncRNA HOXD-AS1为远处转移的CRC组织中显著上调与无转移的CRC组织相比（*P<0.001）。（C） RT-qPCR分析表明lncRNA HOXD-AS1在晚期CRC中的表达高于低期CRC（*P<0.05，**P<0.01）。（D和E）Kaplan-Meier方法和对数库检验表明：lncRNA HOXD-AS1高表达的患者总体情况较差与低lncRNA患者相比，生存率和无进展生存率HOXD-AS1表达。结直肠癌；HOXD-AS1、HOXD集群反义RNA 1；lncRNA，长非编码RNA；RT-qPCR，反向转录定量聚合酶链反应。

表二 之间的关联临床病理参数与长非编码RNA HOXD簇136例结直肠癌患者反义RNA 1的表达癌症。

表二

之间的关联临床病理参数与长非编码RNA HOXD簇136例结直肠癌患者反义RNA 1的表达癌症。

特性	n个	高表达	低表达	P值
年龄（岁）				0.492
<60	64	30	34
≥60	72	38	34
性别				0.729
男性	78	38	40
女性	58	30	28
肿瘤大小				0.122
<4厘米	71	31	40
≥4厘米	65	37	28
区别				<0.001
嗯	28	9	19
中等	63	24	39
可怜的	45	35	10
淋巴结入侵				0.855
不存在	45	22	23
出席	91	46	45
远距离转移				<0.001
不存在	84	31	53
出席	52	37	15
TNM阶段				0.009
I–II级	42	14	28
III–IV类	94	54	40

[一]数据为使用χ²测试。

表III 单变量和多变量分析136例结直肠癌患者潜在预后因素分析癌症。

表III

单变量和多变量分析136例结直肠癌患者潜在预后因素分析癌症。

特性	单变量分析		多变量分析
	心率（95%置信区间）	P值	心率（95%置信区间）	P值
年龄（岁）	0.85(0.65–1.23)	0.157	–	–
性别	1.13(0.73–1.51)	0.541	–	–
区别	1.09(0.88–1.49)	0.159	–	–
肿瘤大小	1.07(0.82–1.34)	0.657	–	–
淋巴结入侵	1.23(1.13–1.90)	0.134	–	–
远距离转移	1.45(1.04–2.13)	0.005一	1.12(1.04–1.99)	0.103
TNM阶段	1.16(1.07–2.15)	0.011一	1.18(1.03–1.72)	0.151
HOXD-AS1水平	1.67(1.55–2.61)	0.006一	1.51(1.21–2.53)	0.018一

a P<0.05。CI，置信区间；HOXD-AS1，HOXD簇反义RNA 1；HR，危害比。

显著击倒HOXD-AS1体外抑制细胞活力、增殖和侵袭

由于HOXD-AS1在CRC，本研究旨在确定HOXD-AS1是否参与CRC细胞生物学的调控。表达式在CRC细胞系中检测到HOXD-AS1水平。结果证明HOXD-AS1在CRC细胞系中显著增加与正常结肠细胞系CCD-112CoN相比（P<0.05）；图2A). 击倒HOXD-AS1降低HCT116和LoVo中HOXD-ASC1的表达细胞>50%，而HOXD-AS1的过度表达增加了HOXD-AS1在SW480细胞中的表达增加了3.2倍（P<0.05；图2B). MTT分析证明HOXD-AS1的敲除抑制了HCT116细胞，而HOXD-AS1异位过度表达促进SW480细胞存活率（P<0.05）；图2C和D）。此外，击倒HOXD-AS1显著抑制HCT116和LoVo细胞（P<0.05；图2E).同样，HOXD-AS1基因敲除抑制细胞迁移和HCT116和LoVo细胞侵袭率>50%（P<0.05；图2F).

图2 lncRNA HOXD-AS1调节CRC体外增殖和侵袭。（A） 相对表达式大肠癌细胞株和正常结肠组织中lncRNA HOXD-AS1的水平上皮细胞系CCD-112CoN（*P<0.05）。（B）逆转录定量聚合酶链反应分析表明lncRNA HOXD-AS1的敲除减少lncRNA HOXD-AS1在HCT116和LoVo细胞中的表达，而lncRNA HOXD-AS1的异位过度表达增加了其表达SW480细胞中lncRNA HOXD-AS1的表达（*P<0.05 vs.NC）。（C和D）MTT分析表明HOXD-AS1的敲除抑制HCT116细胞的细胞增殖，而异位过度表达HOXD-AS1促进SW480细胞增殖（*P<0.05）。（E） HOXD-AS1抑制菌落的敲除HCT116和LoVo细胞形成（*P<0.05 vs.NC）。（F） HOXD-AS1的敲除抑制了细胞迁移和对HCT116和LoVo细胞（*与NC相比P＜0.05）。放大倍数，×100。结直肠癌；HOXD-AS1、HOXD集群反义RNA 1；lncRNA，长非编码RNA；NC，阴性对照；OD，光密度；小干扰RNA。

显著降低HOXD-AS1抑制CRC细胞的EMT和干细胞电位

此前有报道称，EMT与癌症干细胞参与肿瘤进展(20,21);本研究通过实验对此进行了研究。作为如所示图3A，击倒HOXD-AS1增加E-cadherin表达并降低波形蛋白HCT116细胞表达。此外，RT-qPCR分析表明HOXD-AS1的敲除降低了波形蛋白、N-钙粘蛋白、鼻涕虫和蜗牛，并增加表达E-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素水平（P<0.05）；图3B). 此外，击倒HOXD-AS1抑制HCT116和LoVo细胞中干细胞的形成（P<0.05）；图3C). RT-qPCR分析还表明，HOXD-AS1的敲除降低了干细胞标记物（CD44、CD133、CD24、CD166、，HCT116和LoVo细胞中的Oct4、Lgr5、Sox2和Nanog（P<0.05；图3D).

图3 长非编码RNA HOXD-AS1调节上皮-间充质转化和干细胞形成在结直肠癌细胞中。（A） HOXD-AS1敲除增加HCT116中E-cadherin表达和波形蛋白表达降低单元格。放大倍数，×200。（B） RT-qPCR分析表明HOXD-AS1的敲除降低了波形蛋白的表达水平，N-cadherin、Slug和蜗牛，并增加HCT116细胞中的E-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素（*P<0.05 vs.NC）。（C） HOXD-AS1敲除被抑制HCT116和LoVo细胞中的干细胞形成（*P<0.05对比NC）。放大倍数，×200。（D） RT-qPCR分析证明HOXD-AS1的敲除降低了茎的表达水平细胞标记物（CD44、CD133、CD24、CD166、Oct4、Lgr5、Sox2和Nanog）HCT116和LoVo细胞（*P<0.05 vs.NC）。CD、，分化簇；HOXD-AS1，HOXD簇反义RNA 1；Lgr5，富含亮氨酸的重复性G蛋白偶联受体5；NC，阴性对照；Oct4，八聚体结合转录因子4；小干扰RNA；Sox2，性别决定区Y-box2

HOXD-AS1敲除抑制体内肿瘤发生和转移

探讨HOXD-AS1的生物学作用在里面活泼地、sh-HOXD-AS1和sh-NC细胞被构建，并且植入小鼠体内。结果表明HOXD-AS1显著抑制肿瘤发生；肿瘤重量（0.771±0.46 vs.0.349±0.23；P<0.001）和肿瘤体积（P<0.001）在植入sh-HOXD-AS1 HCT116细胞(图4A和B）。此外，HOXD-AS1的敲除显著抑制肝脏（9.00±1.76 vs.2.00±0.57；P<0.001）和肺转移裸鼠（6.16±0.74 vs.2.00±0.54；P<0.001）(图4C和D）。

图4 HOXD-AS1基因敲除抑制体内肿瘤发生和转移。（A和B）拆除HOXD-AS1显著抑制肿瘤发生；肿瘤重量和HOXD-AS1被击倒后体积显著减少（*P<0.001）。（C和D）HOXD-AS1的拆卸显著抑制裸鼠肝和肺转移（*P<0.001）。放大倍数，×200。HOXD-AS1、HOXD簇反义RNA 1；NC，阴性对照；sh，短发夹RNA。

HOXD-AS1作为miR-217的海绵CRC细胞

此前有报道称，一些lncRNAs可以作为miRNAs的竞争内源性（ce）RNAs。目前研究，使用生物信息学工具（miRcode，http://www.mircode.org/)，经鉴定HOXD-AS1含有一些miRNA-结合位点。然而，进一步分析表明，只有miR-217能够调节其表达CRC细胞中HOXD-AS1的数量（未显示数据）；因此，现在针对miR-217的研究(图5和6). miR-217-结合位点为在chr2-q31.1的HOXD-AS1中检测到(图5A). 随后，miR-217被HCT116和LoVo细胞过度表达或敲除用miR-217模拟物或miR-217-抑制剂转染；成功的RT-qPCR证实转染(图6). 此外，HOXD-AS1表达在HCT116和转染LoVo细胞中显著抑制miR-217模拟物（P<0.05；图。第5页); 然而，HOXD-AS1的敲除并不影响miR-217的表达水平(图。5摄氏度). miR-217的抑制导致HOXD-AS1；然而，HOXD-AS1的表达增加是由于抑制HOXD-AS1可以减少miR-217的抑制（P<0.05）；图5D). 此外，miR-217的过度表达显著降低了荧光素酶的活性在转染pmirGLO-HOXD-AS1-wt的细胞中，但不在细胞中转染pmirGLO-HOXD-AS1-mt(图5E). 此外，RIP分析表明miR-217和HOXD-AS1可显著富集在HCT116和LoVo细胞中，因为Ago2是RNA诱导沉默复合物（RISC），从而表明miR-217HOXD-AS1处于相同的RISC（P<0.05；图5F和G）。此外，现在研究进行了western blotting，结果证实HOXD-AS1的敲除降低了蛋白表达水平CRC细胞中的AEG-1和EZH2(图。7).

图5 HOXD-AS1充当miR-217的海绵在CRC细胞中。（A） HOXD-AS1和miR-217之间的结合位点chr2-q31.1。（B） miR-217的过度表达被显著抑制HOXD-AS1在HCT116和LoVo细胞中的表达（*P<0.05）。（C） HOXD-AS1的击倒没有影响miR-217的表达水平。（D） miR-217的抑制导致HOXD-AS1表达增加；然而，增加的表达miR-217抑制引起的HOXD-AS1的减少可以通过抑制HOXD-AS1（*P<0.05）。（E） 异位miR-217的过度表达显著降低了荧光素酶HOXD-AS1 wt载体转染细胞的活性，但不用HOXD-AS1 mt载体转染的人（*P<0.05）。RNA免疫沉淀分析显示miR-217和HOXD-AS1可以在（F）中显著富集HCT116细胞和（G）LoVo细胞（*P<0.05）。Ago2、，argonaute 2；HOXD-AS1，HOXD簇反义RNA 1；IgG，免疫球蛋白G；miR-217，microRNA-217；mt，突变体；NC，负极控制；ns，不显著；si，小干扰；重量，野生型。

图6 （A） miR-217异位过度表达增加HCT116和LoVo细胞中miR-217的表达（*P＜0.05）。（B） 使用miR-217击倒miR-217s抑制剂降低HCT116和LoVo中miR-217的表达细胞（*P<0.05）。miR-217，microRNA-217；NC，负极控件。

图7 HOXD-AS1调节AEG-1和EZH2。Western blotting表明HOXD-AS1降低（A）AEG-1和（B） HCT116细胞中的EZH2。AEG-1，星形胶质细胞升高基因-1；EZH2、，zeste同源物2的增强子；NC，阴性对照；siRNA，小干扰RNA。

讨论

大量研究表明lncRNA是经常在肿瘤中失调，包括CRC(22,23).一些lncRNA被认为是诊断和预后的生物标志物以及各种肿瘤的治疗。例如，有报道称结直肠癌相关lncRNA促进CRC进展通过激活Wnt/β-catenin信号通路激活蛋白2α的抑制作用(24). 此外，陈先生等显示lncRNA X非活性特异性转录物（XIST）通过调节EMT促进CRC的进展和转移(25). 本研究表明lncRNA HOXD-AS1在大肠癌组织中显著上调和细胞系。HOXD-AS1的过度表达与CRC的侵袭性肿瘤表型和不良预后。此外，HOXD-AS1被确定为一个独立的预后指标CRC患者。这些结果表明HOXD-AS1可能是CRC中的重要生物标志物。

目前的结果在体外和在里面活泼地实验表明HOXD-AS1可以调节细胞增殖、细胞迁移和细胞侵袭，从而导致CRC肿瘤发生和转移增加。同意目前的结果，先前的研究报道HOXD-AS1参与膀胱癌的进展和转移，胃癌与肝细胞癌(12,13,26).这些结果突出了靶向HOXD-AS1作为CRC的新治疗策略。

EMT是与肿瘤相关的重要过程转移和肿瘤干细胞是肿瘤的主要来源进展；因此，本研究调查了这些影响HOXD-AS1在EMT和CRC干细胞上的表达。结果表明HOXD-AS1基因敲除抑制EMT和干细胞特性在CRC中。这一发现与之前的报告一致，即证明癌症干细胞是肿瘤的主要来源进展与转移(20).值得注意的是，EMT和增强干细胞特性(21). 综合起来，这些数据表明HOXD-AS1可能促进EMT和干细胞特性，因此导致扩散、迁移和入侵加剧，最终加速肿瘤的进展和转移。

越来越多的研究表明存在一个广泛的涉及ceRNA的相互作用网络，其中lncRNAs可以隔离miRNAs，滴定它们脱离结合mRNA上的位点(27). 例如，肝癌中高度上调的lncRNA在肝脏中过度表达并通过抑制miR-372型(28). 此外，它还具有据报道，lncRNA H19作为ceRNA调节let-7表达，从而促进乳腺癌进展(29). 最近，陈等报道lncRNA XIST可能通过充当miR-101调控EZH2表达的ceRNA(18). 本研究使用了生物信息学数据库并鉴定了可能与HOXD-AS1相互作用。值得注意的是，miR-217被证实为在CRC细胞中由HOXD-AS1调节，如下所示证据：i）miR-217异位过度表达可降低HOXD-AS1的表达，而miR-217的抑制增加了HOXD-AS1的表达；ii）荧光素酶活性测定已确认miR-217能与HOXD-AS1的3′-非翻译区结合；iii）RIP分析表明miR-217和HOXD-AS1可能是Ago2显著富集HCT116和LoVo细胞。A上一个研究表明，lncRNAs可以调节微小RNA(18); 然而，现在研究表明，HOXD-AS1不会影响miR-217；潜在的机制需要进一步探索。与这些结果类似，据报道HOXD-AS1起作用作为肝细胞癌miR-19a的ceRNA(13). 以前的研究表明miR-217可能抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡CRC细胞(30,31). 值得注意的是，据透露miR-217可以抑制其他恶性肿瘤的EMT，如胃癌症(32)，肺癌(33)和胰腺癌(34). 本研究证实HOXD-AS1可以作为miR-217的ceRNA；这一发现可能部分解释HOXD-AS1调节CRC增殖和EMT的原因细胞。研究HOXD-AS1是否调节靶基因对miR-217进行western blotting，结果证实HOXD-AS1的敲除能够减少AEG-1和EZH2在CRC细胞中的表达。AEG-1和EZH2据报道是先前研究中miR-217的靶基因(30,35,36).这些发现进一步证实了HOXD-AS1可能作为miR-217的ceRNA。

总之，据我们所知本研究首次表明HOXD-AS1是在CRC组织和细胞系中显著上调。HOXD-AS1型表达也与侵袭性肿瘤显著相关CRC患者的表型和不良预后。击倒HOXD-AS1抑制CRC细胞增殖、迁移、EMT和干细胞细胞形成在体外以及肿瘤生长和转移体内因此，HOXD-AS1可被视为在CRC中有用的肿瘤生物标志物，靶向HOXD-AS1可能是一种CRC患者的新型治疗策略。

缩写：

致谢

不适用。

基金

本研究得到了国家中国自然科学基金（批准号81372533）。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据如下包括在这篇发表的文章中。

作者的贡献

四十、 YL和LP进行了分子研究起草手稿。XZ和ZF执行了体内分析。BY和TL收集了临床数据和组织样本。WM和ZhL进行了统计分析。ZeL设计了研究并帮助起草手稿。所有作者阅读和批准了最后的手稿。

道德批准和同意参与

本研究得到了伦理委员会的批准西安交通3201附属医院委员会大学（中国汉中），书面知情同意书从所有患者身上获得。所有的动物实验都是根据国家卫生研究院（Bethesda，MD，USA）关于实验动物使用的指南由机构审查委员会道德委员会批准西安交通大学附属3201医院动物实验。

出版同意书

同意发表临床和从所有涉及的患者中获得病理数据在本研究中。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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