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介绍

鼻咽癌（NPC）是亚洲常见的头颈癌，尤其是东南亚和中国，发病率高每年每100000人中约有20–50例(1). 相比之下，鼻咽癌在美国（阿拉斯加除外）和西欧发病率<1/100000。准确检测鼻咽癌由于其解剖位置而不容易。在常规情况下临床治疗，放射治疗是主要的治疗方法，同时建议使用放疗和化疗用于治疗晚期癌症(2). 然而，5年生存率是非常低。由于耐药和远处转移的发展。

耐药性是癌症的主要并发症化疗。这就是化疗无效的原因在大多数癌症患者中(三). 当肿瘤细胞产生耐药性时对抗癌药物没有反应。顺铂（DDP）用于临床作为鼻咽癌的辅助治疗，以诱导肿瘤细胞死亡。DDP通过形成DNA加合物或通过靶向蛋白质/酶和途径(4——6).然而，DDP的疗效往往伴随着抗药性。鼻咽癌细胞获得的机制化疗耐药性尚不清楚。因此，更好地理解细胞获得抵抗力的机制和对诱导抗性或与抗性相关的分子变化可能导致鼻咽癌新的治疗策略的发展(7，8).

最近的证据表明上皮间质过渡型（EMT）细胞在化疗耐药中起着关键作用。因此，与EMT相关的化疗耐药性的分子基础是目前是癌症研究的一个重要热点。EMT描述了一系列显著的形态变化，特征是从上皮向间充质表型的转变，导致增加运动能力和侵袭力(9). EMT收购期间特征，细胞失去上皮细胞-细胞连接经历肌动蛋白细胞骨架重组。下调上皮分子标记物，如E-cadherin和β-catenin是也观察到间充质分子上调标记物，如波形蛋白、纤维连接蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和N-钙粘蛋白抑制E-cadherin表达的转录因子，包括扭曲、锌指电子盒绑定同源盒1（ZEB1）、蜗牛和鼻涕虫此外，基质活性也会增加金属蛋白酶（MMPs），如MMP-2和MMP-9，与侵袭性表型(10). 这个EMT过程也被证明在协商中很重要对传统疗法的癌细胞耐药性。建立了几种化疗耐药细胞系在体外，比如耐他莫西芬的乳腺癌(11)，耐紫杉醇卵巢癌(12),草酸铂耐药大肠癌与吉西他滨耐药胰腺癌(13)单元格各品系表现出与EMT一致的表型变化。这些数据明确提供了强有力的证据证明化疗耐药性与EMT有关。然而，对DDP耐药的鼻咽癌细胞尚未被广泛应用研究。

在本研究中，我们分离出了DDP耐药性来自特征良好的鼻咽癌细胞系的细胞，并确定它们具有许多类似EMT的特性。我们证明了这一点DDP耐药细胞对DDP不敏感，并且具有较强的入侵和迁移能力。这些特征稳定的鼻咽癌细胞可能提供对表型的新见解与DDP抗性相关的变化。

材料和方法

试剂和抗体

DDP购自齐鲁制药有限公司。（中国济南）。RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）购自Gibco-BRL（美国纽约州格兰德岛）。Matrigel从BD Biosciences购买（美国马萨诸塞州贝德福德）。我们购买了3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）来自Sigma Chemical Co.（澳大利亚Castle Hill）。抗体抗Bcl-2、Bax、Puma和髓细胞白血病-1（Mcl-1；1:100）购自北京生物合成生物技术有限公司。（中国北京）。抗E-cadherin、β-catenin、，波形蛋白、纤维连接蛋白、MMP-9、扭曲、鼻塞、蜗牛、ZEB1（1:500）和β-肌动蛋白（1:2000）从圣克鲁斯生物技术公司获得。（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。

细胞系和培养

人鼻咽癌细胞株HNE1、HNE1/DDP和CNE2，由中山大学（中国广州）和保存在我们的实验室中。HNE1、HNE1/DDP和CNE2细胞在含有10%FBS和青霉素的RPMI-1640培养基中培养（100 U/ml）和链霉素（100 U/ml），在潮湿的空气中5%一氧化碳237°C时。HNE1/DDP的RPMI-1640介质细胞还补充了4μmol/l的DDP。所有细胞系每月检测支原体污染，仅在低浓度下使用传代并定期在显微镜下检查表型使用前进行更改。

细胞生长测定

为了研究细胞生长，我们进行了一个细胞细胞增殖试验（1×104电池/孔）电镀在24井Costar®板（康宁生命科学，美国纽约州科宁市）。实验进行了168小时每24小时计数一次细胞数在指定的时间点。

形态学分析

细胞在无DDP的条件下生长到70%的融合适合亲本细胞系的培养基，并在含有DDP抗性细胞系的DDP。它们是在光学显微镜（CKX41；日本东京奥林巴斯）。数字图像使用安装在显微镜上的摄像机（cellSens进入；奥林巴斯）。

细胞活力测定

MTT法检测细胞活力。MTT是一种黄色四氮唑染料对代谢活动有反应。在生活中细胞，还原酶将MTT的颜色从淡黄色改变为深蓝色，对应于formazan晶体。简要地，7×10三细胞/孔被镀成96个Costar公司®培养皿一式三份。24小时后培养后，用不同浓度的DDP，随后孵育24、48和72小时加入20μl MTT的孵育期，以获得最终的浓度为0.5 mg/ml。然后培养细胞继续4 h。然后在150μl之前去除培养基和MTT向每个孔中添加二甲基亚砜（DMSO）以溶解晶体。formazan产品的光密度（OD）为使用微孔板阅读器在570nm波长下测定（Bio-Tek Instruments Inc.，美国弗吉尼亚州Winooski）。细胞存活率（%）=（外径样品-外径空白的)/（外径控制-外径空白的)×100。IC50值，定义为将细胞存活率降至50%所需的药物浓度为由MTT的相对吸光度测定。所有实验都是一式三份。

伤口愈合分析

通过伤口愈合评估细胞迁移化验。细胞被放置在6孔板中（康宁生命科学）5×105细胞/孔，并允许增长到90%汇流。用无菌微量移液管尖端刮取细胞以创建标准宽度的间隙。要去除非粘附细胞，在清洗之前，用培养基轻轻冲洗两次盘子孵化。在×100下监测伤口闭合24小时放大倍数。在倒置的显微镜并在适当的区域成像，以计算治愈百分比。每个实验都是在一式三份。

侵袭和迁移试验

细胞通过过滤器的能力是使用Transwell Boyden腔室系统（Corning LifeSciences），含有聚碳酸酯过滤器（直径6.5mm，8μm孔径）。膜下表面涂有50μlMatrigel，以1:8的比例与RPMI-1640无血清培养基混合稀释并随后应用于过滤器顶部细胞侵袭试验。相比之下，过滤器没有涂层细胞迁移实验。细胞被重新悬浮在无血清培养基。随后，200μl细胞悬浮液（5×104细胞/孔）添加到上室，而将含有10%FBS的600μl RPMI-1640培养基添加到下室，用作化学引诱剂。该系统是在37°C下培养24小时。未迁移的细胞或24小时后从过滤器的上表面去除侵入物用棉签擦洗。然后用4%甲醛在室温下放置15分钟，并用0.5%结晶紫15分钟。最后，5个视野从每张滤膜中随机选择并在光线下拍照放大倍数为200倍的显微镜。迁移或然后对入侵细胞进行计数和分析，以确定具有统计学意义的差异。对每种情况进行了分析一式三份。实验是在至少3次。结果表示为细胞数量每个字段。

定量逆转录PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol试剂分离总RNA（Invitrogen Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。等分试样（1μg）使用寡核苷酸（dT）和M-MuLV逆转录酶（Fermentas Inc.，Glen Burnie，MD，USA）遵循制造商的说明。五分之一的cDNA被用作PCR模板，使用SYBR公司®-ABI中的绿色PCR试剂盒（日本京都高原）StepOne™实时PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，美国）。看家基因，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）被选为每个实验。本研究中使用的引物见表一.循环条件如下：在95°C下进行10分钟的预自然，然后在95°C下40次循环10秒，在57–60°C下20秒，在72°C下15秒。扩增产物的特异性得到确认通过熔化曲线分析。所有反应均一式三份。作为父母之间表达相对变化的衡量标准计算了抗药性样品的ΔΔCt值，并将其转换为近似折叠变化值（2-ΔΔCt).

表一 用于qRT-PCR的底漆。

表一

用于qRT-PCR的底漆。

基因	底漆顺序(5′-3′)	产品尺寸（bp）
MDR1型	传真：CCCATTGCAATAGCAGG公司 R： GTTCAAACTTCTCTCCTGA公司	157
物料需求计划	传真：AGGAGAGATCATCATCGAGG公司 R： GCCTTCTGCACATTCGG公司	235
Bcl-2型	传真：CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC R： CCGCATGCTGGGCCGTACAGTCCC	319
Bax公司	传真：TTTGCTTCAGGGTTTCTCATCC公司 R： CAGTTGAAGTGCCGTCAGA公司	246
E-钙粘蛋白	传真：CATTTCCACACTCTCTCGGC公司 R： ATGGGCCTTTTTCATTCTGGG	90
β-连环蛋白	传真：仙人掌 R： gattcctgaggtccaaagacag公司	146
波形蛋白	传真：AGATGGCCCTTGACATTGAG公司 R： TGGAAGAGAGAGAAAATTC公司	80
纤维结合蛋白	传真：CCCACCGTCTCTCACATGCTTAG公司 R： CTCGGCTTCCTCCATAACAAGTAC公司	264
基质金属蛋白酶-9	传真：CGGAGTGAGTTGAACCAG公司 R： GTCCCAGTGGGATTTAC公司	118
蜗牛	传真：中国民航总公司 R： TGGCTTCGGATGGCATCTTGAG公司	108
鼻塞	传真：CCCTGAAGATGCATATTCGGAC公司 R： CTTCTCCCCCGTTGTAGTTCTA公司	116
扭曲	传真：TGCGGAAGATCATCCCA公司 R： TCCATCCTCCAGACCGAGA公司	187
ZEB1号机组	传真：GCACAACAGTGCAGAAGA公司 R： GCCTGGTCAGGAGAAGATG公司	141
GAPDH公司	传真：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG公司 R： AGGGGCCATCCACAGTCTTC公司	258

[一]F、 向前；R、，逆序；多药耐药；MRP，多药抗性相关蛋白；基质金属蛋白酶；ZEB1、，锌指电子盒绑定同源盒1；GAPDH、，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

蛋白质印迹分析

将细胞置于6孔培养皿中（康宁生命科学），密度为4×105细胞/孔。培养24小时后，清洗细胞用1 ml PBS/孔，用胰蛋白酶收获。收集的细胞离心并在裂解缓冲液中再次悬浮。以下在冰上培养30分钟，匀浆在4°C下12000 rpm，持续30分钟。蛋白质浓度为使用二辛可宁酸（BCA）测定法（Beyotime中国北京生物技术研究所）。随后，40μg用10–15%十二烷基钠分离蛋白质硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），以及转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。这个用5%脱脂牛奶封闭被吸过的膜2小时在4°C下用一级抗体隔夜探测。这些膜是用二级抗体清洗并探测2小时使用凝胶成像设备（Bio-Rad、Hercules、CA、，美国）。β-肌动蛋白作为负载对照。

抗DDP NPC的建立细胞

用PBS和转移到含有10%FBS和青霉素-链霉素。创造稳定的鼻咽癌细胞DDP，CNE2细胞连续暴露于DDP>9月。在此期间，每3天更换一次培养基细胞培养物经70-80%胰酶消化后传代达到了汇合点。细胞逐渐显示出阻力DDP的生长抑制特性。抗DDP的CNE2细胞在含有DDP的培养基中培养3个额外的表征前几个月。通过这个过程，我们产生稳定的DDP耐药细胞系（CNE2/DDP细胞）。

统计分析

所有实验重复至少3次。数据表示为平均值±SEM。平均值之间的差异使用双尾Student t检验分析值。全部使用SPSS13.0软件（SPSS）进行统计分析美国伊利诺伊州芝加哥）。P值<0.05被认为是表示具有统计学意义的差异。

结果

HNE1/DDP细胞对完税后交货

我们首先证实了NPC细胞对MTT法检测DDP。NPC细胞增殖受到抑制通过不同浓度的DDP(图1A). 对DDP的化学耐受性为与HNE1细胞相比，在HNE1/DDP细胞中观察到。增加DDP浓度对与HNE1/DDP相比，HNE1的增殖更明显细胞。IC50HNE1/DDP和HNE1细胞的值为29.04±2.82、19.44±1.77、11.39±1.89μmol/l和6.84±1.59，24小时、48小时和72小时分别为4.25±0.36和2.35±0.96μmol/l(图1B). 因此，DDP抑制细胞的增殖。此外，HNE1/DDP单元对DDP处理的敏感性低于HNE1细胞。这个正常情况下，HNE1/DDP细胞增殖低于HNE1细胞培养条件(图1C). 由western blot分析，然后我们检测了蛋白表达多药耐药相关蛋白（MRP）、Mcl-1、，Bcl-2、Bax和Puma以进一步确定化疗耐药性(图1D). 表达式级别在MRP中，HNE1/DDP细胞中的Mcl-1和Bcl-2高于与HNE1细胞。此外，Bax和HNE1/DDP细胞中Puma含量较低。此外，Bcl-2/BaxHNE1细胞中的比率较低。qRT-PCR进一步揭示多药耐药（MDR）1、MRP和Bcl-2上调HNE1/DDP细胞中Bax下调(图1E). 根据这些观察结果，我们结论HNE1/DDP细胞具有化疗耐药性。

图1 HNE1/DDP细胞显示顺铂（DDP）与亲代HNE1的耐药性比较细胞。（A） DDP抑制鼻咽癌生长（NPC）细胞。用DDP处理HNE1和HNE1/DDP细胞24、48和72小时，然后是3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑加入溴（MTT）测定细胞活力。结果是表示为控制水平的百分比。（B） 国际资本5024、48和72小时HNE1/DDP和HNE1细胞的值（平均值±SEM，n=3，*与亲代HNE1细胞相比P<0.05）。（C） 正常培养中HNE1和HNE1/DDP细胞的增殖通过在相同数量的细胞接种后的不同时间点。（D）多药耐药相关蛋白（MRP）的表达水平，Bcl-2、髓细胞白血病-1（Mcl-1）、Bax和Puma蛋白western blot检测HNE1和HNE1/DDP细胞分析。（E） MDR1、MRP、Bcl-2的相对mRNA表达水平并通过以下方法分析HNE1和HNE1/DDP细胞中的Bax基因qRT-PCR（平均值±SEM，n=3，*P<0.05，与亲代HNE1细胞）。

HNE1/DDP细胞增加体外迁移和侵袭潜能

然后我们比较了HNE1/DDP和HNE1细胞各种细胞功能。自收购以来化疗耐药通常与迁移增加有关以及肿瘤进展中的侵袭能力，我们测量了HNE1/DDP和HNE1细胞的迁移和侵袭能力伤口愈合和Transwell-Boyden室分析。伤口愈合进行分析以比较HNE1/DDP和亲代HNE1细胞。24小时时，增加2.7倍通过伤口迁移的HNE1/DDP细胞数量为观察值（P<0.05）(图2A和B类). 此外，我们比较了迁移和入侵使用Transwell的HNE1/DDP和HNE1细胞之间的电位博伊登室分析。24小时时，HNE1/DDP细胞显示移民增加2.2倍，入侵增加2.8倍与HNE1细胞相比（P<0.05）(图2C和D). 因此，HNE1/DDP细胞与亲代HNE1细胞。

图2 HNE1/DDP细胞增加迁移和入侵潜力。（A） 伤口愈合分析比较HNE1/DDP和双亲HNE1细胞放大×100倍。（A和B）HNE1和HNE1/DDP细胞在时间零点。（C和D）HNE1和HNE1/DDP电池培养24小时后。（B） 定量结果是表示为伤口愈合指数，使用5在0和24小时时随机选择穿过伤口的距离（平均值±SEM，n=3，*与亲代HNE1细胞相比P<0.05）。（C） 进行Transwell Boyden小室分析以比较HNE1/DDP和亲本HNE1的迁移和入侵潜力细胞在×200倍放大培养24h后。（D）定量结果显示为迁移和入侵细胞，使用在跨井运移和侵入分析（平均值±SEM，n=3，*与亲代HNE1细胞相比P<0.05）。

HNE1/DDP细胞显示形态和与EMT一致的分子变化

细胞形态通过显微镜在×200放大倍率(图3A). 这个亲代HNE1细胞呈现上皮样鹅卵石样外观它是圆形的，几乎没有假足类的形成。由相反，在HNE1/DDP细胞中观察到的表型变化包括细胞极性的丧失，纺锤形的发育形态和伪足形成增加。要确定获得DDP抗性是否诱导特异性与EMT、western blot分析和qRT-PCR结果显示上皮标记物，如E-cadherin和β-catenin减少HNE1/DDP细胞与HNE1细胞比较。表达式间充质标志物，如波形蛋白和纤维连接蛋白HNE1/DDP细胞中较高（P<0.05）(图3B和C). 此外，信使核糖核酸和HNE1/DDP细胞中MMP-9的蛋白水平高于HNE1细胞（P<0.05）(图。3B和C). 此外EMT-相关转录因子、蜗牛、Slug、Twist和ZEB1，HNE1/DDP细胞比HNE1细胞高（P<0.05）(图3D和E).根据这些观察结果，HNE1/DDP细胞被认为具有获得间充质表型。

图3 HNE1/DDP细胞呈现形态和与上皮-间充质细胞相一致的分子变化过渡（EMT）。（A） 通过显微镜观察细胞形态×200倍放大。亲代HNE1细胞显示上皮样细胞，鹅卵石圆形外观，形成有限伪足类。相比之下，在HNE1/DDP电池失去了电池极性，导致纺锤状形态和增加的伪足类。（B） EMT相关蛋白的表达水平，E-钙粘蛋白、β-连环蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白和基质western blot检测金属蛋白酶-9分析。E-cadherin和β-catenin的下调波形蛋白、纤维连接蛋白和MMP-9在HNE1/DDP电池。（C） E-cadherin的mRNA表达水平，β-catenin、vimentin、fibronectin和MMP-9基因通过qRT-PCR（平均值±SEM，n=3，*与亲本HNE1细胞）。（D） 增加的蛋白质水平EMT相关转录因子、蜗牛、鼻涕虫、扭曲和锌western测定了手指电子盒结合同源盒1（ZEB1）印迹分析。（E） 基因的mRNA表达水平EMT相关转录因子，蜗牛、Slug、Twist和ZEB1，通过qRT-PCR进行分析（平均值±SEM，n=3，*P<0.05与亲代HNE1细胞相比）。

CNE2细胞经历EMT-likeDDP诱导的转化

我们进一步研究了EMT的发生并且观察到EMT相关分子的表达增强在其他对DDP耐药的鼻咽癌细胞系中。为此，我们建立了稳定的抗DDP鼻咽癌细胞系（CNE2/DDP细胞）。与CNE2细胞相比，CNE2/DDP细胞对DDP治疗（数据未显示）。如所示图4A，亲代CNE2细胞显示类似于HNE1细胞的上皮样鹅卵石样外观。相比之下，CNE2/DDP细胞的形态是混合的：显示一个上皮样、长、纺锤形/成纤维细胞样形状，沿形成假足类和无组织生长模式。此外，较高水平的间充质标记物，如波形蛋白、纤维连接蛋白和MMP-9以及低水平上皮标记物，如E-cadherin和β-catenin，在CNE2/DDP细胞与亲代CNE2细胞比较（P<0.05）(图4B和C). 此外EMT相关转录因子的mRNA和蛋白水平，CNE2/DDP细胞中蜗牛、鼻涕虫、扭体和ZEB1较高与CNE2细胞相比（P<0.05）(图4D和E).

图4 顺铂（DDP）处理的CNE2细胞经历了上皮-间质转化（EMT）样转型。（A） 通过显微镜观察细胞形态×200倍放大。父母CNE2细胞显示上皮样细胞，鹅卵石外观，类似HNE1细胞。相比之下CNE2/DDP细胞的形态为混合型，表现为上皮样，长，纺锤形/成纤维细胞型，假足以及无组织的增长模式。（B） 的表达式级别EMT相关蛋白、E-钙粘蛋白、β-连环蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白和基质金属蛋白酶（MMP）-9通过western印迹分析。E-cadherin和β-catenin的下调波形蛋白、纤维连接蛋白和MMP-9在CNE2/DDP细胞。（C） E-cadherin的mRNA表达水平，β-catenin、vimentin、fibronectin和MMP-9基因通过qRT-PCR（平均值±SEM，n=3，*与亲代CNE2细胞）。（D） 增加的蛋白质水平EMT相关转录因子、蜗牛、鼻涕虫、扭曲和锌western测定了手指电子盒结合同源盒1（ZEB1）印迹分析。（E） 基因编码的mRNA表达水平EMT-相关转录因子、蜗牛、Slug、Twist和ZEB1，通过qRT-PCR进行分析（平均值±SEM，n=3，*P<0.05与亲代CNE2细胞相比）。

讨论

DDP化疗广泛应用于鼻咽癌患者的治疗；DDP是最活跃和最常用的药物通常用于治疗远处转移或鼻咽癌患者晚期局部复发(14). 然而对DDP的耐药性是其用于癌症的主要限制化学疗法(15). 这个DDP导致DDP耐药性的生物学机制是现在开始被理解，并有潜力提供治疗干预的分子靶点，改善预测反应并制定策略克服对DDP的抗性。为了进一步研究这些机制，我们选择性DDP耐药NPC细胞、HNE1/DDP细胞和亲本HNE1细胞。我们的结果显示HNE1/DDP细胞获得了化疗耐药的特点。

化疗耐药与转移的研究进展通常在癌症研究中单独进行字段。因此，很少有人知道化疗耐药与肿瘤转移。尽管如此，还是有两个感兴趣的观察结果：首先，选择了一些肿瘤细胞因为耐药性有更大的转移潜力与非耐药亲本细胞相比。第二，次要（转移潜能更大）肿瘤对化疗药物在数量上比其主要同类药物例（共例）(16). 转移是一种复杂的多步骤过程，包括局部侵入，静脉注射，通过血管系统运输期间的存活，毛细血管阻塞、渗出，最后生长到在远处器官形成大转移瘤(17，18). 临床上，转移增强在鼻咽癌的治疗过程，似乎与肿瘤的恶性特征越来越明显。然而，在一些情况下，在化疗耐药与肿瘤转移(19). 一项研究表明钙耐药人纤维肉瘤HI-1080 Cd-R细胞变异是发展，对DDP具有交叉抗性，且比父母HIT-1080 Cd-R细胞，如Transwell所示在体外分析。此外，MMP-9的表达增加在HT-1080 Cd-R细胞中观察到(20). 在本研究中，我们证明HNE1/DDP细胞的容量增加迁移和入侵在体外在开发过程中对DDP的抗性。此外MMP-9在HNE1/DDP细胞中升高。因此，化疗耐药和转移是鼻咽癌的临床管理现状。预防、预测和抑制鼻咽癌的化疗耐药性和转移对于进一步提高鼻咽癌患者的生存率。

越来越多的证据支持分子和化学抗性与获得之间的表型关联癌细胞中EMT样表型。它已经很成熟了上皮细胞可以通过以下途径获得间充质表型基本和复杂流程(21). 虽然EMT已被广泛研究由于其在早期发育和癌症转移中的作用，它可以也会影响细胞逃避铂基疗法(22).EMT诱导分化上皮细胞的转化变成具有干样特性的间充质细胞其特点是失去细胞间的粘附、紧密和间隙结，以及细胞极性的损失和增加能动性(23). 最近的研究已经表明EMT可能会促进癌症的发展进展，表明上皮源性肿瘤细胞可以转化为更初步的间充质表型促进运动和入侵(24，25). 在本研究中实验中，我们证明了鼻咽癌细胞DDP导致形态和分子改变与间质样表型的改变相一致。我们还获得的分子证据表明DDP耐药的NPC细胞系与转录因子、蜗牛、Slug、Twist和ZEB1。这些是负责开发EMT，并直接绑定到E-cadherin启动子抑制该基因的转录(26). 然而DDP耐药鼻咽癌细胞系中的扭转显著mRNA和蛋白质水平均增加。增加的Twist的表达负责后天鼻咽癌细胞对紫杉醇的耐药性及异位表达扭转使其能够抵抗微管破裂剂，包括紫杉醇(27).尽管相关机制的细节仍在研究中调查表明扭曲与DDP耐药细胞中的EMT。

据我们所知，化疗药物，包括DDP，通常通过凋亡诱导肿瘤退化，这是通过一系列原癌基因和肿瘤抑制剂进行调节基因(28，29). 然而这种凋亡过程的调节可能导致EMT相关分子的表达水平，导致治疗失败。尽管抵抗的机制DDP和EMT仍在调查中(30)，我们认为我们的发现耐DDP的NPC细胞经历EMT反映了一个重要的过程从而使癌细胞可能获得化疗耐药性。阻断或逆转EMT变化可能导致耐药细胞还原为化学敏感性细胞。

总之，我们证明了鼻咽癌细胞对DDP的耐药性伴随着诱导转移潜能增加的EMT样改变在里面体外.进一步说明对DDP和EMT的抗性将允许开发新的未来化疗耐药肿瘤的治疗方法。

致谢

本研究得到了来自国家自然科学基金（81372899，81072207），安徽省自然科学基金（090413135）和教育自然科学研究重点项目中国安徽省厅（KJ2012A202），创新蚌埠医学院研究生科研项目中国安徽省（Byycx1327）。

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