本文在以下内容中提到：

介绍

各种形式的慢性肝病可导致肝星状细胞（HSC）激活并诱导肝纤维化，肝硬化进展的早期阶段最终发展为肝细胞癌。值得注意的是，这些各类肝病被视为全球主要健康问题关注(1). 肝纤维化是一种常见的病理过程，最终导致肝脏故障(2). 肝纤维化是定义为细胞外重塑和过度沉积肝脏中的基质蛋白(3). HSC的激活非常重要肝纤维化过程中的事件(4). 激活的HSC通常被视为纤维化ECM蛋白的主要生产商(5)，包括I型胶原和纤维连接蛋白。转化生长因子β1（TGFβ1）被称为肝纤维化中最强的效应器促纤维细胞因子，促进成纤维细胞募集，增殖和分化为产生ECM的肌成纤维细胞(6). 有几个已知的信号通路参与肝纤维化的进展。转化生长因子β1通过Smad依赖性和Smad依赖性途径(7)，其中包括TGFβ1/ERK1/2信号通路(8). ERK1/2通路已报告给通过与其他信号通路(9)。值得注意的是，先前的研究表明ERK1/2的抑制作用信号通路增强大鼠肝纤维化(10). 此外，它已经被证明肝纤维化的进展是可逆的(11–14)。有几种治疗药物，包括奥利司他、二甲双胍和坎地沙坦，通常用于抗纤维化治疗(15,16)。然而，主要的限制是缺乏有效的治疗肝纤维化的治疗策略(17,18)。因此，需要新的有效治疗靶点肝纤维化的治疗。

葛根素是一种中草药具有多种生理活性，包括抗氧化和抗炎活性(19,20)。葛根素已被广泛用于治疗各种疾病，包括缺血性中风(21),肾纤维化(22)，心肌缺血与高血压(23). 在此外，葛根素也被认为有治疗作用肝纤维化。以前的研究表明葛根素通过调节TGFβ1的表达减轻肝纤维化抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）/核因子κB亚单位1（NF-κB）(24),磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶（PI3K）/Akt(25)和TGFβ1/Smad(26)信号通路。然而，是否葛根素通过ERK1/2信号通路减轻肝纤维化抑制HSC的激活和胶原蛋白的过度沉积肝纤维化尚不清楚。

硫代乙酰胺（TAA）是一种含硫化合物化合物，广泛用于诱导大鼠肝纤维化研究潜在的抗纤维化药物(27)。因此，本研究的目的是检查葛根素的抗纤维化作用及其机制TAA诱导大鼠肝纤维化。此外，对转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白的相对蛋白表达水平（α-SMA）、I型胶原、纤维连接蛋白、p-ERK1/2和ERK1/2分别为分析。

材料和方法

实验动物和治疗

共36只雄性Sprague-Dawley大鼠（年龄6-8岁周；重量，180～200 g），来自山西医药大学实验动物中心（中国太原）建立肝纤维化体内建模依据腹腔注射200 mg/kg硫代乙酰胺（TAA：Sigma-Aldrich；默克（Merck KGaA）。老鼠被关在一个环境受控繁殖室（12小时暗/光循环；温度，25±1摄氏度；湿度，55±5%），喂食啮齿动物实验室食物和无菌水。大鼠被随机分为三组：对照组、TAA组葛根素/TAA组。对照组大鼠接受同样的治疗PBS剂量每日一次（n=12）。注射TAA组大鼠使用200 mg/kg TAA，每周三次，持续8周（n=12）。老鼠在葛根素/TAA组与TAA组一样注射TAA但他们也接受了0.1 ml/10 g葛根素的每日剂量第5周，与TAA给药同时（n=12）。全部大鼠通过腹腔注射氯醛麻醉水合物（400mg/kg），于第8周处死。肝组织采集并储存在−80°C下进行进一步分析。所有动物本研究采用的实验方案如下国际公认的原则，并获得山西省医学院机构动物保护和使用委员会大学（中国太原）。

免疫组织化学

肝组织固定在10%中性缓冲液中福尔马林在25–27°C下放置一周，以70–100%的梯度脱水乙醇，在二甲苯中洗涤并嵌入石蜡中。将石蜡包埋的肝组织样本切割成4–5µm厚部分。对于一般组织学，随后进行组织切片在室温下用苏木精染色5分钟，然后室温下曙红染色5min。形态变化在房间内通过Van Gieson（VG）染色观察2分钟温度。在灯光下观察病理变化显微镜（放大倍数，×200）。分析胶原蛋白含量使用Image-Pro Plus分析软件（6.0版；Media控制论公司，美国马里兰州罗克维尔）。

肝脏羟脯氨酸含量分析

肝脏中的羟脯氨酸含量胶原蛋白含量的间接指数，使用羟脯氨酸检测试剂盒（目录号02140R1；南京建成生物工程研究所，中国南京），根据制造商协议。简单地说，肝组织样本水解、冻干和羟脯氨酸含量在分光光度计上550 nm的波长（分子器件，LLC，美国加利福尼亚州桑尼维尔）。

蛋白质印迹分析

肝组织样本均化使用HEPES提取缓冲液（Sangon生物技术有限公司）。使用Bicinchonic acid assay（Santa Cruz Biotechnology，Inc.，达拉斯，美国德克萨斯州）和等量的总蛋白质（40µg蛋白质/车道）在10%凝胶上通过SDS-PAGE分离。分离的蛋白质随后转移到聚二氟乙烯膜上在室温下用3%脱脂牛奶封闭2h。这个用抗TGFβ1的一级抗体培养细胞膜（1:1000；分类号ab92486），α-SMA（1:1000，分类号ab5694），I型胶原蛋白（1:1000；分类号ab34710）、纤维连接蛋白（1:100；猫。编号ab2413），磷酸化（p-）ERK1/2（1:1000；类别号。ab214362）、ERK1/2（1:1000；目录号ab17942）和β-肌动蛋白（1:1000）；猫。编号：ab8227；所有Abcam）在4°C下过夜。遵循主要原则孵育，膜与辣根孵育过氧化物酶偶联山羊抗兔二级抗体（1:5000；猫。编号D110066；Sangon Biotech，Co.，Ltd.）在室内放置2小时温度。使用Super ECL显示蛋白质带检测试剂盒（Bio-Read Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）。使用Bio-Read Quantity One量化蛋白质表达带有β-actin的软件（4.6.2版；Bio-Read Laboratories，Inc.）作为加载控制。

统计分析

数据以平均值±标准表示偏差。所有统计分析均使用SPSS进行软件（版本16.0；SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）。单向采用Student-Newman-Keuls检验进行方差分析分析各治疗组之间的差异。P<0.05为被认为显示了统计上的显著差异。

结果

葛根素缓解炎症和TAA诱导的大鼠肝纤维化

所有大鼠均在实验过程中存活。肝脏对每个实验组的大鼠组织样本进行染色使用H&E和VG检查组织病理学变化与肝纤维化相关。H&E染色显示在TAA组，有明显的变性和坏死肝细胞以及炎性细胞浸润的比较与对照组。此外肝脏改变，纤维间隔组织明显形成TAA组与对照组比较。然而，葛根素/TAA组的病理变化较轻与TAA组相比(图。第1页). 肝组织中I型胶原的存在是VG染色观察。在TAA组，胶原蛋白水平随着纤维间隔的形成，纤维明显增多肝小叶周围与对照组比较(图1B). 此外，胶原蛋白与TAA组相比，葛根素/TAA组的沉积较少组(图1B)。

图1。 组织病理学改变肝纤维化体内模型。（A） 苏木精和曙红染色用于检查大鼠肝脏的病理变化对照组、TAA组和葛根素/TAA组的组织样本。这个黑色箭头突出显示肝细胞的变性和坏死以及纤维间隔组织的形成。（B） 范·吉森的染色法用于检查I型胶原在大鼠肝组织样本。比例尺，50µm。（C） 肝脏检测羟脯氨酸含量。（D） 相对蛋白质I型胶原和纤维连接蛋白的表达水平为用western-blot分析大鼠肝组织样品。β-actin作为负荷对照（n=12）*P<0.05与对照组#与TAA组相比，P<0.05。TAA、，硫代乙酰胺。

肝羟脯氨酸含量显著与对照组相比，TAA组增加（P<0.05）；图1C). 此外，肝羟脯氨酸含量在葛根素/TAA组与TAA组比较（P<0.05）；图1C). 类似地，western blot分析证明了I型胶原和纤维连接蛋白在TAA组大鼠肝脏与对照组比较（P<0.05）；图1D). 然而I型胶原和纤连蛋白的蛋白表达水平分别为葛根素/TAA组与TAA组（P<0.05）；图1D)。这些结果表明，葛根素治疗可以缓解肝纤维化中的炎症和纤维化。

葛根素减轻TGFb1表达和HSC活化在TAA诱导大鼠肝纤维化中的作用

为了进一步研究葛根素对肝纤维化与HSC活化体内下列的TAA诱导的肝纤维化与TGFβ1的相对表达水平α-SMA进行检测。TGFβ1被称为最强的效应剂α-SMA是HSC活化的标志物(28,29). 相对蛋白质表达水平TAA组TGFβ1和α-SMA显著增加与对照组相比，TGFβ1和α-SMA表达葛根素/TAA组的水平显著降低与TAA组比较（P<0.05）；图2A和B). 这些结果表明葛根素可能减少TGFβ1的生成和HSC的活化。

图2。 TGFβ1和α-SMA蛋白表达。（A）TGFβ1和（B）α-SMA的相对蛋白表达水平为用western-blot分析大鼠肝组织样品。β-actin作为负荷对照（n=12）*P<0.05与对照组#与TAA组相比，P<0.05。转化生长因子β1，转化生长因子；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；TAA、，硫代乙酰胺。

葛根素抑制ERK1/2信号通路

ERK1/2信号通路起着重要的作用在肝纤维化中的作用(10,30). 因此，要检查葛根素是否参与调节ERK1/2减少HSC活化和ECM沉积，ERK1/2和检测活化形式p-ERK1/2。相对蛋白质TAA中p-ERK1/2的表达水平显著增加组与对照组比较(图3A). 相比之下，相对蛋白质p-ERK1/2的表达水平在葛根素/TAA组与TAA组比较(图3A). p-ERK1/2与ERK1/2的比值与对照组相比，葛根素/TAA组也显著降低与TAA组比较（P<0.05）；图。3B公司). 蛋白质表达没有显著差异实验组间ERK1/2水平(图3A). 这些结果表明葛根素可能抑制肝脏ERK1/2磷酸化纤维化。

图3。 ERK1/2和p-ERK1/2表达。（A）ERK1/2和p-ERK1/2的相对蛋白表达水平为用western-blot分析大鼠肝组织样品。（B） ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达的定量。β-actin作为负荷对照（n=12）*P<0.05与对照组#与TAA组相比，P<0.05。TAA、，硫代乙酰胺。

讨论

肝纤维化是全球主要公共卫生问题问题(31)并且是由几种慢性肝病(32). 肝纤维化的发病机制是复杂，以增强ECM生产和改变为特征ECM蛋白沉积。值得注意的是，肝纤维化失控会发展成肝硬化(33)。目前尚无肝纤维化治疗方案高效(34). 因此，需要更有效的治疗肝纤维化。

TAA会干扰蛋白质合成和酶肝脏中的代谢，可导致慢性肝损伤(35,36). 以前的研究已经证明TAA能诱导大鼠肝纤维化(37,38). 在目前的研究，H&E和VG染色显示坏死肝细胞数量增加和浸润炎症细胞，明显增加TAA组胶原纤维和肝纤维化直接观察。此外，肝脏羟脯氨酸含量TAA组与对照组相比显著增加组。这些结果表明肝纤维化体内在大鼠体内成功建立模型。

包括葛根素在内的中草药可以诱导对肝纤维化有良好效果，ECM成分可以正常基底基质的变化，包括胶原蛋白类型四、 纤维基底基质，包括I型胶原(39). 在之前的研究中，葛根素羟脯氨酸和I型胶原蛋白水平显著降低在肝纤维化中(25,26). 在目前的研究中，肝脏炎症和I型胶原的蛋白表达水平治疗后纤维连接蛋白明显减轻与之前的报道一致(40,41). 这个当前研究结果表明，葛根素可能具有抗肝纤维化作用。然而，潜在的葛根素在肝纤维化中的作用机制尚不清楚。

HSC被广泛认为是关键的成纤维细胞协调肝脏ECM的形成(5). HSC的激活起着重要作用在肝纤维化过程中的作用(4). TGFβ1是HSC的有效激活剂(42)和一种有效的诱导剂I型胶原蛋白生产(43)。α-SMA是广泛接受的活化HSC标志物(44). 以前的研究表明葛根素治疗降低TGF-βl和α-SMA的生成(24,45). 在目前的研究中，蛋白质TGFβ1和α-SMA的表达水平显著降低之后使用葛根素进行治疗，与之前类似报告(26,40,45)。综上所述，这些结果表明葛根素可能减少TGFβ1的产生和HSC的激活减轻ECM蛋白在肝纤维化中表达。

先前的研究表明，葛根素可以调节血清酶，减少TGF-β1的生成并抑制过度胶原沉积通过抑制TNF-α/NF-κB(24),PI3K/Akt公司(25)和TGFβ1/Smad(46)信号通路。然而，葛根素是否通过ERK1/2信号通路减轻肝纤维化路径仍然未知。因此，当前研究假设葛根素可能通过ERK1/2信号通路减轻肝纤维化通路。在当前研究中，p-ERK1/2与ERK1/2的比值蛋白表达水平在葛根素/TAA组与TAA组的比较表明葛根素在肝纤维化中的抗纤维化作用可能发生通过ERK1/2信号通路。这些结果表明葛根素可能通过抑制ERK1/2改善肝纤维化减少HSC激活和ECM沉积的途径。线路接口单元等铝(47)报道说葛根素抑制乳腺癌细胞中ERK磷酸化。因此，葛根素可能参与调节ERK1/2磷酸化，从而抑制肝纤维化中ERK1/2信号传导。然而，葛根素是否与ERK1/2的其他功能域结合需要进一步调查。

总之，目前的研究表明葛根素可能抑制TGF-β/ERK1/2信号通路，从而降低HSC活化，从而减轻肝脏中ECM蛋白的表达纤维化。因此，葛根素可能是一种潜在的治疗方法用于治疗肝纤维化。然而，进一步需要进行调查以验证潜在的治疗效果葛根素对肝纤维化的影响。

致谢

不适用。

基金

目前的研究得到了来自连云港东方医院基金会（批准号：。2016-12年）。

数据和材料的可用性

当前使用和/或分析的数据集可从通讯作者处获得关于合理请求。

作者的贡献

YW设计了实验。HaZ、LP、HuZ、XM和JC进行了实验。XL分析了数据并准备了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

道德批准和同意参与

该研究得到了山西医科大学（SCXK2009-0001）。

患者同意发布

不适用。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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