本文在以下内容中提到：

介绍

恶性胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统的恶性肿瘤。尽管手术、放疗等常规治疗的改进和化疗，对高级别患者的预后胶质瘤仍然很贫乏(1). 在近年来，越来越多的研究人员对针对胶质瘤的靶向基因治疗(2,三)和非常需要为这些设备开发合适的载体将治疗药物有效输送至胶质瘤组织。作为一种成人多能干细胞，骨骨髓间充质干细胞（BMSCs）的特征是他们容易被隔离体外膨胀势(4,5). 以前的研究已经证明骨髓间充质干细胞可在脑内或全身后向胶质瘤转移注射，使这些细胞具有吸引力胶质瘤靶向基因治疗中的载体(2,三).阐明这种迁移的分子信号通路行为将帮助我们进一步提高针对性的效率骨髓间充质干细胞介导的基因治疗。

血管内皮生长因子（VEGF）是胶质瘤组织中表达的最重要的血管生成细胞因子并参与恶性脑肿瘤的进展(6,7). 以前的研究已经证明VEGF表达与胶质瘤分级的相关性(8). 此外，趋化作用VEGF对各种细胞类型的作用已被广泛报道(9,10).血管细胞粘附分子-1作为一种细胞表面糖蛋白（VCAM-1）介导白细胞和T细胞的粘附和迁移淋巴细胞通过脑微血管内皮细胞，根据与受体的结合，α4β1和α4β7整合素(11,12). 在之前的研究中，我们证明了VCAM-1在由C6和U87胶质瘤细胞(13).分析VEGF在胶质瘤诱导的脑胶质瘤中的作用骨髓间充质干细胞的迁移和VCAM-1表达可能有助于我们理解血管内移植后骨髓间充质干细胞向胶质瘤迁移的机制递送或脑内移植。此外，之前数据表明磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）发挥细胞外信号通路中的关键作用向关键细胞过程发出信号并促进生长细胞膜刺激因子信号转导细胞质。此外，PI3K还参与了VEGF诱导细胞迁移的细胞内信号转导(14,15).

因此，在本研究中，我们试图评估VEGF在C6胶质瘤诱导的BMSCs迁移中的作用，VEGF是否上调BMSCs的VCAM-1表达VCAM-1与VEGF诱导BMSCs迁移的关系PI3K是否参与VEGF诱导的BMSCs的迁移和VCAM-1上调。

材料和方法

骨髓间充质干细胞的分离和培养

使用4周龄雄性Wistar大鼠（80–100 g）在我们的研究中。这些大鼠是从实验动物那里购买的中国医科大学中心。所有使用动物的实验经中国医学会动物保护和使用委员会批准大学和国家卫生研究所实验动物护理和使用指南。BMSC是如前所述，根据对塑料的粘附性(16,17).简言之，大鼠在用10%水合氯醛（0.3ml/100g）通过腹腔注射。双侧胫骨和股骨无菌解剖，收集并悬浮骨髓在低血糖Dulbecco改良Eagle's培养基（L-DMEM；Gibco，Invitrogen Corp.，Grand Island，NY，USA）含10%胎儿牛血清（FBS；Gibco）。然后转移细胞悬液25厘米2培养瓶。培养48小时后，更换培养基以清除非粘附性血液进一步培养造血谱系细胞和贴壁细胞扩大。第3代的骨髓间充质干细胞用于研究。

C6胶质瘤细胞的培养

大鼠C6胶质瘤细胞（美国型培养马里兰州罗克维尔的收藏）保存在补充的L-DMEM中含10%FBS。

体外迁移试验

在我们的实验中，24孔Transwell插入一个8-μm孔径（康宁Costar）用于评估不同条件下骨髓间充质干细胞的迁移。C6胶质瘤细胞和骨髓间充质干细胞在无血清L-DMEM中进行胰蛋白酶化和再悬浮5x10像素5/ml和1x106/ml。收件人探索骨髓间充质干细胞向C6胶质瘤细胞的迁移，1 ml C6将胶质瘤细胞悬液加入下腔，6h稍后，200-μl BMSC悬架添加到上部腔室。此外，为了确定VEGF是否促进BMSCs向C6胶质瘤的迁移，我们检测了骨髓间充质干细胞对补充C6胶质瘤细胞悬浮液的反应有或没有VEGF中和抗体（1μg/ml时，Abcam，Cambridge，UK），位于下室，分别是。此外，我们应用了VEGF164，一个主要大鼠VEGF亚型，检测VEGF对BMSC。含重组大鼠血管内皮生长因子的无血清L-DMEM164（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）浓度为20下井加入ng/ml。VCAM-1阻断抗体（Covance，Princeton，NJ，USA）被添加到BMSC的悬浮液中10点μg/ml，以评估VCAM-1在血管内皮生长因子164-诱导BMSCs迁移。此外，我们使用PI3K选择性抑制剂LY294002评估PI3K的作用在VEGF诱导的BMSCs迁移中。骨髓间充质干细胞用LY294002（20µM；Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA）在刺激20分钟之前和持续30分钟ng/ml血管内皮生长因子164.上下井内容物由聚碳酸酯膜（8-μm孔径）。细胞迁移在37°C下进行36小时。孵化后，抽吸培养基，细胞留在上层聚碳酸酯膜的表面用棉花去除拭子。迁移到下表面的细胞被染色Giemsa染色15分钟。细胞计数在由两名研究人员分别进行倒置显微镜检查。平均值迁移细胞的数量是通过计算6个随机高功率场（x400）。仅提供无血清L-DMEM作为阴性对照。

逆转录聚合酶链反应

研究VEGF诱导的VCAM-1的变化BMSC的表达以及PI3K与该过程的相关性细胞与含有10%FBS的L-DMEM一起孵育血管内皮生长因子164（20 ng/ml）含或不含LY294002（20μVCAM-1 mRNA的表达为用逆转录聚合酶链反应评价分析（RT-PCR）。用含有10%的L-DMEM培养的细胞FBS作为阴性对照。总RNA从使用TRIzol试剂（Invitrogen）和cDNA培养的细胞从1生成μg每个样品的总RNA。这个使用的引物如下：VCAM-1，5′-ACACCTCCCCCAAGAATACAG-3′（正向）和5′-GCT CATCCTCAACACCACAG-3′（反向）(18); β-肌动蛋白，5′-TCAGGTCATCACTCGGCAAT-3′（正向）和5′-AAAGA AAGGTGTAACGCA-3′（反向）。两者的PCR条件如下：32个周期94°C下变性30秒，55°C下退火30秒在72°C下延长2分钟。PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳。所有cDNA条带均为使用Chemi Imager 5500 V2.03软件进行扫描通过计算机图像分析计算密度值系统（Fluor Chen 2.0），并与β-肌动蛋白标准化。

免疫荧光分析

为了进行免疫荧光分析，培养骨髓间充质干细胞在涂有0.1%明胶的玻璃盖玻片上。孵化后如上所述，用丙酮和小鼠单克隆抗VCAM-1抗体免疫染色（稀释1:100; 圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州圣克鲁斯），4°C一夜之间。随后使用抗鼠软件进行可视化罗丹明偶联IgG（TRITC）（稀释1:200；圣克鲁斯生物技术公司）在37°C的黑暗中放置1小时。盖玻片是安装在安装介质中，图像是用奥林巴斯拍摄的BX60立式荧光显微镜，配有适当的过滤器和目的，每个实验使用相同的采集参数。含有10%FBS的L-DMEM作为对照。

统计分析

所有结果均以平均值±SD表示组。学生的t检验用于评估两组之间的差异。单向方差分析（ANOVA）用于确定多个组。P＜0.05被认为表明显著的结果。

结果

BMSC表现出迁移能力体外研究C6胶质瘤

我们使用了在体外迁移asssay到评估骨髓间充质干细胞向C6胶质瘤细胞的迁移能力。与之前的研究一致，在我们的实验中，我们发现骨髓间充质干细胞向胶质瘤方向迁移(2). 如所示图1，迁移的平均数量C6胶质瘤细胞的细胞数明显高于控件。

图1 血管内皮生长因子在骨髓基质干细胞迁移中的作用C6胶质瘤细胞诱导。与对照组相比，共培养含C6胶质瘤细胞的骨髓间充质干细胞显著增加迁移。VEGF中和抗体的应用显著减少了迁移BMSC的数量。C6胶质瘤细胞和骨髓间充质干细胞被胰蛋白酶化并在无血清中重新悬浮L-DMEM分别为5x105/ml和1x106/ml。对于每个组，将200μl BMSC悬浮液添加到上部腔室。对照组，1 ml无血清L-DMEM加入下室；C6组，1 ml C6细胞悬液被添加到下室；抗VEGF组，1ml C6细胞添加VEGF中和抗体的悬浮液（1μg/ml）加入下室。*与对照组相比P<0.05，且#P<0.05与C6组相比。

VEGF的中和作用降低向C6胶质瘤迁移的骨髓间充质干细胞数量

确定VEGF是否在BMSC中起作用向胶质瘤转移，添加VEGF中和抗体与C6胶质瘤细胞一起进入下腔。我们发现VEGF的中和作用显著降低了C6胶质瘤细胞的促迁移作用及细胞数量迁移细胞与对照组相比减少(图1). 这些结果表明VEGF参与调节BMSCs向C6胶质瘤的迁移在体外.

重组大鼠VEGF164促进骨髓间充质干细胞的迁移

评价血管内皮生长因子对大鼠的趋化作用在骨髓基质细胞中，我们分析了重组大鼠VEGF的作用164骨髓基质干细胞的迁移。我们的数据表明重组大鼠血管内皮生长因子164引起的趋化活性骨髓间充质干细胞并诱导其向下腔室迁移。什么时候？与对照组相比，VEGF164，浓度为20 ng/ml，导致迁移数量显著增加骨髓基质干细胞(图2).

图2 重组大鼠VEGF164是BMSCs和LY294002的趋化性抑制VEGF诱导的骨髓基质干细胞的迁移。迁移的骨髓基质干细胞数量增加在浓度为20 ng/ml。在LY294002存在下迁移BMSC的数量减少。C6胶质瘤细胞和骨髓间充质干细胞胰蛋白酶化并在无血清L-DMEM中重新悬浮分别为5x105/ml和1x106/ml。对于每个组，将200μl BMSC悬浮液添加到上腔室。对照组，将1 ml无血清L-DMEM加入下室。VEGF组，1 ml无血清L-DMEM，20 ng/ml将VEGF164加入下腔室中。VEGF和LY294002组，1 ml无血清L-DMEM和VEGF164（20ng/ml）和LY294002（20μM）添加到下部腔室*与对照组相比P<0.05；#与VEGF组相比，P<0.05。

阻断VCAM-1会降低VEGF164诱导BMSCs迁移

我们的数据在体外迁移分析证明添加VCAM-1中和抗体显著减少了向血管内皮生长因子164(图3). 这些结果表明，VCAM-1是介导血管内皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞迁移164.

图3 VCAM-1是一种重要的粘附力介导由VEGF164.与VEGF164组相比骨髓基质干细胞悬液中添加VCAM-1中和抗体明显减少了骨髓间充质干细胞向VEGF164。骨髓间充质干细胞经胰蛋白酶消化后再悬浮于1x106/ml的无血清L-DMEM。每组200将μl BMSC悬浮液添加到上室。VEGF组，将VEGF164加入下腔20 ng/ml。抗-VCAM-1组，VEGF164添加到下腔室为20ng/ml，VCAM-1中和抗体为以10μg/ml的浓度加入上腔。*与VEGF组相比，P<0.05。

重组大鼠VEGF164上调BMSCs的VCAM-1表达

RT-PCR和免疫荧光分析结果发现BMSCs表达低水平的VCAM-1无VEGF培养164而用20ng/ml血管内皮生长因子16412小时后，VCAM-1较高表达比不受刺激的细胞血管内皮生长因子164(图4和5).

图4 RT-PCR分析显示VCAM-1BMSC的mRNA表达通过与20 ng/ml VEGF164，被LY294002抑制。（A）RT-PCR的代表性结果显示了VCAM-1的477-bp带；（控制组中的车道1、VCAM-1；VEGF组中的第2通道，VCAM-1；VEGF中的车道3、VCAM-1和LY294002组；第4巷，对照组β-actin；5号车道，VEGF组β-actin；血管内皮生长因子和LY294002中的β-肌动蛋白通道6组）。（B） 相对综合密度值（IDV）分析骨髓间充质干细胞VCAM-1 mRNA表达（n=8，每个；*与对照组相比P<0.05，且#P<0.05与VEGF组相比）。对照组，细胞与含10%FBS的L-DMEM 12小时；VEGF组，细胞为与含有10%FBS的L-DMEM在VEGF存在下孵育（20纳克/毫升）持续12小时；VEGF和LY294002组，细胞为与含有10%FBS的L-DMEM在VEGF存在下孵育（20 ng/ml）和LY294002（20μM）持续12小时。

图5 免疫荧光分析显示VEGF增强BMSCs的VCAM-1表达由LY294002编制。免疫荧光的代表性结果说明VCAM-1表达水平的差异。图像在x200处。（A） 对照组；（B） VEGF组；（C） VEGF和LY294002组。对照组，细胞与含有10%FBS持续12小时；VEGF组，用L-DMEM培养细胞在VEGF（20 ng/ml）存在下含10%FBS 12 h；VEGF和LY294002组，用L-DMEM培养细胞在VEGF（20 ng/ml）和LY294002存在下含有10%FBS（20μM）持续12小时。

抑制PI3K减少迁移BMSCs对重组大鼠的反应及VCAM-1的表达VEGF164（血管内皮生长因子164）

的结果在体外迁移分析表明BMSCs向重组大鼠的迁移血管内皮生长因子164发现部分被阻止，号码随着添加LY294002。这表明VEGF164-介导PI3K激活可能与以下因素诱导的骨髓间充质干细胞迁移有关血管内皮生长因子164(图2). 我们还发现VCAM-1 mRNA和蛋白的上调LY294002治疗后表达下降提示PI3K激活可能在VCAM-1中发挥积极作用血管内皮生长因子刺激的骨髓间充质干细胞上调164(图4和5).

讨论

在本研究中，我们证明了VEGF参与调节C6胶质瘤诱导的迁移，并参与促进骨髓间充质干细胞表达VCAM-1，VCAM-1发挥重要作用VEGF诱导的骨髓基质细胞迁移中的作用以及PI3K的参与在这个调控过程的信号转导中。

据报道，BMSC的容量为迁移到胶质瘤(2,19). 与这些发现一致，我们的在体外迁移结果表明大鼠骨髓间充质干细胞定向迁移到C6胶质瘤细胞。共同培养后C6胶质瘤细胞36小时迁移细胞的平均数量显著高于对照组。这个方向迁移行为可能是由于C6胶质瘤细胞。

VEGF是最强和最特异的血管生成细胞因子。VEGF不仅与胶质瘤的侵袭性，也与胶质瘤恶性(20,21). VEGF mRNA和据报道，C6胶质瘤中的蛋白质增加(22). 此外，已经证明VEGF在胶质瘤组织中表达，并起到血管生成作用肿瘤血管因子(6,23).因此，我们将VEGF中和抗体添加到阻断VEGF对C6胶质瘤诱导的骨髓基质干细胞的迁移。我们发现迁移的骨髓基质干细胞数量明显减少，这表明VEGF在这个过程。我们的研究结果还表明阻断VEGF后，BMSCs仍高于对照组表明可能有其他可溶性活性因子释放来自参与诱导胶质瘤细胞迁移的C6胶质瘤细胞BMSC。通过分析影响进一步支持了这些结果重组大鼠血管内皮生长因子164，大鼠的一种主要亚型血管内皮生长因子在骨髓间充质干细胞迁移中的作用在体外迁移化验。数据表明，重组大鼠血管内皮生长因子164浓度为20 ng/ml油井导致迁移的骨髓基质干细胞显著增加。

作为一种跨膜糖蛋白，VCAM-1是免疫球蛋白超家族。VCAM-1及其受体整合素α4β1不仅在BMSCs上表达在胶质瘤微血管内皮上表达(24,25).先前的数据表明，VCAM-1与整合素的相互作用α4β1增强人黑色素瘤细胞的迁移活化内皮细胞层(26). 此外，VCAM-1有助于中性粒细胞进入中枢神经系统(27). 我们之前的数据也表明VCAM-1在胶质瘤转移中的重要作用(13). 自VEGF164是在C6胶质瘤细胞和大鼠脑，我们研究了重组大鼠的作用血管内皮生长因子164骨髓基质干细胞VCAM-1表达的研究(28). RT-PCR和免疫荧光试验表明，与20 ng/ml VEGF孵育164增加BMSCs中VCAM-1 mRNA和蛋白的表达。我们的数据还表明，VCAM-1的中和作用降低了向血管内皮生长因子迁移的骨髓间充质干细胞数量164，其中表明VCAM-1在血管内皮生长因子164-诱导BMSCs迁移。我们共同努力结论是VEGF通过增加骨髓基质干细胞中VCAM-1的表达。

最初定义为重要的细胞内信号转导途径，PI3K广泛参与细胞内一系列生理和病理反应由VEGF诱导，包括迁移(29,30).我们利用PI3K特异性抑制剂LY294002来探索PI3K对VEGF诱导的BMSCs迁移的影响。数据表明阻断PI3K后血管内皮生长因子164被抑制。我们还发现VCAM-1 mRNA和蛋白表达上调降低用LY294002治疗后。这些结果提供了PI3K信号通路与这种定向迁移的细胞内信号转导。由于LY294002不能完全阻断VEGF诱导的BMSCs，可能还有其他信号转导途径参与调节骨髓间充质干细胞的迁移能力和VCAM-1上调。

总之，我们的结果表明VEGF发挥在C6胶质瘤诱导的迁移和重组中起重要作用大鼠血管内皮生长因子164通过升高BMSCs的VCAM-1表达，PI3K是重要的信号分子介导的信号转导血管内皮生长因子164-诱导迁移和VCAM-1表达BMSC。

致谢

本研究得到了中国自然科学基金（合同编号：30901781，81171131、81172197、30973079和81072056）和博士辽宁省创业基金（no.20091107）。

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