Comprehensive Analysis of the Transcriptome-Wide m6A Methylation in Mouse Pachytene Spermatocytes and Round Spermatids

Hong, Shihao; Shen, Xiaozhong; Cheng, Jinmei; Tang, Hanyu; Sun, Fei

doi:10.3389/fgene.2022.832677

原创研究文章

正面。遗传学。2022年3月17日

第二节表观基因组学和表观遗传学

第13卷-2022年| https://doi.org/10.3389/fgene.2022.832677

小鼠粗线期精母细胞和圆形精母细胞转录体宽m6A甲基化的综合分析

已更新

修正适用于以下内容：

勘误表：小鼠粗线期精母细胞和圆形精子细胞中转录组范围m6A甲基化的综合分析
1. 读取校正

Shihao Hong先生^†

沈晓忠^†

程金美（Jinmei Cheng）

韩愈汤

孙飞*

南通大学医学院生殖医学研究所，南通，中国

精子发生是雄性生殖系发育中一个高效而复杂的系统，需要一系列精心调控的遗传事件，其中二倍体精原细胞分化为单倍体精子。N6-甲基腺苷（m6A）是精子发生过程中发生的一种重要的表观遗传RNA修饰。ALKBH5是一款m6A橡皮擦Alkbh5公司增加总m6A甲基化水平并导致男性不育。在这项研究中，对MeRIP-seq和RNA-seq数据的综合分析揭示了野生型（WT）和Alkbh5公司敲除（KO）小鼠。在粗线期精母细胞（PA）中，从WT中检测到与9959个基因相关的8151个m6A峰，从KO小鼠中检测到10856个m6A峰，与10016个基因相关。在圆形精子细胞（RO）中，从WT小鼠中测试了与10109基因相关的10271 m6A峰，从KO小鼠中检测了与10138基因相关的9559 m6A峰值。峰主要集中在GGAC基序的编码区和终止密码子。此外，富集分析显示精子发生相关通路中存在显著的m6A甲基化基因。此外，我们对m6A甲基组和RNA转录进行了联合分析，表明m6A是基因表达的调节机制。最后，用qPCR验证了PA和RO中RNA-seq数据中7个差异表达的mRNA。总的来说，我们的研究提供了关于PA和RO中WT和KO之间m6A修饰变化的新信息，并可能为m6A在生殖细胞发育和精子发生中的修饰分子机制提供新的见解。

引言

在哺乳动物中，精子发生由一系列严格控制的过程组成，包括有丝分裂、减数分裂和精子生成(Li等人，2014年;Griswold，2016年). 精原干细胞（SSC）的适当功能决定了精子的持续产生(Oatley和Brinster，2012年). SSC通过有丝分裂增殖，产生的子细胞分为两类：保持有丝分裂特征的子细胞，以及分裂形成A配对（Apr）和A排列（Aal）精原细胞的子细胞(Oatley和Brinster，2008年). Aal精原细胞经历一系列有丝分裂，然后分化为B型精原细胞。B型精原细胞产生初级精母细胞，进入减数分裂，减数分裂包括粗线期精母细胞（PA）和同源染色体重组，从而形成单倍体圆形精子细胞（RO）。最后，反渗透转化为成熟精子(Ahmed和de Rooij，2009年;Handel和Schimenti，2010年;O'Donnell等人，2011年;Naro等人，2017年).

N6-甲基腺苷（m6A）修饰与转录后水平的表达调控有关，包括前mRNA剪接、mRNA核输出、稳定性、衰变和翻译(Wei等人，1975年;Dominissini等人，2012年;Meyer等人，2012年;Wang等人，2014年;Alarcon等人，2015年;Wang等人，2015年). 在哺乳动物细胞中，m6A是一个涉及书写器、橡皮擦和读取器的动态可逆修改过程(贾等人，2013;Fu等人，2014年;Yue等人，2015年;A.Alemu等人，2016年;赵等，2017). METTL3是m6A的作者，调节主要作为主要催化成分的m6A修饰，在小鼠精子发生中发挥功能作用，因为METTL3-缺乏小鼠是不育的(Lin等人，2017年). m6A橡皮擦ALKBH5被认为是第二种m6A脱甲基酶(Ensfelder等人，2018年). 删除后Alkbh5公司粗线期和中期精母细胞凋亡和精子发生异常导致雄性小鼠生育能力下降。观察到PA和RO的数量显著减少Alkbh5公司敲除（KO）小鼠(Zheng等人，2013). 另一项研究表明Alkbh5公司缺陷导致精母细胞和RO中异常剪接和m6A修饰水平增加，生成具有较长的3ʹ-非翻译区（3 \697-UTR）和较短转录物的转录物，这表明3 \697 ;-UTR较长的转录物的m6A水平远高于终止密码子附近3ʸ-UTR较短的转录物(Tang等人，2018年). 此外，研究表明，精子发生在Alkbh5公司敲除（KO）小鼠停滞在圆形精子期，偶尔在KO小鼠的附睾尾部发现一些精子。这些KO精子畸形，表现出各种结构异常。然而，目前，m6A甲基化在PA和RO中的作用尚不清楚。

在本研究中，我们旨在研究m6A修饰的作用，以促进哺乳动物m6A的未来功能研究，并探讨生精障碍的发病机制。为此，我们检测了从Alkbh5公司使用STA-PUT方法对KO和野生型（WT）成年小鼠睾丸进行测试。RNA-Seq和MeRIP-Seq用于揭示Alkbh5公司基因在小鼠精子发生中转录组范围内的m6A甲基化水平，并了解m6A甲基化的功能作用是否在不同的生精阶段之间有所不同。我们还确定了精子发生中细胞类型特异性差异甲基化峰内的分子功能，这为进一步研究雄性生殖系发育的潜在机制提供了有用的参考。

材料和方法

老鼠

该动物研究由南通大学（中国南通）机构审查委员会审查和批准。这个Alkbh5公司^+/−这些老鼠是中国医学科学院基础医学研究所牛亚梅博士赠送的礼物，从杰克逊实验室（马萨诸塞州巴尔港）购买。纯合子Alkbh5公司小鼠是由杂合子Alkbh5小鼠杂交产生的。小鼠被关在温度和湿度控制的笼子里，光/暗周期为12小时。所有WT和Alkbh5公司本研究中使用的KO小鼠为C57BL/6J（B6）小鼠。男性Alkbh5公司此前曾报道过KO小鼠(Zheng等人，2013).

大体形态和精子分析

从12周龄的WT和Alkbh5公司KO小鼠，清洗并浸泡在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。称重睾丸并记录其形态后，用针头多次刺穿附睾尾，然后将精子释放到37°C的PBS溶液中30分钟。使用计算机辅助精子分析（CASA）测定精子活力，并重复测量三次。用血细胞仪测量精子浓度，一式三份。

不同发育阶段生精细胞的分离

PA和RO分别取自5名成年WT和10名成年Alkbh5公司如前所述，使用STA-PUT方法对KO小鼠进行测试(Song等人，2009年). 使用显微镜检查细胞纯度和形态，混合并离心含有类似细胞类型的组分，以收集纯化的PA和RO。如前所述，通过细胞形态分析测定，PA和RO-细胞组分的纯度高于90%(Bryant等人，2013年). 上述实验重复三次。

组织学

将WT和KO小鼠的睾丸和附睾固定在4%多聚甲醛溶液中，通过乙醇和水的梯度混合物脱水，通过二甲苯清除，包埋在石蜡中，并切片至5μm厚。切片用苏木精-伊红（HE）溶液染色。最后，使用光学显微镜获得显微照片（德国莱卡DM 2000）。

Western Blot分析

使用RIPA裂解缓冲液从WT和KO小鼠的整个睾丸中提取总蛋白裂解物。采用Pierce BCA蛋白检测试剂盒（P0012，Beyotime）测定蛋白质浓度。蛋白质裂解物（30μg）再次悬浮在十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后转移到硝化纤维素膜上。用5%浓度的脱脂牛奶封闭膜，并在20°C下培养1小时。接下来，在4°C下将膜与抗Alkbh5（1:500，HPA007196；Sigma）和抗β-微管蛋白（1:3000，ab108342；Abcam）抗体孵育过夜，第二天在PBS-T中洗涤，在20°C下与山羊抗兔HRP（1:5000，ab205718；Abcam）孵育1小时。最终使用奥德赛红外成像系统（Li-Cor Biosciences）对蛋白质进行可视化。

定量实时PCR分析

使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从WT和KO小鼠的睾丸组织中提取总RNA。使用HiScriptⅡ第一链cDNA合成试剂盒（Vazyme Biotech Co.，Ltd）逆转录总共1μg的总RNA。根据制造商的说明，使用TB Green™Premix Ex Taq™II（日本京都TakaRa生物技术公司）进行实时PCR。基因的所有引物均由Genewiz合成，如图所示补充表S1mRNA的相对丰度使用2^-ΔΔCt方法并归一化为β-actin mRNA水平。

MeRIP测序和RNA测序

在低温研磨环境中，使用研磨珠和高速往复振动装置（Tissuelyser-24）分离组织样品，并使用TRIzol™试剂（目录号15596018；Invitrogen）从三组PA和RO中分离总RNA。用DNase I（M0303S；NEB）处理分离的RNA以去除基因组DNA污染。提取的RNA在−30°C的糖原（最终25μg/ml）和异丙醇中沉淀2小时。将颗粒用70%乙醇冲洗两次，干燥，并溶解在超纯水中，然后将RNA片段化。简单地说，添加2μl 10×RNA片段缓冲液（100 mM Tris-HCl，100 mM ZnCl2于无核水中），并在70°C下培养6分钟后立即添加2μl 0.5 M EDTA以终止反应(Zeng等人，2018年). 使用Zymo RNA Clean and Concentrator-5 Kit（目录号R1013；Zymo Research）纯化并回收片段RNA。一部分纯化的片段RNA被保存为输入控制。将其余纯化片段RNA与2μg抗m6A抗体（ABE572；Sigma-Aldrich）在含有Dynabeads蛋白A（10002D；Invitrogen）和Dynabheads蛋白g（10004D；Invit罗gen）的IP反应系统中孵育，在4°C下过夜，轻轻摇晃。磁珠分离后，去除上清液，添加×5沉淀缓冲液和RNA酶抑制剂。反应在4°C下进行1-3小时，然后用低盐沉淀缓冲液进行2-3次洗涤，用高盐缓冲液进行2-3次洗涤。此后，将Dynabeads置于50°C的洗脱缓冲液（200μl）中30分钟，以分离出m6A-抗体免疫沉淀RNA片段。通过酚氯仿提取和乙醇沉淀纯化mRNA。通过核糖体RNA去除产物，根据SMART协议合成第一链cDNA，并通过PCR扩增富集片段以构建cDNA文库。用DNA纯化磁珠文库片段，提取甲基化m6A超微量RNA，检测文库。使用生物QseP70分析仪检查文库，并确定文库的大小分布是否符合理论大小。最后，在NovaSeq高通量测序平台上执行PE150测序模式。

数据分析

生物信息学数据分析由广州Epibiotek有限公司执行。Cutadapt（v2.5）用于修剪适配器和筛选序列。其余序列读取与小鼠集合基因组GRCm38对齐。我们在参数“--rna-strandness RF”下使用Hisat2校准仪（v2.1.0）(Kim等人，2015年). 使用exomePeak R包（v2.13.2）在参数“peak_CUTOFF_PVALUE=0.05，peak_CUTOFF_FDR=NA，FRAGMENT_LENGTH=200”下执行m6A峰值调用(Meng等人，2014年). 在所示参数下，使用exomePeak R包识别差异m6A峰。使用聚类分析R包（v3.6.0）对差异表达基因（DEG）进行GO和REACTOME分析。使用Guitar R软件包（v1.16.0）在参数“-len 6-RNA”下对所得数据进行可视化。Homer（V4.10.4）用于选择m6A峰值第页-值<0.05从头开始基序分析。

结果

Alkbh5公司敲除小鼠表现出精子发生障碍

Western blot分析显示，ALKBH5蛋白在KO小鼠中确实被删除(图1A). 调查女性不育的原因碱性磷酸酶5KO小鼠，我们首先从大体形态和组织学角度分析了睾丸发育。KO小鼠睾丸的形状和质量分别小于WT组和WT组(图1B). 睾丸切片的组织学分析显示，与WT小鼠相比，KO小鼠的生精小管中含有大小不等的多个液泡，生精细胞较少(图1C). 此外，附睾头和尾Alkbh5公司-KO小鼠只出现少数退化的未成熟精子细胞或精母细胞(图1D). 为了进一步分析这一点，我们从成年WT和KO小鼠中分离出附睾精子，尽管KO小鼠附睾中的精子数量很低。使用HE染色，我们还发现KO小鼠的精子显示出各种结构异常(补充图S1). 正如预期的那样，KO小鼠的精子数量减少，精子活力和形态受损(补充图S2).

图1

图1ALKBH5蛋白的Western blot分析。β-管蛋白被用作负荷控制（A）12周龄WT和WT的代表性右睾丸和右附睾Alkbh5公司KO小鼠（左图）。12周龄WT和Alkbh5公司KO小鼠（右图）条形图表示平均值±SEM（n=10****第页< 0.0001)（B）用苏木精-伊红（H&E）染色WT和Alkbh5 KO小鼠的生精小管结构（比例尺，50μm）（C）用H&E染色的WT和Alkbh5 KO小鼠的尾和附睾头（比例尺，50μm）（D）。

粗线期精细胞（PA）和圆形精细胞（RO）中m6A甲基化图概述

我们对PA和RO中不同阶段的生精细胞进行了MeRIP-seq分析Alkbh5公司-KO和WT小鼠(Meng等人，2013年).Alkbh5公司-KO-PA有1929个甲基化峰显著上调，326个下调峰（|log2FC|>1和FDR<0.05）。这个碱性磷酸酶5-与WT RO相比，KO RO有1589个甲基化峰值显著上调，而1602个甲基化峰下调(图2A、B)建议击倒Alkbh5公司可能对PA中甲基化的上调有相当大的影响，而下调的甲基化峰的数量远小于PA中上调的峰的数量。然而，RO结果与PA的结果不同，PA中上调甲基化峰数量与下调甲基化峰相似。PA和RO中的前10个甲基化改变峰如所示补充表S2接下来，来自两者的PA中甲基化峰值的分布碱性磷酸酶5-mRNA的3ʹ-UTR区域和长非编码（lnc）RNA的大部分区域的KO和WT相似(图2C). 具体来说，甲基化在Alkbh5公司-KO-PA显示出与WT-PA中的峰显著不同的模式，终止密码子（21.3%对19.7%）、起始密码子（4.7%对4.3%）、3UTR（20%对17.8%）、5UTR（1.6%对1.4%）和TSS（0.6%对0.3%）中甲基化峰的数量相对增加，编码DNA序列（CDS）显著减少（56.5%对51.8%）(图2E). 与PA相比，RO中不同区域的分布差异较大。击倒Alkbh5公司与PA相比，RO中lncRNA的分布变化更大(图2D). RO中不同区域的分布与PA相反Alkbh5公司-KO RO显示出与WT RO中的峰值显著不同的模式，CDS中甲基化峰值的数量相对增加（51.6%vs.49.7%），5ʹ-UTR（1.4%vs.1.2%），3ᭁ-UTR（21.4%vs.22%），TSS（0.4%vs.0.7%），终止密码子（21.1%vs.21.4%）和起始密码子（4.3%vs.5.1%）相对减少(图2F). 此外，GGAC基序在PA和RO的m6A位点高度富集(图2G).

图2

图2火山图显示WT PA和Alkbh5-KO PA之间的差异甲基化峰（A）火山图显示WT RO和Alkbh5公司-KO反渗透（B）m6A峰最富集于mRNA终止密码子附近的编码序列和PA中lncRNA的分布（C）m6A峰最富集于mRNA终止密码子附近的编码序列和lncRNA在RO中的分布（D）.不同区域在Alkbh5公司-KO和WT PA（E）.不同区域在Alkbh5公司-KO和WT RO（F）从Alkbh5-KO PA中鉴定出的前五个富含m6A峰的共有序列基序（G）。

差异甲基化峰在精子发生相关途径中富集

为了研究m6A差异的生物学意义碱性磷酸酶5-对KO和WT生精细胞、GO和REACTOME通路进行差异甲基化峰分析(Ashburner等人，2000年;Draghici等人，2007年). GO分析可分为两部分：生物过程（BP）和分子功能（MF）。首先，我们检查了Alkbh5公司-KO PA和WT PA。我们发现上调和下调的甲基化峰都与共价染色质修饰和组蛋白修饰密切相关。此外，我们发现上调的甲基化峰与MAPK活性的激活有关，下调的甲基化峰与MAPK级联的负调控有关(图3A、B). 接下来，我们分析了RO与Alkbh5公司-KO和WT。我们发现Alkbh5公司RO和PA中的甲基化峰可能没有什么不同，因为一些上调和下调的甲基化峰值也与染色质修饰和组蛋白修饰有关(图3C、D). 我们进行了REACTOME通路分析，以进一步研究Alkbh5公司-KO小鼠。在比较中Alkbh5公司-KO和WT-PA，我们发现甲基化峰的上调和下调都与染色质修饰酶和染色质组织有关。此外，我们发现上调的甲基化峰与M相有关。比较Alkbh5公司-KO和WT RO，我们发现上调的甲基化峰与有丝分裂前中期更相关，下调的甲基化峰值与RHO GTPase循环更相关(补充图S3).

图3

图3差异甲基化mRNA分析。上调GO富集分析（A）和下调（B）甲基化mRNA介于Alkbh5公司-上调的KO PA和WT PA.GO富集分析（C）和下调（D）甲基化mRNA介于Alkbh5公司-KO RO和WT RO。

转录组图谱概述揭示了精子发生障碍的重要机制

使用来自RNA-seq结果的数据集（MeRIP-seq输入库），我们比较了碱性磷酸酶5-KO与WT生精细胞。我们发现这些样本在表达水平的密度和分布上没有显著差异，这可以全面表明测序结果是可靠的(图4A). 我们使用R包DESeq2在PA中发现785个上调基因和440个下调基因（|log2FC|>1和FDR<0.05）。我们还发现RO中有564个上调基因和539个下调基因。PA和RO中前10个差异表达基因见补充表S3简而言之Alkbh5公司-KO PA远大于WT PA。然而碱性磷酸酶5-KO RO与WT RO相似(图4B、C). 此后，我们对Alkbh5公司-KO和WT生精细胞。GO分析可以分为两部分：BP和MF。首先，我们考虑了Alkbh5公司-从BP结果中，我们发现这些DEG与生殖过程密切相关，如精子细胞分化、精子细胞发育和生殖细胞发育。此外，上调基因与精子发生更为相关，下调基因与减数分裂周期更为相关。由此可以推测，击倒Alkbh5公司可能会对小鼠的生殖功能造成损害。从MF结果中，我们发现上调基因与蛋白质二硫键异构酶活性相关，下调基因与动力蛋白轻中间链结合相关(图5A、B). 接下来，我们比较了与生殖过程密切相关的二甘醇Alkbh5公司-KO RO和WT RO。然而，我们发现上调基因与蛋白质结合更相关，下调基因与ATP酶活性更相关(图5C、D). 此外，我们筛选出DEGs，并在PA和RO中进行REACTOME富集分析。此外，我们发现上调基因与M期相关。比较Alkbh5公司-KO和WT RO，我们发现上调基因与应激反应更相关(补充图S4).

图4

图4差异基因分析FPKM密度分布（A）火山图显示了Alkbh5公司-KO PA和WT PA（B）,Alkbh5公司-KO RO和WT RO（C）。

图5

图5上调的GO富集分析（A）和下调（B）基因介于Alkbh5公司-上调的KO PA和WT PA.GO富集分析（C）和下调（D）基因介于碱性磷酸酶5-KO RO和WT RO。

精子发生相关基因的表达在Alkbh5公司科

为了进一步调查Alkbh5公司在精子发生方面，我们对甲基化和mRNA表达水平发生显著变化的基因进行了关联分析。结果分为四部分：高甲基化下降、高甲基化上升、低甲基化下降和低甲基化上升。图6A显示了前10个差异甲基化基因。为了发现差异峰与基因之间的关系，我们计算了PA和RO中上调和下调mRNA的数量以及KO中的峰值，并计算了它们的交集。我们发现PA中共有54个上调重叠基因和10个下调重叠基因。然而，RO中有37个上调基因，55个下调基因。这揭示了PA和RO之间相对较大的差异(图6B). 接下来，我们选择了Alkbh5公司-KO PA和WT PA(表1)，以及Alkbh5公司-RO和WT RO(表2). 然后，我们在每个表中交叉了20个基因。我们发现，在每个表中的前20个DEG中，大约有11个基因出现在两个比较中。我们发现这些基因与精子发生的发展有关。因此，我们使用qPCR来发现这些基因的全面变化，以及它们是否存在于整个睾丸中。我们发现了Mroh4、Prm1、Lrrc7、Dbil5、H1fnt、Catsperd、和奇数4在Alkbh5公司KO公司(图6C).

图6

图6PA和RO甲基化和mRNA表达水平显著变化的基因关联分析（A）维恩图显示了上调和下调甲基化峰的交叉点，以及PA和RO的mRNA（B）七个基因的mRNA表达水平Alkbh5公司-qPCR检测KO和WT小鼠睾丸组织(****第页< 0.0001, ***第页= 0.0001, **第页< 0.01.)（C）。

表1

表1中前20个差异蛋白编码基因Alkbh5公司-KO PA和WT PA。

表2

表2. The top 20 differential protein-coding genes in碱性磷酸酶5-KO RO和WT RO。

讨论

m6A脱甲基酶的修饰在哺乳动物精子发生中起着关键作用。ALKBH5作为m6A清除剂在小鼠睾丸中高度表达，ALKBH1的缺失显著增加了睾丸细胞中m6A的水平。Alkbh5公司-KO小鼠出现精子发生异常和生育能力低下(Zheng等人，2013). 一项独立研究表明，较长的3ʹ-UTR转录物的正确剪接可能需要ALKBH5介导的m6A去甲基化(Tang等人，2018年). 然而，以往关于Alkbh5公司只关注精子发生的整体变化，而不关注精子发生各个阶段RNA和m6A甲基化变化的具体变化。为了解决这个问题，我们进行了高通量测序，以揭示精子发生阶段PA和RO中m6A的分布Alkbh5公司-KO和WT小鼠。使用MeRIP-seq，我们发现Alkbh5公司-与WT-PA相比，KO-PA有1929个明显上调的甲基化峰，而326个下调。这个Alkbh5公司-与WT RO相比，KO RO有1589个显著上调的甲基化峰，而1602个下调。然后，我们使用GO和REACTOME途径富集分析来探索差异甲基化转录物的潜在功能。最后，我们发现甲基化峰基因和富含精子发生相关途径的同步差异表达基因存在差异。

在本研究中，由于MeRIP-seq的分析结果包括RNA-seq的结果，我们的分析揭示了Alkbh5公司从甲基化和基因表达差异的角度研究精子发生。我们发现Alkbh5公司PA和RO的差异很大。首先，我们发现ALKBH5是一种去甲基化酶，对PA和RO转录物的甲基化有不同的影响Alkbh5公司KO，这与我们之前关于碱性磷酸酶5睾丸中RNA甲基化程度显著增加Alkbh5公司KO公司(Tang等人，2018年). 然而，在RO中，我们发现Alkbh5公司KO，显著上调的甲基化峰的数量非常接近显著下调的甲基化峰的数量。我们发现甲基化峰在PA和RO中的分布有很大差异。特别是，在Alkbh5公司敲除后，我们发现甲基化峰分布在PA CDS区域的比例显著增加，而甲基化峰在RO CDS区域分布的比例降低。此外，lncRNAs作为表观遗传调节剂，在精子发生中发挥着重要作用(Wichman等人，2017年)例如精子参数的定义(An等人，2017年)和精子获能(Song等人，2011年). 我们对lncRNA、PA和RO甲基化峰分布的观察也受到敲除Alkbh5公司lncRNA的表达特征是随着精子发生的发展，其表达位点数量和总表达水平急剧增加，并在圆形精子发生阶段达到峰值(Davis等人，2017年).

在这里，我们使用GO富集分析进一步探索差异甲基化峰。之后我们发现了Alkbh5公司敲除，PA和RO中上调和下调的甲基化峰与共价染色质修饰和组蛋白修饰密切相关。组蛋白修饰影响染色质的结构和功能。先前的研究表明，各种组蛋白修饰参与精子发生的调节(Okada等人，2007年;刘等人，2010;Okada等人，2010年;岩森等人，2011年)但共价染色质修饰在精子发生中的作用尚不清楚。然而，最近的研究表明，m6A修饰通过改变组蛋白修饰和染色质结构来激活基因转录(Wang等人，2018年). 在小鼠胚胎干细胞中，敲除METTL3降低了m6A修饰水平，稳定了促进和维持基因转录的染色质开放(刘等人，2020年). 基于我们的研究结果，我们提出以下推测：PA和RO生精细胞mRNA上的m6A修饰水平和相关结合蛋白可以共同调节染色质的开放状态和下游基因的转录水平，对精子发生的顺利进行起着重要作用，而不正常的调节会导致男性不育。此外，PA中m6A修饰位点上调的基因与MAPK活性的激活有关，m6A-修饰位点下调与MAPK级联的负调控有关。MAPK级联在男性生殖过程中发挥着重要作用，如精子发生、精子成熟和顶体反应(Li等人，2009年). TCP1参与MAPK级联的调节，参与肌动蛋白和微管蛋白丝的组装(Dun等人，2012年). 哺乳动物生殖细胞中存在肌动蛋白丝，参与精子发生过程中的一些变化，如精子成熟和获能(Howes等人，2001年). 我们的结果表明，MAPK信号通路m6A修饰的变化可能影响精子成熟和获能。综上所述，这些因素可能有助于KO小鼠的生育能力。

在DEG分析中，我们检测到了几个与许多重要生物途径相关的DEG。REACTOME通路分析显示，在精子发生过程中，与受精和生殖基因相关的转录物在PA和RO中下调，表明与精子发生相关的基因在PA和RO中的表达都受到甲基化酶敲除后甲基化水平升高的影响。这进一步说明了m6A甲基化在精子发生过程中是必要的。利用MeRIP-seq结果，我们从RNA的角度分析了差异。RNA差异分析结果与甲基化结果相似。我们发现PA中上调基因的数量显著大于PA中下调基因的数量Alkbh5公司淘汰赛。然而，RO中上调和下调基因的数量相近。在富集分析中，我们发现PA和RO的差异基因与精子发生密切相关。因此，这个结果揭示了敲出Alkbh5公司影响PA和RO中的基因表达。需要进行进一步的分子实验来验证小鼠PA和RO.中的差异甲基化基因。接下来，我们发现Alkbh5公司-KO PA、WT PA、，Alkbh5公司-RO和WT-RO与精子发生密切相关。此外，在交叉这些基因后，我们发现一半以上的基因出现在两个比较中。在qPCR实验中，我们发现与精子发生相关的转录物显著下调，因为Alkbh5公司让开。其中之一是，项目1在精子发生的单倍体阶段，精蛋白是精子染色质中组蛋白的鱼精蛋白替代物，它将精子DNA压缩成高度浓缩、稳定和无活性的复合物(Fagerberg等人，2014年). 此外，我们发现奇数4它编码一种蛋白质，该蛋白质位于成熟精子尾部的外层致密纤维中。这种蛋白质被认为在精子尾部起重要作用(Nakamura等人，2002年). 此外，H1FNT型年也受到了下调Alkbh5公司KO是一种生殖细胞特异性连接组蛋白变体，在精子生成过程中表达，特别是在圆形和伸长的精子细胞中表达(田中等人，2006年). 总之，Alkbh5公司在表观遗传和mRNA水平上对精子发生的发展都有很大贡献。

虽然约50%的男性不育的原因尚不清楚，但遗传原因尤其难以诊断(Zhang等人，2011年). 我们目前的小鼠研究为男性不育的遗传原因提供了基础。Alkbh5公司在人类睾丸中也广泛表达。在人类中，Alkbh5公司与其他阶段相比，PA的表达更高，这意味着它会影响精液质量，其功能的紊乱会增加男性不育的风险(Landfors等人，2016年). 然而，在整个进化过程中，人类也发展出了精子发生的特征，这些特征与小鼠的不同。目前还不清楚PA和RO中m6A甲基化水平和mRNA表达水平在人类中是否与小鼠中相同。这项研究揭示了未来研究开发某些类型人类不育治疗方法的可能目标。

总之，我们分析了PA和RO中的差异m6A甲基组分Alkbh5公司-与相应的WT小鼠相比，KO小鼠表现出m6A修饰与精子发生之间的强烈关联。此外，在Alkbh5公司KO、m6A水平升高，影响许多精子发生相关基因，很可能导致精子发生障碍。此外，数据显示，小鼠PA和RO中m6A甲基化水平和mRNA表达水平存在显著差异；需要进一步研究来揭示影响男性生育能力的潜在机制。

数据可用性声明

本研究中的数据集可以在在线存储库中找到。存储库名称和登录号如下：BioProject:PRJNA761579，SRA登录：SRP336482，GEO:GSE186217。

道德声明

该动物研究由南通大学（中国南通）机构审查委员会审查和批准。

作者贡献

SH和XS参与了研究设计、统计分析和论文写作。HT协助数据收集。JC审查并编辑了手稿。FS修订了手稿，并负责监督研究。

基金

本研究得到了国家重点研发计划（No.2021YFC2700200 to FS）和江苏省研究生科研与实践创新计划（KYCX20_2841）的资助。

利益冲突

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

出版商备注

本文中表达的所有声明仅为作者的声明，不一定代表其附属组织的声明，也不一定代表出版商、编辑和审稿人的声明。任何可能在本文中进行评估的产品，或制造商可能提出的索赔，都不受出版商的保证或认可。

致谢

我们感谢中国医学科学院基础医学研究所的牛亚梅博士对杂合子的慷慨捐赠Alkbh5公司老鼠。我们要感谢Home对研究人员的支持(www.home-for-researchers.com)用于书面写作。我们还要感谢Editage(编辑网www.editage.cn)用于英语编辑。

补充材料

本文的补充材料可以在以下网站上找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2022.832677/fill#补充-材料

工具书类

A.Alemu，E.、He，C.和Klungland，A.（2016）。ALKBH-促进RNA修饰和去修饰。DNA修复44, 87–91. doi:10.1016/j.dnarep.2016.05.026