机械刺激通过虹膜素诱导PI3K/Akt/NF-κB信号通路抑制骨关节炎软骨细胞下垂

1引言

骨关节炎（OA）是最常见的关节疾病之一，影响超过80%的70岁以上老年人(Martel-Pelliter等人，2016年). OA常伴有关节软骨炎症、退行性变和滑膜炎(Kalunian，2016年). 目前OA的治疗包括手术和药物治疗，如非甾体抗炎药（NSAID）；然而，这些只是缓解症状。在新的临床指南中，非手术治疗，如体育锻炼被推荐为一线治疗(区块，2014年;Nelson等人，2014年)运动疗法被广泛认为是一种安全有效的治疗方法。在过去10年中，越来越多的证据表明，体育活动对骨性关节炎有积极影响(Fransen等人，2014年;Fransen等人，2015年). 然而，体育锻炼改善OA并达到治疗效果的机制尚不清楚。

Boström等人（2012年）2012年发现，体育锻炼刺激肌肉产生代谢因子虹膜素，这是一种被纤维连接蛋白III型结构域蛋白5（FNDC5）裂解的激素样多肽。鸢尾素含有112个氨基酸残基，分子量约为12 kD。研究表明，运动可以增加肌肉中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）及其辅活化因子-1-α（PGC-1α）的表达，从而促进FNDC5的下游生成及其蛋白水解裂解形成虹膜素(Hecksteden等人，2013年;艾丁，2014;Norheim等人，2014年). 尽管有报道称虹膜素对软骨细胞具有抗骨关节炎的作用(Li等人，2021;瓦达拉等人，2020年)其在骨关节炎（OA）运动治疗中的作用尚不清楚。作为一种运动诱导的肌细胞因子，我们假设鸢尾素可能是治疗OA的关键运动因子。

尽管OA的病因和发病机制尚不清楚，但已知软骨细胞中的炎症反应在OA的发展中起着关键作用，这些炎症反应可触发和促进软骨细胞死亡(斯坎泽洛，2017a;2017年b). Pyroptosis是一种促炎性程序性细胞死亡，由涉及nod样受体蛋白-3（NLRP3）/胱天蛋白酶-1（Y.Hu等人，2020年;Kesavardhana等人，2020年). 提高对OA炎症和炎症诱导的细胞凋亡的认识有助于寻找新的治疗靶点。

为了确定与运动相关的差异表达基因，我们使用了从基因表达Ominibus数据库（GSE74898）、基因本体（GO）注释和京都基因和基因组百科全书（KEGG）获得的数据进行分析。一些研究表明，核因子κB（NF-κB）转录因子在骨关节炎的发病机制中起着核心作用(Choi等人，2019年;Lepetsos等人，2019年;Chow&Chin，2020年). 基于先前的研究和运动相关差异表达基因，我们假设核因子κB（NF-κB）通路在OA运动治疗中起关键作用(补充图S1–S3). PI3K/Akt是NF-κB的上游，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，通过磷酸化（Z.C。Hu等人，2019年;Lou等人，2017年). 据报道，活化的PI3K/Akt/NF-κB级联增加了基质金属蛋白酶（MMPs）、去整合素和带血小板反应蛋白基序的金属蛋白酶（ADAMTS）的表达，而减少了II型胶原的表达，最终导致细胞外基质（ECM）的破坏在OA发病过程中诱导软骨细胞凋亡(Huang等人，2019年;谢等人，2019年). 因此，研究PI3K/Akt/NF-κB通路及其作为OA治疗潜在靶点的凋亡机制具有重要意义。

在本研究中，我们评估了平板运动后人类关节软骨和大鼠与未运动对照动物相比的虹膜素水平，并研究了平板运动期间虹膜素对OA的治疗作用。我们还研究了虹膜素影响PI3K/Akt/NF-κB信号通路抑制炎症的机制以及软骨细胞的抗甲状腺功能减退机制。

2材料和方法

2.1生物信息学分析

为了鉴定运动相关差异表达基因，我们选择GSE74898数据集进行进一步研究。该数据集来自GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo网站)并且包含Sprague-Dawley（SD）大鼠，其被分为对照久坐组和2-、5-或15-d运动组。所有组均用于差异基因表达分析。使用Limma/R软件包（版本3.5.1）生成差异表达基因的火山图。主要参数为对数倍变化，对数倍变化>2表示差异表达基因。然后，将差异表达基因提交给DAVID v6.8工具(https://david.ncifcrf.gov网址/)用于注释、可视化和集成发现。对运动相关差异表达基因采用基因本体（GO）功能注释分析（分子功能、生物过程和细胞成分），并使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）路径富集分析确定运动治疗中的潜在路径(黄达等，2009).

2.2人类关节软骨及其临床病理特征

人类全膝关节置换术后关节标本的方案和实验得到了中国医科大学盛京医院伦理委员会的批准（编号：2019PS629K），该委员会遵守了世界医学会赫尔辛基宣言中规定的原则。12名捐赠者参与了我们的研究，我们获得了所有患者的知情同意。如我们之前的研究所述(Lin等人，2021年)收集全膝关节置换术后膝骨关节炎患者的软骨和临床病理特征，并根据国际软骨修复学会（ICRS）分级将其分为受损组和未受损组(Kleemann等人，2005年)ICRS=0被归类为未受损区域，ICRS=1～4被归类为受损区域。我们比较了同一捐赠者的受损区域和未受损区域。

2.3实验动物和骨关节炎模型

共获得48只Sprague-Dawley（SD）大鼠（240±5 g，4周龄，雄性，无特定病原体，每组8只，每个笼子6只），来自HFK生物科学有限公司（中国北京）。本研究由中国医科大学伦理委员会（编号：2017PS237K）批准，该委员会遵循世界医学会赫尔辛基宣言中规定的原则。所有SD大鼠被放置在覆盖有木屑的单独笼子中，并保持在受控环境中（12小时光照：12小时黑暗循环，温度控制在22±2°C，湿度70%），食物和水可自由选择。定期记录大鼠的体重。在适应性喂养1周后，所有大鼠在ZH-PT动物跑步机运动平台（中国北京中世地创科技发展有限公司）开始适应性训练。用戊巴比妥钠（1.0%，2.5ml/100g）麻醉大鼠，然后用微型注射器关节内注射MIA（50μl无菌盐水中每腔1mg）建立OA模型。

2.4骨关节炎大鼠模型的平板运动方案

SD大鼠在跑步机上以10 m/min和10 min/d的速度训练1周，无任何其他刺激，以适应跑步机训练。本研究中使用的跑步机运动方案基于先前的研究(Yang等人，2020年;Yang等人，2018年). 具体的跑步机锻炼方案如所示图1A对照组（CG）和骨关节炎（OAG）为久坐组，而OA为低强度平板运动组（OAL）；OA伴中等强度平板运动（OAM）；OA和高强度平板运动（OAH）为运动组。所有测试均使用适当的光、声和电刺激进行。为了提供关于虹膜素在骨关节炎运动治疗中重要性的数据，添加了虹膜素中和抗体体内中等强度运动组。向大鼠注射20μg虹膜中和抗体通过根据之前的研究，在运动前1小时检查尾静脉，每周三次(Fan等人，2019年;Li等人，2017年).

图1在膝关节骨性关节炎（OA）患者的关节软骨损伤区域，虹膜蛋白的表达下调。（A）膝关节骨性关节炎（OA）患者的平片(n个= 12). 黑色箭头表示骨关节炎较严重的区域。前-后（A-P）。（B）未受损（U）和受损（D）的虹膜相对蛋白水平（D）区域，以GAPDH为控制。（C）膝关节软骨的H&E和甲苯胺蓝染色。蓝色箭头表示受损区域，红色箭头表示未受损区域。虹膜相对水平和OARSI评分*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001.

2.5组织取样和采集

处死大鼠通过最后一次跑步机运动后服用过量戊巴比妥。立即从下腔静脉采集血液，并以3000 rpm离心15分钟以分离血清。去除上清液，转移到微管中，并在−80°C下储存以供分析。解剖大鼠以获得膝关节，然后用4%多聚甲醛（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）溶液固定7天。然后使用20%EDTA（Sigma-Aldrich）溶液将膝关节脱钙7周，每3天用新鲜溶液替换一次。脱钙后，接头在乙醇和二甲苯（Sigma-Aldrich）中脱水。最后，将样品包埋在石蜡中（Sigma-Aldrich）。

2.6酶联免疫吸附测定虹膜素水平

按照制造商的说明，使用商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（SEN576Ra；Cloud-Clone Corp.USCN Life Science，中国武汉），在波长为450 nm的分光光度读取器上测定虹膜蛋白和滑液虹膜蛋白的血清水平。标准曲线R（右）²= 0.997.

2.7 X射线和计算机断层扫描和磁共振成像观察

膝关节图像由X射线（MX-20，Faxitron X-ray，Corp.，Lincolnshire，IL，United States）、SkyScan 1276 Micro-CT（Bruker，Kontich，Belgium）、NRecon 1.6版软件（Bruke）和Ingenia3.0 T MRI系统（Philips，Uniteds States）拍摄。通过腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，并将其固定在仰卧位。用胶带将双踝固定在托盘上。镜头聚焦在大鼠膝关节上合适的焦距，曝光时间设置为适当的分钟，以确保图像清晰。根据以前文献中使用的基于表面粗糙度和侵蚀的宏观评分的成像评分系统，通过成像结果评估骨关节炎的程度，包括关节间隙狭窄和关节表面钙化，以及关节软骨损伤。利用成像技术，我们通过计算病变面积与总表面积的比值来量化胫骨平台或股骨髁表面。胫骨和股骨关节均根据最高得分10分进行评估(Gerwin等人，2010年;Kohn等人，2016年;Lin等人，2021年). 评分由两名经验丰富的观察员进行，他们对研究组一无所知。

2.8组织学

将样品包埋在石蜡中后，从胫股关节切下5μm的矢状截面，并用苏木精-伊红（H&E）和甲苯胺蓝染色进行组织学检查。然后在奥林巴斯BX53显微镜下观察获得的切片（日本东京奥林巴斯）。根据改良Mankin量表（0-14分）和国际骨关节炎研究学会（OARSI）量表（0-24分）评估胫股关节软骨损伤程度(Gerwin等人，2010年). 胫骨和股骨关节均根据Mankin评分28分和OARSI评分48分进行评估。评分由两名经验丰富的观察员进行，他们对研究组一无所知。

2.9免疫组织化学

在切片脱蜡并用PBS清洗后，在增湿条件下执行以下步骤。酶抗原提取（C1033，Solarbio Science&Technology Co.，Ltd.，Beijing，China）在37°C下进行30分钟，以修复切片中的抗原。然后，3%H₂O（运行）₂在25℃下使用30分钟以消除内源性过氧化物酶活性，而在25℃条件下使用阻断血清（15019，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，United States）30分钟以阻断非特异性抗原。然后，将切片与抗FNDC5抗体（ab174833，1:100，Abcam，Cambridge，MA，United States）、抗胶原蛋白II抗体（ab34712，1:100，抗NLRP3抗体（19771-1-AP，1:100，Proteintech Group，Rosemont，IL，United States）和抗caspase 1抗体（22915-1-AP，1:100）在4°C过夜。第二天，将Boost IHC检测试剂（HRP，兔子；8114，细胞信号技术）添加到25°C下的切片中30分钟，然后用PBS清洗切片三次。使用二氨基联苯胺（DAB）底物试剂盒（8059，细胞信号技术）对切片进行染色3分钟，用苏木精（G8550，Solarbio Science&Technology Co.，Ltd.，Beijing，China）复染3分钟。然后，切片被脱水并密封。使用光学显微镜（Eclipse Ci，Nikon，Chiyoda，Japan）拍摄切片图像，并使用Image-Pro Plus 6.0版软件量化光密度。平均光密度代表II型胶原的相对表达，而MMP-13、ADAMTS-5、虹膜素、NLRP3和caspase-1的表达则根据阳性细胞的百分比进行测量。

2.10原代软骨细胞培养和治疗

从4周龄SD大鼠的膝关节软骨中分离出大鼠原代软骨细胞。膝关节软骨被切成1毫米^三粒子。然后，使用3 mg/ml蛋白酶K（V900887，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，United States）在37℃下消化软骨碎片2 h，然后在37℃用2.0 mg/ml胶原酶D（C0130，Sigma Aldrich）消化1 h。在整个消化过程中使用了轻微的机械振动。接下来，将细胞悬浮液以800 rpm离心5分钟，并重新悬浮在新鲜的Dulbecco改良Eagle’s培养基F-12（DMEM/F-12；美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的赛默飞世尔科学公司）中。将重新悬浮的软骨细胞转移到培养瓶中，并在37°C、5%CO的条件下，用补充有10%FBS（abs972，Absin Bioscience Inc.，中国上海）和1%青霉素和链霉素（Hyclone Laboratories Inc.，Logan，UT，United States）的DMEM/F-12培养₂孵化器。然后，软骨细胞与0.05%胰蛋白酶（C0202；Beyotime Biotech，中国上海）以1:4的比例传代，直至70%–80%融合。软骨细胞在1到3代之间培养，以避免软骨细胞表型的丢失。根据之前的研究(Tine Kartinah等人，2018年;Shirvani等人，2019年)根据大鼠滑液中虹膜素的浓度，用在不同生理浓度（0、5或10 ng/ml）的培养基中溶解的虹膜素（8880-IR-025，R&D Systems，Minneapolis，MN，United States）预处理软骨细胞1 h，然后用或不用IL-1β（10 ng/ml）孵育24h诱导软骨细胞炎症及信号通路的参与。将软骨细胞分为以下组：对照组，加入等量无血清培养基；IL-1β组；IL-1β+虹膜素（5 ng/ml）组；IL-1β+虹膜素（10 ng/ml）组。

2.11细胞活力测定

采用CCK8试验（Beyotime Biotech，中国上海）评估了IL-1β在原代大鼠软骨细胞中的最佳应用浓度。软骨细胞（1×10⁴/well）接种在96 well培养板上，并用递增浓度的IL-1β（1、2、4、8、10、15和20 ng/ml）处理。根据这些结果选择后续实验中使用的IL-1β浓度。使用Gen5平板读取器（BioTek，Winooski，VT，美国）测量450nm处的光密度值。所有实验均一式三份。

2.12 Western Blot分析

人软骨在冷PBS中清洗三次，然后切成碎片。软骨和大鼠初级软骨细胞均在RIPA（9806S，Cell Signaling Technology）中用1 mM PMSF（ST506；Beyotime Biotech，中国上海）和1 mM磷酸酶抑制剂（P1081；Beyotime Biotech（中国上海））进行裂解。在4°C下以12000 rpm/min的速度离心裂解液15 min，收集上清液并将其储存在−80°C下。蛋白质浓度采用双钦尼克酸法测定（P0010；Beyotime Biotech，中国上海）。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（8%–10%SDS-PAGE）分离等量的蛋白质（20μg），然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。接下来，用5%牛血清白蛋白（BSA）在25°C下封闭PVDF膜2小时，并用含0.1%吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水（TBS）洗涤三次。然后在4°C下将PVDF膜与一级抗体孵育过夜。使用的抗体包括抗FNDC5抗体（ab174833，1:1500，Abcam）、抗胶原蛋白II抗体（ab188570，1:2000，Abcam）、抗MMP-13抗体-PI3激酶抗体（4228T，1:2000，Cell Signaling Technology），抗Akt抗体（abs1317881:2000，Absin Bioscience Inc.），磷酸化（p）-Akt抗体，NLRP3多克隆抗体（19771-1-AP，1:2000，Proteintech Group，Rosemont，IL，美国）、胱天蛋白酶1/p20/p10多克隆抗体（22915-1-AP，1:2000，Proteintech Group）和抗β-肌动蛋白抗体（205361-AP，1:3000，Proteintech Group）。第二天，用TBST清洗PVDF膜三次，然后在25°C下与山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab6721，1:10000，Abcam）孵育2 H。使用增强化学发光对膜进行可视化（Millipore，Billerica，MA，美国）。ImageJ软件(imagej.nih.gov/ig/下载)用于量化。β-actin作为内部对照。

2.13定量逆转录聚合酶链反应分析

使用RNAiso Plus试剂盒（Vazyme Biotech Co.，Ltd.，中国南京）从原代大鼠软骨细胞中提取总RNA。接下来，按照制造商的指示，使用HiScript II Q RT SuperMix将RNA反向转录到cDNA中进行qPCR（+gDNA擦拭器；Vazyme Biotech Co.，Ltd.）。qRT-PCR反应是使用SYBR Green PCR试剂盒（Vazyme Biotech Co.，Ltd.）和Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系统制备的。每种反应均一式三份。PCR条件如下：步骤1，95°C，30 s；步骤2，95°C持续5s，60°C下40次循环持续30s；步骤3：95°C持续15秒，60°C持续60秒，95°C保持15秒。相对mRNA表达使用2^-ΔΔCq方法(Livak&Schmittgen，2001年). 根据相对于β-肌动蛋白的折叠变化来表示获得的值。目标基因引物由中国桑贡设计并购买(表1). β-actin作为内部对照。

表1用于qRT-PCR的引物序列。

2.14免疫荧光显微镜

软骨细胞接种在24孔板中的盖玻片上。一旦达到70%的融合率，用在培养基中溶解的虹膜素预处理细胞1 h，然后用或不用IL-1β（10 ng/ml）培养24 h。含软骨细胞的盖玻片用4%多聚甲醛固定20分钟，然后用0.5%Triton X-100（Solarbio Science&Technology Co.，Ltd.，Beijing，China）在25°C下渗透20分钟。接下来，用5%BSA封闭盖玻片30分钟，不进行清洗，然后在4°C下与抗NF-kappaB p65抗体（ab16502，1:500，Abcam）孵育过夜。在PBS中洗涤三次后，将细胞与抗兔IgG（H+L）F（ab′）2片段（Alexa Fluor^®488共轭）（4412s，1:200，细胞信号技术）在25°C下持续3小时。细胞核用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色5分钟。在共焦显微镜下观察盖玻片（奥林巴斯）。

2.15流式细胞术

使用caspase-1荧光抑制剂探针FLICA 660-YVAD-FMK（BD Biosciences，San Jose，CA，United States）评估炎症性软骨细胞死亡。去除培养基并清洗5次后，用碘化丙啶（PI）（BD Biosciences）标记有膜孔的细胞，并使用FACSCalibur流式细胞仪（BD bioscience）进行测量。将细胞死亡率的倍增率与对照组进行标准化，并使用FlowJo软件（BD Biosciences）分析数据。

2.16透射电子显微镜

细胞在25°C的2.5%戊二醛中固定2-4小时。在低速离心（800转/分，5分钟）后，在试管底部可以看到绿豆大小的细胞团。细胞簇用1%琼脂糖染色，并用0.1M磷酸缓冲液PB（pH 7.4）漂洗三次，每次15分钟。然后，加入1%的OSO4，轻轻提起并悬浮细胞团。脱水后，将样品嵌入树脂中。铀铅双重染色后（2%乙酸铀饱和酒精溶液，柠檬酸铅；每个染色15分钟），切片在25°C下干燥过夜。使用Hitachi 800 TEM（日本东京）观察细胞形态和亚细胞结构。

2.17统计分析

所有实验均独立进行至少三次。使用GraphPad Prism 5将结果表示为平均值±平均值标准误差（SEM）。使用IBM SPSS Statistics 25.0进行统计分析。A类第页-值<0.05被认为具有统计学意义。

3结果

3.1运动相关差异表达基因和潜在信号通路的生物信息学分析

对照组与2、5和15天运动组之间确定的运动相关差异表达基因的火山图如所示补充图S1A–C我们共鉴定出389个重叠的差异表达基因；我们的结果如所示补充图S1D。我们对潜在差异表达基因进行了GO功能注释分析，包括分子功能(补充图S2A)，生物过程(补充图S2B)、和蜂窝组件(补充图S2C). 我们还进行了KEGG通路富集分析，以进一步研究这些差异表达基因的潜在通路。如所示补充图S3，NF-κB信号通路包含在富集的KEGG通路分析中。基于先前的研究和运动相关差异表达基因，我们预测NF-κB通路及其上游效应器可能在运动治疗中发挥关键作用(补充图S1–S3).

3.2膝骨关节炎患者关节软骨损伤区虹膜蛋白表达下调及其与病理特征的关系

为了评估虹膜素在OA中的潜在作用，我们首先通过收集18例膝OA患者的临床图像来验证关节软骨标本的有效性(图1A); 这些区域分为未受损（U）和受损（D）区域。结合蛋白质印迹分析(图1B)和组织学评估(图1C)，我们观察到虹膜蛋白(第页=0.046<0.05）关节软骨损伤区下调。

3.3平板运动对骨关节炎大鼠虹膜素浓度的影响

如所示图2D、EELISA显示，与久坐组（CG和OAG）相比，所有跑步机运动组（OAL、OAM和OAH）的血清水平和滑液虹膜蛋白水平均升高。我们的结果表明，跑步机运动（尤其是OAM）可以显著(第页<0.001）与CG组和OAG组相比，增加了虹膜蛋白水平，OAH组和OAL组、OAM组之间无统计学差异。如所示图2B平板运动（OAL、OAM和OAH）组和久坐（CG和OAG）组之间的体重差异显著(第页< 0.001). 相反，OAL、OAM和OAH之间的差异不显著(第页=0.874）。

图2.为OA大鼠模型制定的跑步机运动方案，以及研究期间大鼠血清和滑液虹膜蛋白浓度的ELISA。（A）OA大鼠跑步机运动的不同强度基于以下方案：速度为15.9、19.2和26.8 m/min，倾角为0°、5°和10°，分别代表OAL、OAM和OAH组。CG和OAG为久坐组。从第1周到第2周的适应性喂养和训练；实验方案从第3周到第6周实施。最后一次运动后，立即处死大鼠。（B）研究期间大鼠的体重变化。平板运动（OAL、OAM和OAH）组和久坐（CG和OAG）组之间的差异显著。相反，OAL、OAM和OAH之间的差异不显著***第页< 0.001;n个=每组8只大鼠。数据表示为平均值±SEM。（C）采用CCK8法评估IL-1β在原代大鼠软骨细胞中的最佳应用浓度。IL-1β在原代大鼠软骨细胞中的最佳应用浓度为10 ng/ml（D）和滑液中虹膜素的水平（E）平板运动组（OAL、OAM和OAH）高于久坐组（CG和OAG）；这些水平在OAM中尤其高。数值表示为平均值±SEM*第页与重心相比<0.05**第页< 0.01与.CG***第页< 0.001与.重心。^#第页< 0.05与.OAG；^##第页< 0.01与.OAG；^###第页< 0.001与.OAG公司。n=8，平均值为±95%CI。

3.4不同平板运动方案下骨关节炎大鼠胫股关节的组织学评价和影像学检查

我们使用平片、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）证实了OA在大鼠模型中的发生。我们观察到，与CG组相比，OAG组和OAH组的软骨下骨表面粗糙、颤动、裂隙和侵蚀增加。我们还注意到，与OAG和OAH组相比，OAM和OAL组出现缓解(图3A). 我们使用H&E和甲苯胺蓝染色组织学观察进一步评估了我们的OA模型(图3B). 我们发现，与CG相比，OAG和OAH组出现软骨损伤和细胞减少；OAH比OAG严重。然而，我们观察到，与OAG和OAH相比，OAM显示出相对完整和光滑的软骨表面，表明OAM可以改善OA症状。基于改良Mankin和OARSI评分的组织学分析表明，与CG相比，OAG和OAH的胫股关节软骨减少且受损。然而，我们发现与OAG和OAH相比，OAL和OAM的关节软骨损伤都得到了逆转。尤其是OAM组对胫股关节的治疗效果最好(图3C). 然而，中等强度跑步机运动的治疗效果可以被虹膜中和抗体所抑制。OAM和OAM+irisin（NA）组之间的差异是显著的：宏观评分(第页<0.01），改良Mankin评分(第页<0.001），OARSI得分(第页< 0.001).

图3不同跑步机运动方案下OA大鼠胫股关节的组织学评估和影像学检查。通过平片、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）证实OA模型（A）使用苏木精伊红（H&E）和甲苯胺蓝评估组织学分析（B）染色。我们观察到，与CG相比，OAG和OAH的软骨下骨表面粗糙、颤动、裂隙和侵蚀增加。与OAG和OAH相比，OAM的关节软骨表面相对光滑完整。然而，中等强度跑步机运动的治疗效果可以被虹膜中和抗体所抑制。（C）胫股关节改良Mankin评分。胫股关节OARSI评分。数据表示为平均值±SEM*第页与重心相比<0.05**第页与重心相比<0.01***第页<0.001与重心#第页与OAG相比<0.05##第页与OAG相比<0.01###第页<0.001与OAG+第页与OAM相比<0.05++第页与OAM相比<0.01+++第页<0.001与OAM。n个=5，平均值为±95%CI。

3.5平板运动诱导的虹膜素对骨关节炎大鼠模型炎症相关蛋白表达的影响

我们的免疫组织化学染色显示，CG和OAM组II型胶原的光密度高于OAG和OAH组。我们进一步注意到，OAG和OAH组阳性染色的MMP-13、ADAMTS-5、NLRP3和caspase-1细胞的百分比高于CG组。有趣的是，这种效应在OAM中得到了恢复。我们发现，与OAG和OAH组相比，OAM组软骨细胞特异性胶原II的表达增加(图4A、B但关节软骨中MMP-13和ADAMTS-5的衰减(图4A、C、D). 我们的结果还表明，OA组膝关节软骨中虹膜蛋白的表达降低，但在所有运动组中都增加，OAM组中的表达尤其显著，虹膜蛋白上调可被虹膜蛋白中性抗体阻断(图4A、F). 如所示图4A、G、H)，OAM组显示NLRP3和caspase-1等凋亡相关标记物逆转。此外(图4A–H)结果表明，MMP-13、ADAMTS-5、NLRP3和caspase-1在OAM组和OAM+虹膜（NA）组之间存在显著差异，表明虹膜中和抗体部分阻断了治疗效果。

图4在接受不同跑步机运动方案的OA大鼠中进行免疫组织化学染色。（A、B）CG、OAM和OAL中II型胶原的表达高于OAH和OAG。（A、C）CG和OAM中MMP-13阳性细胞百分比低于OAH、OAG和OAL。（A、D）CG和OAM中ADAMTS-5阳性细胞百分比低于OAH和OAG。（A，F）OAL、OAM和OAH的虹膜阳性细胞百分比高于CG和OAG。（A、G）OAL、OAM和OAH中NLRP3阳性细胞百分比低于CG和OAG。（A、H）OAL、OAM和OAH中caspase-1阳性细胞百分比低于CG和OAG。然而，中等强度跑步机运动的治疗效果可以被虹膜中和抗体所抑制。数据表示为平均值±SEM*第页与重心相比<0.05**第页与重心相比<0.01***第页<0.001与重心。^#第页与OAG相比<0.05；^##第页与OAG相比<0.01；^###第页<0.001与OAG。⁺第页与OAM相比<0.05；⁺⁺第页与OAM相比<0.01；⁺⁺⁺第页<0.001与OAM。n个=5，平均值为±95%CI。

3.6鸢尾素对IL-1β诱导的软骨细胞炎症及炎症相关蛋白/mRNA表达的影响

为了进一步研究运动诱导的虹膜素对OA软骨细胞的抗炎作用，我们进行了western blot和qRT-PCR分析。我们首先检测了CG组、IL-1β组、IL1β+鸢尾苷（5 ng/ml）组和IL-1β+鸢尾苷（10 ng/ml(图5A、B). 我们发现，IL-1β上调了ADAMTS-5和MMP-13蛋白的表达水平，但在用虹膜素治疗后出现了逆转。我们进一步观察到，在虹膜素处理的软骨细胞中，软骨细胞特异性蛋白II胶原蛋白的表达得到恢复。如所示图5E，IL-1β处理的软骨细胞显示MMP-13 mRNA和ADAMTS-5 mRNA上调，而II型胶原mRNA下调。然而，我们也注意到，鸢尾素处理抑制了IL-1β诱导的炎症mRNA的表达。

图5软骨细胞中炎症相关标记物的表达和NF-κB p65的免疫荧光分析。（A–D）在对照组（CG）、IL-1β组、IL-1α+鸢尾苷（5 ng/ml）和IL-1β+鸢尾素（10 ng/ml。软骨细胞用不同浓度的虹膜素（0、5或10 ng/ml）预孵育，并用IL-1β（10 ng/ml）处理24 h。IL-1β治疗后ADAMTS-5和MMP-13的表达水平升高，而虹膜素治疗后表达水平降低。此外，虹膜素处理的软骨细胞可以部分恢复软骨细胞特异性II型胶原的表达。与IL-1β组相比，虹膜素治疗组PI3K、Akt和NF-κB p65的磷酸化显著受到抑制。（E）II型胶原、ADAMTS-5和MMP-13的相对mRNA表达。虹膜素以剂量依赖的方式抑制IL-1β诱导的炎症基因的表达。（F）虹膜素对NF-κB p65核转位的影响。使用抗NF-κB p65兔抗体（绿色）对软骨细胞进行免疫染色，并在共聚焦显微镜下观察。细胞核用DAPI（蓝色）染色。在IL-1β（10 ng/ml）刺激的软骨细胞中检测到NF-κB p65的显著核移位。相反，虹膜素干预可以扭转这一趋势。数据表示为平均值±SEM*第页与IL-1β相比<0.05**第页与IL-1β相比<0.01***第页<0.001 vs.IL-1β。^#第页与重心相比<0.05；^##第页与重心相比<0.01；^###第页<0.001与重心。n个=每组3，平均值为±95%CI。

3.7鸢尾素对IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路的影响

为了探讨虹膜素在OA软骨细胞中的具体机制，我们评估了IL-1β和虹膜素治疗后软骨细胞中PI3K/Akt/NF-κB信号通路的变化。特别是，我们测量了PI3K、Akt和NF-κB p65的磷酸化水平，这表明了这个级联的激活状态。如所示图5C、D与CG组相比，IL-1β组的PI3K、Akt和NF-κB磷酸化水平显著升高，而irisin处理组的PI3 K、Akt和NF-kb磷酸化水平则受到抑制。我们用免疫荧光法研究虹膜素对软骨细胞NF-κB p65核转位的影响。因此，我们观察到，与CG相比，NF-κB p65在IL-1β处理的软骨细胞的细胞核中高度定位，这表明IL-1β促进了NFκB p 65的核移位。我们进一步发现，虹膜素预处理阻断了IL-1β诱导的NF-κB p65核移位(图5F). 总的来说，虹膜素通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路来抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症。

3.8鸢尾素对IL-1β诱导的软骨细胞下垂的影响

我们使用流式细胞术评估炎症诱导的软骨细胞死亡。如所示图6A，虹膜显著(第页<0.001）软骨细胞凋亡减少。我们用透射电子显微镜（TEM）研究了虹膜素对炎症相关的细胞凋亡的影响。如所示图6BCG组细胞形态最好，无典型细胞凋亡特征。更具体地说，我们观察到细胞有一个完整的细胞膜，膜周围有大量的伪足和突起物。相反，我们注意到IL-1β组的软骨细胞表现出焦下垂的趋势，包括严重的细胞质水肿、细胞膜肿胀、细胞基质的总电子密度降低和严重的空化。然而，我们发现，虹膜素抑制了虹膜素处理的软骨细胞，尤其是虹膜素（10 ng/ml）处理组的软骨细胞的热解过程。我们进一步观察到，虹膜素抑制了NLRP3/caspase-1通路，这是细胞凋亡的关键，如图6C、D结论：鸢尾素通过抑制NLRP3/caspase-1通路改善了IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。

图6虹膜素影响IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，NLRP3/caspase-1的抑制改变细胞形态。（A）虹膜素对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的影响。（B）细胞形态变化的典型TEM图像，如细胞肿胀、细胞膜突起和细胞核萎缩（比例尺：5μm）。黑色箭头表示细胞肿胀、细胞膜突起；黑色三角形表示细胞器空洞。（C、D）热解相关蛋白表达的代表性western blots。GAPDH作为对照。数据表示为平均值±SEM*第页<0.05 vs.IL-1β**第页与IL-1β相比<0.01***第页与IL-1β相比，<0.001。^#第页与重心相比<0.05；^##第页与重心相比<0.01；^###第页<0.001与重心。n个=每组5，平均值为±95%CI。

4讨论

在这项研究中，我们报道了跑步机运动诱导的虹膜素对OA的治疗作用体内和在体外我们发现跑步机运动可以显著上调血清和膝关节滑液中虹膜素的水平。此外，运动诱导的虹膜素通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路减轻软骨细胞炎症，并改善软骨细胞的凋亡来治疗OA。

在之前的几项研究中，据报道，无氧运动和急性运动可提高血清虹膜素水平；然而，运动方案没有具体说明(Schaalan等人，2018年;Tavassoli等人，2019年). 相反，一些研究报告称，耐力和阻力训练可以降低虹膜素的循环水平(邱等，2015). 我们假设这些差异受锻炼方法、强度或持续时间的影响。然而，目前尚无可靠的运动诱导虹膜素治疗OA的模型。因此，在本研究中，我们建立了不同强度的平板运动模型，以评估虹膜素的水平及其对OA的治疗作用。因此，我们发现，运动后，尤其是中等强度运动后，虹膜素的循环水平显著升高。我们的结果不仅为运动诱导的虹膜素在大鼠模型中建立了可靠的运动方案，而且也证实了先前研究的结果，即适度的跑步机运动可以减轻大鼠模型OA软骨的损伤(Martins等人，2019年;Bjerre-Bastos等人，2021年).

有趣的是，我们的免疫组化结果发现运动增加了软骨中虹膜阳性细胞的百分比。这让我们怀疑虹膜蛋白是在软骨细胞中局部产生的，还是收缩肌肉将虹膜蛋白分泌到血液中，然后到达软骨细胞；或者，这两种机制也可以同时发生。鉴于这一发现，添加了鸢尾素中和抗体体内中等强度运动组，发现其可阻断局部虹膜蛋白表达并抑制OAM组的治疗效果。根据本研究的结果和Boström等人（2012年）可见，运动后肌肉可以分泌虹膜素并释放到血清中参与体循环；值得注意的是，据我们所知，没有研究表明软骨细胞可以表达虹膜蛋白。其次，正如先前的研究所表明的那样，软骨细胞是形成关节软骨并分泌细胞外基质主要成分的唯一细胞(Krishnan和Grodzinsky，2018年;Varela-Eirin等人，2018年). 第三，滑液有助于关节表面的独特功能特性，为软骨提供营养，构成软骨细胞的微环境，并调节软骨细胞的活动(Carlson等人，2019年). 因此，我们证实了鸢尾素的免疫组织化学染色(图4A)是由于周围滑液微环境中虹膜素的上调引起的，并得出结论，肌肉收缩导致虹膜素产生并分泌到血液中，然后到达软骨细胞通过滑液。我们的实验结果不支持软骨细胞分泌虹膜素的假设。此外，中等强度运动的治疗效果也可能被鸢尾素中和抗体部分阻断，这表明鸢尾素是OA运动治疗的媒介。

我们发现，高强度跑步机运动导致OA软骨损伤更严重，但OAH组的虹膜蛋白水平显著高于久坐组（CG和OAG）。我们之前证明，运动可以通过机械应力影响软骨，而机械应力对骨关节炎具有双重影响。适应性机械应力可以降低软骨细胞对炎症的敏感性。然而，过度的机械刺激会导致渐进性损伤，抑制基质合成，并刺激基质降解酶的产生(Adams等人，2009年;Buckwalter等人，2013年;Yang等人，2019;Yang等人，2020年). 其次，运动还可以通过改变周围的微环境，如滑液，影响关节软骨(Akhbari等人，2020年). 我们发现跑步机运动可以显著增加滑液中的虹膜素浓度，我们包括在体外确定虹膜素可以减轻软骨细胞的炎症和凋亡的实验。第三，运动对骨关节炎的影响部分取决于机械刺激和虹膜素浓度的增加。当过度机械刺激关节软骨时，高强度运动造成的损伤超过了虹膜素浓度升高的治疗效果。因此，高强度运动加剧了OA的进展。在这项研究中，我们重点关注机械刺激和提高虹膜素浓度治疗骨关节炎之间的平衡。我们测量了低强度、中等强度或高强度跑步机运动对虹膜蛋白水平的影响，以确定最大治疗效果。我们的研究结果表明，在适应性运动期间维持高水平的虹膜素循环可以在OA治疗中取得疗效。因此，我们得出结论，适应性机械刺激通过上调虹膜蛋白来预防骨关节炎。

在诱导OA的炎性细胞因子中，IL-1β起着关键作用，因为它在OA发病过程中通过诱导MMP-13和ADAMTS-5的表达，促进软骨细胞降解(Hu等人，2019年;卡普尔等人，2011年). 焦下垂是程序性炎症细胞死亡的一种形式，涉及NLRP3/caspase-1的激活，NLRP3/caspase-1被认为是细胞焦下垂的主要标志物(Liu等人，2019年;Kesavardhana等人，2020年). 我们使用CCK8试验评估IL-1β的最佳应用浓度(图2C). 由于炎症和炎症诱导的pyroptosis在OA的发病机制和发展中发挥着重要作用，深入研究OA的炎症机制将为发现和开发新的疾病改良疗法提供希望。在本研究中，使用改良Mankin评分和OARSI评分以及MMP-13、ADAMTS-5、II型胶原、，和NF-κB p65。因此，我们假设虹膜素是与运动治疗OA相关的关键因素。迫切需要研究虹膜素对软骨细胞的抗炎和抗凋亡作用，以确定其具体机制。

在本研究中，分离并培养原代大鼠软骨细胞，以评估虹膜素对OA的影响在体外在本研究中，分离并培养原代大鼠软骨细胞，以评估虹膜素对OA的影响在体外滑液由关节囊中的血清形成，并释放到关节腔内。滑膜液有助于关节表面的独特功能特性，为软骨提供营养，构成软骨细胞的微环境，并调节软骨细胞的活动(Akhbari等人，2020年). 因此，我们使用的滑液浓度接近体内通过ELISA确定的条件，以模拟我们的在体外实验。我们发现，虹膜素治疗显著降低了IL-1β诱导的炎症相关基因和蛋白的表达，如MMP-13和ADAMTS-5，并抑制NF-κB p65的核转位。虹膜素还可增强软骨细胞特异性胶原II的表达，并抑制结节样受体蛋白-3（NLRP3）/caspase-1的活性，以改善软骨细胞的热下垂。

中等强度的平板运动和适度机械刺激诱导的虹膜素被认为可以改善OA的进展。我们的在体外实验表明，鸢尾素抑制了IL-1β诱导的软骨细胞炎症，减少了pyroptosis，并阻断了培养的OA软骨细胞中PI3K/Akt/NF-κB级联的激活。综上所述，这些研究结果表明，适度的机械刺激通过虹膜素诱导的骨关节炎中PI3K/Akt/NF-κB信号通路的抑制来保护软骨细胞的凋亡。该拟议机制如所示图7。我们的结果也证实了先前研究的结果Vadala等人（2020年）他认为，虹膜素可以通过失活p38 MAPK、Akt、JNK和NFκB信号通路，降低X型胶原以及IL-1、IL-6、MMP-1、MMP-13和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达。Li等人（2021）据报道，虹膜素参与了OA的软骨生成和发病机制，而OA软骨中虹膜素表达的异常变化表明虹膜素是一个很有前景的治疗靶点。为了进一步验证我们的发现，我们制定了一项运动方案来测量运动诱导的虹膜蛋白水平，并研究虹膜蛋白在运动疗法治疗OA中的作用。基于我们生物信息学分析中运动相关基因的差异表达，我们证明虹膜素确实可以抑制PI3K/Akt/NF-κB级联的激活。我们还证实，虹膜素可以抑制炎症诱导的软骨细胞凋亡，从而改善OA。

图7通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路和软骨细胞的凋亡，虹膜素在跑步机运动期间对OA的治疗作用。在适当的跑步机运动中，虹膜分泌出来，然后释放到血液中，最终到达膝关节腔，发挥其抑制炎症和热解的作用。运动诱导的虹膜素与软骨细胞的相互作用导致炎症反应的下调和软骨基质降解的抑制，从而抑制软骨细胞的焦下垂。此外，虹膜素通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路抑制IL-1β诱导的OA软骨细胞炎症和炎症相关的凋亡。

我们的研究有几个局限性。首先，考虑到人类和大鼠膝关节生物力学的显著差异，本研究中使用的运动诱导虹膜蛋白方案不能直接外推到人类研究中。我们的下一步是修改该协议，以更好地适用于人类研究。第二，我们没有考虑其他已知参与NF-kB和炎症小体激活的信号通路，之前有报道称这些信号通路被虹膜素抑制。在随后的实验中，我们将考虑其他信号通路。第三，在本研究中，我们重点关注机械刺激和提高虹膜素浓度之间的平衡，以治疗OA。在未来的研究中，我们将直接研究体内不运动时虹膜素的作用。

5结论

总之，适度的机械刺激可以通过虹膜素预防骨关节炎，但在高强度运动中会加重骨性关节炎体内此外，运动诱导的虹膜素通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路和NLRP3/caspase-1的活性，抑制IL-1β诱导的大鼠OA软骨细胞炎症，改善软骨细胞的凋亡。总的来说，中等强度的运动可能被认为是OA的一种新的治疗剂，而鸢尾素可能是治疗效果的媒介。我们的研究结果不仅为骨关节炎的治疗提供了重要的参考，还可以用于指导运动疗法，减少运动的副作用，降低骨关节炎发病率，帮助确定骨关节炎临床治疗。

数据可用性声明

可通过以下链接访问研究中提供的数据：https://doi.org/10.6084/m9图19315841.v1.

道德声明

涉及人类参与者的研究由方案审查和批准，人工关节置换后的关节标本实验由中国医科大学盛京医院伦理委员会批准（编号：2019PS629K）。患者/参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。该动物研究由中国医科大学伦理委员会（编号：2017PS237K）审查和批准。发布本文中包含的任何潜在可识别图像或数据时，已获得个人的书面知情同意。

作者贡献

SJ：概念化、方法论、形式分析、调查、撰写初稿、可视化和验证。YY：写作评论和编辑。YS：形式分析、软件和方法。YW：写作评论和编辑。HZ：资源。YT：软件和方法论。JB：资源。LB：概念化、资金获取和监督。

基金

该研究得到了中国国家自然科学基金的支持（批准号81772420、81272050和82102613）。

利益冲突

作者YB受雇于江苏恒瑞制药有限公司。

其余作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

出版商笔记

本文中表达的所有主张仅为作者的主张，并不一定代表其附属组织或出版商、编辑和审稿人的主张。任何可能在本文中进行评估的产品，或制造商可能提出的索赔，都不受出版商的保证或认可。

致谢

我们感谢中国医科大学附属实验室同事的帮助。

补充材料

本文的补充材料可以在以下网站上找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.797855/full#补充-材料

参考文献