二甲双胍使用史和全基因组DNA甲基化谱：衰老和长寿的潜在分子机制

结果

人口统计学的

173名受试者参与了这项研究，但只有171人参与了下游数据分析。患者的平均年龄为74.4岁（标准偏差=9.8）。58名（33.9%）受试者是女性，而根据自我报告，几乎所有受试者都是白人(n个= 167; 97.7%). 108名患者为非糖尿病（non-DM），63名患者为糖尿病（DM）。在糖尿病组中，37名糖尿病患者有二甲双胍处方糖尿病（+）Met病史，26名糖尿病患者没有二甲双胍-二甲双胍的处方糖尿病（-）Met史。此外，43名（68.3%）糖尿病受试者有胰岛素使用史。查尔森共病指数（CCI）和体重指数（BMI）信息也包括在表1没有变量显示DM（−）Met和DM（+）Met之间的统计学显著差异。然而，正如预期的那样，与非糖尿病组相比，糖尿病组的CCI、BMI和胰岛素使用显著升高。

表1。患者特征。

分类	所有受试者	糖尿病		第页	统计检验	糖尿病受试者		第页	统计检验
		非糖尿病患者	DM公司			DM（−）已达到	DM（+）符合
N个	171	108	63			26	37
年龄-年	74.4	74.6	74.1	0.77	t吨= 1.98	73.8	74.3	0.833	t吨= 2.01
标准偏差	9.8	9.7	10			10.6	9.7
女性(n个)	58	36	22	0.81	χ2= 0.10	11	11	0.303	χ2= 1.06
%	33.9	33.6	34.9			42.3	29.7
种族，白人(n个)	167	105	62	0.63	χ2= 0.23	25	37	0.229	χ2= 1.45
%	97.7	97.2	98.4			96.2	100
CCI公司	3.8	3.1	4.9	7.5E-06页*	t吨= 1.98	4.8	5	0.756	t吨= 2.00
标准偏差	2.7	2.7	2.4			2.4	2.5
体重指数	29.7	28.3	32.2	0.002*	t吨= 1.98	30	33.8	0.64	t吨= 2.00
标准偏差	7.6	6.3	8.8			5	10.5
胰岛素使用史	43	0	43	第3.3页至第23页*	χ2= 98.48	15	28	0.131	χ2= 2.28
%	25.1	0	68.3			57.7	75.7
年龄、性别和种族在非糖尿病组和糖尿病组之间没有显著差异，而CCI、BMI和胰岛素使用则有显著差异。糖尿病组中二甲双胍非使用者DM（−）Met和二甲双胍者DM（+）Met之间的患者特征无统计学意义。缩写：SD：标准偏差；CCI：查尔森共病指数；BMI：体重指数。*第页< 0.05.

Met与非Met（包括所有患者，无论糖尿病状态如何）：热门、KEGG、GO

表2显示了在有和无二甲双胍使用史的患者（171名受试者）之间甲基化率差异最大的基因。没有一个位点符合全基因组统计显著性的标准(第页<5E-8）。

表2。所有患者中二甲双胍使用者和非使用者之间差异最大的20个CpG位点。

基因名称	CpG站点	染色体	未达标（%）	已达到（%）	%平均差（Δβ）	第页-价值
PSME3型	cg22769787号	chr17	15.6%	14.3%	1.3%	3.37E-07号
EPHA8型	cg27136384号	chr1号机组	83.2%	−2.7%	−2.7%	4.84E-07
	cg22163972号	chr17	92.1%	4.2%	4.2%	4.89电子-07
	cg23047680号	氯甲烷	0.8%	−0.2%	−0.2%	9.08E-07年9月
NEDD4公司	cg11341892号	chr15	4.7%	0.6%	0.6%	2.82E-06号机组
PRKCG公司	cg11293016	chr19系列	52.9%	4.0%	4.0%	4.68E-06页
SRSF11型	cg12923877号	chr1号机组	97.5%	−0.3%	−0.3%	4.94E-06号机组
第15页	cg24353272号	chr1号机组	95.3%	−0.8%	−0.8%	5.16E-06页
科威特航空1688	cg07969649号	chr8系列	91.1%	−1.6%	−1.6%	5.22E-06日
修剪27	cg02525926号	铬6	97.4%	0.8%	0.8%	2006年6月9日
	cg23067796号	chr12	93.7%	1.7%	1.7%	2006年7月29日
瑞尔2	cg04573831号	chr1号机组	96.6%	−0.6%	−0.6%	2006年11月8日
	cg15180899号	chr18	93.9%	1.7%	1.7%	8.67E-06号
	cg12222244号	氯甲烷	94.1%	2.1%	2.1%	1.27E-05
C1或125	cg20746459号	chr1号机组	90.6%	3.5%	3.5%	1.52E-05型
SERPINH1系列	cg19586851号	chr11号机组	97.2%	−0.5%	−0.5%	1.55E-05型
PPL（公私合营）	cg12991522号	chr16系列	1.8%	−0.5%	−0.5%	2005年5月15日
ACO1公司	cg13567378号	chr9公司	89%	−1.3%	−1.3%	2005年1月17日
	cg24525630	chr17	1.6%	−0.3%	−0.3%	1.72E-05
TCF7L1型	cg20116596号	chr2型	95.7%	−0.5%	−0.5%	1.76E-05

接下来，我们根据二甲双胍使用者（Met）和非使用者（非Met）甲基化水平（β值）的绝对差异大于4%，以及第页-值小于0.01。KEGG顶部信号的富集分析显示了二甲双胍可能作用的相关途径，如“寿命调节途径”、“寿命调节通路-多物种”和“AMPK信号通路”(表3). 此外，还发现了其他通路，如“mTOR信号通路”、“胰岛素分泌”、“谷氨酸能突触”和“昼夜节律夹带”(表3). GO分析还揭示了相关的通路，如“低氧诱导因子-1α信号通路的调节”、“低氧诱发因子-1α的正调节信号通路”和“典型Wnt信号通路”(表4)，尽管KEGG或GO中的路径均未达到假发现率（FDR）显著性水平（FDR<0.05）(表3和4).

表3。基于二甲双胍使用者和非使用者之间不同甲基化率的前30种KEGG途径。

通路	N个	判定元件	第页-价值	财务总监
松弛素信号通路	129	6	0.007	1
长寿调节途径	89	5	0.008	1
谷氨酸能突触	114	6	0.008	1
库欣综合征	155	6	0.018	1
甲状旁腺激素的合成、分泌和作用	106	5	0.019	1
AMPK信号通路	119	5	0.021	1
调节干细胞多能性的信号通路	142	5	0.028	1
缝隙连接	88	4	0.033	1
胰岛素分泌	86	4	0.034	1
黑色素生成	101	4	0.043	1
长寿调节途径-多物种	62	三	0.051	1
醛固酮的合成和分泌	98	4	0.055	1
化学致癌作用-DNA加合物	69	2	0.056	1
昼夜节律夹带	97	4	0.058	1
类固醇激素生物合成	61	2	0.062	1
生热作用	219	5	0.063	1
胆汁分泌	89	三	0.063	1
细胞色素P450对外源物质的代谢	76	2	0.068	1
皮质醇合成和分泌	65	三	0.069	1
甲状腺激素合成	75	三	0.071	1
Wnt信号通路	166	5	0.071	1
加压素调节的水重吸收	44	2	0.081	1
胆碱能突触	113	4	0.090	1
逆行内源性大麻素信号	141	4	0.089	1
雌激素信号通路	137	4	0.091	1
矿物质吸收	60	2	0.111	1
胃癌	149	4	0.121	1
mTOR信号通路	155	4	0.123	1
蛋白质消化吸收	102	三	0.123	1
卵巢类固醇生成	51	2	0.123	1
甲状腺激素合成	75	三	0.071	1
KEGG的相关途径[58]突出显示。缩写：N个：每条通路中包含的基因数量；DE：差异表达基因的数量，即来自CpG顶部位点的基因数量；FDR：错误发现率。

表4。基于二甲双胍使用者和非使用者之间不同甲基化率的前30种GO途径。

通路	安大略省	N个	判定元件	第页-价值	财务总监
通过质膜粘附分子实现嗜同性细胞粘附	英国石油公司	168	8	2004年7月20日	1
长期突触抑制	英国石油公司	31	4	9.77E-04号	1
运动行为	英国石油公司	198	9	0.001	1
中脑多巴胺能神经元分化	英国石油公司	17	三	0.002	1
细胞表面受体信号通路参与细胞间信号传导	英国石油公司	622	17	0.002	1
突触传递的负调控	英国石油公司	71	5	0.002	1
典型Wnt信号通路	英国石油公司	335	11	0.002	1
钙离子结合	MF公司	698	17	0.003	1
己糖介导的信号传导	英国石油公司	6	2	0.003	1
糖介导的信号通路	英国石油公司	6	2	0.003	1
葡萄糖介导的信号通路	英国石油公司	6	2	0.003	1
细胞对酸性化学物质的反应	英国石油公司	209	8	0.003	1
细胞间信号	英国石油公司	1847	345	0.003	1
离子跨膜转运蛋白活性的调节	英国石油公司	256	9	0.004	1
中胚层发育	英国石油公司	133	6	0.004	1
神经细胞体膜	科科斯群岛	27	三	0.004	1
细胞体膜	科科斯群岛	28	三	0.004	1
跨膜转运蛋白活性的调节	英国石油公司	264	9	0.005	1
低氧诱导因子-1α信号通路的调节	英国石油公司	1	1	0.005	1
低氧诱导因子-1α信号通路的正调控	英国石油公司	1	1	0.005	1
细胞对维生素K的反应	英国石油公司	1	1	0.005	1
细胞对胰高血糖素刺激的反应	英国石油公司	25	三	0.005	1
碳水化合物介导的信号	英国石油公司	8	2	0.005	1
精囊形态发生	英国石油公司	1	1	0.005	1
胰高血糖素样肽1受体活性	MF公司	1	1	0.005	1
行为	英国石油公司	593	15	0.005	1
烟酰胺磷酸核糖转移酶活性	MF公司	1	1	0.006	1
对D-半乳糖的反应	英国石油公司	1	1	0.006	1
胚胎骨骼系统发育	英国石油公司	125	6	0.006	1
运输活动的监管	英国石油公司	279	9	0.006	1
重点介绍了相关途径。缩写：Ont：本体；BP：生物过程；CC：细胞成分；MF：分子功能；N个：每条通路中包含的基因数量；DE：差异表达基因的数量，即来自CpG顶部位点的基因数量；FDR：错误发现率。

Met与非Met（仅包括2型糖尿病患者）：热门、KEGG、GO

表5显示了糖尿病组（63名受试者）中二甲双胍使用者和非使用者甲基化率差异最大的基因。与之前的分析类似，没有基因达到全基因组的统计显著性(第页<5E-8）。

表5。糖尿病组二甲双胍使用者和非使用者之间差异最大的20个CpG位点。

基因名称	CpG站点	染色体	未达标（%）	已达到（%）	平均差（Δβ）	第页-价值
	cg19873536号	铬10	78.3%	67.9%	10.4%	1.28E-06
	cg13596208号	chr9公司	1.9%	2.7%	−0.9%	2006年2月29日
HBA1型	cg01704105号	chr16系列	40.5%	33.7%	6.8%	2006年5月42日
DUOX2型	cg02550961号	第15章	1.5%	1.9%	−0.4%	2006年6月6日
近地天体1	cg12516231号	第15章	2.2%	3.2%	−0.9%	6.97E-06号
C7或46	cg06685724号	chr7系列	2.1%	2.9%	−0.8%	1.28E-05
NAT15型	cg00484396号	chr16系列	9.8%	4.9%	4.8%	1.56E-05型
	cg14685975	铬5	89.9%	92.1%	−2.2%	1.64E-05
CTSL公司	cg02104500型	chr9公司	3.6%	4.9%	−1.4%	1.66E-05
	cg12584257	chr9公司	67.6%	77.2%	−9.6%	1.69E-05
NAT15型	cg22508957号	chr16系列	10.9%	6.3%	4.6%	1.84E-05型
区域1	cg11034672号	chr14系列	11.6%	15%	−3.3%	1.86E-05型
	cg24651265号	铬10	1.1%	1.7%	−0.5%	2.12E-05日
CMBL公司	cg17467873	铬5	1.7%	2.1%	−0.4%	2.21E-05年
EBF4类	cg05857996号	铬20	77.6%	63.6%	13.9%	2.23E-05日
	cg18482666号	chr2型	95.8%	94.8%	1.0%	2.39E-05号
HRASLS5型	cg00489394号	chr11号机组	6.6%	7.1%	−0.5%	2.40至05
AKAP13公司	cg21530087号	chr15	2.2%	2.6%	−0.4%	第2.59页至第05页
	cg15864571号	氯甲烷	93.4%	95.0%	−1.6%	2.67E-05年
FLJ35024型	cg15981195	chr9公司	2.3%	3.5%	−1.1%	2.91E-05年

使用甲基化水平差异的一致参数（β>4%）和第页-值（<0.01）。然而，目前的分析包括1283个CpG。KEGG显示了许多从先前分析中发现的相同信号，包括“寿命调节通路”、“谷氨酸能突触”、“胰岛素分泌”、“昼夜节律携带”和“胆碱能突触“(表6). 与第一次分析相比，GO也显示出重叠的通路，包括“低氧诱导因子-1α信号通路”，还有新的通路，如“白细胞介导的信号通路”、“白细胞凋亡过程的负调控”、“中性粒细胞内稳态”和“神经元投射”，尽管这些通路没有达到FDR显著性水平（FDR<0.05）(表7).

表6。糖尿病组中二甲双胍使用者和非使用者之间存在差异的前30种KEGG途径。

通路	N个	判定元件	第页-价值	财务总监
醛固酮的合成和分泌	98	14	0.001	0.219
昼夜节律夹带	97	14	0.001	0.219
皮质醇合成和分泌	65	10	0.003	0.303
甲状腺激素合成	75	10	0.004	0.303
脂肪细胞脂肪分解的调节	55	8	0.006	0.330
甲状旁腺激素的合成、分泌和作用	106	13	0.006	0.330
胰岛素分泌	86	11	0.007	0.330
钙信号通路	238	21.5	0.009	0.388
cAMP信号通路	221	19	0.010	0.388
胆碱能突触	113	13	0.012	0.420
化学致癌-受体激活	212	16	0.015	0.435
谷氨酸能突触	114	13	0.016	0.435
Rap1信号通路	210	19	0.016	0.435
生热作用	219	15	0.020	0.468
苯丙胺成瘾	69	8	0.021	0.468
神经活性配体-受体相互作用	349	19.5	0.022	0.468
胰腺分泌物	101	9	0.029	0.552
长期增强	67	8	0.029	0.552
可卡因成瘾	49	6	0.036	0.552
磷脂酶D信号通路	147	14.5	0.038	0.552
cGMP-PKG信号通路	166	14.5	0.039	0.555
Apelin信号通路	139	12	0.040	0.555
尼古丁成瘾	40	5	0.040	0.555
EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性	78	9	0.041	0.555
TRP通道的炎症介质调节	98	10	0.042	0.555
缝隙连接	88	9	0.042	0.555
II型糖尿病	46	6	0.043	0.558
长寿调节途径	89	9	0.045	0.561
唾液分泌	92	8	0.048	0.578
膀胱癌	41	5	0.054	0.610
KEGG的相关途径[58]突出显示。缩写：N个：每条通路中包含的基因数量；DE：差异表达基因的数量，即来自CpG顶部位点的基因数量；FDR：错误发现率。

表7。糖尿病组中二甲双胍使用者和非使用者之间存在差异的前30种GO途径。

通路	Ont公司	N个	判定元件	第页-价值	财务总监
神经元投射	科科斯群岛	1304	97.1	1.29E-05	0.286
第二信使介导信号	英国石油公司	438	38.5	第2.53页至第05页	0.286
中性粒细胞稳态	英国石油公司	16	6	3.77E-05日	0.286
突触信号	英国石油公司	725	59.5	2005年9月26日	0.505
跨突触信号	英国石油公司	708	57.5	1.67E-04页	0.505
白细胞凋亡过程的负调控	英国石油公司	46	8	1.93E-04号机组	0.505
钙介导信号	英国石油公司	218	22.5	1.94E-04号机组	0.505
化学突触传递	英国石油公司	700	56.5	2.00E-04年	0.505
顺行跨突触信号	英国石油公司	700	56.5	2.00E-04年	0.505
细胞基质粘附的正向调节	英国石油公司	51	10	2004年3月1日	0.682
多细胞生物过程的正向调节	英国石油公司	1802	106	3.39E-04号	0.682
质膜结合细胞投影	科科斯群岛	2093	130.1	4.05E-04号机组	0.682
白细胞介素-8受体活性	MF公司	2	2	4.44E-04号机组	0.682
白细胞介素-8介导的信号通路	英国石油公司	2	2	4.44E-04号机组	0.682
成人行为	英国石油公司	144	17.5	4.73E-04号机组	0.682
细胞连接	科科斯群岛	1858	123.8	5.16E-04页	0.682
突触	科科斯群岛	1168	85.5	5.27E-04号	0.682
NMDA谷氨酸受体活性	MF公司	7	4	6.05E-04（电子版）	0.682
低氧诱导因子-1α信号通路	英国石油公司	6	三	6.39电子04	0.682
枝晶发育的调控	英国石油公司	148	19	6.44E-04号	0.682
阿克森	科科斯群岛	606	50.6	6.46E-04号	0.682
低电压门控钙通道活性	MF公司	三	三	04年7月18日	0.682
树枝状岩发育	英国石油公司	232	26.5	2014年7月28日	0.682
前庭耳蜗神经发育	英国石油公司	10	4	7.64E-04页	0.682
离子型谷氨酸受体信号通路	英国石油公司	25	7	7.69E-04页	0.682
神经元投射发育	英国石油公司	976	74	8.82E-04号	0.682
细胞对葡萄糖刺激的反应	英国石油公司	132	15	2004年9月26日	0.682
运动行为	英国石油公司	198	21.5	9月36日-04	0.682
细胞对己糖刺激的反应	英国石油公司	134	15	1.08E-03版	0.682
细胞成分生物发生的正调控	英国石油公司	533	41	1.12E-03号机组	0.682
强调了相关途径。缩写：Ont：本体；BP：生物过程；CC：细胞成分；MF：分子功能；N个：每条通路中包含的基因数量；DE：差异表达基因的数量，即来自CpG顶部位点的基因数量；FDR：错误发现率。

DNA甲基化年龄加速

在糖尿病组中，非二甲双胍使用者的平均年龄加速为−8.07，而二甲双胍者的平均年龄加快为−4.47(第页= 0.11) (图1). 无论糖尿病状态如何，所有受试者之间的差异都较小（未使用二甲双胍的受试者为-5.92，使用二甲双双胍者为-4.47；第页= 0.34) (图2). 两项分析均未达到统计显著性。

图1。 糖尿病组二甲双胍使用者和非使用者之间的年龄加速。使用Horvath表观遗传时钟作为DNAm年龄-年代学年龄计算年龄加速。二甲双胍=0：无二甲双胍症使用史，二甲双胍=1：有二甲双胍血症使用史。第页= 0.11.

图2。 二甲双胍使用者和非使用者之间的年龄加速。使用Horvath表观遗传时钟作为DNAm年龄-年代学年龄计算年龄加速。二甲双胍=0：无二甲双胍症使用史，二甲双胍=1：有二甲双胍血症使用史。第页= 0.34.

缩写

DM：糖尿病；非Met：无二甲双胍使用史的患者；Met：有二甲双胍使用史的患者；DM（−）Met：无二甲双胍使用史的糖尿病患者；糖尿病（+）Met：有二甲双胍使用史的糖尿病患者。

作者贡献

P.S.M.收集、分析数据并撰写手稿。T.Y.整理了临床数据集并编辑了手稿。K.J.C、Z.E.M.A.、M.M.、G.C.和T.T.收集临床数据和生物样本，并进行处理。N.E.W、K.J.C.、M.I.和H.R.C.对手稿进行了批判性审查。G.S.构思了该研究的想法，计划了其设计和协调，并编写和编辑了手稿。

致谢

作者感谢参与这项研究的患者。

利益冲突

Gen Shinozaki是Predelix Medical LLC的联合创始人，拥有以下未决专利：“用于预测和筛查谵妄的非侵入性设备”、PCT申请号PCT/US2016/064937和美国临时专利号62/263325；“利用新型脑电图设备预测患者预后”，美国临时专利第62/829411号；PCT申请号PCT/US19/51276和美国临时专利号62/731599中的“谵妄风险的表观遗传生物标记物”。Pedro S.Marra、Takehiko Yamanashi、Kaitlyn J.Crutchley、Nadia E.Wahba、Zoe-Ella M.Anderson、Manisha Modukuri、Gloria Chang、Tammy Tran、Masaaki Iwata和Hyunkeun Ryan Cho已声明不存在利益冲突。

道德声明和同意

该研究由爱荷华大学医院和诊所机构审查委员会批准，所有程序均符合赫尔辛基宣言。获得了所有参与者的书面知情同意。

工具书类

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