结果
基于过度表达的基因交互作用粉红色1和奥米在眼睛里
Omi/HtrA2用线粒体靶向序列和跨膜结构域编码蛋白质,然后是丝氨酸蛋白酶结构域和C末端PSD-95/DlgA/Zo-1(PDZ)结构域(Vande Walle等人,2008年).黑腹果蝇包含一个同系物Omi/HtrA2(CG8464,以下简称奥米)氨基酸序列同源性为50%,相似性为68%,结构域与人类Omi/HtrA2相似。为了检验以下假设奥米和粉红色1在同一途径中发挥作用,我们问这两个基因之间的遗传相互作用是否可以在果蝇属眼睛。苍蝇眼对于生存能力和生育能力来说是不可或缺的,并且被广泛用作研究人类神经退行性疾病的系统Bonini和Fortini(2003)和马什和汤普森(2006)]. 我们利用UAS-Gal4系统产生转基因苍蝇,以进行组织特异性过度表达(布兰德和佩里蒙,1993年). 什么时候?奥米在眼睛中高水平过度表达(25或29°C),观察到小而粗糙的眼睛(图1K(K)与…相比A类),与之前的报告类似(Igaki等人,2007年). 这些小眼睛可能是Omi在过度表达时激活细胞死亡的能力所致(Challa等人,2007年;Igaki等人,2007年;Khan等人,2008年). 由以下因素导致的眼部表型奥米过度表达对奥米表达式。表达低水平奥米(18°C)显示出野生型眼睛,为相互作用研究提供了敏化遗传背景(图1B类). 眼睛特有的粉红色1过度表达导致眼睛轻度粗糙(图1C类) (Poole等人,2008年). 然而,苍蝇过度表达这两种蛋白粉红色1和奥米在18°C时,眼睛比与粉红色1仅过度表达(图1F类). 这表明两者之间存在基于过度表达的相互作用粉红色1和奥米,这与最近的报告一致(Whitworth等人,2008年)并结合其他观察结果解释为奥米作用于下游粉红色1共同的遗传途径(Whitworth等人,2008年).
图1。
基于过度表达的基因交互作用粉红色和奥米.扫描EM和光学显微照片果蝇属眼睛被显示出来。18°C时,奥米过度表达(B类)导致野生型眼睛出现,而粉红色1(C类)导致眼睛轻微粗糙。两者过度表达奥米和粉红色1导致眼睛小而粗糙(F类). 这个粉红色-omi过表达相互作用被蛋白酶激活型Omi S266A的表达所消除(G公司). OmiS266A的表达本身不会导致任何眼部表型(D类). 与Pink1病突变体G426D类似的突变的表达没有表型(E类); 然而,它仍然显示了与奥米过度表达(H(H)). The phenotype of粉红色1过度表达不能通过丢失奥米RNAi诱导的功能-奥米,即使在29°C下升高(我,J型). 的静音奥米RNAi功能-奥米很强大,因为它完全抑制奥米过度表达诱导的眼部表型(补充图S2,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 类似地,由奥米过表达不能因缺乏粉红色1(K(K),我).A–H来自18°C饲养的苍蝇,而I–L型来自29°C下饲养的苍蝇。基因型:对照:w个; GMR-Gal4/+。奥米(Omi):w个; GMR-Gal4,无人机-奥米/+。粉红色1:w个; GMR-Gal4,无人机-粉红色1/+。粉红色1G426D:w个; GMR-Gal4/UAS-Pink1G426D。Omi+Pink1:w个; 无人机-奥米/+; GMR-Gal4,无人机-粉红色1/+。Omi+Pink1G426D:w个; GMR-Gal4,无人机-奥米/UAS-Pink1G426D。粉红色1+OmiS266A:w个; UAS-OmiS266A/+;GMR-Gal4,无人机-粉红色1/+。粉红色1+奥米功能丧失(lof):w个; GMR-Gal4,无人机-粉红色1/无人机系统RNAi-奥米。奥米+粉红色1lof(参考):w粉红色15; GMR-Gal4,无人机-奥米/+.
以下情况下观察到的交互作用的一种可能解释粉红色1和奥米共表达的是两种线粒体靶向蛋白的过度表达导致对有限数量的线粒体输入机制的竞争。在这种模型中,增加Pink1的输入可能导致胞浆中Omi过量,导致眼睛粗糙。线粒体基质靶向绿色荧光蛋白(mitoGFP)的过度表达粉红色1或奥米然而,并没有导致奥米或粉红色1过度表达表型,表明线粒体输入不受限制(补充图S1,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 这个omi/粉红色1共过度表达相互作用依赖于Omi的蛋白酶活性,因为苍蝇过度表达了Omi-S266A的蛋白酶头版本(图1D类(见下文),当与粉红色1过度表达(图1G公司).
进一步探讨以下假设:奥米作用于下游粉红色1,我们发现粉红色1过度表达诱导的眼部表型不能通过丢失奥米功能(图1我,J型). 类似地,由奥米过表达不能因缺乏粉红色1(图1K(K),我). 因此,这些结果不支持奥米下游功能粉红色1。接下来,我们探讨了眼睛中观察到的这些相互作用与粉红色调节线粒体形态。我们培育了表达Pink1G426D的转基因果蝇果蝇属类似于PINK1 PD相关突变G309D的突变。G309D改变激酶结构域中的一个残基(瓦伦特等人,2004年)并显著降低PINK1激酶活性在体外自动磷酸化(Beilina等人,2005年).粉红色1携带G426D的空突变苍蝇表现出很大程度上丧失了挽救雄性不育的能力(可育性<2%,n个=60),肌肉变性和线粒体形态缺陷粉红色1空突变体(图2)表明该突变蛋白与正常蛋白相比严重受损粉红色1功能。然而,令人惊讶的是,当Pink1G426D的表达与奥米过度表达(图1H(H)). 这些结果表明粉红色1调解所需的功能奥米眼睛中基于过度表达的相互作用与粉红色1提供正常线粒体功能所需的功能。一起,尽管奥米和粉红色1在基于过度表达的分析中显示了遗传相互作用,但这些结果并不能为支持以下模型提供证据:奥米在传播中起着重要作用粉红色1-调节线粒体功能的依赖信号。
图2。
Pink1G426D的mRNA表达和表型分析,该突变类似于PD-相关突变PINK1G309D。A类、使用全长苍蝇的Northern印迹粉红色1作为探针。与野生型相比,粉红色1空突变体(粉红色15)苍蝇没有显示全长mRNA。转基因苍蝇表达粉红色1G426D突变体显示类似或更高的粉红色1与表达野生型的苍蝇相比粉红色1。箭头指向粉红色1表达式,以及第49页(*)用作RNA负载控制。B–J类,示意图(B类)洋葱期精子细胞线粒体的相控显微照片(C–F类)和“叶片阶段”(G–J型). 与野生型相比,粉红色1在洋葱期,突变体在nebenkern中表现出液泡化(红色箭头)(D类)叶片期野生型中的线粒体衍生物(黄色箭头)有一种,而不是两种(H(H)). 携带野生型基因的基因组拯救转基因粉红色1(CaSpeR-粉红色1)彻底挽救因缺乏粉红色1(100%可育,n个> 120) (Clark等人,2006年)洋葱期和叶片期的精子细胞表型(F类,J型). 相反,粉红色1G426D(CaSpeR-粉红色1G426D)未能挽救粉红色1男性(生育率<2%,n个=60)或精子细胞表型(E类,我). 红色箭头表示nebenkern的液泡化,黄色箭头表示每个线粒体衍生物。K–N间接飞行肌线粒体用丝裂原原纤维蛋白标记。与对照组相比(K(K)),粉红色1突变体表现出丝裂原纤维蛋白信号整体水平降低和大量强纤维蛋白信号(我)可以通过Pink1WT的过度表达完全挽救(N个),但不是Pink1G426D(M(M)).
奥米空突变体是雄性不育的,但表现出不同于粉红色1或停车场空突变体
为了进一步探讨奥米因为它与粉红色1,我们对奥米突变体。的内生功能奥米在里面果蝇属由于缺乏功能丧失突变体,尚未进行充分研究。该分析与奥米因为它与PD有关,因为奥米在帕金森病患者中观察到的是功能丧失或显性阴性突变,并没有导致活动增加。为了获得功能丧失突变奥米,我们使用了TILLING(Till等人,2003年)一种检测化学诱变后感兴趣基因中甲基磺酸乙酯(EMS)诱导的点突变的方法。我们在奥米,奥米国家统计局和一个错义突变V110E(见下文)。截短的蛋白质由奥米非标准操作系统预计缺乏蛋白酶域和PDZ域的活性位点(图3A类),因此代表一个空等位基因。纯合的苍蝇奥米国家统计局是半致命的。然而,苍蝇携带奥米国家统计局转化为该地区的缺陷,英国国防部(3R)ED5644,完全可行,表明致命性与奥米国家统计局是由背景突变引起的。普遍表达RNAi的苍蝇-奥米使用tubulin-Gal4驱动器也是可行的。RNAi的沉默效应-奥米被其完全抑制的能力所证实奥米过度表达诱导的眼睛表型(补充图S2,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 正如预期的那样,使用抗Omi抗体进行的Western blotting显示,在奥米国家统计局/英国国防部(3R)ED5644苍蝇(补充图S3,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料).
图3。
奥米空突变体显示精子发生缺陷,但睾丸线粒体形态正常。A类,Omi域示意图。MTS,线粒体靶向序列。TM,跨膜结构域。IBM,IAP-binding motif。的确切位置奥米国家统计局和奥米V110E型分别用蓝色和红色星号表示。B类,Omi/HtrA2在高度保守区域的不同物种中的序列比对,其中保守缬氨酸在奥米V110E型,标记为红色。C–E类,C′–E′,睾丸的相控显微照片。与控制飞行相比(C类,C′),其中精囊(箭头)充满精子(暗相),奥米突变体(D类,D′)显示一个空的精囊(括号内有星号),可以通过奥米过度表达(E类,E′)(箭头指向精囊)。C′–E′精囊的高分辨率视图来自C–E类.F–H(飞行高度),一个合胞体囊肿内投资锥的Phalloidin染色。与投资锥排列良好的控制相反,这表明同步运动(F类),奥米突变体在一些囊肿中显示出分散的投资锥,表明个体化存在轻微缺陷(G公司),可以通过奥米过度表达(H(H)).输入-输出“洋葱期”精子细胞线粒体的示意图和相控显微照片(I–L型)和“叶片阶段”(我,M–O型). 与野生型相比(J型,M(M)),奥米突变体在这两个阶段都没有任何缺陷(K(K),N个),而粉红色1在洋葱期,突变体在nebenkern中表现出液泡化(红色箭头)(我)叶片期野生型中的线粒体衍生物(黄色箭头)有一种,而不是两种(O(运行)).P–S公司,个体化后囊肿部分的示意图和透射电镜图像。每个精子细胞在单个质膜内都包含一个轴丝(橙色箭头)和线粒体衍生物(红色箭头)。这个奥米突变囊肿(R(右))显示精子细胞的紊乱和偶尔的个体化缺陷(数据未显示)。然而,与粉红色1突变体,表现出线粒体的大小和形态严重受损(S公司),奥米突变囊肿显示正常线粒体(R(右)). 基因型:野生型:w个/是;控制:w个/是;奥米国家统计局/+;奥米突变体:w个/是;奥米国家统计局/英国国防部(3R)ED5644;奥米突变体+救援:w个/是;TMR公司-奥米/+;奥米国家统计局/英国国防部(3R)ED5644.比例尺:C–E类500微米;问-答500纳米。
奥米国家统计局/英国国防部(3R)ED5644苍蝇,以下简称奥米突变体没有表现出任何明显的外部缺陷。奥米突变体雌性可以生育(96%,n个=50),但奥米突变雄性不育(100%,n个= 110). 在这些雄性中,储存成熟精子的精囊是空的(图3D类,D′),没有观察到活动精子,这表明精子的产生或向精囊的转运存在缺陷。确保这些表型归因于缺乏奥米,我们产生了多个表达奥米特别是在雄性生殖系(TMR-奥米). 的过度表达奥米使用抗Omi抗体(补充图S3,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 这些品系中有许多是雄性不育系。然而,10个品系中有3个是可育的。这些可育系表现出较弱的奥米而不是不育系(补充图S3,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 这表明不育是由高水平的过度表达引起的,可能导致Omi蛋白酶的混杂活性。引进任何肥沃的奥米过度表达线进入奥米突变背景导致精囊中存在活动精子(图3E类,E′)和恢复生育能力(95%,n个= 100). 基因组拯救转基因的单个拷贝包含奥米,但不是周围的基因,也完全挽救了雄性不育的奥米突变体(100%,n个= 50). 这些结果表明奥米对精子发生至关重要。
我们还分析了第二个奥米EMS等位基因。V110对应于人类Omi/HtrA2中的V154,它位于一个高度保守的区域(图3A类,B类)结构研究预测Omi/HtrA2的同质化,激活其蛋白酶活性所需(Li等人,2002年).奥米V110E型/英国国防部(3R)ED5644和奥米V110E型/奥米国家统计局突变果蝇也具有雄性不育性(0%,n个= 45; 0%,n个=65),显示精囊空,没有活动精子,表明奥米V110版本很可能是一个空的或强的低形态等位基因。这些结果提供了体内支持三聚基序对Omi功能的重要作用,并表明Omi的蛋白酶活性对其调节精子发生的作用至关重要。
因为粉红色1突变体也表现出雄性不育,我们询问是否奥米突变睾丸显示线粒体形态缺陷,这是粉红色1突变体(Clark等人,2006年;邓等人,2008). 期间果蝇属精子发生,线粒体发生显著形态学变化(富勒,1993年). 干细胞分化后,有丝分裂和减数分裂伴随不完全胞质分裂,形成64个精子细胞的合胞囊。早期精子细胞经历线粒体聚集和融合,产生两个巨大的线粒体,形成一个球形结构,称为nebenkern(富勒,1993年). 在相控显微镜下,这种“洋葱期”精子细胞可以被鉴定为具有两个相邻的球形结构:细胞核和内本核(图3我,J型). 在随后的精子细胞伸长过程中,内本核开始展开,在这个“叶片”阶段产生两个线粒体(图3我,M(M)). 在伸长后,精子细胞经历一个称为个体化的过程,在这个过程中,连接一个囊肿内64个精子细胞的细胞质桥被打破,多余的细胞质被挤出(富勒,1993年). 这种个性化的过程需要以肌动蛋白为基础的结构(称为投资锥)的同步运动。个体化后,每个精子细胞的尾部主要由轴丝、运动所需的微管结构和线粒体衍生物组成(图3P(P),问).
正如预期的具有线粒体靶向序列的蛋白质一样,Omi定位于nebenkens(参见图6A–C). 在洋葱期精子细胞中粉红色1突变体表现出明显的空泡化(图3我),以及在随后的叶片阶段粉红色1和停车场突变体只含有一种线粒体衍生物(图3O(运行))而不是野生型的(图3M(M)) (Clark等人,2006年;Riparbelli和Callaini,2007年;邓等人,2008). 令人惊讶的是奥米突变体与野生型突变体没有区别。在洋葱期,内本核边缘光滑,没有观察到液泡化(图3K(K)). 在叶片期,奥米突变精子细胞含有两种线粒体衍生物,而不是在粉红色1或停车场突变体(图3N个).粉红色1和停车场如透射电镜所示,突变体在个体化后阶段的线粒体形态也显示出明显缺陷(图3S公司) (Greene等人,2003年;Clark等人,2006年;Riparbelli和Callaini,2007年;邓等人,2008). 相比之下,线粒体在匹配的阶段表现正常奥米突变体,尽管单个精子细胞在囊肿内有点紊乱(图3R(右)). 此外,投资在奥米突变体分散(图3G公司与…相比F类),表明这些结构的运动是异步的。这种表型与个体化缺陷有关(Huh等人,2004年). 虽然个体化缺陷被特异性试验抑制奥米过度表达(图3H(H)),我们不能排除精子发生的其他个体化后步骤中的缺陷也可能导致与奥米突变体。这种可能性似乎特别可能,因为在奥米突变体似乎相对温和。总之,奥米睾丸中的突变表型与粉红色1或停车场突变体,其中观察到线粒体形态缺陷。
与粉红色1突变体,奥米突变体没有显示多巴胺能神经元丢失、肌肉变性或线粒体完整性缺陷
接下来,我们问是否奥米突变体的表型与粉红色1其他组织和环境中的突变体。奥米突变体对多种应激诱导剂敏感,包括百草枯(一种自由基诱导剂);鱼藤酮,它损害线粒体呼吸链中的复合物I活性(Przedborski和Ischiropoulos,2005年); 蛋白质折叠抑制剂;和高浓度盐(补充图S4,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 因此不是对氧化应激特别敏感,奥米突变果蝇通常对压力敏感。这些结果可能表明奥米突变体,特别是因为奥米突变体的寿命缩短(补充图S5,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料).
据报道,多巴胺能神经元的数量随着年龄的增长而减少粉红色1或停车场突变体(Meulener等人,2005年;Park等人,2006年;Yang等人,2006年) (图4A类,B类,D类,E类). 相反,奥米突变体在40天龄的苍蝇大脑中没有表现出任何多巴胺能神经元损失(图4C类,F类).粉红色1或停车场突变体还表现出显著的间接飞行肌退化,线粒体形态严重受损,嵴断裂,这在1至2岁的果蝇中尤为明显(图4我,J型与…相比G公司,H(H)) (Greene等人,2003年;Pesah等人,2004年;Clark等人,2006年;Park等人,2006年;Yang等人,2006年). 相反,尽管Omi在肌肉中表达并定位于线粒体(数据未显示),奥米突变体没有表现出任何肌肉退化,即使它们老化了30天(图4K(K)). EM分析奥米突变体肌肉也没有表现出线粒体完整性的任何缺陷(图4我). 总之,我们的数据表明奥米突变体,与粉红色1突变体在包括精子细胞和肌肉在内的多个组织中不显示线粒体形态缺陷。奥米突变体也不能显示多巴胺能神经元的丢失粉红色1突变体。
图4。
奥米空突变体没有显示多巴胺能神经元丢失、肌肉变性或线粒体形态缺陷。A–C,40d龄野生型全脑的抗酪氨酸羟化酶免疫染色(A类),粉红色1突变体(B类)、和奥米突变体(C类)苍蝇。对每个基因型的17到27只个体苍蝇(两个半球)进行了计数。D类,示意图描绘了成年人大脑中主要多巴胺能神经元簇的位置,如缩写所示(Nässel and Elekes,1992年). 主要多巴胺能神经元簇位于大脑后表面附近,但位于前表面附近的原大脑前外侧(PAL)除外(标记为灰色)。PPL,前脑后外侧;前脑后内侧;VUM,腹侧不成对内侧。E类,F类,每簇多巴胺能神经元的量化粉红色1突变苍蝇和野生型苍蝇(E类)、和奥米突变苍蝇和野生型苍蝇(F类)在25°C下老化40 d。错误栏代表SD和Studentt吨测试用于统计分析*第页< 0.05; **第页< 0.01.G–L间接飞行肌纤维甲苯胺蓝染色(G公司,我,K(K))和这些肌肉的EM研究(H(H),J型,我). 线粒体的边界用白色虚线标记。与…对比粉红色1突变体(我,J型),奥米突变体没有显示肌肉退化或线粒体形态缺陷(K(K),我),即使年龄达到30天。基因型:野生型:w个/年。奥米突变体:w个/是;奥米国家统计局/英国国防部(3R)ED5644。粉红色1突变体:w粉红色15/年。比例尺:H(H),J型,我,1微米。
功能丧失研究未能检测到粉红色1和奥米
为了进一步探讨以下假设:奥米和粉红色1为了共同调节线粒体的完整性,我们在这些基因功能丧失的基础上寻找遗传相互作用。之间的遗传相互作用粉红色1和停车场为测试奥米和粉红色1以共同的方式行动(Clark等人,2006年;Park等人,2006年). 我们以及其他人之前已经表明粉红色果蝇1和停车场以共同的遗传途径行事粉红色1上游功能停车场(Clark等人,2006年;Park等人,2006年;Yang等人,2006年). 这一结论是基于几项观察结果得出的。功能丧失突变粉红色1和停车场导致线粒体完整性的高度相似(如果不完全相同)缺陷(Clark等人,2006年;Park等人,2006年;Yang等人,2006年;邓等人,2008;Poole等人,2008年). 尽管过度表达停车场救援粉红色1空突变表型,过度表达粉红色1未能救援停车场零突变表型(Clark等人,2006年;Park等人,2006年). 此外,双突变体消除了两者粉红色1和停车场表现出与单个突变体相同的表型(Clark等人,2006年;Park等人,2006年).
与…对比粉红色1(图5C类,H(H))或停车场过度表达(Clark等人,2006年),特定于测试奥米过度表达并不能挽救雄性不育或线粒体表型粉红色1突变体(0%可育,n个= 65) (图5D类,我). 类似于S306A、S276C、G399S或S400A(见下文)的Omi突变型的表达也没有挽救雄性不育粉红色1突变体(0%可育,n个> 30). 类似地,奥米过度表达导致肌肉完整性的大量丧失,也未能挽救肌肉退化表型粉红色1突变体。此外,蛋白酶死亡型Omi S266A的表达不会导致肌肉完整性的丧失,也未能挽救肌肉表型粉红色1突变体(数据未显示)。与假设一致粉红色1和奥米功能独立,奥密克戎的表达水平和线粒体定位在粉红色1突变体(图6D–F型).
图5。
之间缺乏遗传交互作用粉红色1和奥米线粒体形态的功能丧失研究。A–J,“洋葱期”精子细胞线粒体的相控显微照片(A–E)和“叶片阶段”(F–J型).粉红色1空突变体显示nebenkens的空泡化(B类)和一个线粒体衍生物(G公司). 这种表型可以被粉红色1过度表达(过度反应)(C类,H(H)),但不是由奥米过度表达(D类,我). 双突变体同时去除粉红色1和奥米函数结果粉红色1无任何增强的突变体样表型(E类,J型). 红色箭头表示nebenkern的液泡化,黄色箭头表示每个线粒体衍生物。K–N(K–N)间接飞行肌线粒体用丝裂原原纤维蛋白标记。与对照组相比(K(K)),粉红色1突变体表现出丝裂原纤维蛋白信号的整体水平降低,以及大量强烈的纤维蛋白信号(我),完全可以通过粉红色1过度表达(M(M)). 双突变体粉红色1和奥米显示粉红色1突变体样表型(N个). 基因型:A类,F类,w个.B类,G公司,w粉红色15/年。C类,H(H),w粉红色15/是;TMR公司-粉红色1/+.D类,我,w粉红色15/是;TMR公司-奥米/+.E类,J型,w粉红色15/是;奥米国家统计局/英国国防部(3R)ED5644.K(K),FM6公司/是;Mef2-Gal4,UAS-mitoGFP/+。我,w粉红色15/是;Mef2-Gal4,UAS-mitoGFP/+。M(M),w粉红色15/是;Mef2-Gal4、UAS-mitoGFP/UAS-粉红色1.N个,w粉红色15/是;Mef2-Gal4,UAS-mitoGFP/UAS-RNAi-奥米.
图6。
Omi定位于线粒体,其表达在粉红色1空突变体;Pink1表达在奥米也有突变体。A–F、野生型卵泡期精子细胞的双重标记(A–C)和粉红色1突变体(D–F型)使用Prosα6T-GFP(绿色)标记细胞核,使用抗Omi抗体(红色)标记nebenkern。在粉红色1零突变体,Omi仍然定位于精子细胞的nebenknes。G公司,使用基因组拯救转基因对内源性Pink1-9Myc表达进行Western blotting(WB)。损失奥米功能不会改变Pink1的解理模式。
调查是否粉红色1的下游功能奥米,我们进行了反向救援实验。然而,粉红色1过度表达未能挽救雄性不育奥米突变体(0%可育,n个=70)。此外,Pink1的蛋白质水平和卵裂模式在奥米突变体(图6). 因此,我们没有找到任何积极的证据表明奥米的上游或下游功能粉红色1在共同的道路上。
为了检验以下假设奥米可能与粉红色1以部分冗余的方式,我们生成了两个突变体,将两者都删除粉红色1和奥米。这些双突变果蝇是活的,存活率与粉红色1仅突变体。这些动物是雄性不育动物,在精子细胞和肌肉中表现出线粒体形态缺陷,与粉红色1仅突变体,表明奥米功能未增强粉红色1突变表型(图5E类,J型,N个; 与…相比B类,G公司,我). 总之,我们失去了功能体内研究没有为以下假设提供支持:奥米的上游或下游功能粉红色1,或与粉红色1至少在线粒体完整性的调节方面。
奥密克戎的PD相关突变,以及一个废除推定的Pink1依赖性磷酸化位点的突变,显示出与损害奥密克戎蛋白酶功能的突变不同的表型
因为我们没有检测到它们之间任何基于功能丧失的遗传相互作用粉红色1和奥米,我们决定检查与PD疾病相关的功能奥米突变。据报道,Omi/HtrA2、A141S中的PD相关多态性(在>1%的正常人群中检测到)和突变G399S作为显性阴性突变发挥作用,导致Omi/HtrA2蛋白酶功能降低(施特劳斯等人,2005年). G399位于PDZ域,在果蝇属而位于Omi/HtrA2的IAP结合域中的A141则不是。有趣的是,G399旁边的残基S400被鉴定为p38的PINK1依赖性假定磷酸化位点(Plun-Favreau等人,2007年). 据报道,这种磷酸化对Omi/HtrA2活性很重要,因为S400A是一种磷酸化活性突变,显著降低蛋白酶活性(Plun-Favreau等人,2007年). 研究这些突变是否影响Omi/HtrA2功能体内,我们产生了表达Omi G363S或S364A的转基因果蝇,其类似于人类Omi/HtrA2中的G399S或S400A。
据报道,G399S和S400A都会影响Omi蛋白酶的活性在体外(施特劳斯等人,2005年;Plun-Favreau等人,2007年). 如果这是真的体内G399S或S400A突变型Omi有望显示与蛋白酶受损的Omi突变体相似的表型。为了验证这个假设,我们还生成了两个蛋白酶比较版本的果蝇属Omi、S266A和S236C。S266A类似于人类Omi/HtrA2中的S306A,它改变蛋白酶域中的活性位点丝氨酸并消除蛋白酶活性(Li等人,2002年)和S236C类似于S276C突变二氧化锰小鼠,显著降低Omi/HtrA2的蛋白酶功能(Jones等人,2003年) (表1). 使用UAS-GAL4系统在多个体细胞组织中表达和分析这些突变体(布兰德和佩里蒙,1993年)和在雄性生殖系中使用TMR启动子(Huh等人,2004年;Clark等人,2006年). 将G363S和S364A的作用与野生型Omi(Omi-WT)以及蛋白酶缺乏的S266A和S236C突变形式进行了比较。
表1。
本研究和其他研究报告的各种Omi突变体的表型效应总结
Omi WT的过表达导致了大多数转基因株系的雄性不育,与此相反,所有表达S266A或S236C的转基因株系都是雄性可育的(n个>每种突变体测试了13个转基因株系)。S266A的表达也未能挽救雄性不育(0%可育,n个>60)和因缺乏奥米(图7B类,表1). 这些数据表明,蛋白酶受损突变导致Omi功能丧失。S266A或S236C的眼部特异性过度表达与Omi WT的过度表达相反,进一步支持了这一假设,导致了野生型眼睛的出现(图7E–G公司,表1). 同样,与Omi WT相比,肌肉特异性S266A或S236C过度表达不会影响肌肉完整性(表1,数据未显示)。使用抗Omi抗体确认S266A和S236C的表达(图7D类). 这些结果,再加上前面描述的错义突变,奥米V110E型,在负责蛋白酶活性激活的区域,表明Omi蛋白酶活性对其功能很重要体内.
图7。
Omi突变体的功能分析。A类,描述4个突变(*)相对于奥密克戎结构域的位置的示意图。B类,C类相控显微照片。Omi WT过度表达(图3E类,E′),G363S的表达(C类),但不是S266A(B类),恢复精囊中活动精子的产生奥米突变体。箭头插入C类表示精子的存在(暗相),而括号和星号在B类指出精子的缺失。D类OmiS236C和OmiS266A的表达水平与Omi WT相当,如抗Omi抗体检测到的。显示了使用抗Omi抗体过度表达OmiWT、OmiS236C或OmiS266A的苍蝇头部裂解物的蛋白质印迹。使用眼睛特异性驱动因子(GMR-Gal4)实现过表达,并在18°C下饲养苍蝇,以避免细胞死亡,影响蛋白质的恢复。非特异性带(*)用作蛋白质负荷控制。E–J公司,扫描电镜照片果蝇属眼睛。与在25°C下导致眼睛小而粗糙的Omi WT过表达相比(H(H))Omi G363S或S364A的过度表达导致类似的粗糙眼表型(我,J型),而Omi S236C或S266A的过度表达导致野生型眼睛出现(F类,G公司). GMR-Gal4用作眼睛专用驱动器。比例尺:B类,C类500微米。
相比之下,OmiG363S或S364A的测试特异性表达导致显著的雄性不育,每个构建体测试的10-13个品系中只有3-4个品系产生可育雄性,与Omi WT过度表达类似。这些可育品系可能代表那些表达水平较低的品系。使用这些可育系,我们发现G363S的表达挽救了因奥米功能丧失,表达Omi WT的人也一样(图7C类,表1). 这些结果表明,类似于G399S和S400A的突变保留了大量Omi活性。G363S或S364A的眼部特异性过度表达进一步支持了这一假设,导致了与Omi WT过度表达后的眼睛相似的小而粗糙的眼睛(图7H–J,表1). 同样,G363S或S364A或Omi WT的肌肉特异性过度表达导致肌肉完整性的大量丧失(表1,数据未显示)。这些观察结果(总结于表1)表明类似于G399S和S400A的Omi突变蛋白的行为类似于Omi WT,但与蛋白酶活性受损的蛋白不同体内.
讨论
这个体内的功能奥米
Omi/HtrA2已对其在细胞凋亡中的作用进行了广泛研究(有关综述,请参阅Vande Walle等人,2008年). 然而,尽管过表达Omi/HtrA2强烈诱导哺乳动物细胞凋亡,小鼠缺乏Omi/HtrA2没有显示凋亡减少,而是显示纹状体非多巴胺能神经元丢失(Martins等人,2004年).Omi/HtrA2该功能也与调节抗应激能力有关(Vande Walle等人,2008年). 因此,确定Omi/HtrA2对于理解其在健康和疾病中的作用至关重要。使用果蝇属作为一个模型,我们剖析了体内Omi的功能。我们发现了奥米对精子发生、抗应激和维持正常寿命至关重要。此外,Omi的蛋白酶活性对其功能至关重要。
我们已经确定了奥米在精子发生过程中。然而,尽管Omi定位于睾丸和肌肉的线粒体,但在奥米这些组织中的任何一个都没有突变。Omi可能负责线粒体功能的某些方面,例如伴侣活性或呼吸链功能的调节,这些并不影响线粒体形态,因此在我们的分析中未检测到。也有可能奥米只有在某些情况下才需要,例如在暴露于氧化应激期间,线粒体缺陷可能在奥米这些条件下的突变体。或者,Omi可能在细胞溶质中发挥作用,而不是在线粒体中,线粒体起着调节Omi释放到细胞溶质的作用。需要进一步研究来区分这些可能性。
Omi和Pink1的相互作用
观察到的遗传相互作用粉红色1和停车场作为检验以下假设的重要参考奥米和粉红色1以共同的方式行动。与…对比粉红色1突变体,显示肌肉和睾丸线粒体完整性存在显著缺陷,多巴胺能神经元数量减少,奥米突变体显示肌肉和睾丸的线粒体形态正常,多巴胺能神经元数量正常。此外,与停车场过度表达,奥米过度表达无法挽救粉红色1突变表型。的过度表达粉红色1也未能挽救因奥米功能丧失。缺乏粉红色1不影响Omi的水平或亚细胞定位,Pink1水平和处理在奥米突变体。此外,双突变体消除了两者粉红色1和奥米表现出与粉红色1只有突变体,这表明粉红色1没有负面调节奥米还有那个奥米不执行部分冗余功能粉红色1。这些数据加在一起不会提供任何体内支持以下假设的证据奥米在同一途径的上游或下游的功能粉红色1或以平行方式调节线粒体形态。这些基于功能损失的分析与PD相比更为相关奥米基于过度表达的分析,因为报告Omi/HtrA2与PD相关的突变被认为是功能丧失或显性负突变(施特劳斯等人,2005年).
之间的遗传相互作用粉红色1和奥米已被我们(见结果)和其他人观察到(Whitworth等人,2008年)在基于眼睛的过度表达研究中:粉红色1具有奥米结果小眼表型与任一蛋白的表达无关。虽然是孤立的,但这些结果可以用一个模型来解释,其中奥米和粉红色1共同途径中的功能(Whitworth等人,2008年),这个模型很难与我们丢失的函数数据相协调。细胞基础粉红色1过度表达诱导的眼部表型及其与正常内源性作用的关系粉红色1在调节线粒体功能方面,尚不清楚。虽然无突变体粉红色1和停车场在几乎所有测试的分析中,表现出高度相似(如果不完全相同)的表型粉红色1导致粗糙的眼睛表型,而过度表达停车场不(未显示数据)(Poole等人,2008年;Whitworth等人,2008年). 此外,一种引起帕金森病的激酶缺陷突变形式粉红色1,但未能救援粉红色1多组织中的空突变表型,仍与奥米在基于眼睛的过度表达检测中,表明Pink1激酶活性是线粒体功能所必需的,但不是与奥米在本试验中。根据我们的发现,我们可以得出以下结论:粉红色1调节其与奥米不同于粉红色1和停车场调节线粒体形态。这种线粒体完整性独立的作用粉红色可能很重要,但尚未确定体内。或者,也可以粉红色-omi眼睛中观察到的相互作用在生理上并不相关。过度表达研究,以及在体外研究可以确定被迫发生但通常不会发生的交互作用。例如,当蛋白质过度表达时,可能会作用于不适当的靶点或作用于不合适的亚细胞隔室,从而产生细胞毒性。结合使用,这种毒性可能会增强。基于过度表达的观察结果进一步表明了这种可能性,这些观察结果将菱体7作为Pink1的上游正调控因子(Whitworth等人,2008年). 这一结论很难与更多基于生理功能丧失的观察结果相一致,这些观察结果表明菱形果蝇7促进线粒体融合的功能(McQuiban等人,2006年),而两者都是粉红色1和停车场促进线粒体分裂的功能(邓等人,2008;Poole等人,2008年;Yang等人,2008). 无论如何,我们的功能丧失研究表明奥米在调节线粒体完整性方面不起重要作用粉红色/派金通路。他们留下了相互作用的可能性粉红色1和奥米是调节性的,或在其他情况下很重要。然而,这些体内上下文仍有待确定。
对的影响Omi/HtrA2作为PD基因
Omi/HtrA2最近被指定为停车场13根据一份在散发性PD患者中发现G399S突变的报告(施特劳斯等人,2005年). 哺乳动物细胞培养研究表明,G399S导致Omi/HtrA2蛋白酶活性显著降低,为疾病关联提供了可能的功能基础(施特劳斯等人,2005年). 与之前相比在体外观察(施特劳斯等人,2005年;Plun-Favreau等人,2007年),我们发现G399S和S400A都保留了重要的Omi函数(如果不是完整的)体内从而得出结论,以前认为与疾病相关的突变至少在某些情况下具有功能性体内重要的是,我们的结论与最近的两份报告一致,这两份报告显示Omi G399S在正常对照组和PD患者中的频率相似(Ross等人,2008年;西蒙·桑切斯和辛格尔顿,2008年),
我们不能排除人类Omi/HtrA2具有多巴胺能神经元特异性功能,这种功能在某些情况下被揭示出来,我们也不能排除这种可能性奥米果蝇行为与人类不同Omi/HtrA2然而,苍蝇和人类Omi/HtrA2之间关键结构域结构的广泛同源性和保守性表明,在果蝇属Omi与人体Omi/HtrA2的功能有关。连同以下观察结果奥米突变表型不同于那些与失去粉红色1和停车场功能,以及粉红色1和奥米在基于功能丧失的分析中未能相互作用,我们支持以下假设Omi/HtrA2在PD发病机制中不起重要作用。