结果
成人端脑的心室区包含三种细胞状态
为了鉴定成年斑马鱼端脑神经原域中的静止祖细胞,我们使用放射状胶质细胞标记物(例如:gfap:GFP转基因系(Bernardos和Raymond,2006年;Bernardos等人,2007年)和S100β,增殖标记物,如PCNA和MCM5,在晚期G1相位到G2但不在G中0(Gonzalez等人,2005年)以及神经发生的标志物,如成神经细胞特异性表位PSA-NCAM或神经原基因ascl1a公司(图1). 我们发现了三种不同的细胞类型,它们共同构成了几乎所有的心室区细胞:(1)非分裂的放射状胶质细胞,表达绿色食品添加剂:GFP、S100β和BLBP(未显示BLBP)(März等人,2010年)但不是PCNA(状态I细胞)(图1a–d,绿色箭头);(2) 分裂表达绿色食品添加剂:GFP和S100β以及PCNA(状态II细胞)(图1a–d,黄色箭头);(3)在缺乏放射状胶质细胞标记物的情况下表达PCNA的细胞(图1a–d,红色箭头),但带有PSA-NCAM和ascl1a公司(状态III单元格)(图1e–g,红色箭头在克),很可能对应于在成为神经元的过程中的定向祖细胞(分裂的神经母细胞),也可能对应于少突胶质细胞。
图1。 端脑神经发生区包含三种细胞状态。左下方插图所示的前后位端脑横截面小时.a–d,中的单个光学部分gfap:GFP转基因脑切片,免疫染色GFP(绿色)、S100β(红色)和PCNA(蓝色),描绘了两个大脑半球中线处心室表面的特写视图。gfap:GFP和S100β在所有放射状胶质细胞中共存(黄色c(c)). 可见三种细胞状态:大多数放射状胶质细胞为非循环细胞(PCNA阴性;绿色箭头,I状态细胞)。一些放射状胶质细胞PCNA阳性(黄色箭头,状态II细胞)。一些细胞只表达PCNA,不表达放射状胶质标记物(红色箭头,状态III细胞)。e–g,状态III细胞表达成神经细胞标记物。e(电子),(f),的表达式ascl1a公司由透露就地杂交(黑色信号),显示与PCNA共定位(红色)。克,PSA-NCAM抗体染色(绿色)标记许多状态III细胞,如红色箭头所示,显示其迁移神经母细胞的身份。小时,概述绿色荧光蛋白:绿色荧光蛋白共焦叠加投影端脑切片,GFP(绿色)和PCNA(蓝色)染色。箭头所示为端脑室,位于表面和中线。方框区域描述了中所示的区域a–g白线描绘了大脑皮层-丘脑下边缘区域,其中大多数III状态细胞位于该区域。白点表示混合状态I、II和III的苍白脑室区域。后一个区域被量化为我并在接下来的实验中进一步检查。我,在四个大脑的2845个VZ细胞中计算出状态I、II和III细胞的相对比例。比例尺:(英寸d日)a–d,10微米;(英寸克)e–g,10微米;小时,100μm。
这些细胞类型的相对分布沿着心室区的背心轴变化,与先前报道心室增殖结构域空间组织的研究一致(Adolf等人,2006年). 在大脑皮层-丘脑下缘,大多数状态III细胞存在,并聚集在向嗅球延伸的活跃增殖条纹中(图1小时,白色条)。更靠背,在大脑皮层(图1小时,白点),这三种细胞状态以分散的方式混合在一起,与大多数状态I细胞混合。我们进一步检查了大脑皮层区域,并量化了四个大脑状态I、II和III的细胞比例。状态I细胞占心室区细胞总数的86±5%,状态II细胞占8±5%,而状态III细胞占6±2%(图1我). 成年斑马鱼端脑的大多数放射状胶质细胞,包括状态I细胞,表达祖细胞标记Nestin(Lam等人,2009年)但尚未明确非分裂胶质细胞的确切状态。特别是,尚不清楚该种群是否已不可逆转地退出细胞周期或处于静止状态,G0阶段,因此可能包括成年斑马鱼大脑的潜在神经干细胞。为了解决这个问题,我们测试了这些细胞在刺激过程中是否能被带回细胞周期。
Notch受体和Notch活性报告基因在未分裂的放射状胶质细胞中沿心室区表达
我们研究了状态I细胞中活跃的信号机制,以及可以控制其循环状态的信号机制。Notch受体和配体在成人神经原性结构域中表达。明确地,缺口1a,缺口1b,槽口2,以及缺口3以及maml1号机组编码Notch辅激活子Maml1(Mastermind)的,在包含上述三种细胞状态的第一行细胞中沿端脑心室区表达(补充图1,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料)。缺口3表达得最强烈缺口VZ中的基因(图2一)并显示与细胞周期标记PCNA和MCM5互补的表达域,不包括MCM5表达细胞(图2b条,c(c))【PCNA和MCM5在几乎相同的一组细胞中表达,MCM5表达的细胞数量稍高,因为其在晚G期表达较早1相位(Gonzalez等人,2005年)](未显示数据)。
图2。 的表达式缺口3Notch报告基因转基因系突显I状态细胞,而增殖祖细胞表达增量A.a–c,原位缺口3a端脑中线的杂交(红色信号)和MCM5(绿色增殖标记)显示互补表达:MCM5高表达区域表达低水平的缺口3(白色箭头in一)、和高放大倍数(b条,c(c))揭示了在单细胞水平上的互补表达。d日,作为共焦叠加投影的横截面TP1bglob:gfp转基因端脑,突显沿VZ的RBPJ靶点/典型Notch信号(绿色)的激活(VZ由白色虚线下划线)。e(电子),GFP阳性细胞与S100β(蓝色)共定位。只有少数(6%)弱GFP阳性细胞(箭头)与S100β/PCNA双阳性细胞(红色PCNA)共定位。(f),克,分析前6小时用BrdU脉冲标记的细胞进行分割(橙色,(f))或通过PCNA(红色,克)表示Notch-ligand DeltaA(蓝色箭头),如下所示就地杂交((f),蓝色信号)和增量A:gfp转基因系(克,绿色;95%的PCNA阳性细胞为GFP阳性)。绿色箭头克还描述了δA:PCNA阴性的GFP细胞(64%的GFP阳性细胞为PCNA阴性)。小时,δA的表达:GFP(绿色)与S100β阳性放射状胶质细胞(红色)的比较。绿色箭头指向单个GFP阳性细胞,红色箭头指向仅表达S100β的细胞。大多数标记细胞为双阳性细胞,在第一个面板中显示为黄色(黄色箭头,75%的deltaA:GFP细胞为S100β阳性)。比例尺:一,d日,100微米;c(c),e(电子),小时,10微米;(f),克,50微米。
为了明确哪种心室细胞状态显示活跃的Notch信号,我们分析了一个表达GFP的转基因系,该转基因系受连接的Su(H)/RBPJk结合位点的控制(TP1球:gfp转基因系)(图2d日,e(电子)). 所有GFP阳性细胞沿成人端脑室共同表达S100β,表明它们是放射状胶质细胞(图2e(电子)),符合缺口基因。然而,该品系的GFP仅在S100β阳性细胞中表达16.5%,这可能是因为转基因整合的位点,以及Notch活性对一个亚群的可能限制缺口-表达细胞。然而,该系允许分析GFP阳性细胞的循环活动与GFP表达强度的关系。我们发现大多数GFP阳性细胞为PCNA阴性,而小部分(GFP的6%;PCNA双标记细胞)的特征是GFP水平低或PCNA水平低(图2e(电子)箭头指向弱GFP阳性的PCNA-阳性细胞),表明这两个标记物的共表达不是一个稳定状态。配体编码基因增量A,增量B,增量D,三角形4,锯齿形1a,锯齿状1b,以及锯齿状2(未显示数据)也在端脑VZ中表达(补充图1e–j,网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料),我们更仔细地分析了哪种类型的心室区细胞表达Notch配体。与…对比缺口3,增量A可以在分裂细胞中发现就地杂交(图2(f))和在中增量A:gfp转基因系(图2克,小时)具体来说,deltaA:GFP阳性人群分布在64%的PCNA阴性细胞(状态I细胞)和36%的PCNA-阳性细胞中。几乎所有(95%)在VZ分裂的细胞都表达了δA:GFP。总之,我们发现Notch受体和DeltaA的不同表达模式取决于VZ细胞的分裂状态:Notch在非分裂细胞中主要活跃,而几乎所有分裂细胞都表达DeltaA。
状态I细胞是通过Notch信号维持静止状态的祖细胞
上述观察到的表达模式表明Notch信号在I状态细胞的静止中可能起作用。为了验证这个假设,我们首先用药理学方法阻断了Notch的活性体内通过将小分子DAPT应用于游泳水中,DAPT是γ-分泌酶复合物的抑制剂,可阻止NICD的生成,从而产生Notch信号(Geling等人,2002年). 为了验证这种治疗能成功阻断Notch信号传导,我们分析了GFP在TP1bglob:gfpNotch报告线在治疗前后,利用嗅觉上皮,在活鱼体内可见的一种结构进行简单的体视显微镜观察。GFP在分散的细胞中表达,并且在处理30小时后已经显示出表达的快速降低,表明转基因通过DAPT处理成功沉默(补充图2,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料)。然后我们分析了DAPT治疗后端脑PCNA的表达。值得注意的是,阻断Notch导致PCNA阳性细胞数量的大量增加(图3一,b条),表示心室人口中从14.2%到57.5%的相对变化(参见图3e(电子),州II+III),增长了四倍。
图3。 抑制Notch活动会触发状态I到II的切换。车辆处理过的鱼(一,c(c),(f),克)和用40μ米DAPT公司(b条,d日,小时,我)进行了比较。一,b条,作为单个共焦平面的端脑横截面概述gfap:GFP对鱼进行PCNA染色(红色),显示经DAPT处理的鱼沿着心室区的PCNA阳性细胞密度增加。c(c),d日,背端脑室区gfap:GFP,控制(c(c)),或DAPT处理(d日)fish,显示GFAP阳性细胞群中状态II细胞(PCNA,红色;GFP,绿色)增加。e(电子),计算状态I、II和III细胞的相对比例n个=4个控制脑(2845个细胞)和n个=3个DAPT处理的大脑(3199个细胞)。对于状态I和状态II细胞,控制和DAPT之间的差异非常显著(t吨测试**对< 0.001). 每个心室表面的GFAP阳性细胞密度没有变化。误差条显示SEM(n个=4和3)。f–i型,DAPT处理(小时,我)和车辆处理((f),克)对大脑进行Ink4b(绿色)免疫染色。Ink4b存在于非循环细胞(箭头所示)中,但不存在于PCNA阳性细胞中。在DAPT治疗期间,Ink4b表达消失。比例尺:一,50微米;c(c),(f),10微米。
为了支持这一结果,我们还打算使用遗传方法阻断Notch信号通路。我们开发了活电穿孔和脂肪感染技术(补充图3,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料),允许用DNA构建物转染VZ细胞(图4一,b条). 使用两个报告基因,我们首先验证了这些基因在同一个细胞中有效地共转染(补充图3c(c),网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料),允许在随后的实验中使用GFP构建物作为转染细胞的示踪剂。接下来,将三个破坏Notch通路的显性阴性结构体电穿孔或脂质感染到VZ中,并在24–48小时后分析转染细胞的循环活性(图4c–f). 具体来说,我们选择了配体Delta的显性负结构(三角洲斯图),的转录因子抑制因子[dn-Su(H)]和协同激活大师(dn-maml1号机组)它们都以细胞自主的方式阻断Notch信号。三角洲斯图编码Delta的胞外结构域并使其表达细胞对Notch不敏感(Haddon等人,1998年),而两者都是dn-Su(H)和dn-最大值作用于NICD复合物并阻断其转录活性(Wettstein等人,1997年;翁等人,2003年). 我们观察到GFP阳性细胞中PCNA阳性细胞的比例显著增加(分别是3.6倍和2.6倍)dn-Su(H)或三角洲斯图转染的PCNA阳性细胞中dn-maml1号机组与转染细胞相比GFP公司独自一人(图4克). 因此,使用显性负性结构对Notch通路的基因干扰导致VZ细胞更多地进入细胞周期,这与DAPT治疗的反应非常相似。
图4。 体内通过脂质感染和电穿孔转染Notch通路的主要负性结构诱导PCNA阳性细胞增加。成年鱼端脑的心室区被脂肪感染或电穿孔pCS2型表达eGFP的载体(a–c)或者与pCS2–eGFP与一起pCS2–dn-Su(H(H)) (d日),pCS2–三角洲(e(电子)),或pCS2–dn-maml1((f)).一和b条描述形态和S100β表达(b条)转染的放射状胶质细胞,可作为单个细胞进行评估。转基因细胞c–f在电穿孔后第2天评估PCNA(红色)的表达;绿色箭头指向单个GFP阳性细胞,黄色箭头指向GFP和PCNA双阳性细胞。同时表达PCNA的GFP阳性细胞的百分比绘制于克用于不同的构造。注意,所有三种具有Notch阻断活性的显性负性蛋白都会增加细胞周期进入。在dn-Su的情况下(H(H))和Delta斯图,这一增长达到显著水平(对=**0.0004和*0.02,分别为费希尔精确试验)。n个是每个构建体5-10个大脑的细胞总数。比例尺,10μm。
Notch信号抑制后循环细胞比例的增加可能归因于先前PCNA阳性细胞的循环速度加快或静止细胞的激活。为了区分这些可能性,我们计算了对照组和经DAPT处理的动物中未分裂的放射状胶质细胞的百分比(图3c–e). 在DAPT治疗期间,未分裂的放射状胶质细胞比例显著降低,从85.8%降至42.5%(图3e(电子),状态I单元格)。这种变化主要发生在放射状胶质细胞群体中,因为分裂胶质细胞的比例以相同的相对数量增加(图3e(电子),状态II细胞),而放射状胶质细胞总数保持不变(数据未显示)。因此,阻止Notch活动会导致从状态I切换到状态II。我们得出结论,大部分状态I细胞通过Notch信号保持静止。为了支持这些结果,我们分析了细胞周期抑制剂Ink4b(Cdkn2b,p15ink)的表达,它是p16ink的密切同源物,可抑制CDK4和CDK6(Cánepa等人,2007年). 我们发现,如在其他系统中所观察到的那样,它在非循环的放射状胶质细胞中表达,具有细胞质定位(雷尼斯·多蒂尔和马萨古埃,1997年) (图3(f),克,箭头)。DAPT治疗后几乎检测不到Ink4a蛋白(图3小时,我)与放射状胶质细胞进入细胞周期相一致。
Notch活性调节分裂祖细胞旁的静止
虽然在DAPT治疗期间,有很大一部分状态I细胞转化为状态II细胞,但这种转换在已经含有循环细胞的区域最为明显(图5a–e). 这一发现使我们推测,Notch可能通过与分裂和/或分化的祖细胞(状态II和状态III细胞)接触而保持静止(状态I)。三组数据支持这一假设。首先,如上所述,几乎所有(95%)PCNA阳性细胞表达Notch配体Delta(图2(f),克). 其次,在Notch转基因报告中,在GFP阳性细胞附近反复发现PCNA阳性细胞TP1球:gfp(补充图4,网址:网址:www.jneurosci.org作为补充材料)。最后,我们推断,如果PCNA阳性细胞通过激活Notch信号使相邻细胞保持静止,那么DAPT再激活的细胞应该更经常地与最近标记的BrdU阳性细胞相邻。为了解决这个问题,我们分析了对照鱼和DAPT处理鱼中BrdU标记细胞附近细胞的PCNA表达(图5f–l型). 注射BrdU后第3天在车内处理的鱼中(图5f–h),分裂细胞之间的间距为几个细胞直径,大多数新分裂的细胞(PCNA阳性,BrdU阴性)与BrdU标记的细胞没有接触。相反,当给予DAPT时(图5i–k),许多新分裂的细胞(白色箭头)靠近BrdU标记的细胞(绿色箭头)。为了量化这些观察结果,我们根据BrdU标记细胞的新分裂邻居(PCNA阳性,BrdU阴性)将其分为三组:无分裂邻居,一个分裂邻居,以及两个或多个分裂邻居(图5我). 我们发现DAPT处理诱导BrdU标记的细胞在没有分裂邻居的情况下的比例大幅下降(70%至19%;n个=DAPT为2个大脑,载具为2个脑),BrdU标记的细胞与两个或更多分裂邻居的比例相应大幅增加(1.3至40.2%)。然而,DAPT治疗后PCNA阳性细胞数量的总体增加使得BrdU阳性细胞更有可能将分裂细胞作为邻居。为了排除这一点作为我们结果的唯一解释,我们分析了3周前掺入BrdU的心室区细胞的邻居。尽管在DAPT治疗后,这种没有PCNA阳性邻居的BrdU标记细胞的比例也降低了(68 vs 45%),而那些有两个或多个邻居的比例增加了(13 vs 8%),但这两种变化都不显著(图5米). 这些结果表明,成人大脑中祖细胞保持静止的一种机制涉及隔壁邻居激活的Notch信号。其他未知的信号机制可能负责维持位于更远位置的剩余非循环放射状胶质细胞(见讨论)。
图5。 Notch保持活跃祖细胞附近细胞的静止。经DAPT处理(b条,d日,i–k)或车辆处理(一,c(c),f–h)对鱼类进行了比较。e(电子),端脑横截面概述。黑色矩形表示放大的区域a–d.一,b条,心室内侧区,正常情况下包含分裂祖细胞(PCNA,红色)(一)DAPT后PCNA阳性细胞密度较高(b条).c(c),d日,端脑背侧区(如方框所示e(电子); 内侧是顶部,外侧是底部),在正常条件下含有少量PCNA阳性细胞(c(c))DAPT后PCNA阳性细胞略有增加(d日). 在Notch-blocking条件下,内侧区PCNA阳性细胞比例达到较高水平。f–k,背侧体区PCNA-阳性细胞密度与一.BrdU在3 h内给药2次,1 d后用载体处理鱼(f–h)或DAPT水(i–k)对BrdU阳性细胞附近的细胞进行PCNA表达分析。对照组大脑中很少有BrdU标记的细胞与新分裂的PCNA阳性细胞接触(白色箭头,(f),克),许多BrdU阳性细胞(其中一些仍为PCNA阳性;黄色)没有PCNA阳性(红色)邻居(绿色箭头,(f),小时). DAPT后大多数BrdU标记的细胞被PCNA阳性细胞包围(如箭头所示i–k)这表明Notch可以阻止已经分裂细胞的邻居进入细胞周期。BrdU阳性细胞的数量没有改变,这表明DAPT处理没有改变细胞周期速度。我,米BrdU标记的细胞,在每种情况下在两个大脑中计数,根据其邻居分为三组:无分裂邻居、一个分裂邻居和多个分裂邻居。表示了属于每个类别的单元格的比例,误差条表示SEM,其中n个是大脑的数量。每个类别的蓝色条代表车辆处理的动物,黄色条代表DAPT处理的动物。我在DAPT处理的动物中,BrdU-阳性的3-d标记细胞比例减少,而没有分裂邻居的细胞比例增加(重复测量的单向方差分析;2个对照脑的6个切片和2个DAPT脑的4个切片**对0个邻居<0.01**对=0.02(对于两个或多个邻居)。米在最后一次注射DAPT或DMSO后3周,用BrdU注射Fish 5 d并进行治疗。来自这些BrdU阳性、3周标记的细胞的邻居在DAPT处理后与对照处理相比没有显示出显著差异。观察到的非显著变化可能是由于沿着VZ的分裂细胞普遍增多。比例尺:英寸一对于a–d,英寸(f)对于f–k,100μm。
Notch活性足以在放射状胶质细胞群中重新恢复静止状态
为了证实内源性Notch活性对维持放射状胶质细胞内的静息状态是必要的这一结论,我们评估了组成性Notch激活在成人心室区的作用。具体来说,我们询问II状态细胞中的异位Notch激活是否足以将这些细胞推向I状态。因此,我们使用双转基因系在心室区过度表达Notch的胞内结构域热休克蛋白:gal4【热休克启动子驱动半乳糖苷酶-4(Gal4)的表达】×uas:nicd–myc(Notch胞内结构域的表达–由Gal4与上游激活序列(UAS)启动子结合驱动的Myc)](Scheer等人,2001年). 鱼在38°C下的HS促进了成年脑中NICD-Myc的镶嵌表达(图6b条,(f),我,秒). 表达仅限于感兴趣的区域,沿着大脑的心室区域。没有HS的鱼显示没有Myc染色或Myc染色非常弱(图6一,对)表明转基因表达没有泄漏。
图6。 NICD表达诱导从状态II转换到状态I。双转基因鱼类携带hsp70:加仑4和uas:nicd–myc在38°C条件下将其置于HS中2.5小时。端脑横截面上的Myc抗体染色显示NICD-Myc融合蛋白的表达,如绿色所示(a–n)或红色(p–u型).一,b条无HS转基因鱼的抗-Myc染色(一)和HS(b条)表明该转基因在HS之前没有或只有弱表达。c(c),在HS结束后5、24和48小时杀死鱼类。在三个独立的实验中计算分裂细胞(表达MCM5)的百分比。随着NICD表达时间的延长,分裂细胞比例显著降低(n个=3个大脑,每个大脑在各自的时间点总共有444、1884和1540个计数的细胞**对=0.012,单向方差分析)。d日在两个独立的实验中,在HS前3小时给予BrdU,以追踪NICD–Myc-expressing(蓝色条)和刚分裂的相邻野生型(灰色条)细胞。计算MCM5阳性细胞的比例。对照组的BrdU标记细胞在2天内基本上保持MCM5阳性,但NICD-表达的BrdU-标记细胞迅速退出细胞周期(每个时间点2个大脑中的5–11个脑段;第二个和第三个时间点成对出现显著下降t吨重复测量试验**对< 0.01). 三个时间点之间存在显著差异(重复测量双向方差分析中的交互项,对< 0.01).e–j,HS前3 h给予BrdU。HS后2天,NICD-Myc阳性人群(绿色)中表达S100β(红色)的BrdU-阳性细胞(蓝色)的比例我,高于邻近对照人群。绿色箭头f–i型图中所示为S100β阳性的Myc+BrdU+细胞,而蓝色箭头所示的Myc-negative BrdU+cell为S100?阳性。j个,量化(n个=4个切片,178个Myc+S100β+细胞,407个Myc(−)S100β-细胞**对<0.01,成对t吨测试)。k–o(k–o)HS后第1天,与NICD-Myc阴性人群相比,NICD-Mic+(绿色)中S100β+(红色)、PCNA+(蓝色)细胞(状态II细胞)在总S100β+人群中的比例显著降低(n个=2个大脑,共有572个Myc+和1701个Myc-阴性细胞,在11个切片中计数**对<0.01,成对t吨重复测量测试)。比例尺:b条,50微米;我,米,10微米。误差条代表SEMn个=大脑数量(c(c),d日,o个)或节数(j个).p–u型NICD的表达可以挽救DAPT的作用。转基因动物接受2小时HS(s–u)或无HS(对-对)然后是5小时的暂停和2天的DAPT治疗。然后评估Myc阴性的放射状胶质细胞(表达S100β,蓝色)或Myc阳性的放射状神经胶质细胞(抗Myc免疫细胞化学,红色)的分裂状态(PCNA表达,绿色)。注意,所有Myc阳性神经胶质均为PCNA阴性(n个=从三个大脑的8个切片中计数出113个Myc阳性细胞;一些示例用绿色条表示)。因此,与非热休克的Myc阴性胶质细胞相比,它们在DAPT处理后不能诱导细胞周期(对-对)或热休克(s–u)动物。
我们使用标记物PCNA或MCM5分析了NICD-Myc阳性细胞分裂的比例,作为HS后时间或HS持续时间的函数。我们一直观察到周期中维持的细胞比例下降。使用MCM5,这一比例从30%逐渐显著下降到9%(图6c(c)). 为了评估NICD表达期间活跃循环的细胞是否可以进入静止状态,我们统计了HS前3小时加入BrdU的细胞以及HS后几个时间点保持MCM5阳性的细胞。作为内部对照,在每个时间点将这些值与相邻NICD-Myc阴性人群中MCM5阳性、BrdU阳性细胞的比例进行比较。尽管BrdU掺入后8 h、1 d和2 d周期中仍有大量野生型细胞,但表达NICD的细胞退出细胞周期的速度要快得多(图6d日). 因此,表达NICD足以诱导非循环状态。
接下来,为了评估Notch激活期间退出细胞周期的细胞的命运,我们计算了HS后2天NICD-BrdU双阳性细胞中有多少表达S100β(图6e–i). 这一比例(97%)远高于邻近野生型细胞(65%)(图6我)在2–3天后获得早期神经元特性[~50%的Hu表达(Adolf等人,2006年)]。与此结论一致,HS后1d,只有1%的NICD-Myc阳性、S100β阳性细胞表达PCNA,而对照细胞只有10%表达PCNA(图6j–n). 因此,过度表达Notch诱导增殖祖细胞退出细胞周期并获得S100β阳性的I状态身份。我们的观察进一步支持了这些结果的特异性,即NICD的表达足以在DAPT的存在下恢复放射状胶质细胞的静止,正如预期的那样,作用于DAPT作用下游的Notch成分。为了解决这一点,在HS诱导的NICD表达后,进行为期2天的DAPT治疗,并评估NICD–Myc阳性放射状胶质细胞的分裂状态。尽管绝大多数Myc阴性、S100β阳性细胞在非热休克或热休克鱼类中都表达PCNA(图6p–u型),在热休克鱼类中,没有一个Myc阳性细胞是PCNA阳性(图6s–u).
为了测试NICD-诱导的细胞周期退出是否确实可逆(静止状态),或者NICD-表达细胞是否获得了有丝分裂后S100β阳性状态,我们分析了HS后2周内增加时间点的一系列大脑(补充图5,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料)。状态II细胞的定量显示HS后第3天至第1周和第1周至第2周显著增加,与Myc–NICD-阳性细胞数量的稳步下降一致(占心室区总细胞的24%至10%;数据未显示)。因此,在HS诱导的外源性Notch信号峰值后,S100β阳性细胞能够重新进入细胞周期,表明它们没有获得有丝分裂后的命运。总之,这些结果表明,当Notch被激活时,分裂的放射状胶质细胞可逆地进入静止状态。
内源性Notch活性控制状态I和状态II之间的平衡
Notch活动的实验操作表明,状态I和状态II是可塑的且相互关联。然而,细胞是否会在这些状态之间内生地来回切换,如果是这样,这是否与Notch有关?为了解决这个问题,我们分析了几周前处于周期中的细胞的命运。因此,在gfap:GFP转基因背景,随后是几周的追逐期。我们预计留在VZ的BrdU标记细胞来自循环状态II细胞,因为状态III细胞的后代很可能已经分化并进入薄壁组织。然后我们分析了留在生发区的BrdU阳性标记细胞。这个gfap:GFP转基因系显示心室BrdU阳性细胞为GFP阳性但PCNA阴性(图7a–e),表示状态II到状态I的过渡。同样,在TP1bglob:gfpNotch报告细胞系,60天后,心室中一些(8.5%)BrdU阳性PCNA阴性细胞呈GFP阳性(图7f–j). 总之,这些结果表明,状态II细胞可以内源性地恢复到状态I,并且这些细胞的至少一个亚群显示Notch信号反应。
图7。 根据Notch活性,状态II细胞内源性地转移到状态I并返回状态II。a–e,a的横截面gfap:GFP转基因鱼(蓝色GFP)经BrdU处理5天,最后一次注射后40天死亡。一些BrdU标记的细胞(绿色)仍留在心室区域,但PCNA(红色)呈阴性,如箭头所示,表明它们在分裂后进入状态I。f–j,TP1bglob:gfp转基因鱼用BrdU处理5天,2.5个月后死亡。(f)几个共焦平面的投影,端脑中线的概述:许多BrdU+细胞(蓝色)已从含有PCNA+细胞(红色)的心室区退出,并已进入实质(蓝色箭头)。g–j,显示装箱区域的单个光学部分(f)留在心室区域的一些BrdU+、PCNA阴性细胞是GFP+(白色箭头),表明它们已经进入状态I并且处于高Notch信号传导下。k–o(k–o)WT鱼注射BrdU 5 d,3周后用DAPT或对照水处理2 d。对大脑进行BrdU(绿色)和PCNA(红色)染色。o个在两个对照组和两个DAPT处理的大脑中,计算心室BrdU+群中BrdU~+、PCNA~+细胞的比例。经过DAPT处理后,这一比例比对照组增加了5倍,表明Notch信号使染色细胞保持静止。误差条代表SEM,n个=2,共有217个对照细胞和235个DAPT处理的BrdU+细胞,对<0.01,Rao-Scott检验(修正χ2集群数据测试)。比例尺(e(电子),j个,n个),10微米。
接下来,我们确定从状态II自然衍生的状态I细胞是否处于静止状态(而不是分化状态),以及是否通过Notch活性保持静止状态。重复BrdU标记结束后3周应用DAPT,并计算BrdU人群中PCNA/BrdU双阳性细胞的百分比(图7c–g). 在DAPT治疗期间,与对照组相比,双标记群体确实增加了(DAPT治疗组为16±5.4%,对照组为3.1±1.2%,即增加了5.3倍),其比例与在整个放射状胶质细胞群体上观察到的比例相同(图3e(电子),黄色条)。因此,至少一些从状态II恢复过来的状态I细胞需要内源性Notch活性保持静止。我们注意到,并非所有心室BrdU阳性细胞在DAPT治疗后均为PCNA阳性,这再次表明一些其他机制可解释其静止状态。尽管如此,我们的结果表明,作为内源性Notch活性的函数,祖细胞在分裂和静止之间振荡。
阻断成人大脑中的Notch诱导新生神经元的产生增加
Notch活性降低导致的状态I祖细胞向循环状态II祖细胞的转变促使我们询问这些状态II祖基因是否能够通过细胞周期,然后向成神经细胞的方向退出。因此,我们分析了原神经基因的表达ascl1a公司(图8一,b条,(f),克)和成神经细胞标记物PSA-NCAM(图8c–j). 与对照组相比,DAPT治疗后表达这些标记的细胞增多。出乎意料的是,DAPT治疗后,在许多PCNA阳性细胞中检测到PSA-NCAM的表达,这些细胞也表达S100β,这表明从II状态细胞加速过渡到III状态细胞(图8e(电子),j个). 因此,抑制Notch信号导致分化成神经细胞数量增加。
图8。 Notch阻断可诱导神经母细胞数量增加。仅用载具处理的野生动物端脑横截面(a–e)或使用DAPT(f–j).一,b条,(f),克,现场与ascl1a公司反义探针(蓝色一和(f)和黑色b条和克). DAPT治疗可诱导更多分裂细胞发生神经。c–e类,h–j小时、PSA-NCAM(绿色)、PCNA(红色)和S100β(蓝色),合并于e(电子)和j个.DAPT治疗诱导PCNA+、PSA-NCAM+细胞(状态III细胞,白色箭头)和PSA-NCAM阳性细胞(可能为分化神经元,绿色箭头)数量增加。S100β、PCNA、PSA-NCAM三标记细胞在DAPT条件下也增加(箭头),表明从状态II加速转换到状态III。k个在注射BrdU后4天内追踪2条对照鱼和2条DAPT处理鱼的分裂细胞。对照组和治疗组大脑中BrdU+、Hu+细胞的比例相似,表明DAPT激活I状态细胞后,神经元正常成熟,因此生成的神经元净数量增加。比例尺:克,50微米;j个,10微米。
为了追踪这些细胞的后期命运,我们在第2天DAPT治疗的第一天给药BrdU脉冲。治疗后进行为期3天的追踪(图8k个). 在DAPT治疗组和对照组动物中,4d后同样比例的BrdU标记细胞表达Hu(早期神经元有丝分裂后标记物)(图8我),导致新生成神经元的净增加,表明重新激活的细胞按照与正常祖细胞相同的时间表成熟为神经元。因此,通过抑制Notch激活静止的胶质细胞足以触发整个神经原级联反应。总之,我们的数据揭示了内源性Notch活性在控制放射状胶质细胞分裂频率,从而控制成年大脑中成神经细胞生成和神经元生成方面的关键作用。因此,Notch似乎是神经干细胞维持和向神经发生招募之间过渡的重要看门人。
讨论
在本研究中,我们以斑马鱼端脑为模型系统,揭示了一种控制成年神经干细胞募集频率的机制。我们已经描述了祖细胞的三种状态:静止的放射状神经胶质细胞(状态I)、分裂的放射状神经胶质细胞(状态II)和致力于分化的循环神经母细胞(状态III)。我们已经证明,Notch途径在状态I祖细胞中具有内源性活性,并且该途径的激活导致从状态II到状态I的转换,而阻断内源性Notch活性则导致从状态I到状态II的转换。此外,我们已经证明,Notch通路在循环细胞附近被激活,这表明驱动静止的一种机制是来自活跃祖细胞的反馈控制。最后,通过阻断Notch通路而重新激活的放射状胶质细胞向成神经细胞和有丝分裂后神经元状态发展,表明Notch活性通过维持静止祖细胞和增殖祖细胞之间的平衡来调节成年期的神经元生成。
发现静止的祖先及其诺奇控制招募
几项研究报告称,鱼脑成人心室区存在PCNA阳性的放射状胶质细胞(Adolf等人,2006年;Pellegrini等人,2007年;Lam等人,2009年;März等人,2010年). 然而,到目前为止,还没有研究它们的非分裂邻居在神经发生过程中的意义。这里提出的实验强烈表明,端脑成人生发区的放射状胶质细胞在分裂(PCNA或MCM5阳性,状态II)和静止(PCNA和MCM5阴性,状态I)状态之间来回切换,因此与谱系相关。由于胶质标记物的表达及其循环状态,I型和II型细胞令人想起最近描述的静止和活化的星形胶质细胞,这些星形胶质细胞是从成年小鼠端脑室管膜下区按顺序生成的(Pastrana等人,2009年). 我们的结果进一步证明了这些状态之间存在振荡。事实上,我们显示,分裂数周后,在一个时间点用BrdU标记的状态II细胞可以在状态I(GFAP-阳性,PCNA-阴性)的VZ中发现(图7a–e). 这种进入静止状态也可以由NICD的表达触发(图6c–o(抄送)). 反过来,当Notch活性下调时,状态I细胞(包括标签保持细胞)可以重新进入周期(图6p–u型,7j–o(j–o)). 因此,我们认为,沿成年VZ,放射状胶质细胞群由等量的慢分裂祖细胞组成,在G0阶段(状态I,大多数时间)和循环阶段(状态II,很少)。我们的观察还强烈表明,循环神经母细胞(状态III)是由状态II祖细胞生成的。事实上,很少有细胞出现三重标记gfap:GFPPCNA和PSA-NCAM阳性提示分裂的放射状胶质细胞和成神经细胞之间存在直接谱系。成人生发区的这种清晰的细胞组织使我们能够进一步解决相邻神经干细胞之间的静止和细胞周期进入是如何协调的,这是一个以前没有考虑过的问题。
招聘与沉默之间的平衡机制
我们的结果之和不仅表明了状态I和状态II之间的来回切换,这意味着Notch活动的水平不同,而且还表明相邻NSC之间对这些状态的相互控制。首先,状态II细胞以规则的方式散布在整个VZ中,状态I细胞位于两者之间(图1)表明祖细胞的协同活动。我们的结果进一步表明,与分裂细胞相邻的状态I细胞对Notch抑制特别敏感,因为它们被重新激活的频率高于随机挑选的状态I电池(图5我,米). 我们还观察到几乎所有PCNA阳性细胞都表达DeltaA(图2);因此,它们能够触发Notch信号传导到邻近细胞,因此,Notch报告细胞系中的GFP通常突出PCNA阳性细胞附近的状态I静止祖细胞(补充图4,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料)。因此,我们提出,Notch激活的一种机制是通过源自状态II和/或状态III细胞的横向抑制样过程在VZ内产生的,触发Notch进入它们的邻居,使它们对细胞周期进入不敏感。神经母细胞的分裂和最终迁移,最终失去Delta表达(Delta仅在VZ衬里的前两层细胞中表达),反过来应降低VZ中的Notch信号,允许重新进入细胞周期。总的来说,这种机制将导致放射状胶质细胞群中Notch活性的自持振荡,解释了每一个细胞偶尔进入周期的原因。Notch信号的侧向抑制机制已在许多不同的背景下进行了描述,例如在胚胎小鼠前脑中发现,新生神经元产生的Notch信号指示剩余的放射状胶质祖细胞保持其祖细胞(Yoon等人,2008年)或者获得一个星形细胞的命运(Namihira等人,2009年). 我们目前的工作首次证明了这种“侧向抑制”模型与抑制成人生发区神经发生的相关性。然而,另一种机制可能解释了Notch阻断不位于分裂祖细胞附近的状态I细胞的激活。因为我们还发现高比例的细胞表达DeltaA:GFP(图2小时)或其他Notch配体(参见锯齿状1b,补充图2j个,网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料),在静止细胞中进行Notch刺激是可能的。这种相互作用的机制尚待确定。
这里描述的机制适用于哺乳动物的大脑吗?
与斑马鱼成年端脑VZ一样,SEZ和SGZ这两个成年小鼠成体神经原域也包含慢循环祖细胞,并在正常条件下进行神经发生。我们的结果表明,操纵Notch可以显著影响类似区域斑马鱼端脑的祖细胞增殖和神经发生。作为Notch受体,配体和靶转录物也在出生后小鼠大脑的神经原区表达(Stump等人,2002年;Givogri等人,2006年;Ohtsuka等人,2006年),Notch信号可能在这些神经原域中发挥类似的作用。因此,在成年大鼠脊髓中的研究表明,Notch信号的变化可能会促进成年神经元的生成,无论是在神经原性区域还是在通常缺乏神经原性活动的损伤区域(山本等人,2001年)或在小鼠侧脑室室管膜层(Carlén等人,2009年). 在一项研究中,显然与这些发现相矛盾,使用Cre介导的重组在小鼠出生后齿状回的GFAP阳性星形胶质细胞中过度表达NICD并没有诱导静止,而是将祖细胞推向瞬时扩增状态,而γ-分泌酶抑制Notch或基因无效槽口1诱导细胞周期退出(Breunig等人,2007年). 目前尚不清楚如何协调这些观察结果,但小鼠成年DG中Notch信号的操纵也符合我们的结果(O.Ehm和C.Lie,个人通信)。我们工作的一个重要观察结果是,通过阻断Notch信号而重新激活的静止祖细胞进一步致力于成为神经元(图8). 因此,通过Notch活动主动维持静息状态是新生神经元形成的一个限制步骤。因此,总体而言,从临床角度考虑我们和其他人的研究结果是很有意思的,因为在成人大脑中施用Notch-blocking药物可能会提供一种方法来增强休眠NSC在修复机制中的招募和神经原性命运。未来,评估脑卒中后Notch阻滞期间室管膜区新生神经元的晚期命运将非常重要(Carlén等人,2009年)还有斑马鱼模型。