结果
成人大脑皮层含有长突起的CD44+星形胶质细胞
在每个新皮质样本中,我们观察到CD44+星形胶质细胞具有长突起。位于软脑膜表面的CD44+星形胶质细胞和位于皮层下层和浅层白质的星形胶质细胞显示出长而不分枝的突起,这些突起垂直于软脑膜面和灰质-白质边界。位于软脑膜表面的CD44+星形胶质细胞产生突起,突起下降至皮质,深入到第三层至第四层(图1A–E). 我们观察到这些“层间”星形胶质细胞在血管上终结的许多过程(图1E类,F类),尽管一些进程的结束还不确定,因为它们超出了该节的边界。这些星形胶质细胞的长突起缺乏二级分支,在一些标本中显示不规则间隔的静脉曲张样扩张(图1D类,D类′). 静脉曲张被描述为长过程星形胶质细胞的特征(Oberheim等人,2009年). 大多数星形胶质细胞的胞体位于距视神经管不远处,部分(20%,292个细胞中的58个)与视神经管直接并列。然而,并非所有靠近软脑膜表面的星形胶质细胞都是CD44+(图1C1类,C1'),但这些不会产生长过程。我们量化了CD44+过程的数量,这些过程要么在血管上结束,要么在未与血管接触的情况下自由结束。由于层间突起的密度随着它们穿过皮质层而降低,我们检查了第三层上部突起的末端,那里突起密度较高,而第三层下部突起的尾部密度较低。在上层,大部分长CD44+突起都位于血管上(在52个接受三维重建检查的突起中,49个位于血管上,3个突起在未与血管接触的情况下自由终止)。在第三层的下部,我们发现61个突起的末梢位于血管上,23个突起以神经膜中游离的静脉曲张样扩张结束。
图1。 人脑中的CD44+星形胶质细胞。A类,B类,两个不同的颞叶等皮质标本概述(A类)或多个(B类)皮层中的CD44+星形胶质细胞。A类,许多长的CD44+星形胶质细胞突起穿过上下皮质层(虚线定义了它们在中层皮质的尖端)。注意,它们在上皮层和下皮层的长度相似。I–VI英寸A类'表示皮层。B类,长突(箭头)和短突(箭头)CD44+星形胶质细胞占据大部分皮层。只显示了一些细胞。C类,软脑膜下层间星形胶质细胞。C1类,放大的方框区域C类; 单个光学切片。注意(1)CD44+星形胶质细胞(1–3)只有少数几个具有清晰轮廓轮廓的主要分支,(2)相邻的GFAP+星形细胞(星号)为CD44阴性。D类,第二层膜下层间星形胶质细胞长突起密集堆积。请注意,大多数静脉曲张(箭头,仅标记部分静脉曲张)对GFAP和S100β呈免疫阳性。E类,许多长突起的CD44+星形胶质细胞位于皮质层II的血管(V)上。F类,第三层下部长突起CD44+星形胶质细胞的末端。一个CD44+突起以神经膜扩大结束(双头箭头)。一层楼,中放大的上框区域的3D重建的2D视图F类显示末端脚部(中的箭头F类和一层楼)容器壁(V)处。请注意,看起来像“自由结束”(箭头)的静脉曲张样放大留下了光学图像的体积z(z)-堆栈。地上二层,地上二层′,以三维重建的不同角度显示的2D视图F类V,血管显示为肌营养不良蛋白。共焦显微镜。比例尺:A类,B类450微米;C类115微米;D类,E类,35微米;F类,50微米。
CD44+长突起星形胶质细胞也经常出现在皮质深层(第V层和第VI层;“星状非依赖细胞”;Cajal SRy,1984年),“静脉曲张投射星形胶质细胞”(Oberheim等人,2009年)和浅层白质(图1A类,B类,2E类,F类). 其中许多突起放射状地投射到皮层,在第V层和第VI层中形成一个由薄突起组成的网状结构(Akiyama等人,1993年). 这些细胞的突起缺乏二级分支,仅在突起的近端产生少量棘状突起(图2A2类). 正如下降过程的情况一样,并不总是清楚这些上升过程是否达到特定的目标,但我们观察到许多上升过程触及血管壁(图2克). 注意CD44+长突起星形胶质细胞通常向血管发送许多薄突起,并且它们的末端脚看起来很小(图1E类,2地下二层、C、,第1页,克).
图2。 CD44+星形胶质细胞在颞叶等皮质中具有长突起。A类,皮层深层的长程CD44+星形胶质细胞。A1类,放大的方框区域A类; 单个光学切片。注意CD44+星形胶质细胞的神经周(N)位置。A2类,放大的方框区域A1类主干只有CD44所示的小棘状突起(箭头)。B类,皮质层IV中靠近大血管(V)的CD44+星形胶质细胞具有长突起。B1,放大的下框区域B类.血管蒂星形胶质细胞(箭头)B1′GS水平低;双头箭头表示血管周围星形胶质细胞突起较长。地下二层,放大了上部方框区域。星形胶质细胞占据会阴(N)位置,向血管(V)发送几个末端脚。C类第四层的星形胶质细胞将末端的脚发送到多条血管(箭头),而其他过程则通过这些血管(箭头方向),并在图像区域之外结束。D类,血管周围(V)星形胶质细胞(星号)的长突起(用箭头标记)终止于小血管(参见第1页,放大的装箱区域D类),中的注释第1页从皮层上部发出的几个CD44+突起(箭头)使末梢位于同一血管上(V)。D2类,放大的方框区域第1页显示CD44+长突起沿着靠近血管的CD44-/GFAP+星形胶质细胞突起“爬行”。CD44+和GFAP+过程在相互接触之前分别用绿色和红色箭头标记。E类,长突起从白质星形胶质细胞上升到皮层下层。灰质-白质边界用虚线定义(E类′)并且通过CD44和GS免疫染色被清楚地区分。F类,皮层下层的许多薄星形胶质细胞突起没有显示出可检测的GFAP免疫染色水平(箭头,仅标记一些突起)。克,皮层下层的许多长星形胶质细胞突起以血管结束(V)。共焦显微镜。比例尺:A类180微米;B类215微米;C类,D类120微米;E类,85微米;F类,40微米;克,30微米。
我们发现皮质内有长程星形胶质细胞和胞体。其中大多数与大血管有关(图1B类,沿下降血管的星形胶质细胞,2B类,B1). 他们的一些细胞体接触血管壁(根据Cajal SRy,1984年),尽管更多位于血管附近(根据Cajal SRy,1984年)把几个血管末端的脚送到最近的血管(图2B–D类). 这些星形胶质细胞也发出长的突起,终止于远处的血管(图2C类,D类,第1页,D2类). 皮层中CD44+长程星形胶质细胞的其他细胞体与神经元细胞体密切相关(图2A1类,地下二层; 45%,检查的278个细胞中有123个)。我们还发现,在没有长突起的中脑皮层中,CD44+星形胶质细胞的数量变化很大。许多星形胶质细胞在低倍镜下显示图1B类(没有箭头标记)。注意,另一个标本没有显示这些CD44+星形胶质细胞(图1A类). 下面讨论这些没有长突起的皮质CD44+星形胶质细胞。
我们从切除的颞叶中的几个长突起星形胶质细胞中进行了记录。所有显示的无源电流-电压关系(图3A类). 此外,我们将被动电生理特性与原生质星形胶质细胞进行了比较,发现静息膜电位、输入电阻或膜电容没有显著差异。我们记录的软脑膜表面附近一半(六分之三)的长突起星形胶质细胞与邻近的原生质星形胶质细胞偶联(图3B类). 相反,所有原生质星形胶质细胞都与相邻的原生质胶质细胞偶联。
图3。 A类,典型的电流轨迹是通过阶跃电压协议诱发的(从−160到+60 mV,增量为10 mV;持续时间为100 ms)。电流-电压(I–V型)曲线是从每个电压阶跃接近结束时的测量中获得的(电流轨迹上方的黑色小方块)。注意对照组(短突起星形胶质细胞,左)和长突起星形细胞(右)之间没有差异。B类,膜下层间星形胶质细胞内充满了荧光素黄(用于细胞间偶联)和Alexa Fluor 594(不穿透缝隙连接)。许多邻近的星形胶质细胞充满了路西法黄色(B类). 注射星形胶质细胞的细胞突起有短的棘状突起(箭头所示B1,放大B类′). 共焦显微镜。比例尺:B类,B类′125微米;B1,25微米。
人类海马体还含有长突起的CD44+星形胶质细胞
我们在海马的起始层中发现CD44+星形胶质细胞,这些细胞投射出长突起,覆盖CA1–CA3锥体层和室下的整个深度,并终止于放射层的边界(图4A类,C类). 这些类似于新皮质层间星形胶质细胞。在外科标本中,长突起显示小静脉曲张或无静脉曲张;在几个尸检标本中,长的突起显示出许多巨大的静脉曲张(图4B类).
图4。 海马中的CD44+星形胶质细胞。A类,C类CA1区的锥体层上覆盖着一个由长星形胶质细胞突起组成的密集网。A类,虚线勾勒出金字塔层(pyr):外科组织。B类,锥体层中长星形胶质细胞突起中的许多大静脉曲张:尸检组织。D类,E类,CD44+过程覆盖齿状回的分子层(mol)。F类,一种CD44+星形胶质细胞,在CA1放射层具有长突起。注意,星形胶质细胞有两个核(N)(一层楼,放大F类′; 单个光学切片)。oriens,oriens层;rad,地层放射状。共焦显微镜。比例尺:A类210微米;B类,25微米;C类,D类120微米;E类,35微米;F类,30微米;一层楼,15微米。
与新皮质层相比,海马具有锥体神经元的“倒置”位置。新皮质层I对应于腔隙分子层附近的放射层,而层VI对应于方向层附近的锥体层。因此,覆盖锥体层的长星形胶质细胞突起对应于星形胶质细胞从皮层下白质进入第V层和第VI层的突起。定向层由锥体神经元的轴突组成,与肺泡一起构成海马的“白质”。CD44+星形胶质细胞持续存在的另一个海马区是齿状回的分子层,在那里颗粒下层的星形胶质细胞的长突起覆盖了分子层的整个深度(图4D类,E类). 辐射层中也观察到长突起的CD44+星形胶质细胞(图4F类)齿状回门(数据未显示)。因此,对海马体的分析表明,具有长突起的CD44+星形胶质细胞也是典型的星形胶质细胞皮层。大脑皮层和海马体中沿长突起的静脉曲张被认为是长突起星形胶质细胞的典型特征(Akiyama等人,1993年;Oberheim等人,2009年). 很难确定这些静脉曲张是活组织中的解剖结构还是人工制品。我们在多聚甲醛固定前将手术颞叶材料在室温下放置15小时,发现长程CD44+星形胶质细胞中的静脉曲张比手术后立即固定的相同样本中的静脉曲张要多(A.Sosunov,未发表的观察结果)。因此,能量衰竭,无论是死前还是死后,都可能会导致静脉曲张的发生,可能是由于星形胶质细胞过程中细胞质转运受到抑制。
具有长突起的CD44+星形胶质细胞与灰质中的原生质星形胶质细胞在表型上不同,与白质中的纤维状星形胶质细胞相似
我们通过免疫组织化学方法对长突起的CD44+星形胶质细胞进行了表征,并将其与原生质和纤维状星形胶质细胞相比较。EAAT2、EAAT1和GS的CD44+星形胶质细胞免疫染色比原生质星形胶质细胞弱(图2B类,E类,5A–E). 我们量化了GS免疫标记的光密度,发现与相邻的CD44−原生质星形胶质细胞相比,CD44+星形胶质细胞的水平显著降低(分别为57.23±6.44 vs 106.35±5.85 a.u;第页< 0.001). 然而,CD44+星形胶质细胞中EAAT1和EAAT2的低水平并不意味着CD44+长突起星形胶质细胞所占的整个体积,甚至在其身体附近,都缺乏星形胶质细胞谷氨酸转运体。对靠近长突起星形胶质细胞的CD44和EAAT1或EAAT2共标记的检测表明,在CD44+突起之间确实存在EAAT1+和EAAT2+突起(图5C类,F类). 这些EAAT1+和EAAT2+过程可能来源于邻近的CD44−、EAAT1+/EAAT2+、原生质星形胶质细胞(另见下文星形胶质细胞类型之间的星形胶质细胞结构域定位和微观异质性)。
图5。 长突起的CD44+星形胶质细胞表现出与纤维状星形胶质细胞相似的表型。A类、EAAT2(红色)和GS(蓝色)在CD44+(绿色)星形胶质细胞中含量较低。B类,软脑膜下CD44+星形胶质细胞(星号)显示的EAAT2免疫标记比相邻的CD44-星形胶质细胞少得多(箭头所示)。单个光学切片。C类,EAAT1信号在具有长突的膜下CD44+星形胶质细胞中较低。比较CD44+星形胶质细胞(箭头)和CD44-星形胶质细胞。C类,单片光学片。C1类,放大的方框区域C类.蓝色:C类GFAP;C类′,C1类,C1类′,原子核。请注意,EAAT1+剖面(箭头)位于CD44+星形胶质细胞胞体附近。D类,皮质层V中具有长突的CD44+星形胶质细胞的低水平EAAT1免疫标记。第1页,中的放大框区域D类,单片光学切片,原生质EAAT1+/CD44−星形胶质细胞带箭头标记。E类,F类、GS等级(E类)和EAAT2(F类)CD44+星形胶质细胞含量低,皮质深层有长突起。E1级,一层楼,放大的方框区域E类和F类′分别是。E1级′,CD44+星形胶质细胞用箭头标记。一层楼注意,相邻CD44−星形胶质细胞的EAAT2+突起(箭头)位于CD44+星形胶质细胞胞体附近和CD44+突起之间。共焦显微镜。比例尺:A类110微米;B类55微米;C类,35微米;D类110微米;E类175微米;F类,130微米。
CD44+星形胶质细胞在其细胞体和过程中对富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC;骨连接蛋白;图6A类,A1类,B类)和αB-晶体蛋白(在其胞体中;图6C类,C1类,D类),这是白质中纤维状星形胶质细胞的典型特征(图6E类,F类)但在原生质星形胶质细胞中不存在。大多数CD44+星形胶质细胞显示高水平的GFAP和S100β,尽管一些细胞显示这些蛋白的免疫反应性较低。
图6。 A–D、SPARC(A类,B类)和αB-晶体蛋白(Cryst;C类,D类)存在于长突起星形胶质细胞中,如脚膜下所示(A类,C类)和深层皮层(B类,D类). 结晶+少突胶质细胞D类用箭头标记。A1类,C1类,放大的方框区域A类和C类分别是。SPARC公司(E类)和αB-晶体蛋白(F类)皮质下白质。箭头在F类′标记少突胶质细胞。克,小时,在CD44+星形胶质细胞的所有过程中都观察到AQP4。克层间星形胶质细胞的长突起为AQP4+。小时血管附近的长程CD44+星形胶质细胞在过程中对AQP4表现出免疫反应。注意血管附近的AQP4水平较高(箭头所示)。我,CD44+长突起星形胶质细胞不与Ranvier的节点接触,Ranvier被视为轴突的未染色部分(用箭头表示I1类)相邻髓鞘的两个Caspr1+端之间。I1类,中放大方框区域三维重建的2D视图我.J型,EAAT2位于节点附近,显示原生质星形胶质细胞的过程。J1号机组,J2,中放大方框区域三维重建的2D视图J型注意,EAAT2+(绿色)免疫阳性过程位于节点附近(定义为箭头之间的间距)。共焦显微镜。比例尺:A类,B类130微米;C类,100微米;D类55微米;E类130微米;F类130微米;克,85微米;小时,120微米。
AQP4免疫染色特别令人感兴趣,因为长突星形胶质细胞与血管之间存在密切的空间关系。所有具有长突的CD44+星形胶质细胞在整个细胞体和突中显示出AQP4的阳性免疫染色(图6克,小时). 这种细胞体和过程染色似乎比原生质星形胶质细胞的染色水平高很多,而原生质胶质细胞主要在末梢显示免疫染色(图6克,小时)这表明AQP4在整个细胞中的分布更为广泛,而不是集中在血管接触部位。白质的(CD44+)纤维状星形胶质细胞在细胞体和过程中也显示AQP4免疫染色(数据未显示)。
鉴于白质中的纤维状星形胶质细胞接触Ranvier的淋巴结并参与该区域的离子调节(Lundgaard等人,2013年),我们检查了CD44+进程和节点之间的关系。使用Caspr1作为偏执连接标记,我们无法发现节点和CD44+长突起之间有任何接触(无论是在其末端还是沿着突起)。CD44+突起仅在距淋巴结一定距离处观察到(图6我,I1类). 相反,在淋巴结附近不断发现原生质星形胶质细胞的小突起(图6J型,J1号机组,J2型). 可能在灰质中,原生质星形胶质细胞参与节点周围细胞外空间的离子缓冲。
新皮质内其他类型的CD44+星形胶质细胞
除了具有下降或上升到皮层的长突起的CD44+星形胶质细胞和连接到大血管的CD44~+长突起星形胶质细胞外,我们还观察到皮层内形态各异的CD44+星形胶质细胞。这些细胞的数量差异很大:在一些标本中,我们发现它们很少(图1A类)而在其他人中(55%的研究病例中,58例中有32例),它们占据了所有皮层(图1B类). 其中一些细胞(约30%,200个细胞中的61个)显示CD44免疫染色,均匀地填满了细胞体和突起所占的全部体积(图7A类). 这种浓密的细胞具有原生质星形胶质细胞的形态,没有长突起。其他细胞(约10%,200个细胞中有18个细胞)没有显示出完整的浓密外观,而是显示出较低密度的突起,许多突起带有小的CD44+突起,这与微型小叶状星形细胞突起相对应(图7B类,C类). 该群体中的大多数CD44+星形胶质细胞(约60%,200个星形胶质细胞中的121个)在其主要分支上显示出小型叶状突起密度降低,并且出现许多起源于胞周并占据主要分支近端之间的空间的薄而短的弯曲突起(图7C类,D类). 这些星形胶质细胞经常表现出一些波动的、长的过程,这些过程超出了大多数过程的极限。值得注意的是,在没有共焦成像的情况下,上述许多CD44+星形胶质细胞看起来浓密(图7C类,D类)但对单个光学切片的分析表明,微型叶状突起减少或消失(图7C1类,第1页). 还应注意,这些具有原生质表型的CD44+星形胶质细胞产生包裹血管的末端脚(图7E类,F类),与CD44+长突星形胶质细胞形成对比,后者的末端足很小(图1E类,2地下二层,克). 这些星形胶质细胞被抗GS染色(图8A类,B类)和抗EAAT2(图8C类,D类)抗体。
图7。 CD44+皮质星形胶质细胞形态的变异性,无长突起。A类,一种浓密的原生质星形胶质细胞。B类星形胶质细胞(星号),主要突起呈海绵状,仅有少量二级和三级分支。注意CD44+星形胶质细胞(星形细胞)附近有许多突起。C类,D类,CD44+星形胶质细胞具有减少的微型叶状突起。请注意,丰富的薄突起起源于C1类和第1页.几个细长的过程(D类,箭头)延伸到密集的近端突起之外。A1类,B1,C1类、和第1页显示放大的A类和B类(顶部星形胶质细胞),C类、和D类分别为;单个光学切片。E类,CD44+星形胶质细胞长突起和短突起位于皮质层IV的大血管(V)附近。F类,CD44+原生质类星形胶质细胞,末端位于三条独立的血管上(箭头所示F类′). 注意,末梢足占据血管壁的大面积;单片光学片F类′.克,小时,CD44+星形胶质细胞与邻近神经元接触的过程(箭头,蓝色通道中使用尼塞尔染色确定的神经元)。请注意,流程缺乏微型流程。共焦显微镜。比例尺:A–C,D类,40微米;A1类,B1,C1类,第1页,25微米;E类,145微米;F类55微米;克,小时,45微米。
图8。 CD44+皮质星形胶质细胞无长突起的免疫组织化学特性的变异性。A类,B类,CD44+星形胶质细胞中不同水平的GS。C类,D类,中等(C类)和严重(D类)CD44+星形胶质细胞EAAT2免疫标记减少。C1类,第1页,放大的方框区域C类和D类分别是。C1类‴和第1页CD44和EAAT2共定位区域(黄色):注意C1类‴比英寸第1页‴. 共焦显微镜。比例尺:A类,B类,60微米;C类,100微米;D类,95微米。E类中皮层CD44+星形胶质细胞中GFAP和CD44的光密度读数。注意显著的直接相关性:第页= 0.619,第页< 0.001.F类,皮层中部CD44+星形胶质细胞中GS和CD44的光密度读数。注意显著的反相关性:第页= 0.456,第页< 0.001.
应该提到一种特殊类型的CD44+星形胶质细胞。这些细胞向邻近神经元投射缺乏次级和微型分支的突起,并用末端分支包围其胞体周围(图7克,小时). 这些细胞的数量并不高(<1%),但对切片的详细检查使我们能够在我们的许多样品中找到它们。中层皮质中的大多数CD44+星形胶质细胞也显示出高水平的GFAP免疫染色。对这些细胞的CD44和GFAP光密度的分析表明,这些标记物之间存在直接相关性(第页= 0.619,第页< 0.001;图8E类). 这些CD44+星形胶质细胞中EAAT2和GS的水平不同(图8A–D,F类)CD44和GFAP水平高的人也呈AQP4免疫阳性(数据未显示)。我们基于光密度对GS和CD44免疫染色进行了回归分析,并确定了负相关(第页= 0.456,第页< 0.001;图8F类)表明这些CD44+星形胶质细胞中的GS水平显著降低。
星形胶质细胞结构域的定位和类型间的微观异质性
与纤维状星形胶质细胞不同,原生质星形胶质细胞在其胞体周围的有限体积内展开其过程。这个体积构成了星形胶质细胞的“结构域”。只有在一个很小的外围区域,它们的突起才与相邻星形胶质细胞突起相混合(Bushong等人,2002年,2004). 相比之下,CD44+星形胶质细胞的长突起穿过许多原生质星形胶质细胞结构域,通常在其胞周附近通过(图9A类,B类;Oberheim等人,2009年,他们的图5A类,F类). 如上所述,具有长突起的CD44+星形胶质细胞与原生质星形胶质细胞相比,EAAT2免疫染色水平较低或检测不到。这种差异使我们能够确定CD44+长过程星形胶质细胞与其相邻的CD44-原生质星形胶质细胞的空间关系。原生质性星形胶质细胞的EAAT2+和EAAT1+过程渗透到邻近的CD44+星形胶质细胞域(图5F类,8C类,C1类,D类,第1页). 这表明星形胶质细胞结构域的分解是对称的,CD44+星形胶质细胞通过许多其他星形细胞结构域发送其过程,而CD44-原生质星形胶质细胞可以将过程发送到CD44+星状细胞结构域。
图9。 CD44+星形胶质细胞破坏了原生质星形胶质细胞结构域组织。A类,长CD44+过程穿过邻近CD44-星形胶质细胞的结构域(虚线)。B类,许多CD44+长突起(绿色)通过CD44-星形胶质细胞的突起。B1,放大方框区域三维重建的2D图像B类注意,CD44+过程在CD44−/GFAP+星形胶质细胞的细胞体附近通过。C–E类突触素免疫阳性点在CD44+星形胶质细胞附近的分布(C类)和短(D类,E类)流程。C1类,第1页,E1级,放大的方框区域C–E类分别为;单个光学切片。注意,CD44免疫染色在C类比中的D类和E类共聚焦显微镜。比例尺:A类,60微米;B类,45微米;C类——E类,55微米。F类,CD44−和CD44+星形胶质细胞中突触素点状体和CD44的光密度读数,中间皮层无长突起。注意缺乏相关性,第页= 0.0819,第页< 0.001.
我们还想检测CD44+长过程星形胶质细胞体积内及其周围的突触密度。在用突触素抗体对组织进行免疫染色后,我们在CD44+星形胶质细胞的细胞体附近发现了许多突触素阳性的斑点(图9C–E类). 事实上,密度与EAAT2+/CD44−原生质星形胶质细胞域内的密度没有差异。对于突起较长的CD44+星形胶质细胞,CD44+细胞体周围突触素点的OD(68.38±2.783 a.u.)与附近原生质星形胶质细胞周围的OD无差异(69.093±2.832 a.u。;第页= 0.448). 对于突起较短的CD44+星形胶质细胞,我们确定突触素水平与CD44免疫反应性之间没有相关性(第页= 0.019,第页< 0.001;图9F类). 然而,突触素阳性点位于CD44+星形胶质细胞突起之间,邻近原生质星形胶质细胞的EAAT2+突起位于此处。这些观察结果表明,CD44+星形胶质细胞没有孤立的排斥结构域,其突起之间的体积,甚至在细胞体附近,也被邻近原生质星形胶质细胞和突触的突起占据。
具有长突起和短突起的CD44+星形胶质细胞的一个显著特征是其相对于原生质星形胶质细胞定位的不规则和异质性模式。分离的CD44+星形胶质细胞可能存在于原生质星形胶质细胞区域内(图5D类,E类,8A类,B类). 血管可能被CD44+和CD44-星形胶质细胞覆盖(图10A类,A1类,B类,D类,E类). 值得注意的是,原生质体(短突)星形胶质细胞的端足比长突星形胶质细胞的端足占据更多的血管表面积(图10第1页,E1级,比较短流程和长流程)。我们甚至发现含有一个CD44+和一个CD44−细胞的星形胶质细胞的“双重”(图10C类,C1类). 值得注意的是,所有具有长突起的双倍体星形胶质细胞显示出相似的CD44免疫标记水平。
图10。 星形胶质细胞特性的微观异质性。A类,相邻的两个血管周星形胶质细胞CD44水平不同。A1类,放大的方框区域A类注意,标有星号的星形胶质细胞是CD44+,而其他星形胶质细胞(#)是CD44-。B类,CD44+星形胶质细胞仅覆盖血管(V)周长的一半。C类,两个星形胶质细胞(双重)CD44水平不同,并表现出不同水平的GS和GFAP。C1类,放大的方框区域C类数字1和2表示两个星形胶质细胞具有不同的免疫组织化学表型。D类,E类,CD44+长程星形胶质细胞(D类)和CD44+短突星形胶质细胞(E类)有不同的端脚。请注意,原生质(短突)星形胶质细胞的末端足占据了更多的血管表面积。还请注意这些图像中不同的CD44+和GFAP+过程。共焦显微镜。比例尺:A类,75微米;B类,90微米;C类55微米;D类,E类,85微米。
新生儿大脑含有CD44+长程星形胶质细胞,但不含CD44+皮质星形胶质细胞
我们检查了未显示任何大体或显微镜下CNS病理的胎儿和新生儿端脑,以确定CD44+星形胶质细胞何时出现。如所述科伦坡等人(2005)使用GFAP抗体,在出生后数周内,层间过程就已经形成,然后在数月内密度增加。在我们的样本中,19-21周的胎儿大脑中不存在CD44+星形胶质细胞(图11A类,B类),但在妊娠26周时,pial-based星形胶质细胞的CD44免疫染色开始局部出现(图11C类). 足月时,我们发现在软脑膜表面、下皮质和浅层白质中有细胞体的长程星形胶质细胞是CD44+(图11D类,F类). 我们还发现,在这些年轻的大脑中,皮层本身没有短突起的CD44+星形胶质细胞(原生质星形胶质细胞)(图11E类). 深白质中的CD44+纤维状星形胶质细胞最初出现于妊娠中期,并从那时起增加(数据未显示;Vogel等人,1992年). 我们还检查了2-7岁年龄段无癫痫发作的年轻患者的大脑,发现大脑中层没有短突起,CD44+星形胶质细胞(数据未显示)。为了扩大我们的观察范围,我们还检查了足月新生儿和幼儿的基底神经节,并在大血管周围发现了长程CD44+星形胶质细胞(图11克). 因此,长过程星形胶质细胞对大脑皮层没有特异性,而是半球灰质的普通居民,与灰质区的大血管有关。
图11。 胎儿和年轻CNS中的CD44+星形胶质细胞。A类,B类,妊娠19周时,皮质中没有CD44+细胞(A类)或皮层下白质(B类).C类在妊娠26周时,丘脑顶下区域出现局部CD44信号,一些星形胶质细胞将突起伸入上皮层。D–F型,妊娠40周时,长CD44+进入上皮层(D类); 大脑皮层中部缺乏CD44+星形胶质细胞(E类); 白质和下皮层中的星形胶质细胞将突起延伸到下皮层(Ctx),在这张图像中是从血管(V;F类).克CD44+长突起星形胶质细胞也存在于深灰色细胞核中;在这里,它们从豆纹血管向壳核放射状突起(V)。比例尺:A类,B类,100微米;C类,D类,50微米;E类,100微米;F类,50微米;克,200微米。
讨论
人类星形胶质细胞的多形性和复杂性
本研究进一步强化了人脑星形胶质细胞异质性的概念,以及人类和啮齿动物星形胶质细胞之间的差异(科伦坡和莱辛,2004年;Oberheim等人,2009年). CD44是一种质膜蛋白,免疫染色在一定程度上勾勒出了GFAP免疫染色无法勾勒出的星形胶质细胞形态。长过程CD44+星形胶质细胞的典型位置和特征如所示图12以磷脂为基础、接触大血管或位于白质中的啮齿动物星形胶质细胞也是CD44+(Sosunov等人,2013年)但是,据我们所知,从未在啮齿动物的等皮质和海马中观察到CD44+或CD44-长程星形胶质细胞。长过程层间表型可能部分是由于人类从出生到成年期间大脑大小的大幅增加,因为与软脑膜和胎儿大脑血管相连的星形胶质细胞必须随着大脑的生长而伸长。此外,人脑星形胶质细胞可能具有固有的特性,使其能够延长长过程,如人脑星形细胞移植到小鼠脑中后所示(Han等人,2013年).
图12。 等角体和海马中长突CD44+星形胶质细胞位置的示意图。注意,在皮层中,上层(主要是I层和II层)和深层(主要是VI层和V层)都覆盖着CD44+星形胶质细胞的长突。中脑皮层(第III层和第IV层)中长程CD44+星形胶质细胞的数量较低。在海马体中,CD44+星形胶质细胞的长突起占据纹状体锥体(但不占据放射状纹状体)和齿状回的纹状体分子。在每一个皮层和海马层中都可以发现原生质CD44−星形胶质细胞和源于CD44-原生质星形胶质细胞的短流程CD44+星形胶质细胞。圆形图像显示CD44+星形胶质细胞的典型特征。A类,顶下层间星形胶质细胞的长突起下降。B类,具有短突起的CD44+星形胶质细胞起源于CD44-原生质星形胶质细胞。C类,CD44+长程星形胶质细胞位于灰质。D类层间星形胶质细胞的过程以小血管上的末端脚结束。E类,CD44+长突星形胶质细胞和CD44+纤维状星形胶质细胞的长突形成的血管端足位于白质中。F类纤维状星形胶质细胞的长突起在皮层深层形成致密的网状结构。克星形胶质细胞的长CD44+突起位于纹状体锥体海马的纹状体孔。小时,CD44+长突起星形胶质细胞位于放射状纹状体。我齿状回纹状体分子CD44+长突起。A–C,F–I型,CD44免疫染色。D类,E类CD44(绿色)和GFAP(红色)免疫染色。五、 血管。
新皮质中CD44+星形胶质细胞的来源是什么?
所有标本均含有长突起的CD44+星形胶质细胞,主要位于软脑膜表面、白质和深层皮质层,以及与大血管相关的星形胶质细胞。具有长突起的CD44+星形胶质细胞的形态和免疫组织化学特征并不取决于细胞的位置(例如,软脑膜下区、血管附近或深皮质),并且与白质中的纤维状星形胶质细胞相似。这些CD44+长程星形胶质细胞存在于胎儿和幼年大脑中,表明它们来自正常的发育程序。
除了长程CD44+星形胶质细胞外,我们还发现皮层中的CD44+星状胶质细胞在不同个体中的数量差异很大。其中一些细胞表现出原生质星形胶质细胞的形态,没有长突起。我们没有在新生儿大脑皮层中发现这些CD44+星形胶质细胞,并且它们的数量在成人大脑中变化很大,这表明这是一种后天表型。这些皮质内CD44+星形胶质细胞的来源可能是什么?它们是由正常的、CD44−的原生质体星形胶质细胞对某种病理学的反应引起的吗?
值得注意的是,在这些CD44+星形胶质细胞中,我们没有发现一些典型的反应性变化蛋白质(例如,波形蛋白、巢蛋白、p-S6),也没有显示出任何类型的脑损伤后观察到的典型反应性星形胶质细胞的肥大形状。此外,这些星形胶质细胞都不是胶质瘢痕的一部分。这些星形胶质细胞表型的高度可变性(从与原生质的微小偏差到显著偏差)有利于性状的逐渐改变,而不是急性反应。我们认为,这些皮质内CD44+星形胶质细胞的出现代表着一种长期、渐进的变化,类似于GFAP免疫染色所定义的年龄相关性星形胶质细胞增生症。GFAP仅在一些皮层原生质性星形胶质细胞中逐渐积累,产生GFAP+和GFAP-细胞的镶嵌分布,这是众所周知的年龄依赖现象(米德尔多普和霍尔,2011年). 恒河猴的等皮质CD44+星形胶质细胞随着年龄的增长也出现类似的异质性(Cargill等人,2012年). 这种与年龄相关的增加不太可能是次要的主要病理改变,因为这些动物没有表现出神经退化的迹象。导致这种年龄相关性异质性的原因尚不清楚。这些皮质人CD44+星形胶质细胞可能来源于正常的CD44-原生质体星形胶质细胞,可能是对生活中获得的某种亚临床病理的反应,如缺氧发作、炎症或感染、轻微头部创伤或高血压。
我们的许多标本都是从患有癫痫的中年患者身上获得的,因此我们不能排除癫痫发作可能加速和加重了星形胶质细胞的变化,并促进了更高水平的GFAP和CD44。然而,一些癫痫患者颞叶标本的中脑皮层中含有很少或没有CD44+星形胶质细胞。此外,其中6个标本来自非癫痫患者,这些标本也显示了不同数量的CD44+星形胶质细胞。即使从CD44−到CD44+的转变是一个渐进的过程,或者是由亚临床病理学引起的,它确实会引起星形胶质细胞表型的重要变化。特别是,星形胶质细胞改变了其形态,失去了通常包裹突触的微型叶状突起,积累了GFAP,并显示出低水平的谷氨酸转运体(EAAT1和EAAT2)和GS。这些变化与亚历山大病小鼠模型中观察到的变化非常相似(Sosunov等人,2013年)这种转变是由于细胞内应激途径的激活而发生的。我们不能忽视这样一种可能性,即一些中层皮质CD44+星形胶质细胞可能是从成人中枢神经系统的前体细胞中重新生成的,但我们没有直接证据支持这一结论。
具有长突起的CD44+星形胶质细胞的功能是什么?
具有长突起的CD44+星形胶质细胞接触许多血管和软脑膜表面。因此,CD44+星形胶质细胞比原生质星形胶质细胞覆盖的距离要远得多,能够将远处的血管相互“连接”,将深层血管连接到软脑膜表面。在过去的研究中,血管接触的程度尚未被认识到,这些研究发现了血管接触,但得出结论,大多数长程星形胶质细胞并不接触血管(科伦坡等人,1995年;莱辛和科伦坡,2002b;Oberheim等人,2009年). 以前的研究可能没有认识到血管附着,因为他们用抗GFAP抗体观察到星形胶质细胞。
长程星形胶质细胞在整个细胞体和过程中以及血管和软脑膜表面的末端脚上显示AQP4免疫染色。AQP4是主要的星形胶质细胞水通道蛋白,负责通过质膜的水通量(Binder等人,2012年). 过程中较高的AQP4水平可以使水有效地流过细胞膜。这在高渗状态下尤其重要。此外,长过程星形胶质细胞很可能构成CSF成分的快速管道(“glymphatic flux”;Iliff等人,2012年)在大量脑实质上。
我们发现一半基于pial的长过程星形胶质细胞与相邻的CD44−原生质星形胶质细胞偶联。这种耦合将允许原生质星形胶质细胞连接到水和离子的长过程分配中。长突星形胶质细胞可能显著增加星形胶质细胞合胞体的通讯速度和体积。最近在人类皮层记录到的星形细胞钙波的高速(Oberheim等人,2009年)可能就是这样一个例子。
星形胶质细胞是神经-血管单位的组成部分,参与血管张力的调节(Gordon等人,2007年;Petzold和Murthy,2011年). 因此,与相距较远的多条血管相连的星形胶质细胞不仅可以局部调节血管紧张素,还可以同步远端血管的血流。
与白质中的纤维状星形胶质细胞相比,灰质中的CD44+星形胶质细胞不接触淋巴结。原生质星形胶质细胞对节点附近的细胞外环境进行缓冲。因此,血管似乎是CD44+星形胶质细胞长过程的主要靶点。
CD44+星形胶质细胞不尊重其他星形胶质细胞的边界
细胞质星形胶质细胞产生自己的结构域,相邻的星形胶质细胞在很大程度上被排除在外(Bushong等人,2002年;Oberheim等人,2009年). 具有长突起的CD44+星形胶质细胞是这个“排除规则”的例外,因为它们的长突起穿过许多其他星形胶质细胞的结构域(Oberheim等人,2009年). 相反,CD44−原生质星形胶质细胞向CD44+星形胶质细胞的胞体发送其过程并在其附近定居。因此,当星形胶质细胞减弱其自身结构域的“排斥屏障”时,原生质星形胶质细胞能够将其过程延伸到邻近星形胶质细胞的结构域。原生质突起延伸到长突起星形胶质细胞结构域,将使原生质星形胶质细胞的精细突起靠近长突起星状胶质细胞区域的突触,而长突起的星形胶质细胞没有延伸这种精细突起,并且GS和谷氨酸转运体含量低。因此,长突起星形胶质细胞附近的皮质突触仍然被原生质星形胶质细胞“覆盖”。
总之,我们推断在人类等皮质和海马中有两个CD44+星形胶质细胞的一般群体。第一种是由长过程星形胶质细胞组成的,它们出现在正常发育过程中,并且存在于我们检查的每个标本中,无论年龄或其他病理情况如何。这些细胞通常显示较低水平的GS、EAAT1和EAAT2;GFAP和S-100β水平可变但通常较高;SPARC和αB-晶体蛋白水平高于原生质星形胶质细胞。第二种是更异质的皮质星形胶质细胞群体,由形状上可以表现为原生质的细胞组成,但具有较少的微型突起,很少有没有小分支的长突起。第二组人群GS、EAAT1、EAAT2和GFAP的免疫阳性率各不相同。虽然第一批CD44+星形胶质细胞在一生中都存在,但第二批可能代表获得性表型。