摘要
突触前蛋白α-突触核蛋白是导致路易病病理学和疾病临床方面的主要怀疑因素,包括帕金森病、路易体痴呆和阿尔茨海默病的路易体变体。α-突触核蛋白在路易小体和路易神经节中积累,α-突触核蛋白基因中的两个错义突变(A53T和A30P)与罕见的家族性帕金森病有遗传联系。在小鼠Thy1调节序列的控制下,A53T突变人类α-突触核蛋白在转基因小鼠产生的神经元α-突触核蛋白病动物的神经系统中的表达,与路易病、神经元变性和运动缺陷的人脑中观察到的特征极为相似,尽管黑质致密部多巴胺能神经元缺乏转基因表达。脑干和运动神经元中的神经元似乎特别脆弱。运动神经元病理学检查包括轴突损伤和神经肌肉接头失神经,表明α-突触核蛋白干扰了一种普遍的突触维持机制。野生型人类α-突触核蛋白的Thy1转基因表达导致了类似的病理变化,因此支持突变型和野生型α-突触核蛋白在神经型α-联核蛋白病和路易病的家族性和独特型疾病中发挥中心作用。这些小鼠模型为解决α-同核蛋白病的基本方面和测试治疗策略提供了一种方法。
特发性帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和阿尔茨海默病路易体变体(LBVAD)的病理特征是神经元中的蛋白质内含物,通常在死后脑组织样本中称为路易病理学(福诺,1996年;Ince等人,1998年;Irizarry等人,1998年;Spillantini等人,1998年;武田等人,1998年;Braak等人,1999年). 包涵体出现在营养不良(路易)神经突中,是PD和DLB病理学的重要组成部分(Irizarry等人,1998年;Spialantini等人,1998年;Braak等人,1999年),位于神经元胞周(路易体)(Forno,1996年;Spialantini等人,1997年;Wakabayashi等人,1997年;Baba等人,1998年;Ince等人,1998年;Irizarry等人,1998年;Mezey等人,1998年;Spialantini等人,1998年;武田等人,1998年;Braak等人,1999年)偶尔也会在细胞外(丹·哈托格和贝特莱姆,1960年).
α-突触核蛋白是路易小体和路易神经节的主要成分(Spialantini等人,1997年;Wakabayashi等人,1997年;Baba等人,1998年;Ince等人,1998年;Irizarry等人,1998年;Mezey等人,1998年;Spialantini等人,1998年;武田等人,1998年;Arai等人,1999年;Braak等人,1999年;Giasson等人,2000年). 这些包涵体中含有泛素的程度较小且不同(Gai等人,1995年),神经丝蛋白(福诺,1996年;Ince等人,1998年;Takeda等人,1998年),泛素C-末端水解酶(Lowe等人,1990年),蛋白质体亚单位(Li等人,1997年)以及各种其他抗原决定簇(Pollanen等人,1993年). α-突触核蛋白免疫反应是路易型病理学最敏感和可靠的诊断(Forno,1996年;Spialantini等人,1997年;Wakabayashi等人,1997年;Baba等人,1998年;Ince等人,1998年;Irizarry等人,1998年;Mezey等人,1998年;Spialantini等人,1998年;武田等人,1998年;Braak等人,1999年).
神经元的路易病理学似乎是中枢性的,可能在机制上导致其功能障碍和疾病中的退化。总之,含α-突触核蛋白内含物在路易病理疾病中的分布,发现了与早发家族性PD相关的α-突触核蛋白基因的两个突变(Polymeropoulos等人,1997年;Krüger等人,1998年)蛋白质自我聚集的能力(Conway等人,1998年,2000;Giasson等人,1999年;Narhi等人,1999年;Wood等人,1999年)和最新发现体内转基因果蝇(费尼和本德,2000年)和老鼠(Masliah等人,2000年)支持α-突触核蛋白在路易病理疾病的病理生理学中发挥中心作用。
在这里,我们通过人类α-突触核蛋白A53T突变体或其野生型对应物的神经元表达,证明小鼠存在神经元变性和伴随的运动障碍的病理学。α-突触核蛋白编码cDNA受小鼠Thy1调节序列控制(Lüthi等人,1997年;Sturchler-Pierrat等人,1997年;Wiessner等人,1999年)在小鼠神经系统的许多中枢神经元中产生可靠的神经元特异性表达和高蛋白水平。
材料和方法
转基因小鼠。PCR扩增野生型人类α-突触核蛋白cDNA(396 bp)(2 min,93°C;三个周期15 sec,93°C:30 sec,55°C:30sec,72°C;两个周期15 sec,93℃;30 sec,60°C;30sec,72°C;和30个周期15秒,93°C:30sec、66°C:30Sec、72°C:寡核苷酸cgacgacaggtgtgtaaggaagaa和tgagaactgagcactt)取自20 ng人脑cDNA(Clontech,Palo Alto,CA)并克隆到pMOSBlue(Amersham Pharmacia Biotech,Little Chalfont,UK)。A53T突变是通过PCR寡核苷酸定向突变引入的(加利福尼亚州拉霍拉市斯特拉赫纳;30秒,93°C;14个周期,30秒,1993°C;1分钟,55°C;13分钟,68°C;寡核苷酸,agtggcattgacacagctgaga和tctcacacttgtcacacacacatgcacacacat)。通过测序和相应的钝化(Klenow)cDNA确认野生型和突变cDNA的身份(Nde公司我-Sma公司一) 插入钝化的(Xho公司I现场)Thy1磁带(Lüthi等人,1997年;Sturchler-Pierrat等人,1997年;Wiessner等人,1999年). 对于微量注射,线性不是分离出包含无质粒载体序列的转基因的I DNA片段。注射到纯合C57BL/6小鼠卵中。使用柱纯化(德国希尔登市齐根)尾部DNA,通过PCR进行基因分型(寡核苷酸与用于克隆人类α-突触核蛋白cDNA的寡核苷酸相同;5分钟,95℃;30秒,95℃,30个周期;1分钟,60℃;1分,72℃;10分钟,72℃)。
Northern印迹分析。使用大脑总RNA进行Northern blot分析(TriZol方法;每个凝胶条加载10μg)。探针为364(图。1一,探头A)或111 bp的人α-突触核蛋白cDNA(图。1一,探头B; 不像探头A,探头B与编码α-突触核蛋白相关家族成员的cDNA缺乏同源性)(拉维丹,1998年)或小鼠Thy1 3′非翻译序列的600 bp(Lüthi等人,1997年)(图。1一,探头C). 采用标准程序。
图1。 转基因表达。一,转基因示意图。罗马数字指内源性小鼠Thy1基因的外显子。盒代表一个完整的α-突触核蛋白编码cDNA探针(一),一个C末端111 bpα-突触核蛋白cDNA探针(B类)和Thy1 3′非翻译区探针(C类) (Lüthi等人,1997年).箭头代表用于基因分型的PCR引物。B类使用探针A和C57BL/6非转基因小鼠的脑RNA对10μg总脑RNA进行Northern blot分析(车道1),一行9813鼠标(车道2),一行9956鼠标(车道3)和9832系的单转基因雄性(车道4). 这个箭头指转基因mRNA水平钢筋标记内源性小鼠α-synuclein mRNA的位置。C类,免疫印迹分析显示,9956系每一代小鼠脑匀浆中的α-突触核蛋白水平增加(车道1), 9813 (车道2),9832号线F1单只雄性(车道3)和C57BL/6(车道4). 所用的多克隆兔抗体(Chemicon)可检测小鼠和人类α-突触核蛋白。D类、使用抗体LB509(专门检测人类而非小鼠α-突触核蛋白;Zymed)和系9956的免疫印迹(车道1),9813行(车道2)和C57BL/6(车道3).E类,F类,现场9813系小鼠矢状脑切片的杂交(E类)和一只C57BL/6鼠标(F类)使用35探针A对应的S标记cRNA(一).G公司,H(H),现场9813系小鼠水平脑切片的杂交(G公司)和一只C57BL/6鼠标(H(H))使用35S标记的cRNA对应于探针B(一).
免疫印迹分析。用于Western blot分析,14000×克使用半脑匀浆的上清液部分[在2 ml E缓冲液(50 m)中均质米Tris-HCl,pH7.4,1%NP-40,0.25%Na-脱氧胆酸盐,150 m米氯化钠,1米米EDTA和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(德国曼海姆Boehringer Mannheim)放在冰上30分钟]。每条通道装载15、25或50μg蛋白质,并在15%SDS-PAGE上分离。在印迹和阻断非特异性结合后,用兔抗α-突触核蛋白多克隆抗体(1:1000;AB5038;Chemicon,Temecula,CA)培养细胞膜,然后用碱性磷酸酶(AP)结合的抗兔IgG(1:500000;AO418;Sigma,St.Louis,MO)或抗人α-突触核蛋白特异性抗体LB509(1:5000;Zymed,San Francisco,CA),其次是AP结合抗鼠IgG1(1:40000;Sigma)和化学发光检测(Clontech)。
现场杂交。转基因与内源性α-synuclein表达的空间分布模式由就地杂交(Wiessner等人,1999年). cRNA使用T7-RNA聚合酶和364 bp cDNA模板(完整的人类α-突触核蛋白编码区)或111 bp cDNA模版(对应于人类α-联核蛋白103–140氨基酸编码区)转录。
免疫细胞化学。给小鼠(3.8–6个月龄)注射戊巴比妥(50 mg/ml戊巴比妥;雅培实验室,伊利诺伊州北芝加哥)并经心灌注0.01米PBS,然后在PBS中加入4%的多聚甲醛。将一个大脑半球、脊髓和后肢肌肉包埋在石蜡中,并切割成4μm厚的切片。使用抗α-突触核蛋白鼠单克隆抗体(1:500;S63320;肯塔基州列克星敦的转导实验室)、生物素化抗鼠IgG(1:500,E0464;丹麦哥本哈根达科)、,以及抗生物素-生物素过氧化物酶法(Elite标准试剂盒SK6100;Vector Laboratories,加利福尼亚州伯灵盖姆)。此外,还使用了以下抗体:AT8单克隆抗体,可检测成对螺旋丝和过度磷酸化τ(1:1000;BR-003;Innogenetics,Zwijndrecht,Belgium);神经丝200 kDa特异性单克隆,检测正常和磷酸化神经丝(1:100;NCL-NF200;英国纽卡斯尔新墨西哥州);神经丝M和H单克隆(磷酸化形式;1:500;MAB 1592;Chemicon)。染色(也包括刚果红和硫黄素S)如下所述Sturchler-Pierrat等人(1997年)。脱蜡切片用于Campbell–Switzer银染色(Campbell等人,1987年),Holmes–卢克索染色(福尔摩斯,1943年),以及用兔抗泛素Ig组分(1:200;Z0458;Dako)、兔抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)Ig组分(1:500;Z0334;Dako)、抗磷酸酪氨酸小鼠单克隆抗体(1:1500;P3300;Sigma)和抗人α-突触核蛋白特异性小鼠单克隆抗体(LB509;1:2000;18-2215;Zymed)进行免疫染色(Baba等人,1998年;Jakes等人,1999年). 在与抗α-突触核蛋白孵育前,用浓缩甲酸处理石蜡切片5分钟,在90°C下微波加热60分钟,在抗GFAP和抗磷酸酪氨酸孵育之前,在90℃下微波加热30分钟,以及在抗泛素之前,用蛋白酶处理(37°C,30分钟),可增强抗原性。用正常血清阻断非特异性结合位点。使用亲和素-生物素过氧化物酶法(Elite标准试剂盒SK6100;Vector Laboratories)和DAB底物(1718096;Boehringer Mannheim)或Vector Laboratories AEC底物(SK-4200)观察结合抗体。神经肌肉接头处神经丝和突触素的免疫染色和共聚焦分析如下。老鼠被麻醉致死。切除趾长伸肌(EDL)和比目鱼肌,并用Alexa Fluor 488标记的α-银杏毒素(F-15培养基中1:1000;分子探针,Eugene,OR)在4°C下染色2小时,然后用PBS冲洗几次。然后用冷甲醇(−20°C)固定肌肉并在4°C下用封闭溶液(含5%马血清、1%BSA、1%Triton X-100和0.1%叠氮化钠的PBS)渗透2小时。随后用针对神经丝(封闭溶液中1:500;Sigma)或突触素(封闭溶液:1:200;Dako)的一级抗体培养组织,并在4°C下培养40小时。用PBS冲洗几次后,用Cy3标记的山羊抗兔IgG(封闭溶液中1:1000;宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch)在4°C下培养肌肉过夜。肌肉用PBS彻底冲洗,并用Citifluor(Plano)将其固定在玻璃载玻片上。用共焦显微镜检查组织(TCS-NT型;德国努斯洛赫莱卡)。
免疫电子和电子显微镜。对于免疫电子显微镜,转基因和野生型C57BL/6小鼠经心灌注1.5%苦味酸、0.1%戊二醛和4%多聚甲醛的混合物米磷酸盐缓冲液,pH 7.4。振动组切片用α-突触核蛋白抗体(LB509;1:2000)自由漂浮染色,在升序的乙醇和丙酮系列中脱水,并在Embed-812(电子显微镜科学,宾夕法尼亚州华盛顿堡)的玻璃载玻片和盖玻片之间平铺。然后解剖脊髓碎片,从组织表面切下超薄切片,将其安装在铜网格上,并用蔡司(德国Oberkochen)EM900显微镜进行分析。在常规电子显微镜下,将小鼠麻醉并用冷盐水经心灌注,然后用4%多聚甲醛和0.1%戊二醛灌注0.1米cacodylate缓冲区。从脑干和脊髓切下小组织块,在4°C的相同缓冲液中浸泡固定12小时,并进行环氧树脂包埋,制备超薄切片并放置在200米厚的铜网格上,用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。
神经肌肉接头的银酯酶染色。对腓肠肌应用联合银酯酶技术。这块肌肉刚刚被解剖,经过10米的短暂清洗米EDTA在PBS中,组织被安装用于冷冻切片和切割(50μm纵向切片)。在80米内冲洗滑梯米安装段前PBS中的EDTA。切片在37°C下干燥30–120分钟,浸泡在硫酸钠(29%)中3分钟,在H中清洗2O、 并在37°C的乙酰胆碱酯酶染色液中培养25分钟(佩斯特朗克和德拉克曼,1978年). 在H中清洗后2O、 切片分别在70%和100%乙醇中脱水1~2min。接下来,将切片固定在缓冲福尔马林盐水中(佩斯特朗克和德拉克曼,1978年)室温下30分钟,在H中清洗2O、 并在含有1%吡啶(v/v)的10%水合氯醛(w/v)中于37°C预处理30分钟。在H中清洗后2O、 将切片在新制备的含有1%硫酸铜的20%硝酸银溶液中孵育。将碳酸钙分别添加到每个载玻片中。在37°下培养40分钟,然后丢弃溶液,在H中清洗2O、 分别在1%对苯二酚和5%亚硫酸钠溶液中培养10秒和3-5分钟。在H中清洗后2O、 将切片固定在5%硫代硫酸钠中(2-5分钟),清洗(H2O) ,在0.2%四氯金酸钠中调色5分钟(新鲜加入一滴冰醋酸后),清洗(在H中2O) ,浸泡在1%草酸中20–120秒,清洗(H2O) ,再次固定在5%硫代硫酸钠中,清洗(H2O) ,在乙醇中脱水,风干,在二甲苯中冲洗,风干并安装。
旋转杆。小鼠每天训练两次,连续两天在旋转杆上停留150秒(速度为12 rpm)。随后,每周一次、三次和三种不同速度(即12、24和36 rpm)在旋转杆上对动物进行测试。在所有这些实验中,用于测量耐力性能的截止时间为60秒。特定测试日绘制的平均耐力性能是给定速度下三个性能的平均值。使用重复测量方差分析对数据进行统计评估。
结果
共产生了6个转基因C57BL/6系,每个系都表达不同水平的Thy1αSNA53T转基因。本报告中描述的两个品系(9813和9956)表达转基因mRNA水平(图。1B类3个品系的mRNA水平为9832>9813>9956;其他未显示),每一种都导致大脑中α-突触核蛋白水平增加(图。1C类抗体与小鼠和人α-synuclein交叉反应;图。1D类,抗体仅检测人类α-突触核蛋白)。在这两个品系中,转基因表达都发生在端脑、脑干和脊髓的神经元中,如9813品系小鼠大脑的典型矢状截面所示(图。1E类).现场用与人类α-突触核蛋白全长编码序列相对应的cRNA探针进行杂交(图。1一,探头A),显示了转基因mRNA表达模式叠加在内源性小鼠α-突触核蛋白的表达模式上,后者主要在端脑中表现明显(图。1F类). 还使用与编码人类α-突触核蛋白C端37个氨基酸的111 bp相对应的cRNA探针专门监测转基因表达模式(图。1一,探头B). 该探针与小鼠cDNA的同源性为87.5%,但每10–20 bp出现一次核苷酸差异。结果,如一对水平切片所示,该探针在非转基因C57BL/6小鼠大脑中未检测到背景以上的信号(也通过Northern blot分析验证;数据未显示)(图。1H(H))而转基因大脑中的信号具体反映了转基因表达模式(图。1G公司).
在9813和9956系的所有小鼠中,我们观察到早发(>3周龄)和运动能力逐渐下降。在第三个独立创始人(第9832行)的单个转基因F1雄性中观察到更严重的运动障碍。这只雄性在5周大时死亡,断线。9832单只F1雄性大鼠的脑转基因mRNA水平(图。1B类,车道4)取代了第9813行中检测到的内容。
在旋转杆实验中测量了电机性能的逐渐下降。一组转基因(n个=7)与非转基因(n个=12)对9813品系的同窝雄性进行比较,从40天龄开始到200天龄(图。2). 结果表明,转基因小鼠的运动能力逐渐下降,并且在旋转杆上的耐力急剧下降。在比较衰老(40–200天)雌性转基因时,观察到类似的差异和效果(n个=15)与非转基因(n个= 8; 数据未显示)9813系小鼠。方差分析表明基因型的影响非常显著(第页<0.001),以及显著的年龄、速度和基因型交互作用(第页< 0.005; 重复测量两个试验因子的方差分析)。对两组(转基因和野生型)的性能曲线的比较表明,在12和36 rpm的速度下,转基因动物的性能差异显著(第页<0.001)。
图2。 转基因小鼠的旋转杆性能。从40天开始到200天,转基因(n个=7)和C57BL/6非转基因(n个=12)对同窝雄性小鼠在旋转杆上的耐力进行测试。每周对小鼠进行测试,显示它们在两种不同转速下的性能,即转速1(12 rpm)和转速3(36 rpm)。C57BL/6小鼠在两种速度下表现出最大的耐力表现(60秒),如速度3(36 rpm)所示。
在所有A53T转基因小鼠中发现的显著运动表型和运动神经元中基于Thy1的转基因的记录表达(Aigner等人,1995年)促使我们更仔细地检查这些细胞的病理变化。在脊髓前角,~80%的运动神经元表达人类α-突触核蛋白A53T突变蛋白,如人类α-联核蛋白特异性抗体LB509的免疫反应所示(Baba等人,1998年;Jakes等人,1999年). 针对转基因小鼠,这些细胞中的许多表现为弥漫的核周α-同核蛋白染色(图。三一)有些还表现出路易样病理(图。三C类,D类)具有明显的泛素免疫反应(图。三D类). 此外,使用Campbell–Switzer吡啶银染色技术(Campbell等人,1987年)(图。三C类),一种用于检测人类脑组织路易型变化的常规灵敏方法(Braak和Braak,1999年;Sandmann-Keil等人,1999年),显示强烈染色。这些结果表明,当表达人类α-突触核蛋白A53T突变体时,(啮齿动物)运动神经元容易发生路易样改变。其他与运动神经元病理学发展相关的变化(也见于其他受影响的大脑区域;数据未显示)包括星形胶质细胞增生症(图。三E类)和小胶质细胞激活(图。三F类).
图3。 转基因小鼠脊髓中的路易样病理学。A–H对应于通过前角的截面。一转基因小鼠脊髓切片中运动神经元的核周和近端突起α-突触核蛋白染色,但C57BL/6中没有(B类).C类,Campbell–瑞士染色的转基因小鼠脊髓运动神经元,也用抗泛素抗体进行免疫反应(D类).E类,G公司抗-GFAP和抗磷酸酪氨酸抗体染色(F类,H(H))转基因(E类,F类)与非转基因(G、 H(H))C57BL/6脊髓显示星形胶质细胞性胶质增生症(E类)和反应性小胶质细胞(F类)针对转基因组织。比例尺:A–D(英寸D类),20微米;E–H(E–H)(英寸H(H)),20微米。放大倍数:A–D, 250×;E–H(E–H), 200×.
脊髓根(图。4一)和肌肉中的神经纤维束(图。4C类)α-突触核蛋白免疫染色。脊髓根轴索变性明显,神经纤维断裂并分割成髓鞘的椭圆形(图。4B类). 此外,骨骼肌含有小的角纤维(图。4D类,箭头),表明神经源性肌萎缩,与在取自9813系小鼠的腓肠肌NMJ处观察到的不同程度的去神经支配和神经病理学一致(n个=7,年龄6.5个月;图。4E–J公司). 根据个体小鼠的不同,10-40%的突触失神经,末端前神经变薄,和/或至少50%的神经支配突触出现肿胀。在另外两块肌肉中也观察到了病理变化,即EDL(包含快速收缩肌纤维)和比目鱼肌(主要包含缓慢转换肌纤维)(图。5). 虽然α-银环蛇毒素显示的突触后装置的结构在转基因小鼠和野生型小鼠中相似,但突触前运动神经元显示出明显的退化迹象。在转基因但非野生型C57BL/6窝友中,NMJ通常显示神经丝染色减少,表明运动神经元即将从突触中收缩(图。5C类,D类). 此外,运动神经更近端的神经丝染色不连续(数据未显示)。突触囊泡蛋白突触素染色支持运动神经元放弃突触位点的假设(图。5一,B类). 在野生型动物中,突触素与突触后乙酰胆碱受体(AChRs)的轮廓相匹配(图。5一). 在转基因动物中,突触素呈点状且较薄,因此它没有覆盖AChR聚集体的整个区域(图。5B类). 在所有检查的肌肉中观察到包括NMJ失神经在内的神经变性的发现表明,人类α-突触核蛋白的转基因表达影响了突触维持的普遍机制。再加上在中枢区域检测到的神经病理学变化(见下文),包括一些与运动功能有关的变化(例如苍白球;数据未显示),这些发现为观察到的复杂运动能力下降提供了可能的解释。
图4。 神经肌肉变性。一,带有人类α-突触核蛋白免疫反应性(LB509抗体)神经纤维的脊髓根纵切面,该神经纤维是转基因小鼠特有的(C57BL/6未显示)。B类Holmes–Luxol染色的脊神经根显示轴突变性,髓鞘破裂并分割成椭圆形(“消化腔”)。C类,肌肉中的神经纤维交叉束显示出强烈的人类α-突触核蛋白特异性(抗体LB509)免疫反应轴突。D类,含有小角纤维的横切肌纤维束,与失神经一致(箭头),表明神经源性肌肉萎缩(Holmes–Luxol染色)。比例尺:A–D,20微米。E–J,C57BL/6中的腓肠肌内侧NMJ(E类)和两个不同的9813系小鼠(小鼠1,F–H(飞行高度); 鼠标2,我,J型),6.5个月龄。银酯酶的联合反应揭示了黑色和突触乙酰胆碱酯酶反应产物(星号)英寸蓝色.转基因小鼠中的NMJ表现出神经病变,包括终末前神经肿胀(F类,箭头)临终前神经变细(G公司)神经从突触区收缩(H(H)),以完成去神经支配(我,箭头). 一种纤细且扭曲的神经芽(箭头)再生为失神经突触,如图所示J型.深色椭圆(英寸我和J型)可归因于核的背景标记。比例尺,40μm。放大倍数:一, 100×;B类,C类, 400×;D类, 200×;E–J公司, 400×.
图5。 比目鱼肌神经肌肉接头的神经变性。一–D类,通过AChRs的α-银杏毒素染色观察突触后装置的结构(绿色),与C57BL/6相似(一,C类)和转基因(B类,D类)老鼠。显示α-银环蛇毒素的成本(绿色)和突触素(一,B类),以及α-银环蛇毒素和神经丝(C类,D类). 比例尺,3μm。放大倍率,700×。
为了更仔细地研究大脑中的病理变化,年龄在12周及以上的两组动物(n个=19),采用常规用于评估人脑Lewy病理学的免疫组织化学技术进行检测(Gai等人,1995年;Forno,1996年;Spialantini等人,1997年;Wakabayashi等人,1997年;Baba等人,1998年;Ince等人,1998年;Mezey等人,1998年;武田等人,1998年). 在转基因小鼠大脑中,端脑中的许多神经元(图。6一,B类,D类,E类)和脑干(图。7B类,C类)在细胞体和树突中显示出强烈的α-突触核蛋白染色。当使用特异性检测人类而非小鼠α-突触核蛋白的抗体时,可以看到这种模式(图。6一,D类; 对于阴性对照,见图。三B类). 当使用检测小鼠和人类α-突触核蛋白的抗体时,也可以看到这种情况(图。6B类,E类,7B类,C类)与内源性小鼠α-突触核蛋白在非转基因小鼠神经系统中的轴突和突触前分布形成鲜明对比(图。6C类,F类).
图6。 转基因小鼠脑中α-突触核蛋白的表达。A–F海马CA1区,α-突触核蛋白染色(一,B类)和新皮质(D类,E类)转基因小鼠与非转基因C57BL/6小鼠相应区域的比较(C类,F类). 与转基因脑不同,C57BL/6海马在锥体层CA1锥体细胞体中缺乏α-突触核蛋白免疫反应性(圣保罗。). 在这两只小鼠中,免疫染色在辐射层中都很突出(标准.r。). 放射层中免疫反应强烈的神经突(即CA1细胞树突)是转基因脑特有的。C57BL/6脑中类似的树突状结构看起来苍白,没有α-突触核蛋白。免疫染色为石蜡切片(一,D类; 人α-突触核蛋白特异性抗体LB509)和自由漂浮脑切片(B类,C类,E类,F类; 抗体检测小鼠和人α-synuclein)。比例尺:一,D类(英寸D类),20μm(250倍放大);B、 C、E、F(英寸F类),20μm(200倍放大)。
图7。 转基因小鼠和人PD脑中的α-突触核蛋白和泛素。A–F,所示为人类PD黑质切片(一,D类)和转基因小鼠脑桥网状核(B类,C类,E类,F类)α-突触核蛋白免疫染色(A–C)和泛素(D–F型). 注意,在人和小鼠神经元中,α-突触核蛋白和泛素的神经节染色均显著。路易样神经突由箭头人类PD脑中的黑质细胞显示路易体包涵体(一,箭头).G公司,H(H),小脑核内同一组细胞的两个连续3μm石蜡切片,α-突触核蛋白(LB509抗体;G公司)和泛素(H(H)).G公司,几个神经元表现出类似程度的核周α-同核蛋白免疫反应。许多横切的神经突也被染色。H(H),在三个分组的细胞中只有一个和附近的轴突中可见丰富的泛素免疫反应性(箭头在里面H(H)和G公司表明同一细胞和突起呈α-突触核蛋白免疫反应)。此外,与G公司,英寸H(H)少数这样的结构(深色和点状)显示出泛素的免疫反应性。比例尺:一,D类,20μm(放大倍数:一, 320×;D类, 630×);B、 C、E–H(英寸H(H)),20μm(放大400倍)。
α-突触核蛋白抗体对神经元的核周和神经炎染色增加是患病人脑的一个特征(Spialantini等人,1997年;Wakabayashi等人,1997年;Baba等人,1998年;Irizarry等人,1998年;Mezey等人,1998年;Spialantini等人,1998年;Braak等人,1999年). 与人类PD脑中受影响的神经元相比(图。7一)转基因小鼠脑内α-突触核蛋白染色显示突起的异质性变化,与人脑中观察到的变化非常相似(Forno,1996年;Wakabayashi等人,1997年;Spialantini等人,1997年;Baba等人,1998年;Ince等人,1998年;Irizarry等人,1998年;Mezey等人,1998年;Spialantini等人,1998年;武田等人,1998年;Braak等人,1999年). 经常观察到的变化包括近端和远端神经炎节段的香肠样扩张,粗或细的线状内含物,以及珠状或纺锤状神经炎(图。7B类,C类). 如上图所示,它们在包括口桥中央核、前庭外侧核、小脑深部核、顶盖板深部在内的区域最为突出和常见(图。三)脊髓中的运动核团。
泛素免疫染色也经常用于人脑路易病理的可视化(Gai等人,1995年;Forno,1996年;Spialantini等人,1997年;Wakabayashi等人,1997年;Baba等人,1998年;Ince等人,1998年;Irizarry等人,1998年;Mezey等人,1998年;Spillantini等人,1998年;武田等人,1998年;Braak等人,1999年;Gómez-Tortosa等人,2000b). 在转基因小鼠中,营养不良的神经突和细胞体偶尔会被泛素强烈染色(图。7E类,F类). 染色的神经突显示出形态学特征(图。7E类,F类)与人脑中的情况类似(图。7D类)路易病理学(Gai等人,1995年;Forno,1996年;Spialantini等人,1997年;Wakabayashi等人,1997年;Baba等人,1998年;Ince等人,1998年;Irizarry等人,1998年;Mezey等人,1998年;Spialantini等人,1998年;武田等人,1998年;Braak等人,1999年). 然而,与α-突触阳性细胞和神经突相比,泛素免疫染色的神经元细胞体和神经突较少出现(图。7G公司,H(H))主要局限于细胞和轴突中α-突触核蛋白免疫病理学表现最明显的区域,包括口桥中央核、前庭外侧核、小脑深部核、顶盖板深部和脊髓运动核。在这些区域中的每一个,神经元和轴突均未显示出明显的泛素免疫染色、弱染色(具有不同程度的点状细胞质和/或核周免疫标记)或强泛素免疫着色,如两个连续的3μm石蜡切片所示(图。7G公司,H(H)). 这些切片显示小脑核内的同一组细胞和神经炎结构,α-突触核蛋白染色(图。7G公司)和泛素(图。7H(H)).
与α-突触核蛋白免疫病理学相比,路易小体和路易神经突的人脑中泛素的发生率也较低(Forno,1996年;Ince等人,1998年;Irizarry等人,1998年;Spialantini等人,1998年;武田等人,1998年;Braak等人,1999年;Gómez-Tortosa等人,2000b)这表明泛素化可能是小鼠和人类病理发展的晚期事件。奇怪的是,α-synuclein免疫病理学的一些但不是所有小鼠都存在泛素化现象,并且在两个品系(9813和9956)和性别中都观察到了这种现象。例如,在同时进行病理处理的9813系五只6个月大的转基因小鼠的一组中,五只动物中只有两只在限制性脑区表现出显著的泛素免疫病理学。泛素化出现的随机方式使我们比较了不同小鼠和每个品系中性别之间的转基因mRNA水平,但未检测到个体或性别之间的差异(数据未显示)。显然,除了这些或菌株遗传背景之外的因素(所有小鼠都是C57BL/6)在这种现象中起作用。
最后,用免疫电子和常规电子显微镜对人类α-同核阳性神经元内含物的超微结构进行了表征。与非转基因C57BL/6小鼠相比,该小鼠未显示出LB509人α-突触核蛋白特异性抗体的染色(数据未显示;供参考,见图。三B类),转基因小鼠的神经元显示出含有α-突触核蛋白的颗粒沉积物(图。8一,B类). 使用常规染色的超薄切片,转基因但非转基因小鼠的脑干和脊髓组织显示树突(通常是扩张的)含有电子密度的精细结构颗粒材料(图。8C类). 路易病人脑中的α-突触核蛋白免疫反应性纤维成分(Spialantini等人,1997年;Wakabayashi等人,1997年;Goedert等人,1998年;武田等人,1998年)没有看到。
图8。 Thy1αSNA53T小鼠神经元的超微结构特征。图示为免疫电子(一,B类)和常规显微照片(C类)脊髓灰质。一,B类,9813系五个月龄Thy1αSNA53T小鼠。免疫电子显微镜对人类而非小鼠α-突触核蛋白(LB509抗体)进行了特异性染色。一,通过一个小树突状附属物的纵切面显示树突状细胞质中元素的显著染色。B类,免疫标记的横切面树突,显示含有α-突触核蛋白结构的细颗粒组成,偶尔附着在内质网和线粒体上。C类,一只4个月大的转基因小鼠脑干切片的常规染色电子显微照片显示,树突轮廓中有细颗粒电子致密物质,最明显的是位于右上角位于三个较大和一个较小的有髓轴突之间。比例尺:一,1.7μm(4500倍放大);B类,0.6μm(12000倍放大);C类1.9μm(5000倍放大倍数)。
路易病的绝大多数人类病例是特发性的,除A53T和A30P外,编码区的α-突触核蛋白突变在家族性或散发性帕金森病队列中未发现(Chan等人,1998年;Farrer等人,1998年;法国帕金森病研究小组,1998年;Vaughan等人,1998年). 为了测试在小鼠身上观察到的病理学是否是α-突触核蛋白A53T突变体所特有的,在这种情况下,它对特发性疾病几乎没有影响,我们还产生了转基因系(n个=5)表达野生型人α-突触核蛋白。野生型人类α-突触核蛋白(αSNwt)的表达与A53T突变体一样受小鼠Thy1调节序列的控制(图。1一). 其中一个品系(S969)的小鼠表现出运动表型,并表达了与9813品系Thy1αSNA53T小鼠类似的脑转基因mRNA和蛋白质水平(数据未显示)。脑和脊髓中含有许多神经元,细胞周和树突中有明显的α-突触核蛋白免疫染色(图。9). 据报道,Thy1αSNA53T小鼠的中枢神经系统中具有路易样特征的细胞和神经突起显著且常见。所示的两个典型例子来自中脑深核(图。9D类)和脊髓(图。9E类,F类). 在一些失神经50%以上的区域,腓肠肌神经肌肉接头出现,并且在剩余的终板处经常出现出芽,就像在A53T小鼠中一样(数据未显示)。总之,与其A53T突变体一样,野生型人类α-突触核蛋白的表达可以在中枢神经元中引起致病性。
图9。 Thy1αSNwt的免疫病理学。一大脑皮层深层神经元显示出显著的体细胞和轴皮质α-突触核蛋白免疫染色。B类海马CA1区在主细胞体和树突中显示显著的α-突触核蛋白免疫染色。C类海马CA3区。注意一些锥体细胞在未染色细胞旁边有明显的细胞质染色,苔藓纤维末端有免疫染色。D类,中脑深部核,胞体和近端树突中有一个神经元显示出较强的α-突触核蛋白免疫染色。注意附近有未染色的轴突。E类脊髓纵切面,α-突触核蛋白免疫染色运动神经元和扩大的近端树突(箭头).F类,与中相同的区域E类在一些神经元的细胞质中显示出泛素免疫染色。比例尺:一,B类(英寸B类),20微米;C类,D类(英寸D类),20微米;E类,F类(英寸F类),20微米。放大倍数:一,B类, 100×;C类,D类, 250×;E类,F类, 320×.
脚注
我们分别感谢Hanny Richener、Claudia Falk、Edgar Kaeslin博士、Corina Schneider和Areejittra Soontornmalai、Rita Meyerhofer和Reinhard Bergmann博士在克隆、DNA微注射、组织学、行为分析和统计建议方面的协助。
信件应按上述地址寄送至Herman van der Putten。电子邮件:p_herman.van_der_putten公司{点击}pharma.novartis.com.