摘要
最近的证据表明,中风后血脑屏障(BBB)的恢复和BBB不通透性的重建是不完整的。这可能会影响中风恢复,增加再次中风的风险,并成为发展为血管性痴呆的坚实基础。尽管越来越多的证据已经明确了急性卒中患者血脑屏障破裂期间紧密连接(TJ)变化的形态学改变和潜在机制,对于亚急性或慢性发现的BBB“渗漏”的改变类型和机制知之甚少。目前的研究检查了雄性小鼠和人类两性中风慢性期“BBB渗漏”期间的BBB结构改变。我们发现claudin-1 mRNA和蛋白质显著上调,而claudin-5的表达下调。对缺血后脑内皮细胞和过度表达克劳丁-1的细胞进行光漂白分析后,形态学和生化以及荧光共振能量转移和荧光恢复表明,新合成的克劳丁-1存在于细胞膜上(~45%),与闭塞小带-1(ZO-1)建立了相互作用,被并入TJ复合体,并正在构建亲同性顺式-和反式-互动。在TJ复合体中出现的克劳丁-1减少了克劳丁-5链(嗜同性克劳丁-5顺式-和反式-相互作用)和影响claudin-5掺入TJ复合物的claudin-5/ZO-1相互作用。此外,克劳丁-1的诱导与内皮促炎表型相关。用一种特殊的C1C2肽靶向claudin-1可改善慢性卒中患者的脑内皮屏障通透性和功能恢复。这项研究强调了缺血后屏障形成中的一个潜在“缺陷”,这可能是长期血管泄漏的基础。
重要性声明虽然在正常血脑屏障(BBB)很少表达,但克劳丁-1在病理条件下表达。通过分析中风后人类和小鼠的血液微血管,我们发现claudin-1在渗漏的脑微血管中高度表达。我们的结果表明,claudin-1结合在BBB紧密连接复合体中,阻碍了BBB的恢复,并在中风后恢复过程中导致BBB泄漏。用克劳丁-1肽靶向克劳丁-1可提高脑血管内皮屏障的通透性,从而改善中风后的神经功能恢复。
材料和方法
脑组织。
来自中风患者和健康对照的人类死后脑组织样本来自人类脑和脊髓液资源中心(西洛杉矶医疗中心,加利福尼亚州洛杉矶)和西奈山国立卫生研究院(NIH)脑组织库(纽约州纽约),该项目由国家神经疾病和中风研究所/国立卫生研究院国家心理健康研究所、国家多发性硬化协会和退伍军人事务部赞助。对照脑切片来自ProSci Incorporated,无中风病理。大脑样本的详细信息包括在图1-1这些研究获得了密歇根大学机构审查委员会的伦理批准。新鲜冷冻组织用4%多聚甲醛固定,冷冻保存,15μm切割;石蜡包埋脑组织在4μm处切割。采用免疫组化和PCR阵列分析中风和对照脑组织。
短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)。
所有实验程序均由密歇根大学动物护理和使用委员会批准。实验在10至12周龄C57BL/6雄性小鼠(杰克逊实验室)上进行。用氯胺酮和木聚嗪(100和10 mg/kg,i.p.)麻醉小鼠。在整个实验过程中,使用加热毯和加热灯将体温保持在37±0.5°C。如前所述,右tMCAO采用腔内灯丝技术诱导局灶性脑缺血,并经激光多普勒血流探头证实。tMCAO 30分钟后,通过拆线重新灌注小鼠。假手术动物接受了除咬合外的所有手术。生理参数(pO2,pCO2在tMCAO之前、期间和之后监测pH值、血糖、脑血流)。根据我们对生理参数和tMCAO后生存率的评估,选择再灌注时间1–28天。
由盲法研究人员使用改良的神经严重程度评分(mNSS)评估神经功能缺损。mNSS对神经功能的评分为14分,包括运动(肌肉状态和异常运动)、感觉(视觉、触觉和本体感觉)、反射和平衡测试。在基线检查时以及tMCAO后第1、7、14、21和28天对每只小鼠进行角落测试(感觉运动功能测试)。允许小鼠走到一个角落(60°角),退出方向(右或左)由两名对实验设计一无所知的独立研究人员记录。进行了10次试验(每次试验间隔1分钟),并计算了同侧(右)转弯的百分比。
梗死体积的形态测量。
在tMCAO后1至28天内处死动物,取脑,固定,冷冻保护,并在冠状面冷冻切片。为了测量梗死体积,选择了前角的切片进行Nissl和Fluoro-Jade B染色。根据标准方案,从前角(+4.0至−6.0 mm)以2.0 mm的间隔收集五个冠状切片(20μm),并用0.1%甲酚紫(Sigma-Aldrich)染色。对于Fluoro-Jade(Millipore)染色,将载玻片在用0.1%乙酸稀释的Fluoro Jade B中孵育30分钟,然后冲洗并安装。
每个切片的梗死面积由计算机图像分析系统(ImageJ)确定,梗死体积由切片之间的距离乘以。梗死体积计算如下:[对侧半球体积−(同侧半球体积–测量的损伤体积)]。所有测量均以盲法进行,并由三名独立研究人员分别进行分析。
含水量。
用湿/干重法测量脑含水量。湿称缺血和非缺血半球样品,然后在100°C下烘干48 h,然后重新称重。脑含水量(%)计算如下:[(湿重-干重)/湿重]×100%。
小鼠微血管分离。
为了分析缺血/再灌注(I/R)损伤,分离了半暗带和同侧半球的脑微血管。半影标记为用“pinchout”方法收集的缺血性病变周围直径1mm的区域(Sladojevic等人,2014年). 还收集了相应的对侧区域和对侧半球。为了分离微血管,将脑组织机械分离并在Dounce匀浆器中匀浆。用Hank平衡溶液清洗后,用18%右旋糖酐溶液清洗髓鞘和红细胞(Sladojevic等人,2014年). 然后用0.25%胰蛋白酶在37°C下消化分离的血管5分钟,以去除血管周围细胞。使用抗CD31(脑内皮细胞,1:200;BD Bioscience)、GFAP(星形胶质细胞,1:500;Sigma-Aldrich)、PDGFRβ(周细胞,1:100 Abcam)和Iba1(小胶质细胞,1:1100;Abcam。该方案产生了99.99%的“干净”(无血管周围细胞)血管。
小鼠脑微血管内皮细胞(mBMEC)培养。
mBMEC是使用前面描述的改进方案制备的(Sladojevic等人,2014年). 用抗CD31涂层磁珠(Dynabeads)筛选细胞。该方案通常产生纯度为~99%的原代内皮细胞培养物(通过抗CD31抗体的免疫细胞化学测定)。
小鼠脑内皮细胞系(mBECL)购自Angio-Proteomie,并按照制造商的建议进行维护。
体外I/R受伤。
mBMEC和mBECL受到氧葡萄糖剥夺(OGD)损伤(Dimitrijevic等人,2006年). 在OGD培养基(DMEM无葡萄糖溶液,用厌氧气体混合物净化,5%CO)存在的情况下,将培养物放置在厌氧室(Coy实验室)中,从而引发损伤2/95%牛顿2和10%H2去除残余氧气),在37°C下诱导5小时的缺血样条件。然后,从培养箱中取出培养物,用含氧DMEM交换培养基,并将细胞置于37°C、5%CO的培养箱中2-含有正常氧气(21%O2)模拟0–48小时的再灌注。对每组实验,进行存活率测定(乳酸脱氢酶测定;Promega)。实验中仅使用OGD暴露后细胞活力>95%的细胞培养物。
融合蛋白。
全长开放阅读框(ORF)claudin-1、claudin-5和ZO-1是从商用的无标记cDNA结构中克隆出来的。将ORF克隆到pmCherry-C1载体和pAcGFP-C1输注准备载体中,以创建N末端融合荧光蛋白(Takara)。使用Qiagen质粒midiprep试剂盒从单个转化的恒星感受态(Takara)菌落中分离出质粒DNA。DNA序列经Sanger测序验证。
细胞处理和转染。
使用Torpedo将融合蛋白单或双转染到mBEC和mBECL中DNA(伊比迪)。在5天后和/或建立稳定细胞系后评估转染蛋白的表达谱/水平。通过转染Claudin-1 shRNA质粒DNA(最终浓度0.5μg;Sigma-Aldrich)或claudin1 siRNA(siclaudin1RNA#si64036,#64037,#64048),在5 n时,均能去除Claudin-1shRNA米最终浓度;Thermo Fisher Scientific)靶向三个不同的claudin-1区域24小时。作为对照,用非靶向shRNA控制质粒(0.5μg;Sigma-Aldrich)或shRNA(sicontrol#2,5n)转染细胞米; 赛默飞世尔科技公司)。
Claudin-1肽治疗。
如前所述合成Claudin-1肽(C1C2)(Staat等人,2015年). 对于在体外实验中,将claudin-1肽以1μg/ml溶解在培养基(DMEM)中,并在再灌注6和12小时的两种实验条件下应用于mBMEC。细胞活力测定表明,用克劳丁-1肽处理后,细胞活力>99%。体内在tMCAO后第3、5、7和10天,将克劳丁-1肽溶解在无菌0.9%氯化钠中,并腹腔注射(5μg/kg)。小鼠随机分为对照肽(cp)组和克劳丁-1肽(C1C2)组,在tMCAO后3或5天开始的再灌注期间,用肽(5μg/kg)连续治疗5天。未观察到claudin-1和对照肽的副作用。
细胞分馏、共免疫沉淀和蛋白质印迹。
对梗死周围区域(半影区)和暴露于OGD复氧条件下的mBMEC的分离脑微血管进行细胞分馏和Western blot分析在体外使用蛋白质提取亚细胞蛋白质组提取试剂盒(Calbiochem)进行细胞分离,以分离膜、细胞溶质、细胞骨架和核部分。使用抗细胞色素P450还原酶(膜)、抗钙蛋白酶(胞质)和抗波形蛋白(肌动蛋白细胞骨架部分)抗体确认组分特异性。对于“总细胞裂解物”,细胞在PBS中清洗,刮除,并在裂解缓冲液中冲洗。
使用EZviewRed蛋白G亲和凝胶珠(Sigma-Aldrich)进行共免疫沉淀,并使用以下蛋白进行免疫印迹:抗克劳丁-1、抗克劳丁-5、ZO-1和β-肌动蛋白抗体(均为1:1000稀释;细胞信号技术)。使用ImageJ软件分析免疫印迹。
免疫荧光和定量免疫荧光。
为了进行免疫荧光染色,将脑切片和细胞样本与以下主要抗体孵育:claudin-5–Alexa Fluor 488-conjugated(1:200稀释)、ZO-1-Alexa Fuor 594-conjugared(1:2000)、claudin-1-Alexa Fluor 488(1:200;Life Science Technology)和抗纤维蛋白原抗体(1:500;Abcam)德州红结合抗羊抗体显示的反应。为了测量脑样本中的荧光强度,每个中风病例和对照玻片选择三个切片,每个组织学玻片上随机选择10个点。在具有顺序模式的共焦激光扫描显微镜(Nikon A1)上采集用于定量荧光分析的图像(每个染色/病例30个图像),以避免通道和饱和度之间的干扰。对比度、亮度和针孔保持不变。在ImageJ软件中进行分析,勾画出每幅图像中的纤维蛋白原阳性区域以及对照组血管中的claudin-1和claudin-5阳性染色,并测量封闭区域的荧光强度。从荧光强度中减去背景强度。使用ImageJ软件对三张独立幻灯片上获得的12张图像进行了克劳丁-1和克劳丁-5的TJ相关片段定量。
超分辨率成像。
超分辨率成像是在密歇根大学实时单分子分析(SMART)中心完成的。mBMEC暴露于OGD条件下,转染claudin-1和/或用肽处理,并使用以下一级和二级抗体进行免疫荧光染色:抗claudin1、claudin-5和ZO-1-Alexa Fluor 647(均为1:200稀释;Invitrogen)和山羊抗鼠IgG Alexa Fluor Plus 647(Thermo Fisher Scientific)在成像之前,样品缓冲区与STORM成像缓冲区交换:100 m米三氯化碳,25μ米NaCl,1%v/v BME(β-巯基乙醇),pH 9.0,新添加2.5 m米PCA(3,4-二羟基苯甲酸;Sigma-Aldrich,P5630)和25 n米PCD(原儿茶酸双加氧酶;Sigma-Aldrich,P8279)。在带有细胞∧TIRF模块的Olympus IX81显微镜上用641nm激光激发HILO(高度倾斜叠层光学片显微镜)照明收集图像。图像是在Andor iXon Ultra EMCCD摄像头上采集的。使用ImageJ的ThunderSTORM插件处理图像。
实时RT-PCR。
使用TRIzol(Thermo Fisher Scientific)从人和小鼠脑微血管中制备总RNA。使用RT2第一链试剂盒(Qiagene)合成了单序列cDNA。使用细胞连接PCR阵列(Qiagen)和相关软件分析人和小鼠中风和对照脑组织中连接蛋白mRNA的表达。
为了分析I/R损伤后人和小鼠脑组织分离微血管和mBMEC中claudin-1和claudin-5 mRNA的水平,使用Applied Biosystems 7500 real-time PCR系统进行TaqMan实时PCR分析。使用RT合成单链cDNA2第一股套件。使用商用引物(Qiagen)对claudin-1和claudin-5进行实时PCR。β-actin用于样品归一化。
荧光共振能量转移(FRET)和光漂白后的荧光恢复(FRAP)分析。
顺式-和反式-在用荧光标记(AcGFP或mCherry)的克劳丁-1、克劳丁-5和/或ZO-1组合转染的BMEC中评估克劳丁-1和/或克劳丁-5、克劳丁-1/ZO-1和克劳丁-5/ZO1的相互作用。使用LAS-X软件在密歇根大学显微成像实验室的徕卡SP5X反转双光子FLIM共焦显微镜上进行分析。激光功率和谱线强度如下:FRET:白光激光70%,红光激光587nm,强度40%,绿光激光488nm,强度30%。用579、587和595 nm激光线进行受体光漂白,每一激光线100%持续80 s。FRET效率计算如下:[(供体邮递−捐赠者之前)/捐赠者邮递]. 克劳丁-1/克劳丁-1、克劳丁-5/克劳丁-5和克劳丁-1/Claudin-5顺式-使用CellMask深红色质膜染色在细胞胞浆和膜中观察到相互作用。对于claudin-1和claudin-5,嗜同性和嗜异性反式-相互作用接触富集被量化为细胞-细胞接触处的荧光富集。
claudin-1、claudin-5和ZO-1迁移率的FRAP分析是在以下条件下进行的:25%的氩激光,488的绿色激光线,30%的强度,用100%的激光线488进行光漂白。所有样本组的激光功率和激光线强度保持不变。FRAP值计算如下:回收率=[(漂白后5分钟荧光−漂白后0分钟荧光)/漂白前荧光]*100。
对照组包括:FRET,收集空白AcGFP和mCherry载体共存的对照样品的效率,并在分析期间从实验FRET效率中减去;在非GFP阳性区域选择背景感兴趣区域(ROI)FRAP,以评估荧光强度的非特异性变化,并从所有分析的ROI中减去该背景回收率。
蛋白质阵列。
使用小鼠炎性抗体阵列试剂盒(Ray Biotech)同时检测和半定量在在体外条件。使用ImageJ分析软件和蛋白质阵列分析仪插件进行密度分析。
统计分析。
使用GraphPad Prism 6.0软件进行分析。未付费、双尾学生t吨使用威尔士校正和Tukey's、Sidak和Holman–Sidak的单向方差分析进行测试事后(post-hoc)测试用于测试组水平的差异。神经系统评分采用卡方检验。相关分析采用皮尔逊相关χ2测试。概率值<0.05被视为具有统计学意义。
结果
中风后BBB渗透率
小鼠tMCAO后的慢性期特点是缺血损伤逐渐消退,神经功能改善,BBB恢复。与tMCAO后第1天相比,梗死在第7天显著减少(第页=0.0009、0.0007、0.00045、0.00041,方差分析,Holm–Sidak后测试),然后在第7天至第28天“稳定”病变大小(图1A类). 小鼠有持续的神经功能缺损和单侧无力(图1B类,C).
图1。 小鼠和患者慢性卒中后BBB泄漏。A类tMCAO后第14天梗死区Nissl和Fluoro-Jade B染色的代表性图像。星号表示随后用荧光翡翠B染色的玻片中缺血侧和对侧的相应区域。比例尺为100μm。条形图显示了tMCAO后第1天、第7天、第14天、第21天和第28天,通过组织切片上荧光翡翠染色的形态计量分析评估的脑梗死大小。数据显示为平均值±SD。n个=每组10人***第页=0.0009、0.0007、0.00045和0.00041,方差分析,Holm–Sidak后测试,与第1天相比。ShC,Sham控制。B类,C、NSS分析(B类)和转弯测试(C)小鼠tMCAO后第1、7、14、21和28天。注意,与ShC相比,tMCAO小鼠的持续神经功能缺损。数据显示为平均值±标准差。n个=每组10人;NSS公司(第页= 0.999, ***第页=0.0001,0.00045,0.00045,0.00054,0.0005,ANOVA Sidak后验);转角试验(第页= 0.9954,第页= 0.00067, 0.00062. 0.00073、0.00073和0.00075,方差分析,Sidak的后验)。D类,K(K)我对于菊糖5kDa、右旋糖酐20kDa和右旋糖聚糖40kDa(图1-2)短暂性MCAO后7~28天缺血和非缺血半球。数据显示为平均值±。n个= 8; ***第页=0.000003、0.000003、0.000006、0.00001,对于菊糖和第页右旋糖酐=0.000007,0.00008(方差分析,Sidak后验)与ShC同侧半球的比较;##第页=0.00264,以及###第页菊粉=00009第页右旋糖酐(方差分析,Sidak的后验)与K(K)我tMCAO后第7天同侧半球的值。E类,对照组和慢性中风患者大脑中纤维蛋白原(红色)的免疫荧光染色示例(临床患者数据包括在图1-1). 蓝色DAPI染色显示细胞核。请注意,中风病损处血管通透性增加(纤维蛋白原泄漏)。F类,条形图表示脑中血清蛋白纤维蛋白原血管外积聚的半定量。数据显示为中风病例的平均值±SD(n个= 150; 在5例中风病例和对照病例中,在3张单独的幻灯片上分析了10条血管(n个= 120; 0分析了4例对照病例中3张单独幻灯片上的血管)***第页= 0.0004t吨=5.713,未配对t吨Welch校正测试)中风与对照脑。
图1-2
A)流入速率常数(基)短暂性MCAO后第1-28天,缺血和非缺血半球的右旋糖酐-蝶呤红40kDa。数值为平均值±SD,n=8;克劳丁-5,**p<0.01;claudin-1***p<0.001(方差分析,Sidak的后验)。B)短暂MCAO后1-28天同侧(缺血)和对侧半球的含水量。ShC=假对照。数值为平均值±SD,n=8;与ShC相比,第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天的p<0.001、p<0.000、p=0.2697、p=0.6927、p=0.6827、p=0.5107(方差分析-塔基后验);p> 第3天、第7天、第14天、第21天和第28天分别为0.999、p=0.0626和&p=0.999、0.0626、0.0103、0.0103和0.0219,与第1天(ANOVA Tukey的后测)和tMCAO后第3天相比(#p=0.0626,0.0103、0.01、0.0219,分别为第7、14、21、28天(ANO_VA、Tukey后测)。下载图1-2,TIF文件 在tMCAO后1–28天,通过测量不同大小示踪剂、菊糖5kDa、右旋糖酐20和40kDa的清除率来检测BBB的通透性。对于高分子量示踪剂,右旋糖酐40 kDa,同侧(缺血)BBB高渗透性仅在第1天和第3天发现(图1-2A类). 相反,菊糖5kDa和右旋糖酐20kDa在中风慢性期(7、14、21和28天;图1D类). 特别是,与假手术对照组和对侧半球的同侧半球相比,经tMCAO后,同侧半球的菊糖通透性稳定且显著增加(第页= 0.000038; 0.000032、0.000056和0.000081,方差分析Holm–Sidak后检验)。在MCAO后第1天和第3天,只有同侧脑水肿显著,在卒中后晚期情况下(第7-28天;图1-2B类).
对人类脑卒中后慢性状态下BBB完整性的平行分析显示出类似的变化。对5例脑卒中患者(6个月至2年)的5份脑样本和4例无脑卒中史患者的4份脑样本进行了脑卒中后血脑屏障渗漏的评估(图1-1). 中风损伤区域表现强劲图1E类). 半定量分析显示脑卒中患者的血管外纤维蛋白原水平较高,可确定慢性脑卒中后血脑屏障的渗漏(t吨= 5.713,第页=0.0004未配对t吨韦尔奇校正试验;图1F类).
中风后BBB-TJ蛋白的变化
为了确定慢性卒中后状态下潜在的BBB结构改变,我们对小鼠和人类大脑中的TJ蛋白进行了表达微阵列分析。将tMCAO后同侧缺血半球和假对照组的分离微血管以及慢性卒中患者和相应对照组的大脑进行汇总分析(图1-1). 共分析了84个TJ相关基因(即细胞表面粘附、受体、连接相互作用蛋白、细胞骨架调节器和信号蛋白)。在人类样本中,52个基因在慢性中风后状态下发生了改变(上调或下调)。在小鼠中,50个基因在tMCAO后21天发生改变。在小鼠中,tMCAO后改变的基因数量随持续时间没有显著变化(第7天54个;第14天52个;第28天50个;数据未显示)。在小鼠和人类的总基因改变中,34个基因对小鼠和人类都是常见的。16只和18只分别针对人类和小鼠(图2A类). 散点图显示,在中风后21天的小鼠同侧半球,与对照组相比,45个基因上调,只有5个基因显著下调(倍数变化≥2)。相比之下,人脑中有35个基因上调,17个基因下调(图2B类). 选择的结构TJ基因(包括跨膜、支架和细胞骨架蛋白)总结于图2C有趣的是,小鼠和人的缺血半球显示了claudin-1、claudin-3和claudin-12的上调,以及两种参与白细胞募集的跨膜TJ蛋白,JAM-A和ESAM(图2-1A类). Claudin-5,一种主要的闭塞蛋白,和闭塞蛋白在人类和小鼠大脑中显示出>2倍的下调(图2C和图2-1A类).
图2。 慢性卒中后脑微血管中TJ-相关蛋白基因表达的改变。A类,从缺血半球分离出的微血管中TJ-相关蛋白总数的维恩图,其中基因表达在人类中风和小鼠tMCAO(21天)后至少改变了两倍。B类散点图显示了对照组和缺血微血管中TJ相关蛋白mRNA表达之间的关系。表达被归一化为包含在平板中的管家基因组。左,从缺血半球tMCAO(21天)分离的小鼠微血管与假对照组(ShC)的比较。对,中风患者与非中风(对照)患者的人体微血管。如果表达变化大于2倍,则将缺血时的表达变化分为上调或下调。C,人卒中和小鼠tMCAO(21天)后从缺血半球分离出的人和小鼠微血管中代表性结构TJ蛋白的折叠变化条形图。实时RT-PCR分析慢性脑卒中患者或对照组患者脑血管中claudin-1和claudin-5 mRNA与阵列结果一致(图2-1). 虚线表示上调和下调基因的截止点。OCLN,闭塞素;内皮细胞选择性粘附分子;MPDZ,多PDZ结构域蛋白;CGN,扣带回蛋白;CTTN、皮质素。
图2-1
A)实时RT-PCR分析慢性脑卒中患者或对照患者分离的血管中claudin-1和claudin-5 mRNA的表达。这些值是相对于β-肌动蛋白表达的。对照血管中claudin-1的表达过低,无法在图表上显示。数据表示平均值±SD,n=5;p=0.0003,p=0.003 vs对照组患者(ANOVA Sidak后验)。B)实时RT-PCR分析暴露于OGD 5小时后再灌注(正常氧气和葡萄糖供应)12-72小时的脑内皮细胞中claudin-1和-5 mRNA的表达。这些值是相对于β-actin表达的。对照内皮细胞中claudin-1的表达过低,无法在图表上显示。数据显示为平均值±SD,n=5个独立实验。与对照组相比,Claudin-5***p=0.000009、0.0000007、0.0000002、0.000021和Claudin-1-***p=0.000021、0.0000004、0.000002、0.000031(ANOVA Sidak的后验);Claudin-1(24小时和72小时)#p=0.0249,0.0011,0.0249;(48小时)与I/R 12进行比较(ANOVA Sidak的后测)。下载图2-1,TIF文件 卒中后Claudin-1和Claudin-5的变化体内
Claudin-5是血脑屏障TJ中的一种主要蛋白,它几乎完全堵塞了细胞旁间隙。脑内皮细胞中描述的其他克劳丁是克劳丁-3,主要在发育中出现,克劳丁-12功能未知,在人脑内皮细胞系中是克劳丁-1(Ohtsuki等人,2007年). 分析了慢性卒中后小鼠和人类血管中claudin-1和claudin-5 mRNA和蛋白的表达模式。tMCAO后7、14、21和28天,小鼠同侧半球的脑微血管显示claudin-1 mRNA表达增加(第页=0.000003、0.000002、0.0000038和0.00008;ANOVA Holman–Sidak的后测,与假对照组同侧大脑半球的比较;图3A类)和蛋白质(第页=0.000001、0.0000009、0.00003和0.00007;ANOVA Holman–Sidak后测;与假手术对照组同侧大脑半球比较;图3B类). 缺血损伤小鼠(tMCAO)的对侧半球在损伤后7–28天的mRNA和蛋白质水平上的claudin-1表达没有增加。据报道,在神经血管单位的其他细胞中,星形胶质细胞表达claudin-1。然而,在目前的研究中,在星形胶质细胞中没有发现claudin-1染色(图3-1). Claudin-1蛋白表达与菊糖持续性血管渗漏密切相关(Pearson相关性第页= 0.921;图3C). 大脑微血管在MCAO后第7、14、21和28天,同侧半球克劳丁-5 mRNA和蛋白的表达也降低(图3A类,B类). 克劳丁-5蛋白表达改变与菊糖渗漏增加呈负相关(皮尔逊相关第页= −0.906;图3C). 这些结果表明,缺血后半球血脑屏障渗漏增加可能与克劳丁表达失衡、克劳丁-1增加和克劳丁-5减少有关。
图3。 Claudin-1在慢性中风后的渗漏血管中表达。A类实时RT-PCR分析tMCAO后隔离半影血管中claudin-1和claudin-5 mRNA表达,并与对侧半球和假手术对照组(ShC)进行比较。mRNA水平根据GAPDH标准化。注意,卒中后同侧半球claudin-1的表达稳定升高。相反,与ShC相比,claudin-5被下调。数据显示为平均值±SD。n个= 5.第页= 0.999, ***第页=0.000001、0.0000008、0.0000001、0.000008-第1条;第页= 0.987,第页=0.0006、0.00005、0.00007、0.000089-与同侧和对侧半球进行比较的claudin-5(ANOVA,Sidak后验)###第页与ShC同侧半球相比,<0.0000001、0.0000002、0.0000006、0.000006、0.00002、0.000023、0.000071、0.000089(第1条和第5条,方差分析,Sidak的后验)。B类,tMCAO后分离的半影血管中claudin-1和claudin-5蛋白表达的蛋白质印迹和半定量密度分析,以及非缺血对侧半球和假手术对照的相应区域。蛋白质水平标准化为GAPDH。注意,在tMCAO后,claudin-5的表达减少,而claudin-1的表达增加。数据显示为平均值±。n个= 5; 第1条,第页= 0.9998, ***第页=0.000001、0.000002、0.000001、0.00003和0.00004;第5条,第页= 0.999, **第页=0.003、0.00039、0.0003和0.0012,比较同侧半球和对侧半球(ANOVA Holm–Sidak后测);第1条,###第页=0.000001、0.000002、0.000008、0.00001和第5条,##第页=0.0031、0.003、0.0037和0.0032,与ShC的同侧半球相比(ANOVA Holm–Sidak后测)。蛋白质印迹图像是五个独立实验之一。Cclaudin-1或claudin-5表达与BBB通透性(菊粉)的相关性K(K)我)在不同的时间点。第1条的皮尔逊系数,第页= 0.921,第页= 0.0262; 对于第5条,第页= −0.907;第页= 0.0336.D类,对照患者和慢性中风患者大脑中claudin-5或claudin-1(绿色)和纤维蛋白原(红色)的免疫荧光染色。Arrow指出,一个分析的微血管在两个通道中分裂(缩放图像),以证明纤维蛋白原泄漏血管中的claudin-5表达减少,claudin-1表达增加,神经血管单位(星形胶质细胞)的细胞中没有claudin1表达(图3-1). 在ImageJ中对claudin-1和claudin-5荧光信号进行量化。比较claudin-1和claudin-5的表达(平均荧光强度)和血管渗漏(血管外纤维蛋白原的综合密度)。Pearson相关系数显示claudin-1的表达与血管渗漏高度相关(第页= 0.9123,第页=0.0308),并且claudin-5表达与渗漏呈负相关(第页= −0.7362,第页=0.159)。比例尺,50μm。
图3-1
对人脑样本(A)和小鼠脑样本(B)的星形胶质细胞(GFAP,红色)或脑内皮细胞(CD31,红色)和克劳丁-1(绿色)进行免疫荧光染色,结果显示慢性卒中患者星形胶质细胞中克劳丁-1缺乏表达。Claudin-1主要存在于脑内皮细胞(CD31+细胞)中,比例尺=100μm。下载图3-1,TIF文件 在慢性中风后患者的大脑中也发现了类似的模式。中风但非对照组患者的血管表达claudin-1 mRNA,并降低claudin-5的表达(图2-1A类). 在蛋白质水平上,与对照脑相比,卒中后向纤维蛋白原泄漏的血管增加了claudin-1的表达,降低了clauding-5的表达(图3D类). claudin-1蛋白表达与纤维蛋白原渗漏呈显著正相关(皮尔逊系数第页=0.9123),并且claudin-5表达与渗漏呈负相关(皮尔逊系数第页= −0.7363;图3D类). 因此,与小鼠一样,慢性中风后人脑中的克劳丁-1和克劳丁-5存在不平衡。
克劳丁-1对缺氧缺糖后屏障特性的影响在体外
类似体内OGD后24和48小时,claudin-1 mRNA和蛋白表达增加在体外(图2-1B类). I/R受伤在体外与脑内皮细胞单层对右旋糖酐20kDa和菊糖5kDa的持续渗透性相关,细胞密度和存活率变化非常有限(<1%)。在I/R损伤前通过shRNA耗尽claudin-1有助于更快恢复屏障特性,保护慢性期屏障完整性(24和48小时,第页=0.000001和第页=0.000043,ANOVA Holm-Sidak后验;图4A类). 此外,克劳丁-1的过度表达单独导致脑内皮屏障过度通透性(未配对t吨测试,t吨= 12.77,第页= 0.00021;图4B类).
图4。 Claudin-1改变脑内皮屏障通透性。A类I/R损伤24和48小时后,mBMEC单层中FITC-菊粉的渗透系数(PC)。siRNA(cldn1siRNA)耗尽claudin-1具有保护作用,可降低I/R后大脑内皮屏障的高渗透性。数据显示为平均值±SD。n个= 5;第页= 0.9997, ***第页=0.0000001、0.000001和0.000043,与对照组和###第页= 0.0000001,##第页=0.00102通过siRNA(ANOVA,Sidak’s post test)比较claudin1缺失与否的细胞之间的屏障通透性,Western blotting分析显示实验组中claudin-1 siRNA的敲除效率。显示了来自五个独立实验的Western blotting的代表性图像。B类,在BECL中Claudin-1过度表达增加了FITC-菊粉的通透性。Western blot数据显示为平均值±SD。n个= 8;t吨= 12.77, ***第页与对照组相比<0.0002(未配对t吨测试)。来自八个独立实验的代表性Western blotting图像显示了在BECL中克劳丁-1过度表达的效率。C,在再灌注期间和在过表达claudin-1的BECL中,claudin-1在BMEC和分离的半影血管中的细胞分布的细胞分级和蛋白质印迹分析(cldn1结束). BMEC OGD后24小时,血管(bv)和cldn1 tMCAO后7天结束BECL、claudin-1主要存在于膜组分(MF)和细胞溶质组分(CF)中。肌动蛋白细胞骨架部分(ACF)或核部分(NF)中几乎不存在。“Total”表示在细胞分馏分析中分析的claudin-1的总蛋白分数。显示了三个独立实验的蛋白质印迹的代表性图像。条形图显示了不同细胞组分中claudin-1的百分比。数据显示为平均值±SD。n个= 3.D类在对照组和I/R条件下(24小时复氧),通过免疫荧光染色分析Claudin-1在BMEC中的表达和定位。I/R损伤后claudin-1增加,并出现在细胞-细胞边界。通过转染cldn1-mChery在BECL中过度表达claudin-1,在细胞边界处显示出类似的claudin-1分布模式以及一些细胞溶质表达。比例尺,20μm。E类、对照组细胞边界上TJ-相关claudin-1片段的超分辨率图像、I/R损伤和BMEC-claudin-1结束细胞。F类,FRAP分析以评估过度表达claudin-1(claudin-1)的mBMEC中的Claudin1(Cldn1)流动分数结束)和mBMEC暴露于I/R损伤(24小时复氧)。结果表明流动性较低(例如,可能并入TJ复合体)。BMEC认证-5结束代表转染AcGFP-cldn5的细胞,并作为阳性对照。数据显示为平均值±SD。n个=每组30个ROI。
Claudin-1在脑内皮细胞中的分布及其与TJ复合体的整合
I/R损伤后的脑内皮细胞在体外和tMCAO体内结果显示,约45%的claudin-1存在于膜组分中,50%存在于胞浆中,少量存在于核组分中(仅为~5%;图4C). 在claudin-1-过度表达的细胞中也发现了类似的分布(图4C). 形态学上,膜相关克劳丁-1定位于细胞-细胞接触(图4D类,E类). FRAP进一步分析了克劳丁-1并入TJ复合物的动力学。Claudin-1–mCherry融合蛋白在缺血后状态下的迁移率相对较低,类似于Claudin-5-AcGFP,表明融合到细胞连接中(图4F类; 有关融合蛋白的特异性,请参见图5-1A类).
跨膜蛋白并入TJ依赖于与支架蛋白如ZO-1和ZO-2建立相互作用。免疫荧光(图5A类)和免疫沉淀分析(图5C)显示在I/R损伤后和克劳丁-1过度表达期间,克劳丁-1主要与ZO-1共定位于脑内皮细胞边缘,而不是ZO-2。融合蛋白claudin-1-AcGFP和ZO-1-mCherry的FRET分析表明,claudin-1与ZO-1相互作用,FRET效率为0.4±0.1,与claudin-5/ZO-1交互作用(FRET效率0.7±0.1)相当。图5B类; 关于融合蛋白的特异性,请参见图5-1A类,以及图5-1B类). ZO-2/claudin-1交互不存在(数据未显示)。
图5。 Claudin-1并入TJ综合体。A类对照组、I/R暴露细胞(48小时复氧)和克劳丁-1过度表达细胞(克劳丁-1)的克劳丁-1和ZO-1免疫荧光染色结束). 箭头和放大图像(方框)表示细胞边界上ZO-1和claudin-1的共定位。B类、受体光漂白FRET分析细胞中与claudin-1相关的ZO-1共存的claudin-1AcGFP和ZO1-mCherry(融合蛋白特异性图5-1A类,以及图5-1B类)在控制和I/R条件下。阳性和阴性对照物代表与Cldn5-AcGFP和ZO-1 mCherry、AcGFP及mCherryVectors共同转染的细胞。数据显示为平均值±标准偏差单元格。n个=30个ROI/组。C对照组、I/R暴露细胞和克劳丁-1过度表达细胞(克劳丁-1)中克劳丁-1和ZO-1相互作用/共定位的免疫沉淀(IP)和Western blot分析结束). 显示了三个独立实验的典型Western blot图像。D类,对照组、I/R暴露细胞和过度表达克劳丁-1(克劳丁-1结束).E类,claudin-1/claudin-1、claudin-1/claudin-5和claudin-1/claudin-5的受体光漂白FRET分析反式-相互作用表明主要是亲同性克劳丁-1和克劳丁-5相互作用(而不是克劳丁-1/克劳丁-5)。数据显示为平均值±标准偏差单元格n个=30个ROI/组***第页=0.000023比较嗜同性克劳丁-1和克劳丁-5与嗜异性克劳丁-1/克劳丁5反式-交互作用(方差分析,Sidak的后验)。F类,受体光漂白FRET分析顺式-在对照和I/R条件下(24小时),claudin-1和claudin-5在细胞膜和胞浆上的相互作用。数据显示为平均值±标准偏差单元格。n个=20 ROI/组**第页=0.0051,0.0051适用于顺式-膜和###第页=0.000001,0.000001适用于顺式-胞浆claudin1–claudin5相互作用与嗜同性claudin-1的比较;#第页与cldn5-cldn5相比,cdn1-cldn5 I/R=0.0156,##第页=0.0051,0.004适用于顺式-膜和###第页=0.00073,0.0063,适用于顺式-胞浆cldn1-cldn5与嗜同型克劳丁-5相互作用的比较顺式-交互作用(ANOVA,Holm–Sidak事后测试)。
图5-1
A)融合蛋白Ac-GFP-classudin-5、AcGFP-classudin-1、mCherry-claudin-1和mCherry-ZO-1通过在claudin-5、claudin-1和/或ZO-1的N-末端连接荧光标签而产生。用Ac-GFP-claudin-5和/或mCherry-claudin-1转染mBMEC和mBECL。48小时后,通过免疫印迹分析细胞裂解产物中的克劳丁-1、克劳丁-5、ZO-1、AcGFP或mCherry和β-actin作为负荷对照。来自5个独立实验的代表性印迹。对照组指示的非转染细胞、AcGFP或mCherry指示的仅转染载体的细胞,以及Ac-GFP-claudin-1、mCherry-claudin-1,AcGFP-claudin-5和mCherry-ZO-1表示转染融合蛋白构建物B)抗-claudin-1的细胞,在转染AcGFP-克劳丁-1、mCherry-claudin-1、AcGFP-claudin-5和mCherry ZO-1的BECL裂解液中进行克劳丁-5或ZO-1免疫沉淀,然后用抗GFP或抗mCherri抗体进行免疫印迹分析。输入-表示BECL转染细胞与AcGFP-claudin-1、mCherry-claudin-2、AcGFP-claudin-5或mCherry ZO-1、IgG的总细胞裂解物-表示与对照兔IgG抗体的免疫印迹来自5个独立实验的代表性印迹。下载图5-1,TIF文件 同源克劳丁-1相互作用和与克劳丁-5的异源相互作用
Cis公司-和反式-质膜上的克劳丁相互作用对于形成稳定的功能性TJ复合物至关重要。Claudin-1有能力建立以嗜同性为主的反式-与claudin-5/claudin-5大小相似的脑内皮细胞相互作用反式-相互作用(图5E类). 克劳丁-1/克劳丁-5反式-互动不太普遍(图5E类),尽管免疫细胞化学显示了claudin-1和claudin-5之间的共定位点(图5D类). 同样,顺式-根据FRET效率测定,claudin-1在细胞膜和胞浆中的相互作用主要是亲同性的(claudin-1/claudin-1)(图5F类). 虽然有一些异性恋顺式-与claudin-5的相互作用,这明显少于同源性claudin-1和同源性claudin-5顺式-相互作用(第页=0.005,对于膜和第页胞浆=0.000001,ANOVA Holm–Sidak事后测试;图5F类). 这表明,claudin-1可以通过与ZO-1建立稳定的相互作用,并通过建立claudin-1/claudin-1来构建claudin-1-链,从而并入脑内皮细胞TJ顺式-和反式-互动。
克劳丁-1对克劳丁-5/克劳丁-5和克劳丁-5/ZO-1相互作用的影响
Claudin-1可能通过改变TJ复合体内其他蛋白质的相互作用来增加脑内皮屏障的通透性。我们检测了claudin-1对嗜同性者的影响反式-克劳丁-5的相互作用以及克劳丁-5与ZO-1的相互作用。Claudin-1影响了通过FRAP分析评估的暴露于I/R损伤的脑内皮细胞中Claudin-5的流动性以及Claudin-2过度表达期间(claudin1结束). 通过shRNA将claudin-1耗竭,挽救了在TJ复合体中加入claudin-5(图6A类). 细胞分离进一步证实了克劳丁-1对克劳丁-5分布的影响。当I/R损伤、tMCAO或直接过度表达(Claudin-1结束mBECL)(图6B类).
图6。 Claudin-1对Claudin-5 TJ合并的影响。A类对照组、I/R暴露细胞(48 h)和过度表达BMEC的TJ-相关克劳丁-5的FRAP分析(克劳丁-1结束) ***第页=0.00023,0.000035与对照组相比(方差分析,Tukey后验)。B类,在再灌注过程中,mBMEC和分离的半影血管中的claudin-5的细胞分级和蛋白质印迹分析显示,claudin-5在48小时(mBMEC)和7天(血管)的膜、胞质溶胶和核部分中的分布,以及claudin-1过表达BMEC。MF、CF和ACF分别表示膜、细胞溶质和肌动蛋白细胞骨架细胞组分。“Total”表示在细胞分馏分析中分析的claudin-5的总蛋白分数。显示了三个独立实验的典型Western blot图像。条形图显示了克劳丁-5在分数中的分布百分比。数据显示为平均值±SD。C,对照组和I/R暴露的BMEC中TJ-相关克劳丁-5的免疫荧光染色和超分辨率图像,克劳丁-1 shRNA有或无克劳丁-1缺失。比例尺,20μm。D类,定量对照细胞和I/R暴露细胞中claudin-5/ZO-1共染色免疫荧光图像中的平均TJ-相关claudin-5片段长度,claudin-1 shRNA有无耗竭claudin-2(关于敲除效率,请参见图6-1). ***第页=0.000001和第页与对照组相比=0.2737;###第页=0.00001,与I/R暴露细胞相比(方差分析,Tukey的后验)。E类、克劳丁-5的FRET分析(富集强度)反式-控制中的相互作用结束BMEC和I/R暴露的细胞有或无cldn1 shRNA的claudin-1耗竭。数据显示为平均值±标准偏差细胞。n个=每组30个ROI***第页=0.000001和第页=0.000001与对照组和###第页=0.000001和I/R(ANOVA Tukey检验)。F类,对照组claudin-5和ZO-1相互作用的FRET分析,cldn1结束BMEC和I/R暴露的细胞带有或不带有cldn1shRNA的claudin-1缺失**第页与对照组相比=0.00219、0.002708、0.6476#第页=0.0299与I/R比较(方差分析,Tukey检验)。
图6-1
claudin-1 shRNA在BMEC中的敲除效率。A) 克劳丁-1 shRNA转染后克劳丁-1 mRNA的耗竭(RT-PCR)。Sc-shRNA表示转染了scrable(对照)shRNA的BMEC。图表表示平均值±SD,n=8个独立实验。cldn-1shRNA*p=0.0211与对照sc-shRNA比较(方差分析-Tukey的后验)。B) Western blotting分析显示,对照组和I/R损伤组shRNA治疗后claudin-1蛋白表达显著降低。来自8个独立实验的代表性印迹。图形表示平均值±SD,n=8个独立实验。与I/R sc-shRNA1相比,I/R claudin-1shRNA***p=0.00006(ANOVA Tukey的后验)。下载图6-1,TIF文件 此外,过度表达claudin-1的细胞在内皮细胞-细胞边界处有片段化的claudin-5染色(图6C). 评估两种实验条件下克劳丁-5片段的长度,我们发现克劳丁-5长度显著缩短(第页<0.000001,ANOVA,Holm–Sidak事后测试),但未完全损失(图6D类). shRNA完全耗竭claudin-1可挽救I/R条件下claudin-5的表达和细胞边界定位(图6B类,C). (图6-1A–B). 此外,第5条反式-通过对克劳丁-5AcGFP和克劳丁-5-m樱桃细胞混合培养物的FRET分析测得的相互作用在克劳丁-1存在时显著减弱(第页=0.000002,ANOVA Holm–Sidak后测),表明第5条仍然可以形成第5条反式-交互,但这被claudin-1/claudin-1打断反式-相互作用,在脑内皮细胞中产生可能混合的克劳丁-1和克劳丁-5同源链(图6E类). 此外,claudin-1显著降低了claudin-5/ZO-1相互作用(第页=0.0021和第页=0.0027,ANOVA Holm–Sidak事后测试(图6F类).
靶向克劳丁-1改善中风后血脑屏障恢复
claudin-1对I/R损伤后脑内皮单层渗漏的影响表明,它可能是降低I/R诱导的脑内皮细胞过度通透性的良好靶点。体外,通过在OGD暴露24小时后添加克劳丁-1 C1C2肽来靶向克劳丁-1,降低单层通透性(图7A类,B类)这与时间和剂量有关(图7-1A类1B类;关于C1C2肽的特异性,请参见图7-1C). 根据STORM成像评估,C1C2肽在克劳丁-1-过度表达细胞和暴露于I/R损伤的mBMEC中建立连续的克劳丁-5链也具有形态学作用(图7C). C1C2肽还减少了克劳丁-1/ZO-1相互作用并促进了克劳丁-5/ZO-1相互作用(图7C). 重要的是,体内,从tMCAO后第5天开始每天给药claudin-1 C1C2肽,从第7天起减少BBB向菊粉(5kDa)的泄漏(~2倍,第页=0.00008)并进展到第28天(~3.6倍,第页= 0.000001;图7F类). 因此,慢性中风患者血脑屏障通透性的改善与神经功能的改善有关(图7G公司).
图7。 Claudin-1抑制在慢性I/R条件下保护屏障完整性。A类,用claudin-1肽(C1C2;1μg/ml;有关C1C2肽的特异性,请参见图7-1C)在对照mBMEC单层中对菊粉的屏障通透性没有影响,但在claudin-1过表达(cldn1结束)BMEC单层。数据显示为平均值±SD。n个= 3; ***第页<0.001对照组与cldn1结束(第页= 0.9998, ***第页= 0.00074,第页=0.462,ANOVA Tukey的后验)和##第页=0.00267 cldn1结束与cldn1对比结束+C1C2(ANOVA,Tukey后测)cldn1脑内皮屏障通透性的时间和剂量依赖性改变结束对于用C1C2处理的BMEC单层,请参见图7-1A类和7-1B类).B类,C1C2处理还降低了24和48小时I/R损伤诱导的菊粉高渗性。数据显示为平均值±SD。n个= 3; ***第页= 0.000001, **第页=0.0015、0.0031、0.0028,与对照细胞相比(ANOVA,Sidak的后验)和###第页= 0.000001,#第页=0.0265通过C1C2比较有/无claudin-1耗竭的细胞之间的屏障通透性(ANOVA Sidak的后验)。C,cldn1细胞边界上与TJ相关的claudin-1和claudin-5片段的超分辨率图像结束BMEC,分类1结束用C1C2 claudin-1肽和I/R处理的BMEC和用C1C2 claudin-1肽处理的I/R BMEC单层。C1C2(1μg/ml)处理使claudin-1从细胞-细胞边界移位,并将claudin-5恢复到细胞边界。D类cldn1中ZO-1、claudin-5和/或claudin-1的免疫荧光染色结束BMEC,第1类结束用C1C2克劳丁-1肽和I/R处理的BMEC,以及用C1C2 claudin-1肽处理的I/R BMEC单层。C1C2降低了克劳丁-1与ZO-1的共定位,增加了克劳丁-5/ZO-1共定位。E类,对照BMEC中存在促炎介质的蛋白质阵列,cldn1结束用cldn1 shRNA或C1C2肽处理的BMEC、I/R暴露BMEC和I/R暴露的BMEC。数据表明,24小时收集的细胞培养液中有几种细胞因子/趋化因子高度增加。C1C2肽或cldn1 shRNA耗尽claudin-1后,促炎细胞因子/化学因子的表达降低。数据显示为平均值±SD。n个= 3. ***第页=0.000001与对照组比较(ANOVA Tukey后测)###第页=0.000001(Tukey试验)与I/R暴露细胞相比。F类,K(K)我短暂MCAO后第7-28天缺血半球FITC-菊糖(5kDa)。ShC、Sham控制;tMCAO+cp=用对照肽(cp)治疗,tMCAO+C1C2,用claudin-1 C1C2肽治疗(5μg/kg,i.p.)。数据显示为平均值±SD。n个= 8; ***第页比较tMCAO+cp和tMCAO+C1C2(对照-第页= 0.999; 0.000084、0.000068、0.000062、0.000081用于7、14、21、28天,方差分析Tukey的后验)。G公司用对照肽(cp)和claudin-1 C1C2肽(5μg/kg,i.p.)治疗小鼠,在tMCAO后第1、7、14、21和28天进行转角试验。数据显示为平均值±SD。n个=每组8人***第页= 0.00025,第页=0.000001、0.000207和0.000001。方差分析,Holm–Sidak对tMCAO+cp和tMCAO+C1C2进行后验比较。
图7-1
(A类)剂量依赖性(24小时)和(B类)cldn1的时间依赖性改变结束当暴露于claudin-1肽C1C2时,BMEC单层对FITC-菊粉的渗透性。数据代表3个独立实验的值。C) 用增加浓度的C1C2(0.1-10μg/ml)肽处理12小时的BMEC的Western blotting分析。C1C2处理导致claudin-1的表达死亡,而对claudin-5的表达没有影响。图表表示平均值±SD,n=4个独立实验。下载图7-1,TIF文件 Claudin-1改变脑内皮细胞炎症表型
我们还研究了克劳丁-1在慢性I/R损伤条件下是否具有额外的脑内皮屏障效应。因为I/R损伤会诱导炎症介质的表达,所以我们筛选了I/R损伤后大脑内皮炎症表型的变化。Claudin-1过表达导致细胞培养基中CXCL13、CCL11、CX3CL1、GM-CSF、IL-1β、IL6和CCL5的表达增加(>2.5倍)(图7E类). 如果shRNA抑制了claudin-1的表达,或者在再灌注期间添加了claudin-1 C1C2肽,则I/R损伤期间脑内皮细胞的这些细胞因子/趋化因子的表达会降低(图7E类). 因此,claudin-1可能通过影响屏障结构组织来调节脑内皮细胞表型并损害屏障完整性。Claudin-1缺乏可能对脑卒中后血脑屏障的通透性,进而对慢性脑卒中后损伤产生有益影响。
讨论
中风导致血脑屏障过度通透性,其程度随时间变化。急性期,血浆蛋白外渗、白细胞渗出和血管源性水肿可导致不受控制的增加。然而,在亚急性和慢性情况下,可能存在较小的渗漏,可能导致出血性转化,或者,如果持续存在,液体过度积聚,导致脑功能障碍,发展为慢性炎症,并形成微血栓(Strbian等人,2008年;Kaur等人,2011年). 本研究探讨了脑卒中亚急性期和慢性期血脑屏障渗漏的原因,重点是TJ复合体的改变。我们发现:(1)脑卒中后长期持续的BBB漏与TJ复合体紊乱有关;(2) 大多数泄漏的血管表达出“新”的BBB克劳丁,克劳丁-1;(3) claudin-1通过直接ZO-1相互作用和建立亲同性,并入TJ复合物顺式-和反式-交互作用;(4) claudin-1的存在与claudin-5水平的降低直接相关反式-相互作用和claudin-5/ZO-1相互作用,以及(5)claudin-1可能是中风后慢性降低血脑屏障通透性的治疗靶点,从而促进神经恢复。用肽阻断claudin-1对血脑屏障通透性和内皮细胞炎症表型具有有益作用。
体外和体内小鼠和人类的研究都表明,在缺血状态下,一种新的BBB克劳丁(claudin-1)上调。Claudins是主要的闭塞蛋白,在表达和相互作用中表现出细胞特异性。在脑内皮细胞,主要的克劳丁是克劳丁-5,但在某些情况下(例如血管生成、肿瘤和创伤性脑损伤),其他克劳丁如克劳丁-1也存在,可能参与细胞旁间隙阻塞(Liebner等人,2000年;Shin等人,2008年). claudin-1表达的原因和影响尚不清楚。目前的假设表明,在BBB-TJ复合体组织中,有着同等有益的作用,有助于封闭细胞旁通路,或通过星形胶质细胞的表达,帮助形成次生星形胶质细胞/胶质细胞屏障,以保护大脑免受内皮细胞破坏(Liebner等人,2000年;Pfeiffer等人,2011年). 关于claudin-1在BMEC中TJ形成中的作用的几个有争议的发现对这些假设提出了挑战:(1)与claudin-5相比,静息期BMEC中claudin-1mRNA的表达极低(约3000倍),明确了可诱导的特征和在屏障调节中的作用;(2) claudin-5 KO小鼠出生后即死于脑水肿和出血,而claudin-1 KO小鼠死于表皮屏障,而非BBB缺陷;(3)克劳丁-5 KO小鼠的BMEC克劳丁-1 mRNA和蛋白质水平没有改变,排除了潜在的代偿作用(Nitta等人,2003年;Ohtsuki等人,2007年). 这表明,在生理条件下,claudin-1对BBB-TJ复合物功能不是必需的,其出现/诱导与TJ功能的改变密切相关。此外,我们的结果清楚地表明,卒中后克劳丁-1的出现导致大脑内皮屏障恢复受限,部分原因是克劳丁-5表达受限。
急性中风会耗尽许多TJ蛋白,形成血脑屏障“开放”的基础(Fernández-López等人,2012年). 然而,慢性情况下,BBB部分恢复不完全,TJ蛋白表达增加。在慢性卒中中,BBB泄漏可能是由于TJ蛋白表达不足,这与我们的结果不完全相符,或者是由于TJ组织缺陷。Claudin-5表达可能不足以建立屏障属性,因为TJ复合体中的表达稍低或相互作用不相容。一种潜在的代偿性claudin-12的表达增加,但由于无法建立屏障,它如何影响屏障特性值得怀疑(Nitta等人,2003年). 最近一项关于在实验性自身免疫性脑脊髓炎中过度表达claudin-1的有益作用的研究表明,claudin1是一种屏障型claudin,在脑卒中中的慢性出现,增加了其支持和促进血脑屏障恢复、重建完整性的可能性(Pfeiffer等人,2011年). 值得注意的是,屏障“拯救”(双转基因克劳丁-1小鼠)需要显著的克劳丁-1过度表达,而在我们的中风后恢复情况下,这可能很难实现。
蛋白质表达是建立TJ特性的成分。同样重要的是TJ蛋白与蛋白质的相互作用。第1条和第5条都是“障碍型”条款。克洛丹顺式-和反式蛋白质-蛋白质相互作用在TJ链形成和细胞旁闭塞中很重要(Piontek等人,2008年). Claudin-5通常形成具有同源性的连续链反式-和顺式-在BMEC中齐聚和生成不渗透TJ复合物所必需的相互作用(Piontek等人,2008年;Rossa等人,2014年). 直到最近,克劳丁-5顺式-和反式-BBB处的相互作用被描述为同型。然而,TJ复合物组织的一种新观点表明,异质性claudin分子构成了具有异质性的TJ链的骨架反式-相互作用(Furuse等人,1999年;Milatz等人,2015年). 在上皮细胞中,克劳丁/克劳丁相互作用被定义为相容(例如克劳丁-3和克劳丁-5)或不相容(例如,克劳丁-1和克劳丁5),影响静息和损伤条件下的TJ复合体功能(例如,肺损伤中的克劳丁-1/克劳丁-5相互作用)(科瓦尔,2013). 在确定克劳丁-1对BBB的潜在影响时,我们的数据表明,克劳丁-1基于亲同型克劳丁-1/克劳丁-1生成细胞间链顺式-和反式-没有与claudin-5相互作用的相互作用。在慢性卒中条件下,克劳丁-5链被克劳丁-1/克劳丁-1链片段打断,使屏障更像是一个“零碎”结构,而不是连续链,导致屏障泄漏。Claudin-1影响也影响Claudin-5/ZO-1相互作用。Claudin-5需要ZO-1相互作用定位在细胞膜上并建立反式-细胞间的相互作用(Furuse等人,1999年). claudin-1的高表达及其在膜上积聚的能力表明,claudin1和claudin-5可能会竞争ZO-1的相互作用,从而从TJ复合物中取代claudin5。克劳丁-1 siRNA和克劳丁-1肽的抑制试验支持了这一观察结果,表明克劳丁-1可以从膜上去除并与ZO-1分离,增加克劳丁-5链的形成。因此,在缺乏克劳丁-5的情况下,克劳丁-1可能通过构建自己的链来支持屏障的密封,但由于与克劳丁-5不相容的相互作用,它可能是细胞中完全屏障恢复的限制因素。
需要强调的是,第1条的屏障失稳作用仅限于BMEC。据报道,星形细胞claudin-1的表达,特别是在血脑屏障破裂的病理条件下(Horn等人,2017年). 星形胶质细胞之间的紧密相互作用可能形成对缺血性损伤的二级防御屏障(Duffy等人,2000年;Horn等人,2017年). claudin-1的这种保护能力很可能发生在急性损伤期间。因此,慢性卒中患者星形细胞克劳丁-1表达缺失可能是血脑屏障部分恢复的结果。
脑卒中后内皮微环境的改变或内皮细胞损伤可能导致慢性克劳丁-1。中风后的这一阶段与影响BBB表型的持续低度细胞因子和趋化因子表达密切相关(Elahy等人,2015年;von Leden等人,2017年),可能改变TJ蛋白表达(claudin-1上调和claudin-5下调)。然而,细胞损伤在糖尿病肾病、酒精性肺损伤和脑内皮细胞缺血中诱导claudin-1在体外(长谷川等人,2013年;Schlingmann等人,2016年). 在这种情况下,claudin-1上调主要是由Sirt1或miR155驱动的损伤诱导的表观遗传改变所致(长谷川等人,2013年;Lopez-Ramirez等人,2014年). 因此,claudin-1的诱导可能是慢性中风后细胞损伤和微环境改变的结果。未来的研究应阐明慢性卒中中BBB损伤的信号机制。
克劳丁-1能否成为治疗脑卒中后血脑屏障损伤的重要新靶点?有证据表明,持续的血脑屏障渗漏对脑卒中后的恢复具有破坏性而非有益的影响(Taheri等人,2011年)血管周围水肿和血液成分外渗,导致进行性慢性炎症和微血栓形成(Krueger等人,2015年). Claudin-1抑制可能影响BBB泄漏,防止这些过程加重BBB损伤。由于claudin-1的表达也会增加BMEC中促炎细胞因子/趋化因子的表达,因此其“破坏性”效应不仅仅是结构性的。因此,claudin-1有很好的潜力来实现BBB恢复的靶点作用:它在人和小鼠中风后表现出良好的翻译特性和相同的表达模式,它调节屏障特性和内皮表型,作为一种表面结构蛋白,它可以通过针对内吞作用的小分子策略来获取和去除。这可以带来低离目标效果的好处。
我们的结果显示了claudin-1肽C1C2和claudin-1shRNA在治疗BBB高渗透性方面的有益作用。通过与claudin-1的第一个细胞外环的高亲和力结合,C1C2减少反式-和顺式-克劳丁-1相互作用,减少克劳丁-1/ZO-1相互作用,将克劳丁-1重新分配到胞浆中进行降解(Staat等人,2015年). 这些作用导致claudin-5链持续,并减少脑内皮渗漏。然而,C1C2与claudin-5的亲和力较低,并且不会减少其表达。通过影响克劳丁-1和克劳丁-5,C1C2肽活性与多种细胞类型形成的屏障的通透性增加有关(Staat等人,2015年). 如果要将C1C2暴露用作治疗,则需要在C1C2暴露的剂量和持续时间方面进行护理。
总之,缺血诱导内皮细胞claudin-1表达,在脑卒中后长期血脑屏障泄漏中发挥作用。Claudin-1是一种新的治疗靶点,减少其表达可能对预防中风复发和可能的中风后脑损伤具有重要意义。