结果
视网膜损伤后Müller胶质细胞中诱导1016α1T转基因表达
我们之前报道过,含有野生型1.7 kbα1T启动子的转基因鱼在视网膜损伤后3d内主要在增殖的Müller胶质细胞中表达GFP(Senut等人,2004年). 基于四个观察结果,我们假设α1T表达的Müller胶质细胞可能作为视网膜干细胞发挥作用。首先,米勒胶质细胞具有干细胞特有的增殖特性和存活能力(Yurco和Cameron,2005年). 其次,α1T转基因主要在成人中枢神经系统的干细胞中表达(Goldman等人,2001年)这表明它在视网膜中的表达可以识别那里的干细胞。第三,转基因表达的Müller胶质细胞在光诱导视网膜损伤后1周开始表达神经元标记物HuC/D(Vihtelic等人,2006年)这表明来自转基因表达的Müller胶质细胞可能分化为神经元。第四,出生后鸟类和啮齿动物中的Müller胶质细胞可以被诱导产生新的神经元(Fischer和Reh,2001年;Ooto等人,2004年).
为了进行这些研究,我们认为重要的是确定一个α1T启动子片段,该启动子片段可以特异性地将转基因表达导向视网膜损伤后增殖的Müller胶质细胞。因为1.7 kb的启动子片段在再生受损轴突的细胞中被诱导(Goldman等人,2001年;Senut等人,2004年),它不是这些研究的合适促进剂。因此,我们检测了视网膜损伤后转基因鱼中各种启动子缺失的表达,并鉴定了缺失1016α1T,该缺失是从α1T启动子5′端缺失680 bp。鉴定出三个独立的转基因鱼系,其生殖系中含有1016α1T:GFP转基因,并且在损伤后均在Müller胶质细胞中表达,但在损伤的视网膜神经节细胞中未表达(图1). 为了证实1016α1T:GFP转基因在受损的视网膜神经节细胞中没有诱导表达,我们首先进行了就地对4dpi视网膜切片进行杂交,发现1016α1T转基因在INL内源性α1微管蛋白表达细胞中表达,但在α1微管蛋白表达的视网膜神经节细胞中不表达(数据未显示)。接下来,我们检测了视神经挤压后转基因的表达。正如预期的那样,受损的神经节细胞表达GAP43,这是在轴突再生过程中诱导的(Perry等人,1987年;Bormann等人,1998年),但不是GFP(补充图1,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料)证实了我们最初的观察结果,即含有1016α1T:GFP转基因的视网膜神经节细胞不会诱导GFP对损伤作出反应。在未受损的对照视网膜中,内源性α1T仅在周向生发区(CGZ)的祖细胞和分化后代中表达,1016α1T转基因保留了这种表达模式(补充图2,见网址:www.jneurosci.org作为补充材料).
图1。
1016α1T:GFP转基因鱼在视网膜损伤后诱导Müller胶质细胞表达GFP。在视网膜损伤后4天,对三个独立的转基因鱼类品系(1016 L1、1016 L2、1016L3)进行视网膜GFP诱导试验。标记GFP的面板显示转基因GFP在苗勒样细胞中的表达。中间面板显示GFAP染色,这是一种Müller胶质标记物。合并后的图像(右侧面板)显示,表达GFP的细胞也表达GFAP(箭头)。视网膜神经节细胞不表达GFP以应对损伤(箭头)。
视网膜损伤后1016α1T表达的Müller胶质细胞增生
为了更仔细地检查视网膜损伤后的细胞增殖,并将其与转基因表达联系起来(见下文),我们进行了BrdU脉冲标记实验。1016α1T:GFP转基因鱼在第0天(0 dpi)接受视网膜损伤,并每隔24小时给予单剂量BrdU(1 dpi、2 dpi等)。然后在给予BrdU后4小时处死鱼,分离眼睛,冷冻保护,并连续切片。BrdU标签(BrdU+)对损伤附近的细胞进行定量,以估计BrdU的总数+每个病变的细胞数(图2一). 以前的研究表明,在0和1 dpi时,成年斑马鱼的视网膜边缘的CGZ外没有检测到细胞增殖(卡梅隆,2000年;Yurco和Cameron,2005年). 然而,在2 dpi时,观察到外核层(ONL)和INL中的细胞增殖(Yurco和Cameron,2005年). 与这些结果一致,在1 dpi时,我们很少观察到BrdU+现存视网膜中的细胞以及那些被标记的细胞通常在ONL中发现,在ONL里发现了之前在金鱼中描述的杆祖细胞(约翰,1977年;梅耶,1978年)以及在光纤层中,可以发现增殖的小胶质细胞(根岸和神奈川,1993年;Braisted等人,1994年;Yurco和Cameron,2005年). 溴化铀+在所有时间点都观察到CGZ中的细胞,这表明BrdU给药成功地标记了增殖细胞(数据未显示),但被排除在我们的细胞计数之外。在2 dpi时,BrdU的数量急剧增加+INL中的细胞和总BrdU的76%+细胞群位于INL(238个BrdU中的183个+每个病变的细胞数)。有趣的是,这一增长先于BrdU数量的增加+3dpi时ONL中的细胞,可能表明INL中的这些细胞会在以后的时间点产生增殖细胞。BrdU数量+INL和ONL中的细胞在4dpi时达到峰值,然后下降并恢复到接近基线水平7dpi(图2一). 这些数据表明,受损视网膜需要重新填充的细胞是在损伤后迅速生成的,这与以前的研究一致,表明损伤后细胞增殖的时空模式(Yurco和Cameron,2005年).
图2。
损伤诱导的细胞增殖和GFP表达。一,显示BrdU平均数量的图表+损伤后24小时间隔的每个损伤的细胞数。计算四个病灶(1-5 dpi)或两个病灶(6-7 dpi)以获得平均值。2 dpi时INL的增殖增加先于3 dpi时ONL的增殖增大。在4 dpi时,INL中每个病变有~850个细胞被BrdU摄取标记。到7 dpi时,细胞增殖恢复到接近基线水平。b条,显示BrdU百分比的图表+细胞定量一也是GFP+受伤后每天。c–k码,BrdU图像+/GFP公司+2-5dpi的细胞。c(c),d日,在1 dpi时,很少有细胞是BrdU+,尽管罕见的细胞被认为是杆祖细胞(c(c))和小胶质细胞(d日)根据它们在视网膜内的位置可以识别。很少,GFP+在INL中可以发现增殖细胞(e–g).小时在2 dpi时,观察到Müller样细胞中GFP的强烈诱导,这与BrdU数量的增加有关+2 dpi时INL中的细胞。溴化铀+推测小胶质细胞也存在(灰色箭头)。我,3 dpi时,更多BrdU+/GFP公司+在INL中观察到细胞。j个,在4 dpi时,ONL中假定的杆状祖细胞可被识别为BrdU+/GFP公司−单元格(灰色箭头)和BrdU+/GFP公司+细胞丰富(白色箭头)。此外,我们还发现了一些属于GFP的细胞核+/溴化铀−(箭头)。k个,在5 dpi时,BrdU的数量+INL中的细胞减少,但GFP+增殖细胞可以在所有三个核层中识别出来(箭头所示)。♦、,ONL;▪、,印度卢比;▴, GCL公司。
我们想知道BrdU标记的细胞中哪些部分对应于GFP表达(GFP+)单元格。为了回答这个问题,我们分析了BrdU+GFP表达细胞(图2b条). 1 dpi时,稀有BrdU+可以根据核形态和在视网膜中的位置来识别可能是杆祖细胞和小胶质细胞的细胞(图2c(c),d日). 尽管几乎没有BrdU+1dpi时的细胞,其中一些也是GFP+可能代表了转基因在活化的Müller胶质细胞中的最早表达(图2e–g)(见下文)。几乎所有BrdU+2–5 dpi时INL中的细胞也是GFP+(图2b条)具有典型的Müller胶质细胞形态(图2小时–小时). 在3 dpi及之后,我们注意到一些GFP+未标记BrdU的Müller细胞(图2j个,箭头)。英国国防部−/GFP公司+细胞总是与BrdU典型的细长核形态相联系+细胞核,我们预计这些细胞也会增殖,但在给予BrdU时不处于S期(见下文)。从6-7dpi开始,GFP表达下降,对应于这些时间点BrdU标记减少。这些数据表明增殖细胞在视网膜损伤后的第一周也表达GFP。
尽管大多数BrdU+细胞在4 dpi时表达GFP(占总BrdU的94%+细胞,第1087个,共1161个;和98%的INL BrdU+细胞(662/673)和这些GFP+根据细胞形态,细胞似乎是Müller胶质细胞,我们想确定1016α1T启动子是否在损伤后驱动Müler胶质细胞中的转基因表达。因此,我们检测了两个Müller胶质标记物zrf1(识别胶质纤维酸性蛋白(GFAP))和GS是否与GFP在4dpi的表达共定位。共焦显微镜显示GFP+细胞也表达Müller胶质标记(图3). 接下来,我们量化了GFP和胶质标记物的共表达,以确定GFP的百分比+细胞可以被认为是米勒神经胶质细胞。107 GFP+检测GFAP表达的细胞中,105个(98%)被标记。205 GFP+检测细胞GS表达,标记200(98%)个。我们还用神经元标志物HuC/D和其他视网膜细胞类型特异性标志物(zpr1、PKC和TH;数据未显示)进行了免疫染色,以确定是否有任何其他视网膜细胞类型在4 dpi时表达GFP。尽管进行了广泛的搜索,但没有发现可乐标签。虽然我们不能排除INL中除Müller胶质细胞外的小细胞群因损伤而增殖的可能性,但我们的数据表明,这样的细胞群占总增殖INL细胞群的不到2%。
图3。
1016α1T:GFP表达对Müller胶质细胞特异。用共聚焦显微镜检查1016个转基因视网膜损伤后4天的切片,以确定GFP是否在Müller胶质细胞中特异性诱导表达。用Müller胶质标记物GS(红色一)和GFAP(红色b条)和神经元标记物HuC/D(红色c(c)).一GFP在Müller细胞中表达,并用GS免疫染色标记。有三个GFP+以GS形式出现的细胞核−这张显微照片上的洞(箭头)。注意细胞质中GFP和GS共存(箭头)。205 GFP+检测细胞GS表达,200(98%)细胞被双重标记。b条,GFP阳性细胞也表达GFAP(箭头所示)。107 GFP+检测GFAP表达的细胞,105个(98%)被双重标记。c(c)用神经元标记物HuC/D标记的无长突细胞在损伤后不表达GFP(宽箭头)。4dpi时未观察到HuC/D和GFP双重标记的细胞。
神经原簇源自增殖的Müller胶质细胞
我们注意到GFP+这些细胞与其他研究斑马鱼和金鱼视网膜再生的人所描述的再生细胞神经原簇非常相似(Raymond等人,1988年;Vihtelic and Hyde,2000年;Failace等人,2002年;Yurco和Cameron,2005年). 这些簇的起源尚未确定,但它们是在受到损伤后形成的,表现为一组细胞核较长的细胞,可以通过BrdU标记或用增殖细胞核抗原抗体染色来识别。在受损的1016α1T:GFP转基因视网膜中,细胞核拉长的细胞群始终对应于GFP+米勒-格里亚,让我们假设GFP+我们观察到的细胞是神经原簇。在受伤的金鱼视网膜中,已知神经原簇表达干/祖细胞标记物,如Pax6、Vsx1、Notch-3和N-cadherin(Levine等人,1994年;Hitchcock等人,1996年;Sullivan等人,1997年;Wu等人,2001年). 确定GFP是否+Müller胶质细胞表达干细胞标记物,我们检测了1016α1T转基因鱼4dpi视网膜中Pax6的表达(图4). 这种干细胞标记物是在GFP中诱导的+米勒胶质细胞(33个GFP中的30个+Müller细胞表达Pax6)。尽管并非所有GFP+细胞表达Pax6,所有Pax6表达细胞簇均为GFP+(图4,箭头)。这些数据表明GFP+苗勒胶质细胞或来源于GFP的细胞+米勒胶质细胞相当于神经原簇,可能作为多能干祖细胞介导视网膜再生。这些数据还表明,1016α1T启动子可用于将基因表达导向受损视网膜的神经原簇。
图4。
神经原簇起源于Müller胶质细胞。对4dpi视网膜切片进行GFP表达(绿色)处理,然后就地对Pax6 mRNA(蓝色)进行杂交。一,Pax6在被称为神经原簇的细长细胞柱中诱导,以应对损伤(箭头)。顶泌细胞正常表达Pax6(箭头;另见d日).b条GFP由Müller glia表达,以应对损伤(箭头)。c(c)、GFP+来源于Müller神经胶质的细胞对应于表达Pax6的神经原性簇(箭头)。d日Pax6在无长突细胞的未受损视网膜中表达(箭头所示)。
因为我们观察到在2 dpi时INL的增殖增加,而在3 dpi时ONL的增殖增强之前(图2一)和BrdU+细胞以2 dpi在INL内占据不同位置(图2小时),我们假设在2 dpi时增殖的INL细胞在3 dpi及以上时在其他核层中产生细胞。我们进行了一个2 dpi的脉冲相位实验,在2 dpi时给予单剂量的BrdU,并在3、4、5和7 dpi时检查视网膜(补充图3,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 所有时间点的ONL和神经节细胞层(GCL)均存在BrdU标记细胞,表明BrdU+来自INL的细胞已经迁移到这些层或少数BrdU+ONL和GCL内的细胞已经分裂(补充图3,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料).
神经原簇是与Müller胶质细胞特征密切相关的细胞
我们观察到,每个神经原簇似乎对应于一个单一的、肥大的GFP+米勒·格里亚。共焦显微镜显示BrdU+细胞核位于单个GFP内+米勒-格里亚(图5). 我们捕获了多组图像以生成正交投影,发现BrdU+细胞核表达GFP(图5一,顶部,箭头)。单个Müller胶质细胞内的细胞核表达GFP(图5b条,白色箭头),而GFP外的细胞核+米勒-格里亚没有(图5b条,箭头)。确定增殖细胞是否经历了无胞质分裂的有核分裂,或细胞是否为单个GFP的簇+细胞,我们对4-5dpi视网膜的切片进行了电子显微镜检查(数据显示4dpi图5c–f). DAPI微弱染色的细长增殖细胞核(图5一,b条,插图)始终为GFP+根据这些标准,在光学显微镜下很容易识别。这些神经原簇在电子显微镜下也可以识别,因为它们具有独特的染色质模式和细长的核形态(图5c(c),星号)。我们检查了几个神经原簇(n个=5),发现分离单个细长细胞核的薄质膜(图5d日,箭头),表示簇由紧密关联的细胞组成。对电子显微照片的进一步分析表明,神经原性簇内的细胞与米勒神经胶质细胞具有某些共同的特征。首先,神经原簇的细胞质与邻近的Müller胶质细胞的细胞质无法区分,Müler胶质细胞的突起在其周围延伸(图5e(电子),(f)). 米勒神经胶质与其他米勒神经胶质形成定型连接(克雷布斯和克雷布斯,1991年)在电子显微镜上很容易识别的(图5c(c),e(电子),(f)). 其次,我们在内部丛状层(IPL)中发现了被细胞质包围的细长细胞核,细胞质横向延伸(补充图4,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料),这是该层中典型的Müller胶质过程(克雷布斯和克雷布斯,1991年). 这些数据提供了额外的证据,表明神经原簇来自增殖的Müller胶质细胞。
图5。
神经原簇是具有Müller胶质特征的紧密结合细胞。一,对4dpi视网膜切片进行BrdU(红色)和GFP(绿色)处理。获得了一组共焦图像,并用于在z(z)平面(顶部和右侧面板分别表示在绿线和红线处拍摄的切片)。注意多个BrdU+对应GFP区域内的核+米勒·格里亚(箭头)。插图显示BrdU的放大倍数更高+(红色)为更清晰起见,核在灰度中标有星号。对单个细胞核进行了概述。b条,一组共聚焦图像的代表性图像,这些图像来自于对GFP(绿色)和GS(红色)进行处理的4dpi视网膜切片,显示单个Müller胶质细胞区域内的多个细胞核(顶部和右侧面板分别表示在红线和绿线处拍摄的切片)。被GFP包围的细胞核+Müller细胞处理或位于Müller胶质细胞内表达GFP(白色箭头),而位于GFP外的细胞核+米勒-格里亚(Müller-glia)没有(每个面板中的箭头表示相同的细胞核)。典型的胶质细胞形态可以在z(z)细胞从ONL延伸到GCL并接触玻璃体时的平面(右侧面板,从绿线上取下的切片)。当在x–y当在z(z)平面(灰色箭头,右面板),不表示GFP。插图显示了标有星号的细胞核的放大倍数较高。c–f,4 dpi下神经原簇的透射电子显微照片。c(c),内丛状层附近具有典型增殖神经原簇(星号)的拉长形态的两个细胞核。方框表示放大倍率较高的区域d日和e(电子).比例尺,3μm。d日,所示细胞的两张高倍显微照片的合成图像c(c)证明这些细胞是由质膜(箭头)分离的。比例尺,500 nm。e(电子),中所示区域的放大倍数更高c(c)米勒胶质细胞的细胞质(黑色箭头;参见(f))与细胞核细长的细胞(箭头)的细胞质非常相似,而其他细胞的细胞质则非常不同(红色箭头)。该框表示中显示的区域(f).比例尺,500 nm。(f),所示区域的高倍放大e(电子)显示了米勒胶质细胞(箭头)之间的连接,表明c(c)被米勒过程所包围。比例尺,500 nm。
米勒胶质细胞损伤后产生新的神经元
上述数据表明,1016α1T表达的Müller胶质细胞通过去分化和表达视网膜干细胞标记物(如Pax6和α1T)对视网膜损伤作出反应。如果这些细胞作为损伤诱导的视网膜前体细胞发挥作用,它们最终会生成新的神经元。理想情况下,我们将使用GFP表达作为谱系示踪剂来跟踪这些细胞的命运。然而,GFP的表达是短暂的,在14dpi后几乎检测不到,这表明GFP表达的细胞已经分化(数据未显示)。因此,我们将注意力集中在新的视网膜神经元可能形成的早期时间点(7-11 dpi),并且GFP的表达很容易检测到。我们在这个实验中使用了两种不同的标记。首先,我们使用HuC/D表达来鉴定新生神经元,因为一些Müller胶质细胞在感光细胞损伤后7天表达此标记(Vihtelic等人,2006年). 接下来,我们使用了zn5,它在视网膜神经节细胞分化和延伸轴突时瞬时表达(Trevarow等人,1990年). 与GFP的想法一致+米勒胶质细胞产生新的视网膜神经元,我们发现GFP+/HuC/D公司+细胞早于7 dpi(图6a–d). 此外,我们确定了GFP+/锌5+7和11dpi时INL、IPL和GCL中的视网膜神经节细胞(11dpi显示为图6e–l型). INL和IPL中的细胞可能代表正在迁移到GCL或错位RGC的分化RGC。
图6。
来源于GFP的细胞+米勒胶质细胞表达分化无长突细胞和视网膜神经节细胞的标记。1016条转基因鱼在第0天受伤,并允许其恢复到7或11 dpi(HuC/D显示为7 dpi,zn5显示为11 dpi)。对切片进行HuC/D或zn5(红色)染色,分别标记无长突细胞和视网膜神经节细胞,以及GFP(绿色)检测GFP是否+来自米勒胶质细胞的细胞开始分化。DAPI以紫色显示,表示标记细胞的层流位置。a–d、一些GFP+细胞在7 dpi时开始表达HuC/D(箭头)。e–hIPL和GCL中zn5标记的细胞表达GFP(箭头所示)。我,一个GFP+Müller样细胞,具有薄的轴突样突起(箭头)。j个,一个zn5标记的细胞将轴突(箭头)延伸至IPL。k个、zn5+细胞也表达GFP(箭头)。我,新生的神经节细胞位于INL的边缘。
为了评估增殖的米勒神经胶质在随后时间点的命运,我们在4 dpi时给鱼注射单剂量BrdU,并在60和180 dpi时测定细胞命运。我们选择在4 dpi时标记分裂细胞,因为它代表了细胞增殖的峰值(图2一). 此时,根据形态学和GFP表达,INL中98%的增殖细胞可以被表征为Müller胶质细胞。我们观察到,在4dpi时用BrdU标记的细胞在60dpi和180dpi时表达了双极细胞、无长突细胞、Müller胶质细胞和锥体感光细胞的标记物(数据显示180dpi图7). 神经节细胞在轴突到达顶盖的靶点后不久就失去了zn5的表达,虽然这些细胞是在早期检测到的,但在以后的时间点阻止了它们的识别(图6). 我们还检测到BrdU+水平细胞处于正确的层流位置的细胞(数据未显示),尽管斑马鱼没有针对这种细胞类型的标记。这些数据表明,在4dpi时用BrdU标记的细胞能够产生新的神经元和胶质细胞。当以2 dpi给药BrdU和以180 dpi测定细胞命运时,也获得了类似的结果(数据未显示)。新神经元生成的事实并不令人惊讶,因为损伤后再生的能力已经有很好的记录;然而,我们的数据强烈表明,这些新神经元来自表达α1T的Müller胶质细胞。
图7。
4dpi时被BrdU标记的细胞成为新的神经元和胶质细胞。在第0天受伤的鱼接受4 dpi的BrdU单次注射,并允许其恢复180 d。从这些视网膜切片中处理细胞特异性标记物,以识别视网膜细胞类型(红色),这些细胞来源于4 dpi时标记有BrdU(绿色)的细胞。一、BrdU+如zpr1内BrdU标记的细胞核所示,细胞在损伤后成为锥体光感受器+单元格(箭头)。b条,BrdU示例+/GS公司+穆勒-格里亚180 dpi(箭头)。c(c)、A HuC/D+无长突细胞来源于4 dpi处BrdU标记的细胞(箭头所示)。d日,一个PKC+双极性电池源自标记为4dpi的电池(箭头)。标记,细胞特异性标记。
尽管几乎所有的BrdU+4 dpi的细胞是Müller胶质细胞(见上文),我们想知道少数BrdU是否可能+/GFP公司−INL中标记为4dpi的细胞可能会产生所有的BrdU+我们在180dpi下观察到的细胞。我们在4dpi下用BrdU标记并在4,7,11和180dpi下检查视网膜的连续切片,从而进行了脉冲相位实验。我们统计了BrdU的数量+每个核层中的细胞,并计算BrdU的总数+每个病变的细胞数乘以BrdU的平均数+每个病变的细胞数(我们检查了4个4和11 dpi的病变,3个7和180 dpi的病变;我们收集了5个4、7和11 dpi的连续切片的载玻片,6个180 dpi的载玻片)(图8). 与我们观察到的增殖峰值出现在4 dpi时相一致,我们没有检测到BrdU数量的增加+7、11或180 dpi时的细胞,表明在4 dpi时用BrdU标记的细胞没有进行任何显著的细胞分裂。因此,少数BrdU不太可能+/GFP公司−存在于4 dpi的细胞可能负责产生所有BrdU+180 dpi的细胞。
图8。
在4dpi下用BrdU标记的细胞在以后的时间几乎没有增殖。在第0天受伤的鱼被给予单剂量溴化铀,剂量为4 dpi,在4、7、11或180 dpi时被杀死。收集并处理连续切片进行BrdU标记,以跟踪在4dpi下标记的细胞。每个病变中BrdU标记细胞的平均数量显示为每个检查时间点。BrdU数量+ONL和INL中的细胞随着时间的推移而减少,而GCL中标记细胞的数量在7dpi时增加,表明细胞已经迁移到那里。随着时间的推移,BrdU标记的细胞总数没有增加,这表明在4dpi时,BrdU标记的细胞通常不会在细胞周期中继续进展。事实上,细胞总数有所下降,表明一些标记细胞发生了凋亡。
基于2 dpi脉冲相位实验(补充图3,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 不出所料,BrdU的数量有所增加+7 dpi时GCL中的细胞和BrdU数量的相应减少+INL中的单元格(图8)表明细胞已经迁移。我们观察到BrdU的数量逐渐减少+随着时间的推移,这些细胞中的一些并不存在于视网膜中。这种减少在GCL中最为显著,其中估计有167 BrdU+7 dpi时每个病变的细胞数降至57 BrdU+180dpi时每个病灶的细胞数。GCL中细胞的减少表明视网膜细胞在发育过程中死亡(科尔和罗斯,2001年)再生视网膜成熟时也可能发生。
讨论
Müller神经胶质细胞在视网膜损伤后产生新的神经元和神经胶质细胞
几十年来,研究人员一直未能确定负责修复受损鱼类视网膜的细胞。尽管一些研究暗示了假定的INL驻留干细胞(Braisted等人,1994年;Otteson等人,2001年;Wu等人,2001年)Müller glia仍然是潜在的损伤诱导祖细胞。最近的研究表明,米勒胶质细胞能够在受伤的鸟类和哺乳动物视网膜中生成神经元,这进一步支持了这一观点(Fischer和Reh,2001年;Ooto等人,2004年). 迄今为止,旨在直接研究斑马鱼视网膜损伤后Müller胶质细胞是否会产生新神经元的研究尚不可能。
我们提供了一些证据,这些证据与米勒胶质细胞是斑马鱼视网膜再生的来源这一假设相一致。首先,几乎所有因损伤而分裂的细胞都是Müller胶质细胞。我们得出这一结论的依据是,大多数BrdU标记细胞(94%,4dpi)表达1016α1T:GFP转基因,几乎所有的GFP+细胞(98%)表达Müller胶质标记物。第二,表达α1T的Müller胶质细胞产生神经原簇(图4,5)它们被认为是产生新神经元以应对损伤的原因(Raymond等人,1988年). 第三,表达α1T的Müller胶质细胞表达被认为是视网膜干细胞标记物的基因,如Pax6和α1T(图4). 第四,最近划分GFP+来自米勒胶质细胞的细胞迁移到其他核层(图8)(补充图3,网址:网址:www.jneurosci.org作为补充材料)显示了视网膜各层神经元的补充能力。第五,GFP+来自Müller胶质细胞的细胞开始表达分化细胞标记物,如新生视网膜神经节细胞标记物zn5和HuC/D(图6). 此外,在4dpi下用BrdU标记的细胞最终会产生感光细胞、双极细胞、无长突细胞和Müller细胞(图7)展示了BrdU的多功能性+细胞。最后,76%在2 dpi处标记有BrdU的细胞位于INL内,表明BrdU+180dpi时发现的细胞来源于Müller细胞体所在的INL细胞。综上所述,这些数据强烈表明Müller胶质细胞是斑马鱼视网膜再生的主要来源。
虽然我们没有观察到大量的BrdU+除了Müller glia以外的其他细胞,我们不排除除Müler glia外,INL中假定的干细胞和ONL中的杆祖细胞也有助于再生的可能性。然而,通过基于BrdU的平均数量进行一些简单的计算+每个病变的细胞在4dpi时出现,我们得出结论,不太可能所有的BrdU+在180 dpi时观察到的细胞来自假定的BrdU+/GFP公司−INL中的干细胞。我们估计有14个BrdU+/绿色荧光粉−4 dpi时INL中每个病变的细胞数乘以BrdU的平均数+/GFP公司−以GFP的百分比在4 dpi的INL中观察到的细胞−同一时间点的电池(841 BrdU+细胞/病变×GFP细胞的1.6%−= 14). 如果这14个细胞负责产生估计的550 BrdU+我们在180dpi时观察到每个病变的细胞,它们必须在4~180dpi之间经历至少五轮细胞分裂。虽然在4到180dpi之间有足够的时间进行五次细胞分裂,但我们得出结论,这不太可能,原因有二。首先,我们没有检测到BrdU标记细胞的数量随着时间的推移而增加(图8)第二,五轮细胞分裂可能会将BrdU稀释到无法检测到的水平。这些数据表明,在4dpi下标记有BrdU的细胞在以后的时间点不会发生任何显著的细胞分裂。另一种解释是,BrdU的产生+细胞死亡与细胞对抗。然而,由于损伤后Müller胶质细胞未观察到凋亡(Yurco和Cameron,2005年)在4~7dpi之间,增殖细胞数量迅速下降,BrdU标记细胞在4dpi后似乎很少出现细胞分裂。
核运动间迁移是新生细胞分布的机制
在发育中的哺乳动物皮层中,放射状胶质细胞产生新的神经元,这些神经元继承了将新生细胞连接到大脑软脑膜表面的细胞过程(Noctor等人,2001年). 新生细胞核通过细胞过程从起源转移到目的地。这种神经发生模式产生放射状克隆细胞柱,在成人皮层形成一个功能单位。在鱼类视网膜胚胎发生过程中,发生了一个类似的过程,在这个过程中,一个分裂的每个子细胞维持着横跨正在发育的视网膜的一部分基础过程(Das等人,2003年). 基底突起为新生的细胞核提供了一条通道,使细胞体能够在不延伸到基底视网膜的新连接的情况下行进。三个观察结果表明,斑马鱼视网膜再生过程中可能存在类似的机制。首先,观察到增殖的表达α1T的Müller胶质细胞的细胞核在损伤后从INL迁移到其他核层(图8)(补充图3、4,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料) (Braisted等人,1994年;Wu等人,2001年;Yurco和Cameron,2005年). 第二,GFP+/锌5+来自Müller胶质细胞的细胞体似乎正在迁移到GCL,成为新的视网膜神经节细胞(图6). 第三,新生细胞似乎沿着Müller过程迁移到目的地(Vihtelic和Hyde,2000年). 基于这些观察结果,我们认为新再生的细胞保留了横跨视网膜的一部分亲代Müller胶质细胞过程。因此,这些细胞中的核迁移将类似于在哺乳动物皮层和斑马鱼视网膜发育过程中观察到的核运动,即新核只是通过其细胞质连接迁移到适当的核层,细胞过程被收缩或用于轴突的形成。
1016α1TGFP表达作为损伤诱导信号的报告基因
我们注意到,与损伤远端表达GFP的Müller神经胶质相比,损伤部位附近表达GFP的Müller神经胶质的百分比似乎更高。GFP表达的Müller胶质细胞的百分比从病变附近的90%以上变为病变远端的0%(数据未显示)。这一观察结果与之前的工作一致,表明距离损伤部位的距离与增殖细胞的数量直接相关(Yurco和Cameron,2005年)在视网膜受损最严重的部分有更多的α1T转基因表达(Vihtelic等人,2006年). 这些数据表明,Müller胶质细胞可能对损伤部位发出的损伤诱导信号作出反应,该信号可能参与α1T基因表达的激活。虽然启动视网膜再生的信号尚不清楚,但它们可能来自感光细胞,因为它们必须被破坏才能启动再生反应(Braisted和Raymond,1992年;Braisted等人,1994年). 在小鼠中,有证据表明光感受器通过内皮素受体向Müller胶质细胞发出损伤信号(Rattner和Nathans,2005年). 研究内皮素信号是否参与调节Müller胶质细胞对视网膜损伤的反应将是一件有趣的事情。