成纤维细胞表型从胎儿到成人的转变：它们与癌症发病机制的可能相关性

上皮组织和间充质组织通常在解剖学上很接近。来自间充质的信号对正常发育期间相关上皮的增殖、分化和形态发生产生深远影响(索耶和法伦出版社，1983年)在成年生物体中(Hill&Mackenzie出版社，1984年;库纳等. 1985); 相反，上皮影响间充质功能的各个重要方面，例如基质大分子的沉积和基质降解酶的分泌(卡明斯等. 1981;Johnson-Wint&Gross，1984年)。上皮和间充质以自我调节的方式相互影响的这种“动态互惠”的性质已经通过比塞尔等. (1982)可溶性因子（即旁分泌机制）和基质大分子都参与介导上皮-间充质相互作用(比塞尔等. 1982;特雷尔斯塔德，1984年;劳伦斯，1985年;Gurdon，1987年).

许多工作人员提出，成年人正常上皮-间充质相互作用的中断可能与包括肿瘤在内的各种增殖性疾病的发生有关（Cunha et铝. 1985;鲁宾，1985年)。该建议得到以下报告的支持：塞亚格等. (1985)这表明银屑病相关的上皮增殖和分化异常是由皮下组织中异常的成纤维细胞引起的。因此，值得注意的是，据报道，癌症患者的成纤维细胞表现出许多与转化细胞和/或胎儿细胞相关的异常表型特征。

在本文中，我们：（1）回顾了我们的数据，表明胎儿和成人成纤维细胞在胶原凝胶上表现出不同的迁移表型；（2） 讨论可能导致这些行为差异的生化机制；（3） 记录来自癌症患者的成纤维细胞对胎儿表型特征的表达；探讨胎儿样成纤维细胞在上皮性肿瘤发病机制中的可能参与。

成纤维细胞是一组定义不清的细胞体内通过它们在结缔组织中的位置在体外通过纺锤状形态、波形蛋白中间丝的存在以及间质胶原和纤维连接蛋白的合成等非特异性特征。转化成纤维细胞与正常成纤维细胞在许多行为和生化特征上不同，例如在半固体培养基中形成菌落的能力(Cameron&Pool，1981年).

我们以前曾报道过成纤维细胞向三维胶原凝胶的迁移受镀层密度的影响(朔尔等1985年)。在我们的标准迁移试验中，成纤维细胞以规定的低密度和高密度（即10^三和2.5×10⁺单元格厘米⁻²)培养4天。然后，通过在相位光学下观察培养物，并在凝胶的矩形区域内计数凝胶上和凝胶内的成纤维细胞，从而确定凝胶基质中发现的细胞百分比(Schor，1980年)。用三种具有代表性的（正常成人、胎儿和转化的）成纤维细胞系获得的结果如图所示图1这些数据揭示了细胞密度对成纤维细胞迁移的不同影响，即成纤维细胞系在低密度下迁移的程度相对较大，胎儿系在两种板密度下迁移程度大致相同，而转化细胞系在高密度下迁移幅度相对较大。为了定量表达细胞密度对成纤维细胞迁移的影响，我们定义了一个“细胞密度迁移指数”或CDMI，如下所示：其中“低密度百分比”是指在10^三单元格厘米⁻²“%高密度”是以2.5×⁴单元格厘米⁻²(朔尔等1985年)。应该注意的是，在CDMI的定义中使用了对数，以便于数据的图形表示。根据这一定义，显示出与图中所示成体细胞系相似迁移模式的细胞图1将有正的CDMI值，表现为胎儿系的细胞将有接近零的CDMI数值，而表现为转化系的细胞则有负的CDMI价值。

对大量成纤维细胞系进行的迁移分析结果证实，CDMI可用于区分成人、胎儿和转化成纤维细胞(图2); 我们发现成人和转化的成纤维细胞显示出完全不重叠的CDMI值分布特征，而胎儿细胞形成了介于两者之间的独特组。检查图2表明90%以上的成人成纤维细胞的CDMI值大于+0.4，而90%以上的胎儿成纤维细胞CDMI值小于+0.4；基于这些结果，我们根据经验将大于+0.4的CDMI定义为成人型，而低于此点的CDMI则定义为胎儿型。因此，CDMI提供了一种方便且新颖的“胎儿”行为标记物，可用于评估培养的成纤维细胞的表型在体外.

我们已经报道了从大约50%的乳腺癌患者中获得的肿瘤源性成纤维细胞表达胎儿样迁移表型(Durning公司等1984年)。从这些患者身上获得的表面上正常的皮肤成纤维细胞也表现出胎儿样的迁移行为，因此表明了这种行为异常的系统性。对从多种其他类型癌症患者以及间充质来源肿瘤（Schor等. 1985b条).

这些结果与越来越多的数据一致，这些数据表明，从癌症患者获得的成纤维细胞可能表现出一些通常与胎儿和/或转化细胞相关的表型异常；这包括增加伴刀豆球蛋白A的凝集性(乔杜里等1975年)、纵横交错的生长模式、生长的血清需求减少和凤尾鱼非依赖性生长(阿扎隆等. 1976, 1981;菲弗等. 1976;丹麦，1980年)，延长寿命在体外(阿扎龙等1984;温福德-托马斯等. 1986)肌动蛋白的组织和代谢异常(科佩洛维奇等. 1977;Antecol公司等. 1986)，收缩纤维蛋白凝块的能力下降（Curatolo等1982年），在接触抑制的上皮细胞单层上形成菌落的能力(阿扎隆等. 1984)免疫抑制小鼠结节的形成(史密斯等. 1976)和核型异常(林奇等. 1984)。这些研究中检测到的成纤维细胞既来自原发肿瘤，也来自远离肿瘤的明显正常皮肤。

很大一部分癌症患者皮肤成纤维细胞对胎儿样迁移表型的系统表达表明，遗传因素可能参与控制这种异常的表达。考虑到这种可能性，我们开始了一项研究，旨在检测乳腺癌患者皮肤成纤维细胞的迁移行为，这些患者被认为具有遗传决定的疾病易感性。

流行病学数据清楚地表明，遗传因素与某些罕见癌症综合征的易感性有关，如结肠腺瘤和直肠腺瘤。由于随机家族聚集的显著预测发生率，很难证明遗传因素与更常见类型的癌症（例如乳腺癌或支气管癌）有关。林奇等. (1984)通过在改良的核谱系中存在两个或多个受影响的个体，并与以下至少一个附加特征相关，从而在操作上定义遗传性乳腺癌：（1）垂直传播模式的证据，（2）双侧性，（3）发病早期，和（4）某些类型的第二恶性肿瘤的存在，例如卵巢癌。在最近的一项调查中，我们报告称曼彻斯特研究组中8-9%的乳腺癌患者符合这些假定遗传病的标准(哈吉等. 1985)，该值与之前报告的值非常一致林奇等.（1984年）.

来自散发性和遗传性乳腺癌患者的成纤维细胞迁移表型的比较数据见图313/23（56%）散发乳腺癌患者和16/18（89%）遗传性乳腺癌患者的成纤维细胞表达的CDMI值在胎儿范围内。散发性乳腺癌患者胎儿样成纤维细胞的高发病率表明，迄今尚未认识到的遗传因素可能是决定这类患者疾病易感性的有效因素。

从乳腺癌高发家庭收集的系谱数据表明，对该疾病的易感性是以常染色体显性遗传特征传播的(林奇等. 1984)。这与观察结果一致，遗传性乳腺癌患者未受影响的女儿一生中有50%的累积发病风险(奥特曼等. 1983)。我们检测了15名符合Lynch遗传性乳腺癌标准的患者的一级亲属的皮肤成纤维细胞的迁移行为；其中包括2个兄弟、1个姐妹、8个女儿和4个儿子。患者的正常年龄匹配对照（n）=12） 均为健康女性，无乳腺癌家族史。我们的数据表明，从遗传性乳腺癌患者临床上未受影响的一级亲属（男性和女性）中获得的成纤维细胞表达了异常迁移表型（10/15或67%）。这一发现明确支持这样的解释，即皮肤成纤维细胞的这种异常表达先于临床上可识别的上皮肿瘤的出现，而不是成纤维细胞与肿瘤细胞相互作用的次要结果。事实上，这些成纤维细胞在长时间传代后继续表达胎儿CDMI值在体外（斯科尔等.19856，1986）表明，这种异常行为模式是细胞的稳定表型特征，与细胞中存在的因素无关体内环境。

CDMI是一种测量电镀密度对细胞迁移影响的方法。低密度电镀电池（10^三单元格厘米⁻²)在4天的培养期内，细胞稀疏地分布在凝胶表面，而细胞在高密度（2·5×10⁴单元格厘米⁻²)在细胞附着和铺展后立即形成汇合层（即，接种后1.2小时）。在我们的标准迁移分析中，细胞以这样一种方式被镀，以便在凝胶表面上实现均匀分布。通过刻意以非均匀方式电镀细胞，获得了一些数据，这些数据为细胞密度影响成纤维细胞迁移的机制提供了一些见解，从而在凝胶表面的微域中建立了非常不同的局部密度。这是通过将接种物缓慢滴入凝胶中心，然后使成纤维细胞在最小的搅拌下附着来实现的。凝胶表面每个微域中的细胞密度，其中细胞在迁移分析中被计数，可以通过知道光学放大率和由分划定义的矩形场的面积来计算。使用此方法收集的数据如所示图4用于晚传递WI-38细胞（显示成体CDMI）及其病毒转化的对应物SV WI-38。这些数据表明，成纤维细胞迁移受给定凝胶微域中细胞密度的影响，其方式与之前报道的以不同密度均匀电镀的凝胶的方式相同（如图1)。这一发现表明，介导这种现象的机制在细胞的微环境中起作用，并不是由培养物中的平均细胞密度决定的。

中显示的数据图1,2和4表明在高细胞密度时，胎儿和转化的成纤维细胞迁移的程度大于成人细胞，而在低细胞密度时则相反。细胞密度的这种差异效应可能由多种机制介导，包括：（1）细胞诱导的凝胶中胶原纤维取向和/或堆积密度的改变；（2） 成纤维细胞沉积特定基质成分；（3） 细胞间的社会互动；可溶性因子的分泌。

伤口愈合过程中结缔组织的收缩归因于真皮成纤维细胞的活动。正常的成纤维细胞被镀在三维胶原基质中，对胶原纤维施加牵引力。该力与细胞数量成正比，导致自由漂浮凝胶显著收缩(潜水钟等. 1979;Allen&Schor，1983年)。将新生包皮成纤维细胞涂敷在凝胶表面，在凝胶的表面区域产生类似的胶原纤维压实(Grinnell&Lamke，1984年)。其他具有收缩功能的基质细胞体内例如平滑肌细胞和周细胞，也能使胶原蛋白凝胶致密(Schor&Schor，1986年)。相比之下，转化的成纤维细胞对胶原纤维施加的牵引力很小，因此与正常的成纤维纤维相比，凝胶的紧致性大大降低(斯坦伯格等. 1980)。我们之前已经证明，高浓度胶原蛋白会阻碍成纤维细胞向胶原蛋白基质的迁移(朔尔等. 1982)。正常和转化成纤维细胞对胶原纤维堆积的不同影响可能与细胞密度对这些细胞迁移的相反影响有关；即高密度的正常成纤维细胞预期比转化的细胞更大程度地收缩凝胶的浅表区域，从而抑制它们自身迁移到凝胶基质中。

我们检测了乳腺癌患者胎儿成纤维细胞和胎儿样成纤维细胞接触漂浮胶原凝胶的能力，并将这些结果与正常成人细胞和转化细胞的结果进行了比较(表1)。我们的结果证实了上述报道，正常成人成纤维细胞与胶原凝胶的接触程度显著高于转化细胞，进一步表明乳腺癌患者的胎儿成纤维细胞和胎儿样成纤维细胞根据这一标准与正常成人成成纤维细胞没有区别。因此，胶原纤维的不同收缩和/或重组似乎不太可能是胎儿和正常成人成纤维细胞表达的独特CDMI值的原因。

培养的成纤维细胞在体外沉积含有胶原、纤连蛋白、透明质酸和蛋白聚糖以及其他大分子成分的复杂细胞外基质。正常成纤维细胞合成纤维连接蛋白具有密度依赖性，与低密度相比，高密度细胞沉积的纤维连接蛋白数量显著增加(Mautner&Hynes，1977年)。我们之前已经证明，外源性纤维连接蛋白抑制正常成人成纤维细胞向胶原凝胶的迁移(朔尔等. 1981)。这些观察结果表明，正常成人成纤维细胞在高密度下迁移减少的可能机制；也就是说，在这种条件下，正常成人成纤维细胞产生的纤维结合蛋白数量增加会抑制其迁移到凝胶中。与正常成体细胞相比，转化的成纤维细胞合成的纤维连接蛋白水平大大降低，即使在融合培养中也是如此(海恩斯等. 1979)外源性纤维连接蛋白刺激其迁移(Ali&Hynes，1978年;朔尔等. 1981).

最近的报道表明，纤维连接蛋白实际上是一个由密切相关的分子组成的复杂家族，正常成人、胎儿和转化成纤维细胞合成的纤维连连接蛋白在氨基酸组成和糖基化方面存在差异(卡斯泰拉尼等. 1986)。分子精细结构的这种变化，特别是当它们影响细胞结合和胶原蛋白结合域时，可能会对成纤维细胞迁移产生不同的影响。

透明质酸是细胞外基质的另一个主要成分，已被证明可以刺激细胞迁移到胶原凝胶中(伯南克和马克瓦尔德，1979年)。胎儿和转化的成纤维细胞比正常成人成纤维细胞合成更多的透明质酸，这可能有助于这些细胞在高密度培养中显示出较高的迁移水平（Schor等.未发布的数据）。

I型胶原蛋白和HI型胶原蛋白的相对合成受细胞密度的调节，在稀疏培养基中产生更多的I型胶原酶，而在密集培养基中则相反(阿贝等. 1979)。胶原生物合成中这些与细胞密度相关的变化对成纤维细胞迁移的影响尚不清楚，目前正在研究中。在这种情况下，应该注意到胎儿成纤维细胞合成的III型胶原多于I型胶原(爱泼斯坦，1974).

当迁移的正常成纤维细胞发生碰撞时，它们会出现短暂的瘫痪，并很快开始向相反的方向运动，这一现象被称为“细胞运动的接触抑制”(阿伯克龙比，1970年)。在融合培养中，正常成纤维细胞在其周围的不同点与邻近细胞接触，因此不显示明显的迁移活动。相反，转化的成纤维细胞不显示接触抑制细胞运动。这些社会互动的差异可能导致在正常成年细胞的融合培养物中观察到的相对较低水平的迁移，以及在转化细胞的类似培养物中观察到的较高水平的迁移。胎儿成纤维细胞与正常成人细胞相似，表现为接触性抑制细胞运动(阿伯克龙比等. 1968).

胎儿和正常成人成纤维细胞在融合培养中所采用的定向细胞不同。如图所示图5正常成人皮肤成纤维细胞形成平行排列细胞的特征性漩涡模式，而胎儿成纤维细胞表现出与转化细胞相似的相当程度的重叠。乳腺癌患者的胎儿样成纤维细胞在融合培养物中形成平行排列的细胞阵列，在这个意义上与正常成年细胞无法区分。

我们最近报道了(朔尔等.1987a年)来自胎儿成纤维细胞的条件培养基（CM）刺激正常成人成纤维细胞在高密度培养中向胎儿细胞所特有的高水平迁移(表2) ; 胎儿CM对成人成纤维细胞在低密度培养中已经升高的迁移水平没有影响。因此，成人成纤维细胞暴露于胎儿CM中，总体上可以诱导其表达胎儿范围内的CDMI值。相反，成年CM在低密度或高密度下对胎儿或成人成纤维细胞的迁移没有影响，这表明成年成纤维细胞不产生细胞迁移抑制剂。

从癌症患者胎儿样成纤维细胞中获得的CM也含有迁移刺激活性，其特征与胎儿CM中发现的相似。胎儿和癌症患者成纤维细胞CM中迁移刺激因子（MSF）的初步生化特征表明，它对胰蛋白酶敏感，不耐热，不可透析，对烷基化/还原敏感(朔尔等.1987a年)。FPLC凝胶过滤数据表明，胎儿和癌症患者成纤维细胞CM中的MSF均为单峰，估计M（M）_第页约55×10^三（舍等.未发布的数据）。

初步研究表明，胎儿成纤维细胞CM对成人靶细胞迁移的刺激作用被链霉菌10单位毫升的透明质酸酶⁻¹这些数据表明，胎儿迁移因子的主要作用可能是刺激成人成纤维细胞合成透明质酸，进而刺激细胞迁移。这一结论得到了暴露于胎儿CM（Schor）的成人成纤维细胞透明质酸生物合成的直接测量的支持等.未发表的数据），并与不断增长的数据体一致，表明许多特征良好的肽生长和/或转化因子（例如EGF、TGF-β）对基质生物合成产生主要影响(伊格诺茨和马萨格，1986年).

综上所述，这些数据有力地支持了这样一种观点，即胎儿和成人成纤维细胞表达的CDMI值的差异主要是由胎儿细胞产生迁移刺激肽因子所致。与该因子的纯化和进一步的生物化学表征有关的数据将公布。

癌症患者及其未受影响的一级亲属的表面正常皮肤中存在异常成纤维细胞，这是一个相当出乎意料的发现，其解释尚不清楚。该领域以前的大多数研究都是针对来自相对罕见的癌症综合征患者的皮肤成纤维细胞，其中遗传因素在确定疾病易感性方面的作用是明确的（例如家族性大肠息肉病）。由于这些疾病的公认遗传性质，异常皮肤成纤维细胞往往被视为一种方便的细胞类型，用以证明基因组异常也由相关的靶上皮细胞群表达，但一般认为其本身并没有直接导致致癌过程(科佩洛维奇，1982年).

我们提出了另一种解释，但不是相互排斥的，这源于对上皮-肠系膜-细胞相互作用在控制细胞行为中所起的重要作用的认识（Schor等. 19876). 根据这一观点，假设仅由成纤维细胞表达的畸变会影响上皮性肿瘤的发展。更具体地说，我们建议：（1）胎儿成纤维细胞在正常发育过程中经历表型的程序性转变；（2） 这种从胎儿到成人的转变在某些个体中并不发生；（3）正常上皮-间充质相互作用导致的功能障碍使受影响个体处于癌症发生的高风险中。

我们已经证明，胎儿和成人成纤维细胞的迁移受细胞密度的不同影响。这些结果表明，胎儿成纤维细胞在正常发育过程中经历迁移表型的转变。我们的观察结果支持了这一建议（斯科尔等1985zz），在组织培养中50-55个群体加倍后（即大约3/4的克隆胎儿细胞株），克隆胎儿细胞系的CDMI值自发稳定地转变为正常成人范围内的表达在体外寿命）。这种从胎儿到成人的转变伴随着无国界医生的停止生产(表3).

胎儿和成人成纤维细胞在许多其他标准上存在差异；这包括在半固体培养基中形成菌落的能力(Nakano&Ts'O，1981年)各种生长和转化因子的产生(克莱蒙斯，1983年;劳伦斯等. 1984;艾辛格等. 1985)上皮细胞分散因子的产生(Stoker&Perryman，1986年)以及基质大分子特殊亚型的合成(Matura和Hakomori，1985年;卡斯泰拉尼等. 1986)。在发育过程中的不同时期，包括新生儿期，都会出现这些特征的程序化胎儿到成人的转变，并被认为在组织相互作用的控制和整合中发挥着重要作用(卡普兰等1983年).

癌症患者成纤维细胞表现出的异常表型特征通常从细胞转化的角度进行讨论。然而，胎儿成纤维细胞显示了许多用于定义转化的表型特征（如前一节所示），从而支持了这样的观点，即癌症患者的异常成纤维细胞应被正确地视为胎儿样。在这方面，可以指出鲍陶尔等. (1986)据报道，单克隆抗体VIF3特异性识别胎儿成纤维细胞上的决定簇，但不识别正常成人细胞；免疫定位研究表明，该抗体也染色了与全部的他们检查的癌症。奇奎特·埃里斯曼等. (1986)证明新描述的基质大分子tenascin存在于各种胎儿结缔组织中，但在成人组织中通常不存在；有趣的是，tenascin在与乳腺癌相关的基质中持续存在。

以下研究为这一假设提供了直接的实验支持樱花（1983）who观察到，将胎儿（而非成人）成纤维细胞植入成年大鼠乳腺可诱导正常腺上皮细胞的增生性生长，并使其对致癌剂引起的明显肿瘤转化更加敏感。随后的研究表明，胎儿成纤维细胞产生一种可溶性因子，可促进正常成人乳腺上皮细胞的增殖并抑制其分化(塔加语等. 1983).

我们假设的中心点是，成纤维细胞的某些异常表达可能与上皮性肿瘤的发生有关。

如果事实确实如此，这种模式对于人群筛查和针对基质成纤维细胞而非肿瘤上皮细胞开发新型预防或治疗药物具有深远的临床意义。

这项工作完全得到了癌症研究运动慷慨的研究拨款的支持。作者感谢G.Rushton先生提供的卓越技术援助。