细胞运动分析的统一方法

细胞运动研究中的一个突出问题是如何控制和协调运动机制。它的整体动态是什么？在过去15年左右的时间里，对运动机械的分子成分及其相互作用的分析取得了巨大进展，特别是在那些与肌肉有明显同源性的相互作用方面。这些成分的组装和拆卸动力学现在也开始出现，我们也许离理解细胞运动的许多基本分子相互作用不远。我们如何在分子水平上将这些特性与整个细胞的行为特性联系起来？

在细胞行为的水平上，讨论细胞收缩、牵引、突起或持续方向的机制往往很方便，就像它们是孤立的过程一样，并且很容易将每个过程与单独的分子机制联系起来。例如，第一种可能涉及肌动蛋白-肌球蛋白相互作用，第二种可能需要额外的跨膜分子连接系统；第三个可能需要肌动蛋白组装和第四个微管蛋白组装，以及与其他蛋白质的相互作用。然而，大多数研究人员都同意，这些过程具有一定程度的相互依赖性，即使它们只是利用共同的分子池，并且受到诸如离子浓度变化等全球因素的共同影响。然而，将运动系统视为易受个体分析影响的相对独立子系统的集合仍然存在危险。例如，存在这样一种可能性，即这些过程在更深层次上是相互依存的。牵引、收缩、突起和方向上的持久性可能只是一个基本过程的表面特性。在分子水平上理解这些过程最终将需要有关它们相互依赖的结构的硬信息。

虽然原则上，对分子相互作用的透彻了解应该足以预测生物系统的所有属性，例如细胞的运动机制，但现在人们越来越认识到，这种信息本身可能没有多大帮助。一个经典的类比是Belousov-Zhabotinsky反应，其中相当简单的自催化反应结合在一起，产生了意想不到的复杂度的栩栩如生的变化模式(图1). 操纵实验参数揭示了模式的新方面，从潜在分子相互作用的知识来看，这些模式在实践中是不可预测的(Agladze和Krinsky，1982年). 有趣的是，实验者使用细胞生物学家熟悉的方法来研究反应，例如用针戳。阻碍理解这一现象进展的并不是对潜在反应的化学知识不足，而是对模式动力学和自催化系统动力学理论的知识不足。批量系统的这些新属性通常是由组织较低级别的底层属性意外产生的，这些新属性被称为“紧急属性”(科特雷尔，1977年).

普里戈金和他的同事们现在认为许多生命过程的涌现性质是“远离平衡”热力学的结果，类似于Belousov-Zhabotinsky反应(普里戈金和斯滕格斯出版社，1984年). 例如，这种反应与黏菌的聚集有着密切的相似性。图2显示了两张来自《希思》（1983）并将其与图1，甚至有一个有趣的迹象表明，成纤维细胞中基于肌动蛋白的运动与Belousov-Zhabotinsky反应的动力学有一些相似之处。如果我们采用普里戈金的观点，那么我们对运动过程控制的最终理解将取决于对系统整体稳定性特性的了解，以及系统各部分之间相互通信的模式，而不是对单个分子相互作用的详细了解。如果我们最终能够知道一个移动细胞中所有分子的位置，以及它们是如何移动的，我们可能仍然会发现自己处于这样一个位置，用科特雷尔的话来说，“那时我们会知道有关这片物质的一切，但对它一无所知”。

然而，有一种方法可以理解动态属性是如何从底层交互中产生的。这是为了使用计算机模拟分子相互作用，并观察模型中出现的体积特性。从前面的演示中我们可以看到（见Oster，本卷），这种方法在研究细胞运动方面具有相当大的潜力。如果没有出现适当的属性，则模型明显不足；这种建模的强大之处在于它有助于拒绝关于分子相互作用的假设。不幸的是，如果确实出现了适当的属性，这并不能证明模型是正确的，也不一定意味着我们能够理解属性是如何出现在模型中的。尽管如此，这种方法可能是在两个级别上关联属性的最有希望的方法之一，因为它绕过了理解属性如何出现的需要。重要的是要认识到，任何此类模型的性能只能通过它与两个级别的动态匹配程度来判断。

无论是测试模型的有效性，还是检查实验或基因变化对运动的影响，还是仅仅研究其自身的涌现特性，最终都需要对整个细胞水平上的运动动力学有详细的了解。关于细胞运动的涌现特性，已有大量实验，但很少尝试定量描述这些特性。这可能看起来很明显，但需要强调的是，对过程的任何解释都只能描述过程的特征。组织细胞的运动过程似乎是一个概率或随机过程，因此，其定量描述将包括一组变量的联合统计特性，每个变量都描述了该过程的某些方面。分析细胞运动的目的是发现运动过程的这些不同方面之间的相互依赖性。

定量分析除了可以准确、客观地描述运动性外，还可以对其机制有重要的见解。它的局限性在于，它对运动的分子机制一无所知，除非一些变量被人为地用来表示分子事件，而且众所周知，很难将统计相关性解释为因果关系。考虑到这些局限性，该方法提供了一种捷径来回答这样的问题：“细胞改变速度的机制是否独立于其改变方向的机制？”以及“伸出和收缩相互依赖的时间常数是什么？”如果普里戈金是对的，那么在涌现性质的层面上直接解决这些问题，然后寻求分子解释可能比试图从分子相互作用的研究中预测涌现性质更有效。

鉴于我们想研究许多不同类型的变量之间的相互关系，指定一种分析细胞行为的通用方法似乎是一项毫无希望的任务，但这种方法广泛应用于气象学、经济学、社会学和工业过程控制领域。一种强大且非常通用的统计方法被称为时间序列分析，细胞行为领域的分析要求与这些其他领域的要求非常吻合，令人惊讶的是，时间序列分析方法在很大程度上被细胞行为学家所忽视。

其目的通常是确定数据序列中连续观测之间的统计相关性，以期预测序列的未来发展或可视化潜在过程。该方法是通过从数据中估计每个变量的大型相关矩阵来初步表示这种依赖结构。自相关表示变量在任何时候的值如何依赖于其先前的值，而互相关表示它如何依赖于系统其他变量的当前值和先前值。这种描述在解释之前通常需要简化，下一步是将相关矩阵的显著特征表示为一个模型，通常是一个随机差分方程，该模型具有与原始观测值相同的统计特性。最后，可以对适合离散观测值的模型进行改进，以生成基于微分方程的模型，该模型表示潜在的连续过程。理想情况下，我们最终得到一个与底层过程具有相同统计特性的模型，而不管我们观察该过程的频率如何，甚至错误程度如何。

现在已经发布了几个方案，其中实现最终模型的程序几乎是自动的(Box&Jenkins，1970年;查特菲尔德，1975年;Pandit和Wu，1983年). 实现这些方案的计算机例程现成可用，我们主要使用NAg FORTRAN Library（Numerical Algorithms Group Ltd）的时间序列分析部分（G13）。

没有严格的规则来指导变量的选择。传统显微镜下培养中移动的成纤维细胞图像呈现出无限的潜在可测量变量。每个变量代表一个连续的过程，在给定的时间间隔内可以取任意多的值。然而，通过对活细胞及其活动装置进行成像的特殊技术或通过实验程序，也可能引入其他潜在变量。

然而，也有一些粗略的指导方针。如果大多数可用的分析方法都是有用的，那么运动过程应该以统一的时间增量进行采样，变量没有缺失值。采样间隔应足够短，以检测给定变量连续值之间的相关性。另一个准则是，查看已知变量之间的关系可能没有什么信息先验的携带类似信息。例如，它很少告诉我们有关细胞运动的信息，即细胞核的长度与其面积密切相关。最后，一个可取但不重要的属性是，由变量表示的每个过程都应该是平稳的。这意味着，尽管每个变量明显随时间变化，但其统计特性不应随时间变化。例如，细胞从给定起点的位移并不是一个平稳的过程，因为我们预计其值会随着时间而增加。但我们可以预计，如果实验条件保持不变，细胞位移在连续的短时间增量（例如1分钟间隔）内不会显示出随时间增加或减少的一般趋势。第一个是从实验开始时测量总运动能力，而第二个是测量运动能力水平。

在一个试点项目中，我们选择了一种简单的细胞运动形式：所谓的“随机”运动，即在平面二维基质上培养的孤立成纤维细胞的自由游走。我们使用原代鸡心成纤维细胞，在琼脂下培养，使细胞突起倾向于局限于显微镜的图像平面。成纤维细胞以1分钟的间隔使用时间推移进行相位对比拍摄。通过将每张图像投影到数字化平板上，并用光标沿着每个细胞的边缘，然后沿着细胞核的边缘，将这些胶片上的数据输入计算机。对于一个拍摄时间超过5小时的典型成纤维细胞，计算机中的原始数据由300个不规则多边形的位置表示组成，每个多边形约有120个顶点，另外300个多边形约有40个顶点。这些代表细胞和核轮廓在1分钟间隔内的相对位置和方向。图3显示了从一个成纤维细胞获得的细胞轮廓序列。

所选变量分为四类，具体取决于它们是否携带矢量或标量信息，以及它们是直接根据轮廓计算的还是根据连续轮廓之间的差异计算的。二维向量的规格需要两个数字，而标量只需要一个数字。由于现有的时间序列分析软件通常只接受标量变量，因此处理矢量变量存在一些困难。将矢量变量拆分为幅度变量和方向变量对于检查相关性并不理想，因为在使用角度描述方向时总是存在不连续性（例如0°等于360°）。然而，许多程序将接受相关矩阵而不是原始数据作为输入，因此对于这些程序，只需要定义向量的相关性。我们通过累加向量的标量（点）积之和来实现这一点，而不是像在普通相关性中那样累加乘积之和(陈，1952年)如下所示。请注意，我们使用的所有向量都假设在大样本细胞中各向同性分布，因此我们假设总体平均值为零，而不是从样本平均值中取偏差。使用相关矩阵输入程序还允许汇集来自几个单元格的数据，而接受原始数据的程序通常只处理每个变量的一个时间序列。

固定短时间增量上的单元位移是根据连续位置向量的第一差计算的向量变量的示例。细胞的位置可以用多种方式定义，但从我们的数据计算它的两种明显方法是使用细胞的几何质心和核轮廓。我们同时使用这两种方法，目的是找到更简单的细胞运动描述。这些变量表示细胞的变化速度（实际上是短时间增量的平均速度），即使它们本身也包含大量关于细胞运动性质的信息。由于变量采用矢量值，因此它们包含方向变化和速度变化的信息。我们将在下一节中对其进行初步分析。

凸出和收缩是从连续轮廓之间的差异计算出的标量变量的示例。凸出是指轮廓覆盖但未被前一轮廓覆盖的所有底层区域，收缩是指轮廓未覆盖但已被前一个轮廓覆盖的全部区域，如所示图4.突出和收缩的大小和配置一起完全决定了位移，因此我们预计它们的大小和位移的大小之间会有一些紧密的关系。但是，前伸和后缩之间的关系可能更具信息性，因为它代表了运动系统的基本控制水平：它将给出稳定运动细胞扩散区域的反馈回路参数。这种反馈机制必须存在，否则整个运动过程将显示失控的不稳定性。图5由Dunn&Heath进行的一系列实验表明，如果移动的成纤维细胞的尾部被人为地从基质上分离，它会迅速收缩，在短暂延迟后，细胞前缘会出现一股突起增加的波(邓恩，1980;陈，1981). 检查自由移动的成纤维细胞中这两个变量之间的时滞相关性将提供有关控制回路对称性的信息：是否是收缩通常会导致突出或反之亦然或者他们的角色是否对称。

这些动力学令人感兴趣的另一个原因是，这些过程可能代表单独但相互作用的分子事件。陈（1981）研究表明，尾部收缩至少部分可能是肌动蛋白-肌球蛋白网的主动收缩邓恩（1980）提出了在运动过程中，细胞活动边缘的网状结构通过并行的连续拆卸、运输和重组过程，不断收缩并保持稳定状态。缩回和伸出之间的时间差将指示拆卸和运输干预过程所需的时间延迟。要检查自由移动单元中的两个时间滞后，可能需要比我们在试点项目中使用的1分钟间隔更好的时间分辨率，我们将把此分析留到以后的论文中。

对于每个细胞轮廓和每个细胞核轮廓，我们通常计算所有10个矩，直到并包括三阶矩。我们之前已经描述了如何从细胞数字化图像的像素计算矩(Dunn&Brown，1986年)但是，需要一个更复杂的算法来根据多边形轮廓计算它们，我们很快将在另一份出版物中描述这一点。力矩仅表示轮廓的面积和力矩米_周计算单元质心位置时需要和此力矩。确切地说，如何从高阶矩中导出形状和方向的合理度量不再是一个完全自动的过程，但其思想通常是将尺寸、位置、形状和方向信息分离为单独的变量。胡（1962）描述了如何获得从矩到三阶的一系列七个旋转不变形状度量。我们描述了形状和方向的测量，从力矩计算到二阶，更容易理解为电池的紧密度和伸长率等测量(Dunn&Brown，1986年). 三阶矩可以计算出三个矢量变量；每一个都可以解释为细胞形状不对称的局部最大值的大小和方向。一些成纤维细胞轮廓以及其中一些变量的表示如所示图6可以看出，最大不对称矢量指向与两个极化细胞明显运动方向相反的方向。

从前面的内容可以清楚地看出，即使是对大纲中可用的数据进行彻底的分析，也可以发展成为一个重大项目，特别是因为至少有两种截然不同的定量描述细胞形状的方法（使用

傅里叶变换和中轴变换）可能会导致对细胞运动的更简单描述。一系列多元时间序列分析将每个行为变量（例如1分钟速度、1分钟凸出量等）作为输出序列，将一个或多个形状和方向描述作为输入序列，将提供形状、伸长率方向、不对称方向等与凸出量之间的相关信息，回缩和行驶速度和方向。更重要的是，为了深入了解运动机制，他们还将提供关系的时间优先级信息。例如，在行为发生特定变化之前，是以形状、方向或对称性的变化为特征，还是这些变化跟随行为的变化？我们希望以下对数据子集的初步分析将说明该方法的一些潜力。

图7是在大约5小时内拍摄的单个成纤维细胞的细胞轮廓质心的1分钟位移在1至100分钟的时间滞后时的自相关直方图。该相关图是细胞迁移能力的图片，因为自相关曲线下的面积以及位移的方差，确定总平方位移天²之后的单元格n个1分钟步长：

相关图中与显著自相关相关的最大滞后显示了细胞持续运动的程度。在图8这个最大的滞后表明细胞的速度与大约提前1h的速度显著相关。然而，这种1小时的保留时间并不意味着细胞除了运动本身保留的记忆外，还有其他任何类型的单独记忆。自相关过程的一种非常简单的形式，即一阶自回归或马尔可夫过程，也具有这种性质。这就好比沙漠中的旅行者试图沿着直线行走，使每一步都与前一步的方向准确对齐。除了记住前面的步骤外，这不需要记忆，但任何时刻的行进方向都与前面的许多步骤相关。

部分相关图是揭示成纤维细胞是否对其先前的运动有更复杂的记忆的一种方法。在这种情况下，针对较小滞后时的相关性影响，对每个相关性进行校正。例如，第二个部分自相关在考虑到相邻位移相似的事实后，测量由干预位移分隔的所有位移对之间的相似性。合并的部分相关图图9使用NAg例程G13ACF从合并的自相关中计算。从这个偏相关图中可以看出，前两个或三个偏自相关可能是显著正的。对于离散马尔可夫过程，如沙漠旅行者的行走，应该只有一个非零偏自相关。这表明，成纤维细胞能够更准确地保持其运动速度和方向，而不是通过每个位移与前一个位移之间的相似性来解释。这表明存在一个单独的记忆或引导系统，在持续2或3分钟的微小偏差后，使成纤维细胞回到正常轨道。

虽然2或3分钟不是很长的时间，考虑到成纤维细胞大约需要一个小时才能覆盖其自身长度，但了解运动机制很重要，以发现这种短期记忆的明显证据是否具有误导性。细胞运动观察中有两种内在效应，它们可以结合起来产生虚假的偏自相关。首先，观察到的过程由离散间隔的样本组成，而运动的基本过程是连续的。第二，在估计位置时不可避免地会出现一些错误；成纤维细胞明显偏离其路线可能是由于这些错误。为了解释这些偏自相关是如何产生的，我们必须介绍一些连续随机过程和观测误差的理论。

通过以这种方式对连续O.U.过程进行采样而导出的ARMA（1,1）过程可以通过以下事实来识别θ取决于，因为两者都取决于基础参数β这种关系的细节相当复杂，我们可以在稍后的一篇更具理论性的论文中发表。这里只需说，如果采样间隔相当短，那么，如果⌀的值远高于0·5，那么θ应具有接近2-√3或大约0.268的值。我们从一维过程的考虑中得出这个结果并不重要；很容易表明，我们在上面定义的点自相关与投影到任何轴上的运动的传统自相关具有相同的期望。样本点自相关仅提供两倍于运动的信息，因此可以更好地估计总体值。

可以进一步表明，单元位置随机误差的影响是产生一个更复杂的随机过程，称为ARMA（1,2）模型。在将ARMA模型拟合到细胞易位数据之前，通过对观测误差影响的自方差进行补偿，可以避免这种复杂情况。c（c）_o个应将误差方差减少两倍c（c）₁应增加误差的方差。然而，这需要事先了解误差的变化，另一种方法是找出观察到的成纤维细胞运动是否像是在取样过程中引入位置误差的O.U.过程。

图10是使用NAg程序G13CAF从自相关函数中获得的成纤维细胞混合1分钟位移的功率谱。这显示了细胞速度和方向的变化是如何分布在不同的频率上的。理论上，采样O.U.过程的频谱应随着频率的增加呈指数下降，随机位置误差的影响是添加另一个频谱，该频谱以高频端误差方差的2/π倍从零到平台呈S形增加。这正是光谱图10看起来像。移动细胞的缓慢变化的速度和方向导致频谱低频端的大浓度，而由观测误差引入细胞轨道的快速随机摆动由向高频端逐渐增加的噪声水平表示。根据高频平台水平估计的误差方差为0.314μ米²当对该估计误差进行自相关补偿并拟合ARMA（1,1）过程时，θ的估计值为0.245，与预期值0.268非常接近。补偿自相关得到的频谱如所示图11因此，在补偿了仅为0.560的观测误差后μm标准差时，自相关结构几乎与采样O.U.过程的预期结构完全相同。

总之，我们没有发现证据表明成纤维细胞移位是两个维度中最简单的连续随机过程：O.U.过程。数据集目前还很小，共有1378个大纲，随着收集到更多数据，可能会出现与O.U.过程的微小但显著的偏差。特别是，当不同的成纤维细胞在不同的情况下进行检测时，发现运动性的随机踢腿在运动轴上的强度与在该轴上踢腿的强度相同，这可能只是巧合。然而，很明显，1分钟采样频率接近分析成纤维细胞移位的实际时间分辨率极限。虽然确定细胞质心的估计误差只有0.560的标准偏差微米在1分钟间隔内观察到的合并成纤维细胞位移的标准偏差仅为l·97μm.有趣的是，用核轮廓的质心代替细胞轮廓的估计误差较大，标准偏差为0.831微米这可能意味着核的观测误差更大，因为它们的轮廓往往没有细胞轮廓那么清晰，也可能是核质心是运动过程的一个不太基本的标记。

O.U.过程是一个连续的马尔可夫过程，这意味着该过程的未来进展仅取决于其当前状态。对于成纤维细胞来说，这意味着它们对早期的运动没有可检测的记忆。例如，可以认为细胞质微管系统可以构成一个相对稳定的先导系统，在微小的偏差后将运动方向带回正轨。也可能是整个运动机制以确定性的方式振荡，就像大多数多细胞生物的运动一样。这两种可能性都没有得到分析的支持。方向的改变似乎也不是由一个单独的转向机构控制的，这个转向机构也可能是微管系统，因为速度的改变似乎是由与方向改变相同的随机踢腿引起的。

在更深层次上，这意味着朗之万方程可能在某种意义上代表了细胞运动的物理机制。这表明某些实验处理可能会影响参数一和β彼此独立。对α的任何影响都会改变速度，但持久性只应受到短暂影响，而对β的影响则会改变速度和持久性。有趣的是，在这方面威尔金森等. (1984)发现了一种影响中性粒细胞运动速度但不影响持久性的实验性治疗方法。由此可以预测，可能会发现一种治疗方法以与均方速度相同的比率影响持久性，但不太可能只影响持久性。

当然，现在推测以下分子过程还为时过早一和β，但很清楚它们可能代表什么样的过程。小而快速变化的波动或随机井涌表现为n个（t） 在Langevin方程中，累积以确定O.U.过程的当前运动状态或速度和方向。参数α测量这些波动的强度，参数β测量它们对运动的影响消退的速度。如果我们认为细胞当前的运动状态是由其运动机制中的当前不对称状态决定的，那么对随机波动积累的一个明显解释是，它们是运动机制某些组件组装过程中的波动。参数一代表波动的强度β可能代表组装结构的周转率。因此，β将决定不对称性在大小和方向上随时间漂移的速度，或者换句话说，它将决定运动缺乏持久性。

成纤维细胞移位似乎是一个非常简单的随机或非确定性过程，这一事实支持运动机制的自组织，其过程类似于Prigogine形成的远场平衡或耗散结构。用的话来说季（1985）“细胞的平衡结构可能赋予细胞类似机器的、确定的特性，而耗散结构可能导致活细胞的非机器的、不确定的和不可预测的、生命的行为。细胞的类似机器特性是由于所有分子都倾向于寻找它们的分子。”由相互作用分子的结构互补性决定的最小自由能态。非机器性质反映了远场平衡系统在超过临界阈值后演化为新稳态的能力，而这些新状态是不可预测的，因为它们受到热涨落和微环境因素的影响”。

无论Prigogine和Ji的观点是否适用于细胞运动过程，很明显，我们必须解释的基本机制是不对称是如何从新扩散的成纤维细胞的完全对称的圆形状态发展而来的；成纤维细胞只有在形成这种不对称性后才能移位。从我们的分析来看，这种不对称似乎是由于快速波动的积累造成的，这些波动在方向和强度上都是随机的。不对称性似乎并不是从一开始就存在的，因为它可能是由中心体相对于细胞核的位置决定的。在这方面，有趣的是，看看在一个刚镀膜的成纤维细胞中开始运动的时间过程是否与以零速度开始O.U.过程的时间过程相匹配。普里戈金的观点为这种不对称的发展提供了一种假设机制：涨落的起源可能是热运动和其他微环境因素的放大，这被认为是混沌系统中破坏对称性的常见机制。如果这个观点是正确的，那么成纤维细胞明显的定向组织可能是定向移位的结果，也是其原因之一。这些问题只能通过更详细地检查细胞运动的整体动力学来解决。

我们感谢A.K.Kernaghan小姐提供的出色技术援助。这项工作得到了医学研究委员会的支持。