ASIP/PAR-3参与促进上皮紧密连接形成

上皮细胞在分离生物隔室以调节体内平衡和维持分离生物环境中的生理功能方面发挥着重要作用。这些功能是通过有组织的连接复合体、细胞骨架结构、不同的质膜结构域和高度极化的蛋白质分选来建立的(Yeaman等人，1999年;Balda和Matter，1998年). 连接复合体的一种形式，紧密连接（TJs），其特征是传统电子显微镜显示为相邻细胞细胞膜上的一系列融合点，在冷冻断裂电子显微镜中显示为膜内吻合链，即TJ链(法夸尔和帕拉德，1963年;施泰赫林，1973年). TJ作为细胞间屏障调节脊椎动物上皮细胞和内皮细胞的细胞旁通透性。此外，TJ是建立上皮细胞极性的基本结构之一，因为TJ链在膜双层内提供物理屏障，防止膜结构域的混合，从而保持细胞表面的不对称性(Mitic和Anderson，1998年;Tsukita等人，1999年). 此外，一些证据表明，TJ可作为囊泡靶向的特定位点，以建立和维持细胞膜的上皮极性(Yeaman等人，1999年).

我们之前已经鉴定出一种具有三个PDZ结构域的新蛋白质，一典型PKC同型-秒特定的我相互作用第页蛋白（ASIP），在融合成纤维细胞和上皮细胞的细胞-细胞连接处与aPKC共定位。免疫金电镜显示ASIP定位于大鼠肠上皮TJ(Izumi等人，1998年). 此外，ASIP/PAR-3与两种无脊椎动物极性蛋白显示出显著的整体序列相似性，秀丽隐杆线虫PAR-3和果蝇属Bazooka和ASIP/PAR-3中高度保守的区域之一对与aPKC激酶结构域的相互作用至关重要(Izumi等人，1998年;Etemad-Moghadam等人，1995年;Kuchinke等人，1998年). 此外，ASIP/PAR-3和aPKC之间的物理相互作用在秀丽线虫PAR-3和PKC-3以及果蝇属Bazooka和DaPKC(Izumi等人，1998年;Tabuse等人，1998年;Wodarz等人，2000年). 免疫荧光和遗传分析秀丽线虫和果蝇属揭示了每对蛋白，PAR-3和PKC-3或Bazooka和DaPKC，在经历不对称细胞分裂的各种细胞中都显示出不对称共定位，并且这两种蛋白在正确定位方面相互依赖，以调节纺锤取向和其他细胞命运决定因素的分布(Tabuse等人，1998年;Wodarz等人，2000年). 这些数据表明，进化上保守的蛋白质复合体参与调节各种细胞极性和分化事件；然而，aPKC-ASIP/PAR-3相互作用在哺乳动物中的生理意义仍有待阐明。

在本研究中，我们发现ASIP/PAR-3分布于各种大鼠上皮细胞的顶端细胞-细胞连接处，但其分布方式与另一种TJ-相关蛋白ZO-1明显不同。虽然ZO-1染色模式显示与TJ的发育水平有很好的相关性，但在所有检查的上皮细胞-细胞连接中都可以检测到ASIP/PAR-3，包括那些没有高度发育的TJ链的上皮细胞-细胞连接。此外，aPKC对上皮细胞中TJ的建立至关重要(Suzuki等人，2001年)这些数据使我们分析了ASIP/PAR-3可能在TJ形成和/或维持中发挥调节作用的可能性，而不仅仅是作为结构元素。事实上，我们的功能和生化分析表明，ASIP/PAR-3的过度表达，而不是其缺失aPKC结合序列的缺失突变，促进了上皮性MDCK细胞中TJ的形成。此外，aPKC结合序列包括两个高度保守的PKC磷酸化共识位点[Ser827和Ser829(Izumi等人，1998年)]表明ASIP/PAR-3的这种功能是通过aPKC磷酸化介导的。数据显示ASIP/PAR-3在Ser827被磷酸化，并在TJ形成期间集中于MDCK细胞的最顶端细胞-细胞接触，进一步支持了这种可能性。总之，这些结果提供了第一个证据支持ASIP/PAR-3通过与aPKC相互作用促进上皮性TJ形成。

MDCK-Tet-Off细胞系[建立于MDCK II型细胞系(Barth等人，1997年)]携带潮霉素抗性基因的pTRE（GenBank登录号U89931）和pTK-Hyg（GenBank登录号U40398）购自Clontech（加利福尼亚州帕洛阿尔托）。四环素（TC）和强力霉素（DC）购自西格玛（密苏里州圣路易斯）。

pTREHis/L-ASIP WT编码大鼠ASIP序列的一个剪接变异体（K.M.和S.O.，未发表），该序列缺失六个组氨酸残基下游的氨基酸（a.a.）残基740-742和857-871，以及来自T7基因10-leader序列的11-a.a.序列。pTERHis/L-ASIPΔPB编码缺失残基740-742和aPKC结合序列[残基827-856（K.M.和S.O.，未发表）]的小鼠（N末端989 a.a.）和大鼠ASIP/PAR-3（C末端315 a.a.）剪接变体的T7标记嵌合体。这两种蛋白的表达受四环素可抑制反式激活剂的控制(Gossen和Bujard，1992年).

如前所述，针对aPKC结合区域（C2-3；残基712-936）、第三PDZ结构域（P2-2；残基584-708）和C末端区域（A2-2；残基1124-1337）的GST融合蛋白制备兔抗ASIP/PAR-3抗体(Izumi等人，1998年). 针对与残基1023-1034（NH₂-MFSLAKLKPEKR-COOH）和残基822-832在Ser827（NH）磷酸化₂-CGFGRQpSMSEKR-COH）。针对KLH偶联抗原产生的每个兔抗体都经过亲和纯化（Y.T.-N.和S.O.，未发表）。小鼠抗ZO-1单克隆抗体由S.Tsukita（日本京都京都大学）善意提供或从Zymed实验室（加利福尼亚州南旧金山）购买。兔抗闭塞素多克隆抗体、兔抗T7多克隆抗体（Omni探针）、小鼠抗T7单克隆抗体、FITC-结合二抗和Cy3-结合二抗购自Zymed Laboratories、Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）、Novagen（威斯康星州麦迪逊）、E.Y.Laboratory（加州圣马特奥）和Amersham Life Science（伊利诺伊州阿灵顿高地）。

大鼠各种器官和肠上皮细胞刮片的样本(Saxon等人，1994年)进行SDS-PAGE(莱姆利，1970年)并电转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后将其浸泡在5%脱脂牛奶和10%小牛血清中的PBS（137 mM NaCl，8.1 mM Na₂高性能操作₄2.68 mM KCl和1.47 mM KH₂人事军官₄). 首先将膜与亲和纯化的抗ASIP抗体（C2-3AP、A2-2AP或Yap）孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联二级抗体孵育。通过化学发光ECL plus系统（Amersham Life Science）检测抗体。

成年大鼠前胃(Izumi等人，1998年)和十二指肠(Saxon等人，1994年)按照描述进行制备。将一只12周龄大鼠的肾脏在冰镇PBS中冲洗，切成小块并浸入副甲醛赖氨酸周期固定剂中(麦克林和纳卡内，1974年)在4°C下保持30分钟。固定后，用含有50 mM NH的PBS清洗组织三次₄在4°C下氯化15分钟，并在4°C.下PBS中30%（w/v）蔗糖中冷冻18小时。将组织块嵌入tissue-Tek OCT复合物中并冷冻。冰冻标本在低温恒温器中切割至约4μm厚，安装在玻璃载玻片上，并进行空气干燥。在室温下，将切片在含有0.2%Triton X-100的PBS中渗透5分钟，然后在室温下用含有10%小牛血清的PBS封闭非特异性位点30分钟。将切片在37°C下与稀释在含有0.1%牛血清白蛋白的TBST（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，0.05%吐温-20）中的一级抗体孵育45分钟，并用TBST清洗三次5分钟。第一次孵育后，将切片与二级抗体（FITC-结合山羊抗兔抗体和Cy3-结合抗鼠抗体）在37°C下孵育45分钟，并用TBST清洗三次，每次5分钟。

1.0 cm上生长的MDCK细胞²Transwell Clear™过滤器（#3460，Corning Coster，Cambridge，MA）在室温下固定在PBS中2%的甲醛中10分钟，在PBS内洗涤两次，在室温下在含有0.5%Triton X-100和100 mM甘氨酸的PBS中渗透5分钟，并进行上述免疫荧光检测。

样品安装在含有50%VECTASHIELD安装介质的PBS中（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs），并在配备CCD相机（新泽西州特伦顿普林斯顿仪器公司）或共焦显微镜系统（配备BioRadμ-Radiance的尼康E-600显微镜）的荧光显微镜（奥林巴斯BX40）下进行检查。使用Adobe PhotoShop（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems）对图像进行排列和标记。

用1%多聚甲醛固定剂灌注大鼠肾脏，该固定剂与0.1 M磷酸钠缓冲液（PB，pH 7.4）缓冲，并在4°C下浸泡在相同的固定剂中30分钟。在4°C下用5%蔗糖冲洗样品30分钟。然后用40%聚乙烯吡咯烷酮（Sigma）/2.3 M蔗糖渗透组织样品，用0.1 M PB缓冲，包埋在指甲上，并在液氮中快速冷冻。使用配备徕卡EM FCS冷冻附件（奥地利维恩）的徕卡Ultracut UCT在-110°C下切割超薄冰冻切片。将截面转移到Formvar涂层镍网（150目）。随后的孵育步骤是通过将格栅浮在过滤溶液的液滴上进行的。用PBS-0.01 M甘氨酸淬灭游离醛基团，并用含有10%胎牛血清（FBS）和亲和纯化兔抗ASIP抗体（C2-3AP，1:50稀释）的PBS孵育切片过夜。接下来，用抗兔IgG与5 nm金（1:100稀释，英国加的夫英国BioCell）耦合培养格栅1小时。用ASIP和ZO-1抗体进行双重免疫金染色。简而言之，如上所述切割醛固定肾的超薄冷冻切片。用亲和纯化的兔抗ASIP抗体（C2-3AP，用含有10%FBS的PBS 1:50稀释）和小鼠单克隆抗ZO-1抗体（Zymed Laboratories，1:100稀释）孵育切片，然后用10nm金结合山羊抗兔IgG孵育（1:100稀释，British BioCell）和5 nm金结合山羊抗鼠IgG（稀释1:100，英国BioCell）。免疫染色后，将样品固定在2.5%戊二醛中，戊二醛缓冲0.1 M PB（pH 7.4）。然后将切片与2%醋酸铀酰溶液对比20分钟，并用含有0.2%醋酸铀酰的3%聚乙烯醇吸收染色20分钟。用JEOL 1230-EX电子显微镜观察所有切片。

父母MDCK Tet-Off细胞[(Barth等人，1997年)#C3017-1，Clontech，Palo Alto，CA）和已建立的稳定克隆在含有10%FBS、青霉素和链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；GibcoBRL，Rockville，MD）中生长，37°C空气/5%CO₂恒定湿度下的大气。在实验之前，将MDCK细胞系在有或没有10ng/ml DC的情况下培养至少3天。

用ASIP/PAR-3（pTREHis/L-ASIP WT或pTERHis/L-ASIPΔPB）和pTK-Hig的表达质粒共转染亲代MDCK Tet-Off细胞。整个程序主要遵循前面描述的方法(Jou和Nelson，1998年). 将9μg ASIP/PAR-3质粒、3μg pTK-Hyg和40μl脂质体PLUS试剂（GibcoBRL，Rockville，MD）混合在1160μl含有50μM Ca的无血清DMEM中²⁺（SF-LCM）在室温下保持30分钟；然后添加1.2 ml含有5%脂质体试剂（GibcoBRL）的SF-LCM，并将混合物再培养15分钟。用9.6 ml SF-LCM稀释混合物，并添加到1.5×10⁶在两个10厘米的培养皿中各放置一个细胞；细胞处于对数生长期，并保持在2μg/ml TC中。在37°C下6小时后，用含有10%FBS和2μg/ml TC的DMEM替换培养基，再培养24小时，并在含有200μg/ml潮霉素B的培养基中传代至15个10cm培养皿中（日本大阪和谷）。选择10天后，使用克隆环分离存活的克隆，并在去除TC 48小时后通过western blotting评估每个克隆中外源ASIP/PAR-3的表达。阳性克隆在TC存在下扩增，分成等分并保存在液氮中。

将细胞胰蛋白酶化，悬浮在含有10%FBS的DMEM中，加入或不加入10 ng/ml DC，并在1.0 cm²Transwell Clear公司^TM公司（#3460）在指示的细胞密度和P-60培养皿上过滤。使用Millicell-ERS（Millipore Corp.）测量TER，并通过计算电镀后不同时间P-60培养皿上的细胞数量来评估细胞生长。TER值是通过减去空白Transwell Clear的值来计算的^TM公司过滤器，并归一化为单层的面积。每个点是独立过滤器上三组细胞的平均值±s.e.m。

MDCK稳定克隆被镀在3.9 cm²Transwell Clear公司^TM公司密度为2×10的（#3450）过滤器⁵细胞/厘米²，在正常钙培养基中培养20小时，用PBS冲洗一次，并从中钙培养基转变为低钙培养基[LCM；DMEM补充5μM CaCl₂以及针对PBS进行透析的5%FBS(Gumbiner和Simons，1986年)]. 在LCM中培养20小时后，CaCl水平₂将钙开关调整回1.8 mM。在切换后的不同时间用PBS收集细胞，并在-80°C下冷冻细胞颗粒。按照上述方法制备NP-40不溶性组分(Sakakibara等人，1997年). 简单地说，细胞在700μl冰镇NP-40-IP缓冲液（25 mM Hepes/NaOH，pH 7.4，150 mM NaCl，1%NP-40，50 mM NaF，1 mM Na）中溶解_三VO（旁白）₄、4 mM EDTA、1 mM PMSF、10μg/ml亮氨酸肽、2μg/ml抑肽酶、0.5 mM苯甲脒），在4°C下旋转30分钟。离心后（10000克30分钟）在87.5μl 2×SDS样品缓冲液中重新溶解颗粒(莱姆利，1970年)然后用抗ASIP抗体（C2-3AP）和抗闭塞素pAb（Zymed）进行western blotting分析。通过化学发光ECL（Amersham Life Science）检测NP-40可溶性occludin的水平，用LAS-1000 plus系统（富士胶片，日本东京）直接定量，然后标准化为每条泳道中的微管蛋白的量。

我们之前的研究表明，至少有两种ASIP/PAR-3亚型的分子量分别为180kDa和150kDa，通过对培养的哺乳动物细胞的蛋白质印迹分析，它们可以用两种针对aPKC结合结构域（C1-3/C2-3）或第三个PDZ结构域（P2-2）的独立抗体进行鉴定。MDCKII和COS细胞中检测到这两种亚型，而NIH3T3细胞中只观察到180kDa亚型(Izumi等人，1998年). 随后的研究表明，180kDa ASIP/PAR-3对应于全长产物，而150kDa ASIP/PAR-2是一种主要的剪接变体，具有较短的C末端尾部(图1A) (Lin等人，2000年). 作为获得有关ASIP/PAR-3在哺乳动物组织中生理功能的信息的第一步，我们试图扩展我们对ASIP/PAR-3在多种大鼠组织中的表达和细胞定位的知识。我们建立了针对aPKC结合区（C2-3AP）、全长ASIP/PAR-3的C末端区域（A2-2AP）和短剪接变异体（Yap；图1A). 如所示图1BC2-3AP的western blotting分析显示，180 kDa条带主要在肺、腺胃、前列腺、卵巢和子宫中检测到，与COS1细胞中外源性表达的全长ASIP/PAR-3转录物（ASIP180k）具有相同的迁移率。此外，在肠上皮细胞、肾脏和前列腺中检测到约150kDa的较小条带。重要的是，A2-2AP和Yap分别识别180kDa和约150kDa的谱带。这些数据表明，180kDa和150/160kDa条带分别对应于ASIP/PAR-3及其剪接变异体的全长产物，其C-末端更短。由于ASIP/PAR-3被证明有几个小的、小的删除区域，这些区域可能起源于选择性剪接(Joberty等人，2000年; K.M.和S.O.，未发表），ASIP/PAR-3条带分子量的轻微差异可能反映了这些变体的组织依赖性差异表达。综上所述，这些结果表明ASIP/PAR-3普遍表达，但具有组织依赖性的序列修改，保留了aPKC结合区域。

接下来，我们检测了ASIP/PAR-3在多种大鼠上皮组织中的分布，并与另一种TJ-相关蛋白ZO-1进行了比较(史蒂文森等人，1986年). ASIP/PAR-3染色的特异性可通过相应抗原消除信号，或通过与另一种针对ASIP/PAR-3第三个PDZ结构域（P2-2AP）的亲和纯化抗体的染色模式一致，或两者兼而有之来证实（数据未显示）。ASIP/PAR-3和ZO-1分布之间最显著的差异之一是，在ZO-1高度表达的每一个受检上皮组织（前胃、小肠、肾皮质）中，内皮细胞的细胞-细胞接触区缺乏ASIP/PAR-3染色(图2B，F，箭头）(史蒂文森等人，1986年).

在上皮细胞中，ASIP/PAR-3染色模式与ZO-1相似。一般来说，ASIP/PAR-3(图2，绿色）分布于所检查的每个上皮细胞-细胞连接的尖端下区域。此外，从前胃复层鳞状上皮的基底层到颗粒层，在没有建立特征性TJ的地方，ASIP/PAR-3和ZO-1的染色大多在细胞-细胞接触区以非连续模式检测到，并在细胞质中以点状模式出现(图2A-C). 这些结果令人想起先前在MDCKII细胞中的观察结果，其中ASIP/PAR-3和ZO-1在TJ重建过程中显示了胞质点状分布(Izumi等人，1998年;Rajasekaran等人，1996年). 然而，对染色模式的密切比较揭示了ASIP/PAR-3和ZO-1在上皮细胞中的分布之间的有趣差异。尽管ASIP/PAR-3信号可以在整个上皮层中检测到，但在颗粒层的基底层和最浅层中，其水平略低。相反，ZO-1信号在基底层很低，从棘层到颗粒层增加(图2C)，如前所述(Morita等人，1998年). 考虑上皮细胞分化水平与上皮层深度之间的相关性(图2D)这些结果表明，ASIP/PAR-3染色水平在分化细胞中相对较高，而ZO-1染色随着前胃上皮细胞分化而增加。与这一观察结果一致，小肠ASIP/PAR-3-ZO-1染色的合并视图显示，隐窝中有黄色信号(图2G和绒毛中的橙色信号（星号），表明未成熟上皮细胞中ASIP/PAR-3（绿色）的信号强度相对高于ZO-1（红色）。因此，ASIP/PAR-3存在于细胞-细胞连接处，其水平相对高于ZO-1，用于分化前胃和小肠中TJ链发育不良的上皮细胞(Marcial等人，1984年).

在肾小管上皮细胞中也观察到ASIP/PAR-3和ZO-1之间的差异(图2I-K). 近端和远端肾小管中ASIP/PAR-3的信号强度之间没有显著差异(图2I). 相反，ZO-1在远端肾小管的信号强度远高于近端肾小管(图2J)与之前的报告一致，ZO-1信号与TJ链的数量相关(图2L)(Schnabel等人，1990年).

为了阐明ASIP/PAR-3在超微结构水平上的这种特征性分布，用免疫金电子显微镜研究了ASIP/PAR-3和ZO-1在肾小管上皮细胞中的定位(图3). 在远端小管有深TJ的上皮细胞中(图3A)和那些近端小管内TJ相对较浅的患者(图3B)，ASIP/PAR-3定位于TJ的细胞质表面。有趣的是，并不是所有的TJ都用金颗粒装饰ASIP/PAR-3：ASIP/PAR-3总是在TJ的上边缘检测到(图3A-D)经常在TJ的下边缘观察到(图3A、B). 通过双标记免疫金电子显微镜，ASIP/PAR-3的这种特征性定位与ZO-1的特征性定位形成鲜明对比，ZO-1与先前报道的TJ分布在一起(Kurihara等人，1992年) (图3C和数据未显示）。因此，ASIP/PAR-3的数量和分布并不一定与此处检测的上皮细胞中TJ的发育水平相关，而ZO-1的数量与TJ的结构基础TJ链的数量密切相关，对于上皮细胞中TJ的发育是必不可少的(铃木等人，2001)根据我们的观察，我们调查了ASIP/PAR-3可能在建立和/或维护TJ结构中发挥调节作用的可能性，而不仅仅是作为TJ的结构组成部分。

为了研究ASIP/PAR-3调节上皮性TJ形成的可能性，我们评估了ASIP/PAR-3或其突变体的过度表达对TJ形成和功能的影响。为此，我们使用了稳定的转化子，其中ASIP/PAR-3可以由四环素或强力霉素剥夺诱导(戈森和布贾德，1992年;Barth等人，1997年). 我们为L-ASIP制备了两种不同的T7标记表达质粒；L-ASIP WT具有aPKC结合序列，而L-ASIPΔPB没有(图4A). 通过免疫印迹和T7-tag抗体的免疫荧光法评估建立的细胞系中每个蛋白的表达调控，我们发现1.0μg/ml四环素（TC）可将L-ASIP WT或ΔPB的表达完全抑制到可检测水平以下(图4B、E)或10 ng/ml强力霉素（DC）(图5G). 我们还通过免疫荧光评估了每个T7标记的ASIP/PAR-3的分布及其表达水平的均匀性。在过度表达L-ASIP WT或ΔPB的MDCK细胞系中，尽管外源性表达的ASIP/PAR-3的类型不同，但T7标记的ASIPs优先集中于细胞间接触，作为内源性ASIP/PAR-3，在两个过度表达L-ASIP的MDCK细胞系之间，蛋白质表达的均匀性没有显著差异(图4C、D).

我们使用这些细胞系分析了跨上皮电阻（TER）的发展。由于TER本质上反映了TJ调节的细胞旁阻力，因此TJ的从头形成可以通过电镀后TER的发展来实现(Cereijido等人，1998年). MDCK细胞单层的TER最初在电镀后随时间增加，在细胞融合后开始下降(Jou等人，1998年). 首先，由于细胞增殖是影响TER发展的关键因素，我们研究了ASIP/PAR-3的过度表达是否可以改变细胞增殖；然而，我们发现在有或无阻遏物（10 ng/ml DC）的情况下培养的细胞在任何检测的细胞系中没有显著差异(图5A-C). 相比之下，诱导的L-ASIP WT的过度表达可重复地导致在亚流密度（1.5×10⁵细胞/厘米²;图5D，星号）。虽然两种类型的ASIP/PAR-3的表达方式几乎相同，并且在细胞增殖过程中保持不变(图5G)L-ASIPΔPB的过度表达对TER的发展没有影响(图5E). 此外，我们证实DC本身的耗竭并不促进而是抑制亲本细胞系中TER的发展(图5F). 即使每个细胞系以较低密度电镀，1.0×10⁵细胞/厘米²，三种细胞系之间仍存在差异；然而，每个TER达到峰值需要更多时间（数据未显示）。因此，这些数据表明，L-ASIP WT的过度表达，而不是其缺乏aPKC结合序列的突变，促进了电镀后TJ的形成，而不会改变MDCK细胞的增殖速度。

除了TER的发展外，在各种培养细胞中，磷酸化和对NP-40提取的闭塞素的抗性增强也与上皮TJ的形成密切相关(Sakakibara等人，1997年). 如果L-ASIP WT确实促进TJ的形成，那么在表达L-ASIP TT的MDCK细胞中，闭塞素的生化行为可能会受到影响。为了评估这种可能性，我们检测了Ca后闭塞素的不溶性²⁺交换机(Gumbiner和Simons，1986年)在表达L-ASIP WT或ΔPB的MDCK细胞中。低（5μM）Ca培养²⁺介质破坏细胞-细胞连接复合体，并转换为正常（1.8 mM）Ca²⁺介质触发钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触和一系列分子事件，包括闭塞素不溶，以重建连接复合体。低钙培养MDCK细胞系的融合单层²⁺培养20小时，然后是CaCl₂被重新添加以恢复钙²⁺液位（Ca²⁺开关）。在有或无10 ng/ml DC的情况下培养的每个细胞系均接受Ca²⁺开关。Ca后的不同时间²⁺切换后，将总细胞裂解物分为NP-40可溶性和-不溶性组分，并用抗闭塞素抗体进行western印迹评估每个细胞系中不溶性闭塞素的数量。应用于每个细胞系每条通道的蛋白质量标准化为CBB染色的微管蛋白水平。

如前所述，磷酸化和缓慢迁移的闭塞素优先收集在NP-40不溶部分中，在整个时间过程中检测的任何细胞系中的闭塞素总量没有显著变化（数据未显示）(Sakakibara等人，1997年). 在表达L-ASIP WT的MDCK细胞系中，在Ca后30分钟内，NP-40可溶性occludin的量开始迅速增加至约1.7倍²⁺切换，最终达到Ca前水平的两倍²⁺开关(图6A，左侧面板；图6C，填充圆）。相比之下，在没有诱导过表达L-ASIP WT（DC=10 ng/ml）的细胞中，需要60分钟才能达到相同水平(图6A，右侧面板；图6C，未填充的圆圈）。此外，L-ASIPΔPB的诱导过表达对Ca后闭塞素的不溶性没有显著影响²⁺交换机(图6B;图6D、填充和未填充方块）。与上述TER发展结果一致，这些数据表明只有L-ASIP WT促进MDCK细胞中TJ的形成。

综上所述，这些通过功能和生化分析评估TJ形成的独立结果清楚地表明，L-ASIP WT的过度表达促进了MDCK细胞中TJ的形成。此外，只有L-ASIP WT而不是L-ASIPΔPB具有这种作用，这表明ASIP/PAR-3和aPKC之间的相互作用可能参与促进TJ的形成。

ASIP/PAR-3中的aPKC结合序列在PKC磷酸化共有序列中包括两个高度保守的丝氨酸残基（827和829）(Izumi等人，1998年). 此外，我们最近发现ASIP/PAR-3中的Ser827在体内和体外被aPKC磷酸化（Y.T.-N.和S.O.，未发表）。因此，上述结果表明ASIP/PAR-3的aPKC结合序列在促进TJ形成中的重要性，这意味着Ser827的磷酸化参与了ASIP/PAR-3的功能。为了评估这种可能性，我们观察了在Ca后过度表达L-ASIP WT的MDCK细胞中ASIP/PAR-3的Ser827-磷酸化形式的定位²⁺使用特异识别这种磷酸化形式ASIP/PAR-3的抗体进行切换(图7L、M). 当成熟的细胞-细胞连接建立时，Ser827-磷酸化ASIP/PAR-3的免疫反应性(图7A、C，红色）在顶端细胞-细胞连接处完全重叠过度表达的L-ASIP WT(图7A-C，箭头）。相比之下，Ca后1小时²⁺当细胞-细胞连接形成时，Ser827-磷酸化的ASIP/PAR-3信号(图7D)集中在细胞间接触的最顶端(图7F、G，填充箭头），而L-ASIP WT过度表达(图7E)仍主要位于顶端稍基底的区域(图7F、H，未填充箭头）。这些结果暗示了ASIP/PAR-3的定位与TJ形成过程中Ser827的磷酸化之间的关系。

在哺乳动物上皮细胞中，侧连接复合体的最顶端成分是TJ，它们作为细胞间屏障调节细胞旁通透性，并作为膜内屏障维持顶端和基底外侧膜域的极化(Mitic和Anderson，1998年;Cereijido等人，1998年). 越来越多的TJ相关外周蛋白或整体蛋白被鉴定出来，这些蛋白的特性为TJ的形成和功能提供了分子基础。然而，目前还不完全了解这种复杂连接结构的形成是如何按照动态过程进行编排的。

我们之前已经鉴定了ASIP，它是秀丽隐杆线虫极性蛋白PAR-3，作为上皮TJ相关外周蛋白(Izumi等人，1998年)；然而，哺乳动物ASIP/PAR-3的生理功能尚待阐明。在本研究中，我们提供了两条证据表明ASIP/PAR-3参与了上皮性TJ形成的早期阶段。首先，对各种大鼠上皮组织的免疫荧光分析表明，与ZO-1相反，ASIP/PAR-3分布在没有发育良好TJ链的上皮细胞的顶端连接复合体区域(图2)在一些具有未成熟TJ的上皮细胞中观察到较高水平的ASIP/PAR-3(图2C前胃；图2G，小肠）。此外，肾小管上皮细胞的免疫金电镜显示ASIP/PAR-3仅集中在TJ顶端边缘的细胞质中，而ZO-1则沿TJ分布(图3). 这些观察结果表明，与ZO-1不同，ASIP/PAR-3的分布模式不一定与上皮细胞中TJ的发育水平相关。因此，这些发现不支持ASIP/PAR-3仅作为TJ结构元素的可能性。其次，我们观察到，在MDCK细胞中L-ASIP WT的过度表达促进了TJ形成的初始阶段，这是通过功能评估得出的(图5; TER发展测量）以及生物化学(图6; 闭塞素不溶）分析。有趣的是，在过度表达L-ASIP WT的MDCK细胞中观察到ASIP/PAR-3促进TJ的形成，但在那些过度表达缺乏aPKC结合序列的L-ASIPΔPB细胞中没有观察到，这意味着ASIP/PAR-3的这种功能是通过与aPKC的相互作用介导的。我们的证明进一步支持了这一结论，即aPKC活性对于哺乳动物上皮细胞中TJ的形成是必不可少的，但对TJ的维持则不是必需的(Suzuki等人，2001年). 此外，ASIP/PAR-3和aPKC之间相互作用对TJ形成的重要性与之前的报告一致秀丽线虫PAR-3和aPKC/PKC-3或其果蝇属同源物在建立细胞极性中的适当功能相互依赖(Tabuse等人，1998年;Wodarz等人，2000年). 综上所述，我们的结果加强了以下可能性：进化上保守的aPKC-ASIP/PAR-3复合物是哺乳动物上皮TJ中的调节元件之一，并且需要促进TJ形成的初始阶段，而不仅仅是作为结构成分。

这里描述的ASIP/PAR-3定位的超微结构分析是第一个集中在TJ顶端边缘的蛋白质示例(图3). 就哺乳动物的上皮极性而言，TJ是顶膜域和侧膜域的边界。在缺乏TJ的节肢动物的上皮细胞中，顶端和外侧膜域之间的边界以“边缘区”为标志，即顶端膜域的边缘，其特征是顶端极性的关键调节因子（如Crumbs和Discs Lost）的特异性聚集(Tepass，1997年;Tanentzapf等人，2000年). 虽然还没有发现哺乳动物上皮细胞具有这种结构，但ASIP/PAR-3的特征性定位让人想起了Crumbs and Discs Lost。结合ASIP/PAR-3的可能功能，我们的数据提出了一个有趣的假设，即TJ的顶端边缘可能是边缘区的功能类似物，用于确定哺乳动物上皮细胞的膜极性。

积累的实验证据支持上皮TJ形成的多步骤可能性。我们目前的数据表明，aPKC-ASIP/PAR-3复合物正向调节上皮TJ的形成，但该复合物对哪一步负责？一些证据表明，E-cadherin粘附系统介导TJ成分的初始组织，包括ZO-1，进入原始粘附连接(Gumbiner等人，1988年;Rajasekaran等人，1996年;Ando-Akatsuka等人，1999年). 在下一步中，与钙粘蛋白-αE-连环蛋白复合物相关的长春花蛋白用于组装顶端肌动蛋白束(Watabe-Uchida等人，1998年). 此外，由于有数据表明ZO-1、ZO-2和ZO-3直接与作为TJ链和肌动蛋白丝的主要成分的occludin和claudins结合，因此推测ZO-1，ZO-2和ZO-3可能从钙粘蛋白基的原始粘附分子连接处招募，以交联组装的顶端肌动蛋白束和克劳丁基的TJ链(Furuse等人，1994年;Haskins等人，1998年;Itoh等人，1999年;Wittchen等人，1999年). aPKC-ASIP/PAR-3复合物，包括活化的aPKC，及其在顶端细胞-细胞接触处的浓度，可能是ZO-1从钙粘附素基原始粘附连接分离到TJ结构的关键。这个想法是基于我们之前的观察结果和这里的结果。首先，缺乏激酶活性的aPKCλ突变体的过度表达不仅影响ASIP/PAR-3的正确定位，而且在TJ形成过程中显著干扰了ZO-1在MDCK细胞细胞连接处的定位，而没有严重干扰E-cadherin或β-catenin的定位(铃木等人，2001). 第二，我们在这里证明，相对较高数量的ASIP/PAR-3集中在前胃和小肠未成熟上皮的细胞-细胞连接处，其中ZO-1的含量相对较低(图2A-H). 第三，我们发现在Ser827磷酸化的ASIP/PAR-3比不磷酸化的Ser827的另一种形式的ASIP/PAR-3更集中在发育中的细胞-细胞接触的顶端(图7D-H). 在体外和体内极化MDCK细胞中，Ser827被aPKC磷酸化（Y.T.-N.和S.O.，未出版）。最后，我们最近的观察表明，即使在没有细胞-细胞接触的情况下，aPKC ASIP/PAR-3复合物也存在于细胞质中，并且在钙触发细胞-细胞粘附后，它很早就转移到顶端细胞-细胞接触区(Yamanaka等人，2001年). 因此，我们的研究结果，以及之前发表的数据，使我们可以推测以下可能性：细胞-细胞接触的从头形成启动了先前存在的aPKC-ASIP/PAR-3复合物向原始粘附连接的移位，而aPKC可能磷酸化Ser827的ASIP/PAR-3，将此复合物集中在发育的顶端细胞-细胞连接处；因此，aPKC-ASIP/PAR-3可以促进TJ-相关蛋白（包括ZO-1）从原始粘附连接处分离。

除了TJ的外周蛋白外，闭塞素、克劳丁和连接黏附分子也被鉴定为完整的TJ膜蛋白(Furuse等人，1993年;Furuse等人，1998年a;Martin-Padura等人，1998年). 先前的实验证据表明，在TJ形成的相对较晚阶段，高磷酸化的闭塞素共聚成基于克劳丁的TJ链，而非磷酸化或低磷酸化的封闭素分布到基底外侧膜(Sakakibara等人，1997年;Furuse等人，1998年b;Morita等人，1998年). 我们目前的数据表明，ASIP/PAR-3的过度表达加速了闭塞素的不溶性，这可能是由于MDCK细胞中TJ形成过程中的磷酸化所致(图6C). 此外，我们在这里展示了免疫电镜观察到的ASIP/PAR-3在TJ基底边缘的频繁定位(图3A、B). 因此，我们认为ASIP/PAR-3可能参与了闭塞素从基底外侧膜结构域向TJ链的移位，从而建立成熟的TJ。进一步的分析，包括aPKC和/或ASIP/PAR-3基因的靶向性破坏，将有可能阐明上皮性TJ形成和上皮极性发展的阶段层次。

我们感谢津田昭一郎（Shoichiro Tsukita）和伊藤正彦（Masahiko Ito）（京都大学）提供的抗ZO-1单克隆抗体和有益的讨论，感谢Michiko Ehara（横滨城市大学医学院病理学第二系）提供的技术帮助，以及我们实验室（横滨市立大学医学院分子生物学系）的所有成员，以鼓励讨论和有益的评论。T.H.感谢石川浩的鼓励。这项工作得到了日本科学促进会（给S.O.）和日本教育、科学、体育和文化部（给S.O）的资助。