在小鼠中，决定细胞命运的最早事件之一是在原肠胚形成期间细胞分离成生殖层；然而，由于宫内发育，细胞和分子的细节还没有很好地确定。利用免疫组织化学和延时共焦成像技术，我们能够清晰地观察到细菌层形成过程中发生的事件序列。T-box转录因子brachyury（T）和Forkhead转录因子Foxa2指定后部外胚层中的中胚层和内胚层。命运指定的外胚层细胞失去其极性，并经历上皮-间充质转化，侵入原始条纹区，在那里这些细胞群体迅速分离并分化为形态和分子上不同的Foxa2阳性内胚层和T阳性中胚层群体。内胚层细胞在嵌入外部上皮时变平并获得顶端-基底极性，以便与先前存在的细胞建立适当的细胞内连接。相反，中胚层细胞在迁移过程中变成球形，并获得间充质命运。有趣的是，轴型中胚层细胞是Foxa2阳性外胚层细胞的后代，它们上调前原始条纹区的T蛋白。这些细胞以及Foxa2阳性内胚层细胞高度极化和上皮化，表明Foxa2促进上皮命运并抑制间充质命运。这一观察得到以下事实的支持：福克斯2突变的内胚层细胞不能维持极性，不能建立适当的细胞连接，因此不能在功能上整合到内胚层上皮中。我们提出Foxa2调节诱导上皮细胞表型的分子程序。

关键词：
福克斯2， Brachyury公司， 上皮-间质转化， 间充质-上皮转化， 形态发生， 电池极性， 细胞粘附， 上皮化， 消化， 生殖层形成

在原肠胚形成期间，通过分化和高度协调的形态发生事件建立了小鼠胚胎的多层体平面。在原肠胚形成开始时，即胚胎第6.5天，胚胎杯状外胚层被内脏内胚层（VE）单层上皮所包围，形成卵黄囊的内胚层成分(威尔斯和梅尔顿，1999年). 多能外胚层细胞构成胚胎本身所有细胞系的祖细胞，并分化形成三个主要胚层：内胚层、中胚层和外胚层(贝丁顿和罗伯逊，1999年;Tam和Loebel，2007年). 外胚层细胞命运的克隆分析表明，在E6.5的早期条纹胚胎中，后部外胚层近三分之一包含胚外中胚层和原始生殖细胞的前体。相比之下，外胚层的远端包含整个神经外胚层前体，而中间后部外胚层包含前中胚层和最终内胚层的前体(劳森等人，1991年;劳森和佩德森，1992年;Tam和Beddington，1992年;劳森和黑格，1994年). 克隆后代不一定局限于一个胚层，这表明这些谱系在原肠胚形成初期并没有分离。支持这一观点的是胚胎干细胞分化实验(Kubo等人，2004年)，以及条件基因靶向结果，表明存在双潜能肠系膜祖细胞群(Lickert等人，2002年)（有关审查，请参阅《流浪者与病人》，2001年). 在原肠胚形成的不同阶段，原始条纹（PS）被证明含有不同中胚层和内胚层谱系的前体细胞，这些细胞分布在身体的不同部位(Kinder等人，1999年;Kinder等人，2001年). 因此，中胚层和内胚层在胚胎中的分配是以前后向（AP）方式进行的，这取决于通过PS的募集时间和顺序。大多数最终内胚层（DE）细胞通过中间条纹（MS）的原始条纹（APS）前端进入阶段并嵌入上覆VE中，形成前肠(Kwon等人，2008年); 然而，少量的DE细胞可能直接从外胚层分层进入VE(Tam和Beddington，1992年). 综上所述，这些研究清楚地表明，原肠胚形成期间中胚层和内胚层是以时空方式指定的；然而，尚不清楚这些细胞是否在外胚层或PS区域中被指定，以及这些细胞何时分化为形态和分子上不同的细胞群。

在ES细胞分化培养中，T-box转录因子brachyury（T）可以标记中胚层和内胚层的祖细胞，表明这些细胞来源于共同的祖细胞(Kubo等人，2004年). 在小鼠胚胎中，T蛋白在早期条纹阶段定位于后外胚层，并在原肠胚形成过程中PS区的新生中胚层中检测到，以及从晚期条纹（LS）阶段开始在结节和脊索中检测到(英曼和唐斯出版社，2006年). 中胚层和脊索的T定位表明，这些细胞群的异常是纯合子突变表型的原因(威尔金森等人，1990年). 相比之下，福克斯2从早期开始也表达于后部外胚层，然后局限于前部最终内胚层（ADE）和轴向中胚层，中胚层由头部突起、前索板、脊索和淋巴结组成(佐佐木和霍根，1993年;Monaghan等人，1993年).福克斯2是Forkhead转录因子家族的成员，该家族包括三种相关的转录因子：Foxa1、Foxa2和Foxa3，首次通过调节肝脏特异性基因表达的能力鉴定(Lai等人，1990年;Lai等人，1991年). 的空变异福克斯2基因导致ADE和轴向中胚层缺失(Ang和Rossant，1994年;Weinstein等人，1994年). Foxa1和Foxa3从E7.5开始在最终的内胚层中表达，可以补偿零突变体中Foxa2的缺失，这允许后肠，但不允许前肠和中肠的形成(佐佐木和霍根，1993年;Monaghan等人，1993年;Ang和Rossant，1994年;Weinstein等人，1994年;Dufort等人，1998年). 这些结果共同表明，T和Foxa2对中胚层和内胚层发育具有重要功能；然而，目前尚不清楚这些转录因子如何调节这些细胞群体分化的分子和细胞程序。

除了细胞分化外，原肠胚还经历了巨大的形态变化，形成了三个主要的胚层和基本的身体平面。当信号和因子触发外胚层细胞的上皮-间充质转化（EMT），从而产生中胚层和内胚层时，PS的形成是最初的形态发生事件之一(《小偷与瞌睡虫》，2006年). 在这一过程中，外胚层细胞失去其顶基（AB）上皮极性，下调细胞间粘附分子E-cadherin（cadherin 1–Mouse Genome Informatics），并突破基底膜（BM）侵入PS区域。间质中胚层细胞获得间充质细胞命运，在内胚层和外胚层生殖层之间长距离迁移，然后重新聚集形成不同的器官，如心脏或肾脏。相反，命运决定成为DE的细胞出现在从MS到LS阶段的APS区域(劳森等人，1991年;Tam等人，1997年;Kinder等人，2001年;Tam和Beddington，1992年). 这些细胞获得上皮命运并插入外部上皮，但尚不清楚这些细胞是否经历EMT，然后进行间充质-上皮转化，或者维持上皮极性，只是短暂下调细胞-细胞粘附分子以离开上皮细胞。在原肠胚形成结束时，胚层已经形成，并且已经通过来自胚胎组织的信号获得AP、背腹（DV）和左右（LR）模式信息，这些组织包括前VE、ADE、中胚层轴、淋巴结、脊索和底板(Tam和Loebel，2007年).

对小鼠基因的功能分析极大地有助于理解小鼠胚胎生殖层的形成；然而，表型分析受到静态技术的阻碍，静态技术通常只描述终点，以及所有胎盘哺乳动物的胚胎发生都发生在子宫内，不容易进行体外观察。静态胚胎培养系统的建立和转基因动物中荧光标记蛋白的遗传引入，现在可以直接成像小鼠胚胎发生(Yamanaka等人，2007年;Kwon等人，2008年). 在这项研究中，我们建立了一个体外静态胚胎培养系统，以连续监测生殖层形成过程中发生的细胞过程。利用聚集嵌合体生成遗传嵌合体，使我们能够使用荧光标记区分胚胎和胚外谱系，以便在细胞分辨率下跟踪中胚层和内胚层的形成。我们提供证据证明Foxa2在极化和上皮化细胞类型（即最终内胚层和中胚层轴（节点和脊索））的形成中具有特殊作用。

表达载体的生成

使用以下引物通过PCR扩增编码荧光蛋白（td-Tomato，YFP）的基因：Tomato fwd（5′-不是我-科扎克-Xba公司我),5′-GCGGCCGC公司AGCCACATG公司TCTAGA公司ATGGTGAGAGAGGGCGAGGAG公司；番茄转速（5分-Spe公司我)，3′-北北ACTAGT公司TTACTTGTTACAGCTCGTCCATGCCG；YFP fwd，5′-GCGCCGCATCTAGAATGGAGAGCGAGCTGTTC；YFP版本，3’-ACTAGTTTACTGTACAGCTCGTCCCATGCGAG。不是我/Spe公司将I-消化PCR产物克隆到pBKS载体中。

为了产生Lyn-Tomato，在不是我和Xba公司td-Tomato前pBKS载体中的I位点：Lyn-Oligo fwd，5′-GGCCGCATAACTTCGTAGCATACATTATACAGAGTCATCACCATGGAGTATAAAAGACGGGCCCGGTACTACT；Lyn-Oligo版本，5’-CTAGAGTACCGGCCCCGTCTTTCTTTTGATTAATACATCCATGGTGCATACTTCGTAATGTATGCTTATACGGAGCTTATGC。这个不是我/Spe公司I消化的荧光标记被亚克隆到不是我/Nhe公司真核表达载体pCAGGS的I位点(Niwa等人，1991年).

荧光报告ES细胞系的建立

本研究中使用的荧光ES细胞和小鼠系通过电穿孔产生Sca公司将含有dsRed、YFP或Lyn Tomato的I-线性化pCAGGS载体DNA导入野生型IDG3.2 ES细胞(Hitz等人，2007年)或福克斯2–/–R1 ES细胞（Ang等人，1994）。用1μg/ml嘌呤霉素筛选细胞，筛选耐药克隆，以便在细胞培养和体内使用胚胎干细胞衍生的胚胎进行均匀和普遍的报告表达。

嵌合体和鼠系的产生

根据标准方案生成二倍体或四倍体嵌合体(Nagy，2003年). 胚胎收集自dsRed-(Vintersten等人，2004年)和YFP-(Hadjantonakis等人，2002年)表达小鼠系，均维持在混合遗传背景（CD1/129Sv/C57/Bl6）。T-GFP公司如前所述，靶向结构用于生成ES细胞和小鼠系(Fehling等人，2003年).

时间推移实时成像

在含有10%FCS和20 mM HEPES的DMEM中解剖胚胎。使用200μl胚胎培养基（50%大鼠血清、40%不含酚红的DMEM、2 mM谷氨酰胺、100μM 2-巯基乙醇和1 mM丙酮酸钠）在37°C培养箱中（含5%CO）在玻璃底培养皿上培养胚胎2和5%O2). 为了避免蒸发，培养基上覆盖了矿物油。在徕卡DMI6000共焦显微镜上进行图像采集，并使用徕卡LAS AF软件进行图像分析。

统计分析

使用徕卡LAS AF软件进行细胞测量。平均偏差和标准偏差如图所示。P（P）-使用双尾学生的t吨-用图形图例中所述的细胞和胚胎数量的不等方差进行测试。

全贴装原位杂交

如前所述，进行了整体原位杂交(Lickert等人，2002年). 使用了以下探针：脱中胚蛋白(Ciruna和Rossant，1999年),十六进制(六角螺母–小鼠基因组信息学）(托马斯等人，1998年)和克劳丁4（RZPDp981G04226D）。胚胎是用蔡司立体Lumar V12显微镜拍摄的。

抗体和免疫组织化学

如前所述进行免疫荧光全悬置染色(Nakaya等人，2005年). 简单地说，胚胎被分离出来，在PBS中的2%PFA中固定20分钟，然后在pH值为8.0的0.1 M甘氨酸中的0.1%Triton X-100中渗透。在10%FCS、3%山羊血清、0.1%BSA、0.1%Tween 20中封闭2小时后，将胚胎与第一抗体o/n在4°C的封闭溶液中孵育。在含有0.1%吐温-20（PBST）胚胎的PBS中多次清洗后，在封闭溶液中用二级抗体（驴抗鼠594、驴抗兔488、驴抗羊594 Alexa fluor、分子探针）孵育3小时。在用PBST进行最后清洗的过程中，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚，二盐酸盐（DAPI）对胚胎进行染色，转移到40%的甘油中，并使用120μm Secure-Seal间隔物（Invitrogen，S24737）和ProLong Gold防褪色试剂（Invit罗gen，P36930）将其包埋在两个盖玻片之间。抗体：Foxa2（Abcam，Ab408749）、brachyury（N-19，Santa Cruz）、GFP（A11122，Invitrogen）、E-cadherin（610181，BD）、ZO-1（Tjp1-小鼠基因组信息学）（33-9100，Zymed）。

图1。
原肠期小鼠胚胎的规格和分化。流前（a）、中游（MS）（B）或晚期（LS）（C）胚胎的中矢状共焦切片，显示短梗（T，红色）、Foxa2（绿色）和DAPI（蓝色）的整体免疫荧光染色，左侧为亮场图像。方框区域在显示单独通道和覆盖的面板中放大。（A） Foxa2和brachyury抗体标记流前胚胎后部外胚层中相互排斥的前体细胞群。（B） 在MS阶段，可见两个外胚层结构域（白线显示边界），包括Foxa2阳性（绿色星号）和T阳性（白色星号）细胞。这些前体细胞在原始条纹（PS）中产生T阳性（红色箭头）、T和Foxa2-阳性（黄色箭头）和Foxa2-阳性（绿色箭头）细胞。（C） 在LS期，可以区分三个细胞群：PS后部的T阳性细胞（虚线）、前原始条纹（APS）中的Foxa2和T双阳性细胞，以及Foxa2阳性内脏（VE）和终末（DE）内胚层细胞。请注意，Foxa2阳性祖细胞仍存在于外胚层（Foxa2面板中的绿色箭头）中，外胚层经历EMT（Foxa 2和T覆盖面板中的白色箭头）和上调T（Foxa2和T重叠面板中的红色箭头）。mes，中胚层。
查看大型下载幻灯片

原肠期小鼠胚胎的规格和分化。流前（a）、中游（MS）（B）或晚期（LS）（C）阶段胚胎的中矢状共焦切片，显示短梗（T，红色）、Foxa2（绿色）和DAPI（蓝色）的整体免疫荧光染色，左侧为亮场图像。方框区域在显示单独通道和覆盖的面板中放大。(一个)Foxa2和brachyury抗体标记流前胚胎后部外胚层中相互排斥的前体细胞群。(B类)在MS阶段，可见两个外胚层结构域（白线显示边界），包括Foxa2阳性（绿色星号）和T阳性（白色星号）细胞。这些前体细胞在原始条纹（PS）中产生T阳性（红色箭头）、T和Foxa2-阳性（黄色箭头）和Foxa2-阳性（绿色箭头）细胞。(C类)在LS期，可以区分三个细胞群：PS后部的T阳性细胞（虚线）、前原始条纹（APS）中的Foxa2和T双阳性细胞，以及Foxa2阳性内脏（VE）和终末（DE）内胚层细胞。请注意，Foxa2阳性祖细胞仍存在于外胚层（Foxa2面板中的绿色箭头）中，外胚层经历EMT（Foxa 2和T覆盖面板中的白色箭头）和上调T（Foxa2和T重叠面板中的红色箭头）。mes，中胚层。

图1。
原肠期小鼠胚胎的规格和分化。流前（a）、中游（MS）（B）或晚期（LS）（C）胚胎的中矢状共焦切片，显示短梗（T，红色）、Foxa2（绿色）和DAPI（蓝色）的整体免疫荧光染色，左侧为亮场图像。方框区域在显示单独通道和覆盖的面板中放大。（A） Foxa2和brachyury抗体标记流前胚胎后部外胚层中相互排斥的前体细胞群。（B） 在MS阶段，可见两个外胚层结构域（白线显示边界），包括Foxa2阳性（绿色星号）和T阳性（白色星号）细胞。这些前体细胞在原始条纹（PS）中产生T阳性（红色箭头）、T和Foxa2阳性（黄色箭头）以及Foxa2阳性（绿色箭头）细胞。（C） 在LS期，可以区分三个细胞群：PS后部的T阳性细胞（虚线）、前原始条纹（APS）中的Foxa2和T双阳性细胞，以及Foxa2阳性内脏（VE）和终末（DE）内胚层细胞。请注意，Foxa2阳性祖细胞仍存在于外胚层（Foxa2面板中的绿色箭头）中，外胚层经历EMT（Foxa 2和T覆盖面板中的白色箭头）和上调T（Foxa2和T重叠面板中的红色箭头）。mes，中胚层。
查看大型下载幻灯片

原肠期小鼠胚胎的规格和分化。流前（a）、中游（MS）（B）或晚期（LS）（C）胚胎的中矢状共焦切片，显示短梗（T，红色）、Foxa2（绿色）和DAPI（蓝色）的整体免疫荧光染色，左侧为亮场图像。方框区域在显示单独通道和覆盖的面板中放大。(一个)Foxa2和brachyury抗体标记流前胚胎后部外胚层中相互排斥的前体细胞群。(B类)在MS阶段，可见两个外胚层结构域（白线显示边界），包括Foxa2阳性（绿色星号）和T阳性（白色星号）细胞。这些前体细胞在原始条纹（PS）中产生T阳性（红色箭头）、T和Foxa2-阳性（黄色箭头）和Foxa2-阳性（绿色箭头）细胞。(C类)在LS期，可以区分三个细胞群：PS后部的T阳性细胞（虚线）、前原始条纹（APS）中的Foxa2和T双阳性细胞，以及Foxa2阳性内脏（VE）和终末（DE）内胚层细胞。值得注意的是，Foxa2阳性祖细胞仍存在于外胚层（Foxa2面板中的绿色箭头）中，其经历EMT（Foxa2和T重叠面板中的白色箭头）并上调T（Foxa2和T重叠面板中的红色箭头）。mes，中胚层。

原肠期胚胎的规格和分化

Foxa2是前轴中胚层和最终内胚层形成所需的Forkhead转录因子(Ang和Rossant，1994年;Weinstein等人，1994年)而T-box转录因子brachyury（T）对于中胚层的后部而非前部的形成是必要的(威尔金森等人，1990年). 如前所述，这两个基因的mRNA在后外胚层原肠胚形成期间表达，但尚不清楚这些蛋白是否在外胚层和外胚层衍生的中胚层和内胚层后代的相同细胞中合成(佐佐木和霍根，1993年;Monaghan等人，1993年;Herrmann，1991年). 为了研究这两种转录因子在原肠胚形成过程中的细胞分布，我们使用带有T和Foxa2抗体的整体免疫组织化学（IHC）和固定胚胎的激光扫描显微镜（LSM）。令人惊讶的是，在治疗前阶段的胚胎中，双重免疫荧光抗体染色显示T和Foxa2蛋白是在后部外胚层的两个混合但相互排斥的细胞群中合成的(图1A; 看见补充材料中的图S1A). 在MS期，这两个细胞群分离为后部外胚层的近端和远端区域(图1B;看见补充材料中的图S2). EMT后近端外胚层细胞上调T蛋白，并在PS区显示出圆形间充质细胞表型(英曼和唐斯出版社，2006年)而远端外胚层细胞在EMT后上调Foxa2蛋白，并显示扁平的细胞形态（参见补充材料中的图S2). 有趣的是，表达Foxa2的扁平细胞出现在PS解剖端的前面，形成一排直径为两个细胞的极化细胞（参见补充材料中的图S2D，白色箭头）。从命运地图(Tam和Beddington，1992年)和我们的成像结果（请参见图2下面），这似乎是第一个DE细胞出现在表面的区域，表明少量DE细胞可能直接分层进入外部VE。在LS期，只有APS下的外胚层细胞Foxa2阳性，并显示EMT迹象(图1C; 看见补充材料中的图S1B). 我们可以清楚地区分PS区的三个细胞群：T阳性的后中胚层；Foxa2-和T-双阳性轴向中胚层；以及Foxa2-阳性VE和DE人群。在LS期，我们很少在APS区域检测到Foxa2阳性细胞。这意味着Foxa2+外胚层细胞在EMT后迅速上调T蛋白，这表明中胚层轴细胞是从APS区招募来的(Kinder等人，2001年). 这些结果共同表明，内胚层和中胚层在外胚层中被指定，并在EMT后分化，这可以通过形态学和标记基因表达进行区分。有趣的是，Foxa2成表细胞前体细胞产生极化和上皮化的内胚层和轴性中胚层，包括结节和脊索的极化和上皮化细胞。

图2。
内胚层形成的时间推移成像。（A） 二倍体（2n）或四倍体（4n）胚胎的产生↔ 用于谱系标记和镶嵌分析的ES细胞嵌合体。（B） 静态胚胎培养系统示意图。小鼠胚胎被固定在玻璃底培养皿上，处于横向位置，并用倒置共焦显微镜成像。（C） 监测四倍体（4n）YFP中DE的形成↔ wt-dsRed ES细胞聚集嵌合体。显示了流前（E6.5）、MS（E7.0）和LS（E7.5）阶段四倍体嵌合体的中矢状和表面共焦截面。外胚层和DE来源于表达dsRed的ES细胞。胚外组织，包括VE和胚外外胚层，来源于四倍体胚胎。（D） 4n dsRed中DE形成的时间成像序列↔ wt YFP嵌合体在MS至LS阶段。在指定的时间点（T=小时：分钟）从电影1中获取矢状共焦截面（参见补充材料中的电影1）。YFP阳性DE前体细胞与dsRed阳性VE上皮细胞（黑色星号，T=0:00）相连，并开始嵌入内脏内皮层（蓝色星号，T=0:24-0:39）。中胚层细胞（红色星号）具有圆形形态，并在外胚层和VE之间迁移。请注意，所有胚胎的方向都是后向右侧，远向底部。EPI，外胚层；ExE，胚胎外外胚层。比例尺：100μm（单位：C）；直径50μm。
查看大型下载幻灯片

内胚层形成的时间推移成像。(一个)二倍体（2n）或四倍体（4n）胚胎的产生↔ ES细胞嵌合体用于谱系标记和镶嵌分析。(B类)静态胚胎培养系统示意图。小鼠胚胎被固定在玻璃底培养皿上，处于横向位置，并用倒置共焦显微镜成像。(C类)监测四倍体（4n）YFP中DE的形成↔ wt-dsRed ES细胞聚集嵌合体。显示了流前（E6.5）、MS（E7.0）和LS（E7.5）阶段四倍体嵌合体的中矢状和表面共焦截面。外胚层和DE来源于表达dsRed的ES细胞。胚外组织，包括VE和胚外外胚层，来源于四倍体胚胎。(D类)4n-dsRed中DE形成的延时成像序列↔ wt YFP嵌合体在MS至LS阶段。在指定的时间点（T=小时：分钟）从电影1中获取矢状共焦截面（参见补充材料中的电影1). YFP阳性DE前体细胞与dsRed阳性VE上皮细胞（黑色星号，T=0:00）相连，并开始嵌入内脏内皮层（蓝色星号，T=0:24-0:39）。中胚层细胞（红色星号）具有圆形形态，并在外胚层和VE之间迁移。请注意，所有胚胎的方向都是后向右侧，远向底部。EPI，外胚层；ExE，胚胎外外胚层。比例尺：100μm in C；直径50μm。

图2。
内胚层形成的时间推移成像。（A） 二倍体（2n）或四倍体（4n）胚胎的产生↔ ES细胞嵌合体用于谱系标记和镶嵌分析。（B） 静态胚胎培养系统示意图。小鼠胚胎被固定在玻璃底培养皿上，处于横向位置，并用倒置共焦显微镜成像。（C） 监测四倍体（4n）YFP中DE的形成↔ wt-dsRed ES细胞聚集嵌合体。显示了流前（E6.5）、MS（E7.0）和LS（E7.5）阶段四倍体嵌合体的中矢状和表面共焦截面。外胚层和DE来源于表达dsRed的ES细胞。胚外组织，包括VE和胚外外胚层，来源于四倍体胚胎。（D） 4n dsRed中DE形成的时间成像序列↔ wt YFP嵌合体在MS至LS阶段。在指定的时间点（T=小时：分钟）从电影1中获取矢状共焦截面（参见补充材料中的电影1）。YFP阳性DE前体细胞与dsRed阳性VE上皮细胞（黑色星号，T=0:00）相连，并开始嵌入内脏内皮层（蓝色星号，T=0:24-0:39）。中胚层细胞（红色星号）具有圆形形态，并在外胚层和VE之间迁移。请注意，所有胚胎的方向都是后向右侧，远向底部。EPI，外胚层；ExE，胚胎外外胚层。比例尺：100μm（单位：C）；直径50μm。
查看大型下载幻灯片

内胚层形成的时间推移成像。(一个)二倍体（2n）或四倍体（4n）胚胎的产生↔ ES细胞嵌合体用于谱系标记和镶嵌分析。(B类)静态胚胎培养系统示意图。小鼠胚胎被固定在玻璃底培养皿上，处于横向位置，并用倒置共焦显微镜成像。(C类)监测四倍体（4n）YFP中DE的形成↔ wt-dsRed ES细胞聚集嵌合体。显示了流前（E6.5）、MS（E7.0）和LS（E7.5）阶段四倍体嵌合体的中矢状和表面共焦截面。外胚层和DE来源于表达dsRed的ES细胞。胚胎外组织，包括VE和胚胎外胚层，来源于四倍体胚胎。(D类)4n dsRed中DE形成的时间成像序列↔ wt YFP嵌合体在MS至LS阶段。在指定的时间点（T=小时：分钟）从电影1中获取矢状共焦截面（参见补充材料中的电影1). YFP阳性DE前体细胞与dsRed阳性VE上皮细胞（黑色星号，T=0:00）相连，并开始嵌入内脏内皮层（蓝色星号，T=0:24-0:39）。中胚层细胞（红色星号）具有圆形形态，并在外胚层和VE之间迁移。请注意，所有胚胎的方向都是后向右侧，远向底部。EPI，外胚层；ExE，胚胎外胚层。比例尺：100μm（单位：C）；直径50μm。

延时成像揭示了中胚层和内胚层细胞群体的特征性形态发生行为

为了进一步了解原肠胚形成期间中胚层和内胚层形成的形态发生机制，我们利用延时共焦成像技术开发了一个静态胚胎培养系统(图2A-D). 内胚层发育分析中的一个主要困难是缺乏能够区分胚胎DE和胚外VE的合适标记基因(Lewis和Tam，2006年). 为此，我们使用聚集嵌合体分析了生殖层的形成，这使我们能够通过不同的荧光标记基因标记胚胎和胚外谱系(图2A). 四倍体（4n）或二倍体（2n）胚胎↔ 野生型9（wt）ES细胞聚集嵌合体（以下称为2n/4n↔ wt嵌合体），ES细胞只能参与胚胎外胚层，而胚外谱系总是由2n或4n胚胎的细胞形成(Tam和Rossant，2003年). 因此，使用2n和4n嵌合体使我们能够区分胚胎谱系，即外胚层、中胚层和DE，以及胚胎外谱系，特别是滋养层和VE。生成2n嵌合体还使我们能够在外胚层中生成遗传镶嵌体，以便在其他野生型环境中研究突变细胞。对于延时成像，我们使用了反向共焦显微镜和静态胚胎培养系统(图2B). 使用LSM分析固定4n嵌合体的中矢状面和表面水平的单个光学切片，发现外胚层始终完全来源于流前阶段（E6.5）的ES细胞，并被4n胚胎的单层VE上皮覆盖(图2C) (n个>100). 根据小鼠胚胎的命运图研究预测(劳森等人，1991年;劳森和佩德森，1992年;Tam和Beddington，1992年)，第一个DE细胞从外胚层招募，并在MS期插入APS区域的表面VE(图2C). 到LS阶段，DE的招募几乎完成，VE大部分被DE取代(图2C). 从这些结果中，我们得出结论，使用聚集嵌合体的荧光标记产生有用的遗传镶嵌，以监测LS-期前胚胎的细胞过程和谱系分配。接下来，我们使用静态固定化4n dsRed的LSM进行延时实时成像分析↔ 原肠胚形成期间的wt-YFP嵌合体(图2D). 正如我们对固定MS嵌合体的分析所表明的那样(图2C)，DE细胞在APS区形成，并在此发育阶段嵌入上覆VE(图2D; 看见补充材料中的电影1). 延时分析显示，即使在DE细胞插入外部VE之前，DE和中胚层细胞群在PS区域也是形态上不同的细胞群(图2D)（时间0:00–0:39）。DE细胞形态平坦，平均长宽比为4:1（l=13.1±1.7μm；w=3.24±0.67μm；l/w=4.21±0.9；n个=50），而中胚层细胞呈现典型的圆形形态，长宽比约为1.4:1（l=7.73±1.54μm；w=5.63±1.16μm；l/w=1.41±0.36；n个=50）。此外，T阳性中胚层细胞和Foxa2阳性内胚层细胞在MS阶段表现出不同的形态（参见补充材料中的图S2)，表明中胚层和内胚层可以通过标记基因的表达和形态学来区分。这一观察结果与之前在斑马鱼身上获得的结果一致(瓦尔加和努斯莱因·沃尔哈德，1999年)，证明高等脊椎动物的中胚层和内胚层细胞群也可以通过形态学标准进行区分，并且这些细胞群是在外胚层中指定的(图1)并在PS区分化和分离(图2).

图3。
Foxa2突变嵌合体在原肠胚形成过程中未能形成解剖特征节点和明确的内胚层。（A） 4n YFP的矢状共焦截面↔ Lyn-Tomato wt（左侧面板，MS阶段）或Foxa2–/–（右侧面板，LS阶段）嵌合体。野生型DE在MS阶段嵌入外部VE。Foxa2突变细胞积聚在PS区，不会嵌入上覆的VE上皮。胚胎远端没有形成特征性结节。请注意，前外胚层和夹层DE细胞显示Lyn-Tomato（红色星号）的清晰顶端定位。（B） 2n dsRed中DE形成的时间成像序列↔ Foxa2–/–YFP嵌合体在MS至LS阶段。矢状共焦截面是在指定的时间点从电影2中拍摄的（参见补充材料中的电影2）。Foxa2突变的“内胚层样”细胞具有细长的形态（黑色星号），沿着VE排列，但无法嵌入外部上皮。注意APS中Foxa2突变细胞的EMT（白色星号）（T=0:00至1:45）。（C） 4n-dsRed中内皮样细胞离开VE上皮的时间-成像序列↔ Foxa2–/–YFP嵌合体在MS至LS阶段。中矢状切面，在指定的时间点位于左侧前方和底部远端（参见补充材料中的电影3）。AP，心尖；BAS，基础；内皮样细胞；EPI，外胚层。
查看大型下载幻灯片

福克斯2突变嵌合体在原肠胚形成过程中未能形成解剖特征节点和明确的内胚层。(一个)4n YFP的矢状共焦截面↔ Lyn Tomato wt（左侧面板，MS阶段）或福克斯2–/–（右侧面板，LS级）嵌合体。野生型DE在MS阶段嵌入外部VE。福克斯2突变细胞积聚在PS区，不嵌入上覆的VE上皮。胚胎远端没有形成特征性结节。请注意，前外胚层和夹层DE细胞显示Lyn-Tomato（红色星号）的清晰顶端定位。(B类)2n dsRed中DE形成的延时成像序列↔福克斯2–/–YFP嵌合体在MS至LS阶段。矢状共焦切片取自电影2中所示时间点（参见补充材料中的电影2).福克斯2具有细长形态的突变“内胚层样”细胞（黑色星号）沿着VE排列，但无法嵌入外部上皮。注意EMT福克斯2APS中的突变细胞（白色星号）（T=0:00至1:45）。(C类)4n-dsRed中内皮样细胞离开VE上皮的时间-成像序列↔福克斯2–/–YFP嵌合体在MS至LS阶段。中矢状切面，在指定的时间点位于左侧前方和底部远端（参见补充材料中的电影3). AP，心尖；BAS，基础；内皮样细胞；EPI，外胚层。

图3。
Foxa2突变嵌合体在原肠胚形成过程中未能形成解剖特征节点和明确的内胚层。（A） 4n YFP的矢状共焦截面↔ Lyn-Tomato wt（左侧面板，MS阶段）或Foxa2–/–（右侧面板，LS阶段）嵌合体。野生型DE在MS阶段嵌入外部VE。Foxa2突变细胞积聚在PS区，不会嵌入上覆的VE上皮。胚胎远端没有形成特征性结节。请注意，前外胚层和夹层DE细胞显示Lyn-Tomato（红色星号）的清晰顶端定位。（B） 2n dsRed中DE形成的时间成像序列↔ Foxa2–/–YFP嵌合体在MS至LS阶段。矢状共焦截面是在指定的时间点从电影2中拍摄的（参见补充材料中的电影2）。Foxa2突变的“内胚层样”细胞具有细长的形态（黑色星号），沿着VE排列，但无法嵌入外部上皮。注意APS中Foxa2突变细胞（白色星号）的EMT（T=0:00至1:45）。（C） 4n-dsRed中内皮样细胞离开VE上皮的时间-成像序列↔ Foxa2–/–YFP嵌合体在MS至LS阶段。中矢状切面，在指定的时间点位于左侧前方和底部远端（参见补充材料中的电影3）。AP，心尖；BAS，基础；内皮样细胞；EPI，外胚层。
查看大型下载幻灯片

福克斯2突变嵌合体在原肠胚形成过程中未能形成解剖特征节点和明确的内胚层。(一个)4n YFP的矢状共焦截面↔ Lyn Tomato wt（左侧面板，MS阶段）或福克斯2–/–（右侧面板，LS级）嵌合体。野生型DE在MS阶段嵌入外部VE。福克斯2突变细胞积聚在PS区，不嵌入上覆的VE上皮。胚胎远端没有形成特征性结节。请注意，前外胚层和夹层DE细胞显示Lyn-Tomato（红色星号）的清晰顶端定位。(B类)2n dsRed中DE形成的时间成像序列↔福克斯2–/–YFP嵌合体在MS至LS阶段。在指定的时间点从电影2中拍摄了矢状共焦截面（参见补充材料中的电影2).福克斯2具有细长形态的突变“内胚层样”细胞（黑色星号）沿着VE排列，但无法嵌入外部上皮。注意EMT福克斯2APS中的突变细胞（白色星号）（T=0:00至1:45）。(C类)4n-dsRed中内皮样细胞离开VE上皮的时间-成像序列↔福克斯2–/–YFP嵌合体在MS至LS阶段。中矢状切面，在指定的时间点位于左侧前方和底部远端（参见补充材料中的电影3). AP，心尖；BAS，基础；内皮样细胞；EPI，外胚层。

Foxa2调节内胚层胚层上皮化

为了分析Foxa2转录因子如何在细胞水平上调节最终的内胚层发育，我们利用Foxa2敲除ES细胞系(Ang和Rossant，1994年)并使用LSM分析遗传镶嵌。在4n中↔ wt嵌合体，DE细胞从MS期开始嵌入APS区的外部VE，并通过LS期取代和分散VE(图3A) (n个>20). 与此形成鲜明对比的是，所有4n↔福克斯2–/–嵌合体没有DE嵌入的迹象，即使在LS期结束时，也无法在胚胎远端形成解剖节点，这表明节点和最终内皮细胞要么没有形成，要么这些细胞没有到达表面上皮层(图3A) (n个>30). 我们注意到，从E7.5开始，细胞在APS区域积聚，并经常导致后上皮细胞压入羊膜腔(图3A; 看见补充材料中的电影3; 数据未显示）。接下来，我们使用LSM进行延时成像福克斯2–/–ES 2n嵌合体用于分析福克斯2野生型环境中的突变细胞(图3B; 看见补充材料中的电影2) (n个=9). 如本研究早期所示，Foxa2阳性外胚层细胞位于APS区域(图1)离开上皮形成DE，DE嵌入上覆VE(图2). 成像福克斯2MS期以后的空细胞清楚地显示APS细胞离开外胚层并进入APS区域(图3B)（t=0:00-1:45小时，白色星号）。与野生型DE细胞相比，福克斯2–/–`内胚层样细胞呈内胚层形态(图3B)（时间0:00；l=13.3±2.6μm；w=3.8±0.7μm；l/w:3.6±0.9；n个=50），接触并部分整合到外部VE中，但未能上皮化(图3B)（时间0:00-1:15，黑色星号）。我们想知道是否在2n↔ wt嵌合体野生型细胞具有竞争优势，替代或挽救了DE形成；因此，这可能是原因福克斯2–/–细胞未整合在外上皮中。因此，我们分析了4n中突变细胞的细胞行为↔福克斯2–/–嵌合体(图3C; 看见补充材料中的电影3). 我们清楚地观察到细胞，这些细胞被插入，但仍保留在外部上皮(图3C)（时间0:00-0:36）。这表明Foxa2对DE细胞与VE上皮的功能整合是必要的。

图4。
Foxa2突变细胞的分子鉴定。（A） 全原位杂交显示野生型胚胎（n=5）和4n中肠系膜和EMT标记Eomes的可比表达↔ LS阶段的Foxa2–/–嵌合体（n=3）。（B） 在MS阶段，Hex mRNA在野生型嵌合体（n=3）和Foxa2突变嵌合体（n=6）的前VE（星号）和APS区域中高度表达。（C） 全套免疫染色法检测2n中的T蛋白↔ LS阶段的Foxa2–/–YFP嵌合体。在内皮上皮层（末端）检测到Foxa2–/–内皮样细胞（用YFP抗体标记，绿色），但不合成中胚层标记蛋白T（红色箭头）。外胚层（epi）、中胚层（mes）和内胚层（endoderm）胚层由DAPI通道中的虚线分隔。
查看大型下载幻灯片

的分子特性福克斯2突变细胞。(一个)整体原位杂交显示肠系膜和EMT标记的可比表达脱中胚蛋白在野生型胚胎中(n个=5）和4n↔福克斯2–/–嵌合体(n个=3）在LS阶段。(B类)在MS阶段，十六进制mRNA在野生型的前VE（星号）和APS区域高表达(n个=3）和福克斯2突变嵌合体(n个=6).(C类)全套免疫染色法检测2n中的T蛋白↔福克斯2–/–YFP嵌合体在LS阶段。福克斯2–/–在内胚层上皮层（末端）检测到内胚层样细胞（用YFP抗体标记，绿色），但不合成中胚层标记蛋白T（红色箭头）。外胚层（epi）、中胚层（mes）和内胚层（endoderm）胚层由DAPI通道中的虚线分隔。

图4。
Foxa2突变细胞的分子鉴定。（A） 全套原位杂交显示间充质和EMT标记物Eomes在野生型胚胎（n=5）和4n中的表达相当↔ Foxa2–/–嵌合体（n=3）在LS阶段。（B） 在MS阶段，Hex mRNA在野生型嵌合体（n=3）和Foxa2突变嵌合体（n=6）的前VE（星号）和APS区域中高度表达。（C） 全套免疫染色法检测2n中的T蛋白↔ Foxa2–/–YFP嵌合体在LS阶段。在内皮上皮层（末端）检测到Foxa2–/–内皮样细胞（用YFP抗体标记，绿色），但不合成中胚层标记蛋白T（红色箭头）。外胚层（epi）、中胚层（mes）和内胚层（endoderm）胚层由DAPI通道中的虚线分隔。
查看大型下载幻灯片

的分子特性福克斯2突变细胞。(一个)整体原位杂交显示肠系膜和EMT标记的可比表达脱中胚蛋白在野生型胚胎中(n个=5）和4n↔福克斯2–/–嵌合体(n个=3）在LS阶段。(B类)在MS阶段，十六进制mRNA在野生型的前VE（星号）和APS区域高表达(n个=3）和福克斯2突变嵌合体(n个=6).(C类)全套免疫染色法检测2n中的T蛋白↔福克斯2–/–YFP嵌合体在LS阶段。福克斯2–/–在内胚层上皮层（末端）检测到内胚层样细胞（用YFP抗体标记，绿色），但不合成中胚层标记蛋白T（红色箭头）。外胚层（epi）、中胚层（mes）和内胚层（endoderm）胚层由DAPI通道中的虚线分隔。

接下来，我们分析了内皮样细胞的特性，它们在没有Foxa2的情况下形成并嵌入外部VE。我们进行了全山原位杂交，以检测调节EMT和肠系膜形成的内胚层特异性基因[脱中胚蛋白(Arnold等人，2008年)]转录和内胚层形成[十六进制(托马斯等人，1998年;马丁内斯·巴贝拉等人，2000年)]，以及细胞基质粘附[整合素α3(Tamplin等人，2008年)]紧密连接形成（claudin 4）。完全进入福克斯2–/–ES-细胞衍生的MS期胚胎，脱中胚蛋白在PS中以正常水平表达，证实福克斯2突变细胞接受EMT并形成肠系膜(图4A;图3). 此外，ADE的形成在福克斯2内胚层标记基因的表达表明突变细胞十六进制(图4B). 我们之前使用4n的基因表达谱↔ 重量和福克斯2–/–嵌合体鉴定原肠胚形成期差异表达基因(Tamplin等人，2008年). 该分析显示紧密连接标记物claudin 4和细胞基质粘附分子整合素α3(伊特加3)是DE中Foxa2的潜在靶基因。引人注目的是，我们发现伊特加3在4n的APS区域强烈表达↔福克斯2–/–头戴舞台上的嵌合体(Tamplin等人，2008年)(图2C、F)在4n的前内皮区未检测到紧密连接标记claudin 4↔福克斯2–/–嵌合体(图6C). 为了进一步确定福克斯2–/–在细胞水平上，我们进行了整体IHC检测中胚层标记蛋白T，福克斯2–/–部分整合到外部VE中的内皮样细胞T蛋白为阴性(图4C)，表明福克斯2–/–内胚层细胞没有转变为中胚层，但仍然保持内胚层样，表达Eomes，六角和伊特加3但不是紧密连接标记claudin 4。这些结果清楚地表明内皮样细胞形成于福克斯2突变体，但在APS区域积累，不能诱导claudin 4，并且不能在功能上整合到外部VE中（与图3).

图5。
Foxa2–/–突变细胞在嵌入外部上皮时无法获得顶端-基底极性。（A） 插入4n YFP中YFP阳性（绿色）VE的DE细胞（星号）的延时成像序列↔ wt Lyn-Tomato嵌合体在LS期。在指定的时间点从电影4中拍摄的PS后区域的矢状共焦切片（参见补充材料中的电影4）。在插入过程中，内胚层细胞延伸丝状足类（虚线，T=0）并获得AB极性，如顶端荧光标记蛋白Lyn Tomato所示（白色箭头，T=0:15-:45）。（B） （顶部）DE细胞显示Lyn-Tomato在4n YFP中的顶端定位↔ wt Lyn-Tomato嵌合体在MS至LS阶段。箭头表示极化（白色）和非极化（红色）细胞。（下图）Foxa2突变细胞无法在4n YFP中定位Lyn-Tomato↔ Foxa2–/–Lyn-Tomato嵌合体。（中）野生型DE细胞（78.9±4.6%；n=109；三个胚胎）和Foxa2突变细胞（54.9±5.7%；n=111；四个胚胎）的Lyn-Tomato顶端定位存在统计学显著差异（*P<0.01）。
查看大型下载幻灯片

福克斯2–/–突变细胞在插入外上皮的过程中不能获得顶端-基底极性。(一个)插入4n YFP中YFP阳性（绿色）VE的DE细胞（星号）的时间成像序列↔ wt Lyn-Tomato嵌合体在LS期。在指定的时间点从电影4中拍摄的PS后区域的矢状共焦切片（参见补充材料中的电影4）。正如顶端荧光标记蛋白Lyn-Tomato（白色箭头，T=0:15-0:45）所示，在插入过程中，内胚层细胞延伸出丝足（虚线，T=0）和aquire AB极性。(B类)（顶部）DE细胞显示Lyn-Tomato在4n YFP中的顶端定位↔ wt Lyn-Tomato嵌合体在MS至LS阶段。箭头表示极化（白色）和非极化（红色）细胞。（底部）福克斯2突变细胞无法在4n YFP中定位Lyn-Tomato↔福克斯2–/–Lyn-Tomato嵌合体。（中）存在统计显著差异(*P（P）<0.01）在野生型DE细胞之间的根尖Lyn-Tomato定位（78.9±4.6%；n个=109; 三个胚胎）和福克斯2突变细胞（54.9±5.7%）；n个=111；四个胚胎）。

图5。
Foxa2–/–突变细胞在嵌入外部上皮时无法获得顶端-基底极性。（A） 插入4n YFP中YFP阳性（绿色）VE的DE细胞（星号）的时间成像序列↔ wt Lyn-Tomato嵌合体在LS期。在指定的时间点从电影4中拍摄的PS后区域的矢状共焦切片（参见补充材料中的电影4）。正如顶端荧光标记蛋白Lyn-Tomato（白色箭头，T=0:15-0:45）所示，在插入过程中，内胚层细胞延伸出丝足（虚线，T=0）和aquire AB极性。（B） （顶部）DE细胞显示Lyn-Tomato在4n YFP中的顶端定位↔ 在MS至LS阶段的wt Lyn番茄嵌合体。箭头表示极化（白色）和非极化（红色）细胞。（下图）Foxa2突变细胞无法在4n YFP中定位Lyn-Tomato↔ Foxa2–/–Lyn番茄嵌合体。（中）野生型DE细胞（78.9±4.6%；n=109；三个胚胎）和Foxa2突变细胞（54.9±5.7%；n=111；四个胚胎）的Lyn-Tomato顶端定位存在统计学显著差异（*P<0.01）。
查看大型下载幻灯片

福克斯2–/–突变细胞在插入外上皮的过程中不能获得顶端-基底极性。(一个)插入4n YFP中YFP阳性（绿色）VE的DE细胞（星号）的时间成像序列↔ wt Lyn-Tomato嵌合体在LS期。在指定的时间点从电影4中拍摄的PS后区域的矢状共焦切片（参见补充材料中的电影4）。正如顶端荧光标记蛋白Lyn-Tomato（白色箭头，T=0:15-0:45）所示，在插入过程中，内胚层细胞延伸出丝足（虚线，T=0）和aquire AB极性。(B类)（顶部）DE细胞显示Lyn-Tomato在4n YFP中的顶端定位↔ wt Lyn-Tomato嵌合体在MS至LS阶段。箭头表示极化（白色）和非极化（红色）细胞。（底部）福克斯2突变细胞无法在4n YFP中定位Lyn-Tomato↔福克斯2–/–Lyn-Tomato嵌合体。（中）存在统计显著差异(*P（P）<0.01）在野生型DE细胞之间的根尖Lyn-Tomato定位（78.9±4.6%；n个=109; 三个胚胎）和福克斯2突变细胞（54.9±5.7%）；n个=111; 四个胚胎）。

Foxa2对建立AB极性和细胞间粘附很重要

为了更好地了解福克斯2突变的内胚层细胞，我们更详细地分析了内胚层嵌入的过程。为此，我们利用了一种普遍存在的Lyn-Tomato表达ES细胞系(图5). 将Lyn激酶的10个N-末端氨基酸（包含一致的N-肉豆蔻酰化和S-棕榈酰化位点）融合到番茄蛋白的N-末端，以将融合蛋白靶向质膜。令人惊讶的是，广泛表达的Lyn-Tomato蛋白积聚在外胚层和DE上皮的顶膜表面(图3A，红色星号）。在PS区域，外胚层细胞失去极性并经历EMT，Lyn-Tomato蛋白的连续顶端定位被破坏。使用Lyn-Tomato作为分析细胞极性的工具，我们对4n-YFP中嵌入的DE细胞进行了延时实时成像↔ wt Lyn-Tomato嵌合体(图5A; 看见补充材料中的电影4). 在插入开始时，与外部VE接触的DE细胞没有极化，而是延伸到外部上皮的丝状突起(图5A)（时间0:00）。在嵌入过程中，DE细胞变得越来越极化(图5A)（时间0:15–0:30），并在过程结束时通过Lyn-Tomato定位清楚地显示AB细胞极性(图5A)（时间0:45）。

图6。
Foxa2–/–突变细胞没有获得顶端-基底极性，无法定位粘附物和紧密连接蛋白。（A） 全安装LS嵌合体小鼠胚胎（2n-YFP）的中矢状切面↔ 林·托马托）。野生型显示在顶部的一对面板中，Foxa2突变体显示在底部。切片用抗GFP抗体染色以检测Foxa2–/–细胞（YFP，绿色；蓝色星号）或野生型细胞（未染色；红色星号）、抗E-cadherin抗体（E-Cad，红色）和DAPI（蓝色）以标记所有细胞核。在野生型细胞（红色箭头；条形图中的wt-wt）之间和野生型细胞与Foxa2–/–细胞（绿色箭头；KO-wt）间的基底外侧膜上发现了E-cadherin染色的粘附连接，但在两个Foxa2-/–细胞之间没有发现粘附连接（黄色箭头；KO-KO）。条形图显示了E-cadherin在wt-wt（87.7±6.2%；n=23）或KO-wt（88.3±4.8%；n=34）细胞粘附连接处的定位与来自三种不同嵌合体胚胎的KO-KO（16±9.4%；n:21）细胞之间的统计显著差异（P<0.01）。（B） Foxa2–/–突变细胞无法将ZO-1紧密连接蛋白定位到顶端表面。全山免疫染色LS嵌合小鼠胚胎（2n wt）的中矢状切面↔ Foxa2–/–YFP）用抗GFP抗体染色以检测Foxa2-/–细胞（YFP，绿色；白色星号），用抗ZO-1（黄色）和DAPI（蓝色）标记所有细胞核。在野生型内胚层细胞（YFP阴性）中，ZO-1蛋白定位于基底外侧紧密连接处的点状结构（蓝色箭头），而Foxa2–/–突变细胞显示ZO-1在顶端表面积聚（白色箭头）。量化显示野生型（85.4±5.1%；n=237）和Foxa2突变型（15.4±6.7%；n=123）细胞之间紧密连接ZO-1定位存在统计学显著差异（P<0.01）。（C） 野生型（n=7）和Foxa2–/–嵌合体（n=4）的原位杂交表明，Foxa2-/–突变体的前界内胚层中claudin 4 mRNA在头皮期显著降低。
查看大型下载幻灯片

福克斯2–/–突变细胞没有获得顶端-基底极性，不能定位粘附物和紧密连接蛋白。(一个)全安装LS嵌合体小鼠胚胎（2n-YFP）的中矢状切面↔ 林·托马托）。野生型显示在顶部的一对面板中福克斯2底部的突变体。切片用抗GFP抗体染色以检测福克斯2–/–细胞（YFP，绿色；蓝色星号）或野生型细胞（未染色；红色星号）、抗E-钙粘蛋白抗体（E-Cad，红色）和DAPI（蓝色）标记所有细胞核。在野生型细胞（红色箭头；条形图中为wt-wt）之间的基底外侧膜以及野生型和福克斯2–/–单元格（绿色箭头；KO-wt），但不在两个单元格之间福克斯2–/–单元格（黄色箭头；KO-KO）。条形图显示了统计上的显著差异(P（P）E-cadherin在wt-wt粘连连接处的定位（87.7±6.2%；n个=23）或KO-wt（88.3±4.8%；n个=34）与KO-KO（16±9.4%；n个＝21）来自三个不同嵌合胚胎的细胞。(B类)福克斯2–/–突变细胞无法将ZO-1紧密连接蛋白定位到顶端表面。免疫染色的LS嵌合小鼠胚胎（2nwt↔福克斯2–/–YFP）用抗GFP抗体染色检测福克斯2–/–细胞（YFP，绿色；白色星号），带有抗ZO-1（黄色）和DAPI（蓝色）标记所有细胞核。在野生型内胚层细胞（YFP阴性）中，ZO-1蛋白定位于基底外侧紧密连接（蓝色箭头）的点状结构，而福克斯2–/–突变细胞显示ZO-1在顶端表面积聚（白色箭头）。量化显示出统计显著性(P（P）<0.01）野生型之间紧密连接ZO-1定位的差异（85.4±5.1%；n个=237）和福克斯2突变型（15.4±6.7%；n个=123）个单元格。(C类)野生型原位杂交(n个=7）和福克斯2–/–嵌合体(n个=4）表明克劳丁4 mRNA在大鼠的前界内胚层中显著降低福克斯2–/–头巾阶段的突变体。

图6。
Foxa2–/–突变细胞没有获得顶端-基底极性，无法定位粘附物和紧密连接蛋白。（A） 全安装LS嵌合体小鼠胚胎（2n-YFP）的中矢状切面↔ 林·托马托）。野生型显示在顶部的一对面板中，Foxa2突变体显示在底部。切片用抗GFP抗体染色以检测Foxa2–/–细胞（YFP，绿色；蓝色星号）或野生型细胞（未染色；红色星号）、抗E-cadherin抗体（E-Cad，红色）和DAPI（蓝色）以标记所有细胞核。在野生型细胞（红色箭头；条形图中的wt-wt）之间和野生型细胞与Foxa2–/–细胞（绿色箭头；KO-wt）间的基底外侧膜上发现了E-cadherin染色的粘附连接，但在两个Foxa2-/–细胞之间没有发现粘附连接（黄色箭头；KO-KO）。条形图显示了在wt wt（87.7±6.2%；n=23）或KO wt（88.3±4.8%；n=34）与来自三种不同嵌合胚胎的KO-KO（16±9.4%；n=21）细胞中E-钙粘蛋白在粘附物连接处的定位之间的统计学显著差异（P<0.01）。（B） Foxa2–/–突变细胞无法将ZO-1紧密连接蛋白定位到顶端表面。全山免疫染色LS嵌合小鼠胚胎（2n wt）的中矢状切面↔ Foxa2–/–YFP）用抗GFP抗体染色以检测Foxa2-/–细胞（YFP，绿色；白色星号），用抗ZO-1（黄色）和DAPI（蓝色）标记所有细胞核。在野生型内胚层细胞（YFP阴性）中，ZO-1蛋白定位于基底外侧紧密连接处的点状结构（蓝色箭头），而Foxa2–/–突变细胞显示ZO-1在顶端表面积聚（白色箭头）。量化显示野生型（85.4±5.1%；n=237）和Foxa2突变型（15.4±6.7%；n=123）细胞之间紧密连接ZO-1定位存在统计学显著差异（P<0.01）。（C） 野生型（n=7）和Foxa2–/–嵌合体（n=4）的原位杂交表明，Foxa2-/–突变体的前界内胚层中claudin 4 mRNA在头皮期显著降低。
查看大型下载幻灯片

福克斯2–/–突变细胞不能获得顶端基底极性，并且不能定位粘附物和紧密连接蛋白。(一个)全安装LS嵌合体小鼠胚胎（2n-YFP）的中矢状切面↔ 林·托马托）。野生型显示在顶部的一对面板中福克斯2底部的突变体。切片用抗GFP抗体染色以检测福克斯2–/–细胞（YFP，绿色；蓝色星号）或野生型细胞（未染色；红色星号）、抗E-钙粘蛋白抗体（E-Cad，红色）和DAPI（蓝色）标记所有细胞核。在野生型细胞（红色箭头；条形图中为wt-wt）之间的基底外侧膜以及野生型和福克斯2–/–单元格（绿色箭头；KO-wt），但不在两个单元格之间福克斯2–/–单元格（黄色箭头；KO-KO）。条形图显示了统计上的显著差异(P（P）E-cadherin在wt-wt粘连连接处的定位（87.7±6.2%；n个=23）或KO-wt（88.3±4.8%；n个=34）与KO-KO（16±9.4%；n个=21）来自三个不同嵌合体胚胎的细胞。(B类)福克斯2–/–突变细胞无法将ZO-1紧密连接蛋白定位到顶端表面。全山免疫染色LS嵌合小鼠胚胎（2n wt）的中矢状切面↔福克斯2–/–YFP）用抗GFP抗体染色检测福克斯2–/–细胞（YFP，绿色；白色星号），带有抗ZO-1（黄色）和DAPI（蓝色）标记所有细胞核。在野生型内胚层细胞（YFP阴性）中，ZO-1蛋白定位于基底外侧紧密连接（蓝色箭头）的点状结构，而福克斯2–/–突变细胞显示ZO-1在顶端表面积聚（白色箭头）。量化显示出统计显著性(P（P）<0.01）野生型之间紧密连接ZO-1定位的差异（85.4±5.1%；n个=237）和福克斯2突变型（15.4±6.7%；n个=123）个单元格。(C类)野生型原位杂交(n个=7）和福克斯2–/–嵌合体(n个=4）表明克劳丁4 mRNA在大鼠的前界内胚层中显著降低福克斯2–/–处于头褶阶段的突变体。

使用Lyn-Tomato作为顶膜标记物，我们比较了4n细胞的极化↔ wt或福克斯2–/–嵌合体(图5B). 分析MS到LS阶段的胚胎表明福克斯2突变细胞能够将Lyn-Tomato定位在顶端膜(图5B，白色箭头）。然而，分析也显示了wt和福克斯2突变细胞。为了研究细胞极性缺陷的原因，我们使用全套免疫定位研究来分析粘附物和/或紧密连接的形成，以检测内皮上皮中的E-cadherin和ZO-1。比较MS和LS阶段4n↔ 重量和福克斯2–/–嵌合体清楚地表明，粘附连接蛋白E-cadherin并不定位于相邻突变细胞之间的连接处，但令人惊讶的是，突变wt细胞连接处显示出与wt-wt粘附连接处相似的基底外侧定位程度(图6A). 我们推测E-cadherin在突变-wt细胞连接中的正确定位是由于突变细胞中E-cadherin蛋白与wt细胞中正确定位于基底外侧结构域的E-cadherine蛋白的同型分子相互作用。然而，这些相互作用可能是暂时的，因为突变细胞未能在功能上整合到外部上皮中。由于第4条没有在福克斯2突变体(图6C)，我们研究了紧密连接蛋白ZO-1的定位。比较MS和LS阶段2n↔ 重量和福克斯2–/–嵌合体显示，wt细胞以点状方式将ZO-1定位于基底外侧连接，而大多数突变细胞则将ZO-1定位于顶端表面(图6B). 众所周知，Claudins是紧密连接的主要细胞粘附分子(Tsukita等人，2001年;Furuse和Tsukita，2006年)并通过胞内PDZ结构域特异性结合到ZO-1、ZO-2（Tjp2–小鼠基因组信息学）和ZO-3（Tjp3–小鼠基因组信息化）(Itoh等人，1999年). 因此，未能诱导claudin 4或其他claudin在内胚层表达(Sousa-Nunes等人，2003年;Hou等人，2007年)可以解释ZO-1在心尖膜的异位定位福克斯2突变的内胚层样细胞。或者，Foxa2可能调节细胞极性的分子程序，这对建立功能性紧密连接和粘附连接很重要。

在这项研究中，我们分析了野生型和福克斯2通过免疫组织化学和延时实时成像技术检测突变胚胎和嵌合体。我们发现，外胚层中已经指定了T阳性中胚层和Foxa2阳性轴向中胚层及内胚层细胞群。这些细胞经历EMT并进入PS区域，在那里分化并分离为分子和形态学上不同的中胚层和内胚层群体。扁平内胚层细胞通过形成粘附物和紧密连接，极化并整合到覆盖的上皮中。我们发现Foxa2在极化和上皮化细胞类型的外胚层前体细胞中翻译：即内胚层和中胚层轴（节点和脊索）。中胚层轴细胞在EMT后上调T蛋白，这表明Foxa2是该细胞群中T的上游。在福克斯2突变体，一种解剖特征上的节点结构并没有在胚胎的远端形成，尽管内皮样细胞在PS前区形成并积聚，但它们并没有在功能上整合到外部上皮中。这些细胞不能极化和上皮化，这意味着Foxa2调节着对这些过程很重要的分子程序。

上皮细胞在PS区被指定并分化

胚胎学和干细胞生物学中的一个重要问题是何时以及如何指定和分化前体细胞。令我们惊讶的是，T盒转录因子brachyury（T）和Forkhead盒转录因子Foxa2在原肠胚形成期间在后部外胚层的特定中胚层和内胚层前体细胞中特异性合成。通过延时成像和免疫组织化学，我们发现EMT后中胚层和内胚层细胞迅速分离和分化。T阳性外胚层细胞在PS中分化为T阳性间充质细胞，而Foxa2-阳性外胚叶细胞分化为Foxa2-正上皮内胚层细胞，整合到上覆上皮和Foxa2-阳性、T阳性的轴向中胚层细胞中。命运图分析显示，在MS期胚胎PS前端的细胞，我们已经显示Foxa2阳性，将产生前中胚层和内胚层(Kinder等人，2001年)而PS后部的细胞（我们已经显示为T阳性）将产生胚胎后中胚层和胚胎外中胚层(Kinder等人，1999年). 这与这些基因的基因功能分析一致。T缺失突变体缺乏后部中胚层和脊索(威尔金森等人，1990年;Kispert和Herrmann，1994年)，而福克斯2空突变体缺乏前中胚层和内胚层，以及节点和脊索(Ang和Rossant，1994年;Weinstein等人，1994年). 使用T-Cre和Foxa2-Cre遗传谱系追踪方法，我们和其他人最近发现Foxa2外胚层前体细胞产生前中胚层和内胚层，而T外胚层前驱细胞产生后中胚层或内胚层(Uetzmann等人，2008年;Park等人，2008年;Kumar等人，2007年;Verheyden等人，2005年). 这些结果与哺乳动物中存在双潜能肠系膜祖细胞群的观点一致(《流浪者与病人》，2001年;Lickert等人，2002年;Kubo等人，2004年). 综上所述，这些结果表明，后部外胚层可分为远端Foxa2阳性和近端T阳性前体细胞群，分别产生前和后肠系膜上皮细胞群。

Foxa2位于T的上游，并启动轴性中胚层发育

中胚层，即头突、前索板、脊索和节点是如何发育的？此前有人建议Foxa2处于轴向中胚层形成的发育计划之上(Yamanaka等人，2007年). 在MS阶段，我们检测到一个APS群体，该群体Foxa2阳性，并被定位为产生轴向中胚层和内胚层(Kinder等人，2001年). 在LS期，外胚层细胞通过形态学和标记基因表达产生了三个不同的细胞群体：一个T阳性的后中胚层群体、一个Foxa2阳性的内胚层群体和一个前Foxa2正和T阳性的轴中胚层人群。我们注意到，在EMT后，处于MS至LS期的Foxa2阳性外胚层细胞上调了T蛋白，表明Foxa2上胚层细胞产生轴向中胚层。根据淘汰赛研究可知福克斯2突变体根本不形成轴向中胚层，而T突变体最初形成但不能维持脊索后部。在本研究中，我们还发现福克斯2突变嵌合体。这表明Foxa2位于轴向中胚层层次的顶部(Yamanaka等人，2007年)与以下损失一致短梗表达，特别是在四倍体衍生的节和AME中，但不在PS中福克斯2E7.5时胚胎为零(Dufort等人，1998年). 有趣的是，轴型中胚层细胞（节点和脊索）并没有获得与后PS中其他T阳性中胚层群体一样的间充质命运，而是构成了一个高度极化并通过细胞间黏附连接的细胞群体。例如，节点细胞在胚胎远端的表面内胚层形成了一个独特的解剖结构。这些细胞显示出清晰的AB极性，通过E-钙粘蛋白介导的细胞间黏附相互连接(Yamanaka等人，2007年). 此外，节点细胞的脊索后代高度极化，在内胚层和外胚层上皮之间通过细胞间粘附形成了实心杆状结构。这表明Foxa2祖细胞通常会产生极化的、相互连接的细胞类型，Foxa2促进上皮命运并抑制间充质命运。

Foxa2诱导上皮细胞表型

在这项研究中，我们表明福克斯2突变的祖细胞离开外胚层，但未能整合到外部上皮，导致间充质细胞在APS区域积聚。这与Foxa2调节获得上皮细胞表型所必需的程序的想法一致。这也与缺乏极化和上皮化细胞类型相一致福克斯2突变胚胎，即结节、脊索和前定形内胚层(Ang和Rossant，1994年;Weinstein等人，1994年)，但Foxa2是如何调节内胚层生殖层中的细胞极性和上皮化的？在我们试图在原肠胚形成阶段确定新的Foxa2靶基因(Tamplin等人，2008年)，我们已经确定了许多潜在的靶基因，包括同源盒转录因子Hex和Otx2(Kimura-Yoshida等人，2007年)信号分子Cer1和Shh(爱泼斯坦等人，1999年;Jeong和Epstein，2003年)、SRY相关HMG盒转录因子Sox17和Forkhead盒转录因子Foxa1(Duncan等人，1998年). 大多数这些内胚层特异性图案因子在内胚层生殖层中表达，但在Foxa2阳性的外胚层前体细胞中不表达。这与Foxa2是先驱因子的观点一致，Foxa2打开致密染色质，并在高阶基因调控中发挥作用，使肠系膜和内胚层特异性转录因子指定细胞命运(Cirillo等人，2002年). 但是这个分子程序如何转化为导致中胚层或内胚层谱系决定的细胞变化呢？在这方面，有趣的是发现参与细胞粘附的蛋白质，如紧密连接蛋白claudin 4、同型细胞-细胞粘附分子Flrt2、Flrt3和Pcdh19，以及细胞-基质粘附分子Itga3，作为潜在的Foxa2内胚层靶基因(Tamplin等人，2008年). 最近研究表明，肝细胞核因子4a（HNF4a；Hnf1a–小鼠基因组信息学）是内胚层发育的重要核受体(Lemaigre和Zaret，2004年)通过特异性诱导Claudin表达，触发功能性紧密连接的形成和极化上皮形态的建立(千叶等人，2003年;Satohisa等人，2005年). ZO-1被认为是跨膜蛋白和细胞质蛋白之间的支架蛋白，可能在粘附分子和紧密连接之间形成联系，例如通过e-cadherin形成粘附分子连接与紧密连接蛋白的形成和定位有关，尤其是ZO-1(Rajasekaran等人，1996年;Siliciano and Goodenough，1988年). 综合考虑，我们建议福克斯2突变的内皮样细胞无法启动由Foxa2和不同的内皮特异性模式因子调节的内皮分子程序，从而导致细胞形态的改变，这是由细胞-细胞、细胞-基质粘附和细胞极性分子决定的。

我们感谢Wenke Barkey、Patrizia Giallonardo、Susanne Weidemann和Adrianne Tasdemir的技术支持；钱学友慷慨提供番茄和樱桃荧光蛋白；Christina Vintersten、Andras Nagy和Marina Gerstenstein用于YVI和dsRed ES细胞系；Neil Copeland慷慨地为细菌中的同源重组提供质粒和菌株；和廖佩里对手稿的宝贵意见。这项工作得到了亥姆霍兹学会（Helmholtz Society）和德国研究基金会（DFG）授予H.L。

补充材料

Ang，S.L.和Rossant，J。(
1994
). 在小鼠发育过程中，HNF-3β对节点和脊索的形成至关重要。
单元格
78
，
561
-574中。
Ang，S.L.、Wierda，A.、Wong，D.、Stevens，K.A.、Cascio，S.、Rossant，J.和Zaret，K.S。(
1993
). 小鼠最终内胚层谱系的形成和维持：HNF3/叉头蛋白的参与。
开发
119
，
1301
-1315.
S.J.阿诺德、英国霍夫曼、英国比科夫和E.J.罗伯逊。(
2008
). 小鼠中胚层蛋白在轴形成、上皮-间充质转化和内胚层规范过程中的关键作用。
开发
135
，
501
-511.
Beddington，R.S.和Robertson，E.J。(
1999
). 哺乳动物轴突发育和早期不对称。
单元格
96
，
195
-209.
Chiba，H.、Gotoh，T.、Kojima，T.，Satohisa，S.、Kikuchi，K.、Osanai，M.和Sawada，N。(
2003
). 肝细胞核因子（HNF）-4alpha触发F9胚胎癌细胞中功能性紧密连接的形成和极化上皮形态的建立。
实验细胞研究。
286
，
288
-297.
西里洛，L.A.、林，F.R.、库斯塔，I.、弗里德曼，D.、贾尼克，M.和扎雷特，K.S。(
2002
). 早期发育转录因子HNF3（FoxA）和GATA-4打开致密染色质。
分子电池
9
，
279
-289.
B.G.Ciruna和J.Rossant。(
1999
). 小鼠早期发育过程中T-box基因Eomesodermin的表达。
机械。开发。
81
，
199
-203.
Dufort，D.，Schwartz，L.，Harpal，K.和Rossant，J。(
1998
). 内脏内胚层需要转录因子HNF3beta进行正常的原始条纹形态发生。
开发
125
，
3015
-3025.
Duncan，S.A.、Navas，M.A.、Dufort，D.、Rossant，J.和Stoffel，M。(
1998
). 调节分化和代谢所需的转录因子网络。
科学类
281
，
692
-695.
爱泼斯坦·D·J、麦克马洪·A·P和乔伊纳·A·L。(
1999
). 小鼠中枢神经系统前后轴声波刺猬转录的区域化由Hnf3依赖和独立机制调节。
开发
126
，
281
-292中。
Fehling，H.J.、Lacaud，G.、Kubo，A.、Kennedy，M.、Robertson，S.、Keller，G.和Kouskoff，V。(
2003
). 追踪胚胎干细胞分化过程中中胚层对成血管细胞的诱导及其规格。
开发
130
，
4217
-4227.
Furuse，M.和Tsukita，S。(
2006
). Claudins阻断了人和苍蝇的连接。
趋势细胞生物学。
16
，
181
-188.
Hadjantonakis，A.K.、Macmaster，S.和Nagy，A。(
2002
). 胚胎干细胞和小鼠表达不同的GFP变异体，用于单个动物内的多种非侵入性报告。
BMC生物技术。
2
，
11
.
B.G.赫尔曼。(
1991
). Brachyury基因在全山TWis/TWis突变胚胎中的表达模式。
开发
113
，
913
-917.
Hitz，C.、Wurst，W.和Kuhn，R。(
2007
). 使用Cre/loxP调节的RNA干扰对MAPK进行条件性脑特异性敲除。
核酸研究。
35
，
e90（电子90）
.
Hou，J.、Charters，A.M.、Lee，S.C.、Zhao，Y.、Wu，M.K.、Jones，S.J.、Marra，M.A.和Hoodless，P.A。(
2007
). 通过基因表达序列分析（SAGE）对最终内胚层中表达的基因进行系统筛选。
BMC开发生物。
7
，
92
.
Inman，K.E.和Downs，K.M。(
2006
). 短梗是小鼠尿囊伸长和血管生成所必需的。
开发
133
，
2947
-2959.
伊藤M.、福鲁斯M.、盛田K.、久保田K.、赛投M.和津田S。(
1999
). 三个紧密结合相关的MAGUK，ZO-1，ZO-2和ZO-3与克劳丁的COOH末端直接结合。
《细胞生物学杂志》。
147
，
1351
-1363.
Jeong，Y.和Epstein，D.J。(
2003
). 底板和脊索中Shh转录的不同调节器表明这些组织在小鼠淋巴结中的来源不同。
开发
130
，
3891
-3902.
Kimura-Yoshida，C.，Tian，E.，Nakano，H.，Amazaki，S.，Shimokawa，K.，Rossant，J.，Aizawa，S.和Matsuo，I。(
2007
). Foxa2通过调节前内脏内皮特异性基因在小鼠前后轴极化中的关键作用。
程序。国家。阿卡德。科学。美国
104
，
5919
-5924.
Kinder，S.J.、Tsang，T.E.、Quinlan，G.A.、Hadjantonakis，A.K.、Nagy，A.和Tam，P.P。(
1999
). 小鼠胚胎原肠胚形成期间，中胚层细胞有序地分配到胚外结构和前后轴。
开发
126
，
4691
-4701.
Kinder，S.J.、Tsang，T.E.、Wakamiya，M.、Sasaki，H.、Behringer，R.R.、Nagy，A.和Tam，P.P。(
2001
). 小鼠原肠胚的组织者由中胚层中胚层的动态祖细胞群组成。
开发
128
，
3623
-3634.
Kispert，A.和Herrmann，B.G。(
1994
). 野生型和突变小鼠胚胎中Brachyury蛋白的免疫组织化学分析。
开发生物。
161
，
179
-193中。
Kubo，A.，Shinozaki，K.，Shannon，J.M.，Kouskoff，V.，Kennedy，M.，Woo，S.，Fehling，H.J.和Keller，G。(
2004
). 从培养的胚胎干细胞中发育出最终的内胚层。
开发
131
，
1651
-1662.
Kumar，A.、Yamaguchi，T.、Sharma，P.和Kuehn，M.R。(
2007
). 在脊索后部和脊索中特异表达Cre重组酶的转基因小鼠系。
起源
45
，
729
-736.
Kwon，G.S.、Viotti，M.和Hadjantonakis，A.K。(
2008
). 小鼠胚胎的内胚层是由胚胎和胚外谱系的动态广泛插入形成的。
开发单元
15
，
509
-520.
Lai，E.、Prezioso，V.R.、Smith，E.、Litvin，O.、Costa，R.H.和Darnell，J.E.，Jr(
1990
). HNF-3A是一种结构新颖的富含肝细胞的转录因子，受转录调控。
基因开发。
4
，
1427
-1436.
Lai，E.、Prezioso，V.R.、Tao，W.F.、Chen，W.S.和Darnell，J.E.，Jr(
1991
). 肝细胞核因子3α属于哺乳动物中的一个基因家族，与果蝇同源基因叉头同源。
基因开发。
5
，
416
-427.
Lawson，K.A.和Pedersen，R.A。(
1992
). 小鼠原肠胚形成和早期神经形成期间细胞命运的克隆分析。
找到汽巴。交响乐团。
165
，
三
-21; 讨论21-26。
Lawson，K.A.和Hage，W.J。(
1994
). 小鼠原始生殖细胞起源的克隆分析。
找到汽巴。交响乐团。
182
，
68
-84; 讨论84-91。
Lawson，K.A.、Meneses，J.J.和Pedersen，R.A。(
1991
). 小鼠胚胎胚层形成过程中外胚层命运的克隆分析。
开发
113
，
891
-911.
Lemaigre，F.和Zaret，K.S。(
2004
). 肝脏发育更新：新胚胎模型、细胞谱系控制和形态发生。
货币。操作。遗传学。开发。
14
，
582
-590.
Lewis，S.L.和Tam，P.P。(
2006
). 小鼠胚胎的最终内胚层：形成、细胞命运和形态发生功能。
开发动态。
235
，
2315
-2329.
Lickert，H.、Kutsch，S.、Kanzler，B.、Tamai，Y.、Taketo，M.M.和Kemler，R。(
2002
). 胚胎内胚层β-catenin缺失后小鼠多个心脏的形成。
开发单元
三
，
171
-181.
马丁内斯·巴贝拉（J.P.Martinez Barbera）、克莱门茨（M.Clements）、托马斯（P.Thomas）、罗德里格斯（T.Rodriguez）、梅洛伊（D.Meloy）、基乌西斯（D.Kioussis）和贝丁顿（R.S.Beddington）。(
2000
). 同源异型盒基因Hex在正常前脑、肝脏和甲状腺形成的最终内胚层组织中是必需的。
开发
127
，
2433
-2445.
Monaghan，A.P.、Kaestner，K.H.、Grau，E.和Schutz，G。(
1993
). 植入后的表达模式表明小鼠叉头/HNF-3α、β和γ基因在确定最终内胚层、脉络膜中胚层和神经外胚层中的作用。
开发
119
，
567
-578.
A.纳吉。(
2003
).
操作小鼠胚胎：实验室手册
纽约州冷泉港：冷泉港实验室出版社。
Nakaya，M.A.、Biris，K.、Tsukiyama，T.、Jaime，S.、Rawls，J.A.和Yamaguchi，T.P。(
2005
). Wnt3a将左右测定与分割和前后轴伸长联系起来。
开发
132
，
5425
-5436.
Niwa，H.、Yamamura，K.和Miyazaki，J。(
1991
). 利用新型真核载体高效选择高表达转染体。
基因
108
，
193
-199.
Park，E.J.、Sun，X.、Nichol，P.、Saijoh，Y.、Martin，J.F.和Moon，A.M。(
2008
). 三苯氧胺诱导小鼠Foxa2基因座cre-relucise表达的系统。
开发动态。
237
，
447
-453.
Rajasekaran，A.K.，Hojo，M.，Huima，T.和Rodriguez-Boulan，E。(
1996
). 连环蛋白和闭塞带-1在紧密连接组装的早期阶段形成复合物。
《细胞生物学杂志》。
132
，
451
-463.
Rodaway，A.和Patient，R。(
2001
). 中胚层：一个古老的胚层？
单元格
105
，
169
-172.
Sasaki，H.和Hogan，B.L。(
1993
). 小鼠胚胎原肠胚形成和轴型形成过程中多个叉头相关基因的差异表达。
开发
118
，
47
-59.
Satohisa，S.、Chiba，H.、Osanai，M.、Ohno，S.，Kojima，T.、Saito，T.和Sawada，N。(
2005
). HNF-4alpha诱导上皮极化过程中紧密连接、粘附连接和细胞极性蛋白的行为。
实验细胞研究。
310
，
66
-78之间。
Siliciano，J.D.和Goodenough，D.A。(
1988
). 在Madin-Darby犬肾上皮细胞中，紧密连接蛋白ZO-1的定位受细胞外钙和细胞间接触的调节。
《细胞生物学杂志》。
107
，
2389
-2399.
Sousa-Nunes，R.、Rana，A.A.、Kettleborough，R.，Brickman，J.M.、Clements，M.、Forrest，A.、Grimmond，S.、Avner，P.、Smith，J.C.、Dunwoodie，S.L.等人。(
2003
). 使用非冗余序列选择表征小鼠胚胎基因表达模式。
基因组研究。
13
，
2609
-2620.
Tam，P.P.和Beddington，R.S。(
1992
). 原肠化小鼠胚胎胚层的建立和组织。
找到汽巴。交响乐团。
165
，
27
-41; 讨论42-49。
Tam，P.P.和Rossant，J。(
2003
). 小鼠胚胎嵌合体：研究哺乳动物发育的工具。
开发
130
，
6155
-6163.
Tam，P.P.和Loebel，D.A。(
2007
). 小鼠胚胎发生中的基因功能：为原肠胚形成做好准备。
Nat.Rev.基因。
8
，
368
-381.
Tam，P.P.、Parameswaran，M.、Kinder，S.J.和Weinberger，R.P。(
1997
). 外胚层细胞在胚胎心脏和其他中胚层谱系中的分配：原肠胚形成期间内侵和组织运动的作用。
开发
124
，
1631
-1642.
Tamplin，O.J.、Kinzel，D.、Cox，B.J.、Bell，C.E.、Rossant，J.和Lickert，H。(
2008
). Foxa2突变小鼠胚胎的微阵列分析揭示了原肠胚组织者及其衍生物的新基因表达和诱导作用。
BMC基因组学
9
，
511
.
Thiery，J.P.和Sleeman，J.P。(
2006
). 复杂的网络协调上皮-间充质转化。
自然修订版分子细胞生物学。
7
，
131
-142.
P.Q.托马斯、A.布朗和R.S.贝丁顿。(
1998
). Hex：一种同源异型盒基因，揭示了小鼠胚胎植入期的不对称性，也是内皮细胞前体的早期瞬时标志物。
开发
125
，
85
-94.
Tsukita，S.、Furuse，M.和Itoh，M。(
2001
). 紧密连接的多功能绞线。
自然修订版分子细胞生物学。
2
，
285
-293.
Uetzmann，L.、Burtscher，I.和Lickert，H。(
2008
). 在节点、脊索、底板和内胚层表达Foxa2-driven Cre重组酶的小鼠系。
起源
46
，
515
-522.
Verheyden，J.M.、Lewandowski，M.、Deng，C.、Harfe，B.D.和Sun，X。(
2005
). 小鼠体内Fgfr1的条件性失活定义了其在肢芽建立、生长和数字模式形成中的作用。
开发
132
，
4235
-4245中。
Vintersten，K.、Monetti，C.、Gertsenstein，M.、Zhang，P.、Laszlo，L.、Biechele，S.和Nagy，A。(
2004
). 红色小鼠：小鼠ES细胞、胚胎和成年动物中的红色荧光蛋白表达。
起源
40
，
241
-246.
Warga，R.M.和Nusslein-Volhard，C。(
1999
). 斑马鱼内胚层的起源和发展。
开发
126
，
827
-838.
Weinstein，D.C.，Ruiz i Altaba，A.，Chen，W.S.，Hoodless，P.，Prezioso，V.R.，Jessell，T.M.和Darnell，J.E.，Jr(
1994
). 翼螺旋转录因子HNF-3β是小鼠胚胎脊索发育所必需的。
单元格
78
，
575
-588.
Wells，J.M.和Melton，D.A。(
1999
). 脊椎动物内胚层发育。
每年。Rev.细胞发育生物学。
15
，
393
-410.
Wilkinson，D.G.、Bhatt，S.和Herrmann，B.G。(
1990
). 小鼠T基因的表达模式及其在中胚层形成中的作用。
自然
343
，
657
-659.
Yamanaka，Y.、Tamplin，O.J.、Beckers，A.、Gossler，A.和Rossant，J。(
2007
). 小鼠脊索形成的实时成像和遗传分析揭示了区域形态发生机制。
开发单元
13
，
884
-896.
© 2009.
2009

补充信息

补充图S1

图S1。Foxa2和T标记不同的外胚层祖细胞和后代。(一个)流前的中矢共焦截面T型GFP公司/+敲除胚胎显示后表皮细胞中GFP（绿色）和Foxa2（红色）蛋白的相互排斥合成。(B类)在LS阶段T型GFP公司/+胚胎显示出GFP阳性（绿色箭头）和Foxa2阳性（红色箭头）细胞的不同外胚层结构域，这导致了GFP阳性的后中胚层细胞和双阳性的前PS衍生物。注意，在这个阶段，GFP和Foxa2在外胚层的表达重叠。DE，明确内胚层；VE，内脏内胚层；PS，原始条纹。

-jpeg文件
补充图S2

图S2。T型+中胚层细胞与Foxa2+内胚层细胞表现出不同的形态。(A-I公司)MS-期胚胎的中矢状共焦切片，显示短梗（T，红色）或Foxa2（绿色）与DAPI（蓝色）（B-E）或E-cadherin（E-cad，红色）（F-I）的亮场（A）和整体免疫荧光染色。前部位于左侧，远端位于底部。（A） 解剖原始条纹（PS）由黑点勾勒。（B） T、Foxa2和DAPI染色重叠。注意，Foxa2阳性外胚层（绿色星号）和DE细胞位于PS解剖边界的前方。（C-D）Foxa2和T双重阳性的中胚层细胞位于PS末端（黄色箭头），而扁平的Foxa2-阳性细胞位于PS前部，在那里，它们与内脏内胚层（白色箭头）形成两层厚的细胞层。（F） 沿着胚胎后侧的近远轴，细胞根据T（红条）、Foxa2和T（黄条）以及Foxa2（绿条）蛋白质的合成进行细分。（G） T阳性细胞（顶部）和Foxa2-阳性细胞（底部）的量化区域。利用E-cad染色勾画出的细胞周长来确定圆形T阳性细胞（H）和扁平Foxa2阳性细胞（I）的长宽比。(J型)Foxa2-阳性的长宽比定量（l=9.5±2.05µm；w=4.4±1.08µm，l/w=2.27±0.67；n个=34）和T阳性（l=8.1±1.29µm；w=5.0±1.25µm，l/w=1.68±0.39；n个=44）三个不同胚胎中的细胞(P（P）<0.02).

-jpeg文件
电影1

电影1。在嵌入内脏内胚层之前，明确的内胚层细胞在形态上与中胚层细胞不同。中后期连续4n-dsRed的时间周期分析↔ wt YFP嵌合体。在126分钟内每隔3分钟对胚胎远端部分（右侧PS）的中矢状切面进行成像。扁平的绿色内胚层祖细胞排列在内脏内胚层（白色箭头），并随着时间的推移嵌入内脏内脏层的外层（红色）。一个细胞沿着内脏内胚层向前移动，然后插入外上皮（白色星号）。具有圆形间充质形态的中胚层细胞（红色箭头）向内脏外胚层延伸丝状伪足，但仍与内脏内胚层分离。

-mov文件
电影2

电影2。Foxa2缺陷�内胚层样的�细胞呈细长形态，但不能稳定地整合到上覆的内脏内胚层中。MS阶段2n dsRed最终内胚层形成的时间成像↔福克斯2−/−YFP嵌合体。共聚焦矢状切面（胚胎远端位于底部，PS位于右侧）以3分钟的间隔成像126分钟。绿色福克斯2内脏内皮层排列着形态细长的突变体内皮样细胞（白色箭头）。随着时间的推移，这些细胞聚集起来，与内脏内胚层失去联系，最后接近外胚层。在右上角福克斯2可以观察到突变细胞。

-mov文件
电影3

电影3。福克斯2突变细胞暂时插入内脏内胚层，但不能上皮化。最新4n dsRed的时间间隔成像↔福克斯2−/−YFP嵌合体。共聚焦矢状切面（胚胎远端位于底部，PS位于右侧）成像99分钟，时间间隔为3分钟。Foxa2缺陷的内胚层样细胞嵌入内脏内胚层（白色星号）。然而，该细胞不能上皮化并向上卷曲，离开外层细胞并继续向前迁移。加长型福克斯2内脏内胚层中的突变体内胚层样细胞无法插入并迅速迁移出焦平面。在电影的结尾，一层连续的内脏内胚层（用蓝色表示）覆盖了嵌合体胚胎。

-mov文件
电影4

电影4。内胚层细胞嵌入上皮层时的极化。中间条纹4n YVI内胚层细胞嵌入的时间推移成像↔ wt Lyn-Tomato嵌合体。每隔3分钟对胚胎后侧的矢状面共焦切片进行57分钟的成像。在20多个时间点上，对细胞进行了间隔8µm的三个光学切片。在插入过程开始时，一个非极化的内胚层细胞（该细胞的周长由白点表示）将丝状突起延伸到外部内脏内胚层。在嵌入过程中，Lyn Tomato蛋白集中在迁移细胞的前缘，并导致上皮细胞整合到外部内脏内胚层，Lyn Tomato蛋白高度集中在其顶膜上。

-mov文件