新型G蛋白偶联受体与Na的序列相似性⁺/钙²⁺交换器定义阳离子结合域

摘要

编码一种新型G蛋白偶联受体的cDNA克隆已被鉴定。该受体在正常实体组织中广泛表达。该受体由1967个氨基酸残基组成，是已知最大的受体之一，因此被称为超大G蛋白偶联受体或VLGR1。基于其跨膜片段序列的相似性，它与G蛋白偶联受体的分泌蛋白家族关系最为密切。用生物素衍生物进行细胞表面标记表明，重组蛋白在转染的哺乳动物细胞表面表达。尽管该家族中最近描述的其他几个受体也具有较大的胞外结构域，但VLGR1的胞外大结构域具有独特的结构。它有九个不完全重复的单元，富含酸性残基，间隔大约120个氨基酸残基。这些重复序列类似于Na的调节域⁺/钙²⁺交换器以及海绵细胞外聚集因子的组成部分。含有两个或四个重复序列的细菌融合蛋白特异性结合⁴⁵叠加实验中的Ca；镁对结合的竞争很差²⁺但与新霉素、Al竞争很好³⁺、和Gd³⁺这些结果定义了几种广泛不同类型的蛋白质中使用的一致阳离子结合基序。VLGR1的配体、其功能以及所使用的信号通路仍有待确定。

简介

除了作为细胞内信使的作用外，钙²⁺介导细胞内外蛋白质之间的许多相互作用。因此，许多蛋白质结构域进化为结合钙²⁺在某些情况下，还有其他阳离子。其中一些结构域存在于多种蛋白质中。这些域包括EF-hands(1)，钙粘蛋白重复，钙²⁺结合表皮生长因子（EGF）样重复序列和血小板反应蛋白重复序列(2).

纳⁺/钙²⁺交换器由五个和六个跨膜结构域组成，分别位于N端和C端，由一个大的细胞质环分隔。该环包含两个间隔120–130个残基的结构域，它们协同作用结合Ca²⁺并调节交换器的活动(三,4). 我们现在描述一种新的假定G蛋白偶联受体（GPCR），以下称为VLGR1（超大G蛋白偶联感受器-1），其胞外结构域是迄今为止发现的最大的结构域之一，由与这些基序非常相似的重复单元组成，并且确实结合Ca²⁺和其他阳离子。

结果

编码推测GPCR的cDNA的分离

1986年，在试图分离编码细胞色素P450酶类固醇11β-羟化酶（CYP11B1）的cDNA时，偶然分离出了编码一种未知蛋白质部分的5A1克隆(5). 它包含一个大约3.4 kb的开放式阅读框，延伸至其5′端。开放阅读框预测的氨基酸序列与1991年之前数据库中的任何序列都没有很强的相似性。然而，亲水性图（未显示）显示了预测蛋白质C末端附近的七个疏水性片段。随后发现包含这些片段的域的序列与几个GPCR相似（见下文）。因此，我们试图确定这个假定受体的完整编码序列。

我们无法通过筛选几个cDNA文库来分离更长的克隆。使用“锚定”PCR的几种变体最终分离出包含全长cDNA的克隆。在一些情况下，这些技术无法扩展序列。在每一种情况下，从基因组DNA克隆中对相应的外显子进行测序，并合成与外显子5′端附近序列相对应的额外反义RT-PCR引物。

通过噬菌体λ文库的杂交筛选，分离出包含VLGR1基因部分的基因组克隆。从CEPH文库中分离出几个酵母人工染色体“Mega-YAC”克隆(6)通过PCR筛选。其中包括克隆851C7、930A4、943F7和944B4。

通过覆盖cDNA全长的RT-PCR扩增重叠片段，排除了全长cDNA的嵌合性(图1和2)并将全长cDNA的两端映射到相同的“Mega-YAC”基因组克隆。我们得出的结论是，我们获得了全长cDNA，因为该序列在适当的上下文中编码了Met残基，以便用其帧内终止密码子5′启动翻译，因为进一步的锚定PCR终止于相同的几个核苷酸（未显示）并且因为使用与该区域的基因组DNA序列5′相对应的引物的RT-PCR未能产生产物。在假定转录起始位点区域的基因组序列中没有假定的剪接受体。全长cDNA为6503bp，由284bp和318bp的5′-和3′-未翻译序列组成，开放阅读框为5901bp。据预测，它编码一种1967个氨基酸残基的蛋白质(图1和3亿由于该蛋白被预测为一个非常大的GPCR，因此暂时将其命名为VLGR1，等待功能研究。

表达的组织分布

原始VLGR1克隆与总肾上腺或睾丸RNA的Northern印迹的杂交显示，在长时间暴露于放射自显影图（未显示）后，有约4000至7000个核苷酸的微弱涂片；肝脏RNA中未检测到信号。虽然原始克隆包含poly（a）尾巴，但寡聚（dT）纤维素上分离的poly（a+）mRNA在VLGR1转录物中未富集。可能mRNA相对不稳定。320-核苷酸3′-非翻译区相对较短，富含A+U（70%），富含A+U的元素通常通过促进二烯基化降低mRNA的稳定性(7). VLGR1 mRNA的这种可能性实际上尚未研究过。

筛选10个克隆后，未能分离出任何其他克隆，证实了VLGR1转录物丰度低⁶克隆人肾上腺cDNA文库，并从10个克隆中仅分离出一个较短的VLGR1克隆⁶人类睾丸cDNA文库的克隆。

因此，表达的组织分布是由正常人体组织总RNA的RT-PCR确定的(图4). 同时扩增一段β2-微球蛋白（I类移植抗原中普遍存在的成分）片段，以确认RNA的数量和质量(8). 每五个周期取出等分样品，以确保在放大的指数阶段进行采样。这些实验表明，VLGR1在正常人体组织中广泛表达，但肝脏、脾脏和白细胞除外（不包括图4). 一般来说，VLGR1引物在30个扩增周期后检测到良好的信号，而β2-微球蛋白引物需要大约20个扩增周期才能产生类似的信号。这表明，与β2-微球蛋白（约占总mRNA的0.01%）相比，VLGR1的表达丰度较低(8).

通过对Genbank和expressed sequence tag（EST）数据库的搜索，确认了VLGR1的广泛表达分布，并对肾上腺腺瘤（AA604143和AA602663）、乳腺导管肿瘤（AA575832）、正常肾脏（AA910218）、大脑（R88809和KIAA0686）和视网膜（W27007）的克隆进行了点击。

染色体定位

携带VLGR1的所有四个YAC克隆都有映射到染色体5q14.1的片段，尽管其中一些克隆是嵌合体。根据这些克隆上的连锁标记，VLGR1可能在D5S618和D5S1452之间映射。通过使用斯坦福G-3面板的辐射混合绘图，确认了D5S618的紧密联系（16 cR，～560 kb）(9)（未显示）。VLGR1也通过荧光标记定位到该染色体区域就地中期染色体杂交(10)使用标记的噬菌体λ克隆作为探针（未显示）。

VLGR1胞外结构域融合蛋白的表达

表达的细菌融合蛋白包含四个假定的细胞外重复结构域（pET-24/BD6-9）（参见讨论)或两个这样的结构域（pET-24/BD8-9），在每种情况下都与T7抗原标签序列一起。使用抗T7抗血清进行Western blot分析，确认产生了适当大小的融合蛋白（分别为51和24 kDa）(图5b). 当细菌总裂解物的硝化纤维印迹被覆盖⁴⁵氯化钙₂，仅在用异丙基-β诱导的裂解液中观察到与融合蛋白对应的条带-d日-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）(图5a). 在含有未诱导细胞、用空pET-24载体转化的细胞或用编码未知结合Ca的蛋白的pET载体转化细胞的总蛋白的通道中，未发现与融合蛋白对应的条带²⁺，11β-羟基类固醇脱氢酶(11). 从pET-32构建物表达的VLGR1-硫氧还蛋白融合蛋白（pET-3二编码与pET-24不同的抗原标签）给出了与pET24融合蛋白类似的结果（未显示）。

确定其他阳离子是否能与钙竞争²⁺用于结合VLGR1融合蛋白，不同浓度的未标记Ca²⁺或其他阳离子添加到⁴⁵BD8-9蛋白的钙覆盖层(图6). 所选的其他阳离子是已知的甲状旁腺钙激动剂²⁺-传感接收器(12)和/或假定的成骨细胞阳离子敏感受体(13). 五毫摩尔镁²⁺在不明显影响与融合蛋白结合的情况下降低背景，并添加到所有孵育中。Gd公司³⁺新霉素与⁴⁵钙，含IC₅₀值（带强度降低50%时的浓度）约为10μ米.铝³⁺与IC竞争不太好₅₀0.3米米.Ca²⁺它本身有一个IC₅₀约10 m米.

在培养的哺乳动物细胞中的表达

尽管多次尝试使用肽和细菌融合蛋白，但我们仍无法制备VLGR1胞外结构域的抗血清，该抗血清可识别哺乳动物细胞中的蛋白质（未显示）。确保cDNA被翻译体内将编码流感血凝素抗原标签的片段连接在编码推定信号肽的区域之后的密码子67-68之间。将得到的cDNA瞬时转染到293人胚胎肾细胞中，并用抗血凝素单克隆抗体对细胞裂解物进行Western印迹。如所示图7，仅在转染该结构体的细胞提取物中观察到约220kDa的条带，而在转染对照结构体细胞中未观察到。此外，还观察到一条较微弱的较小条带，可能与蛋白质的假定胞外结构域相对应；GPCR大胞外结构域的蛋白水解裂解(例如TSH受体），但功能未知(14). 或者，较小的带可能代表糖基化蛋白。

然后用生物素衍生物磺基琥珀酰亚胺-6-（生物胺基）己酸盐对转基因细胞进行表面标记。生物素化后，与这两条带相对应的蛋白质被链霉亲和素珠结合，而这些珠不结合未经核苷酸化的蛋白质。因此，重组蛋白存在于细胞表面。

讨论

cDNA编码一种新的推测GPCR

有两个区域，其中VLGR1的编码序列与其他非冗余数据库序列相似，这是由间隙BLAST搜索确定的(15). 与其他数据库条目具有统计上更强的序列相似性的区域在VLGR1中跨越1400–1800个残基，其中有78个命中，E值（E值是整个数据库中预期在给定相似程度下的偶然命中数）小于0.00001。所有这些序列都是一个新的推测GPCR亚家族的成员，该亚家族具有较大的胞外结构域。其中50多个是Ca的变体²⁺-独立的latrotoxin受体（lattrophilin），已知与Gα偶联_o个(16,17). 配体只针对这些相对相似的假定受体中的一种：CD97是衰变加速因子（CD55）的受体，CD55是一种抑制补体级联的细胞表面蛋白(18). 为了确定这些相似性是否涉及共同的主题，PSI-BLAST程序(15)用于构建E值<0.00001的序列比对，然后扫描数据库中与比对相似的序列。共鉴定出152个新序列，E值为10⁻⁵到10⁻⁸²，均为分泌素家族（家族2）中已知的G蛋白偶联肽激素受体。

观察到的序列相似性(图8)簇合在七个疏水结构域中，每个约有20个残基，代表假定的跨膜区域。此外，在第一、第三和第五跨膜结构域之前存在完全保守的半胱氨酸残基(即预计它们位于受体的细胞外侧），其中至少有两个可能形成巯基键，稳定受体的正确构象。基于这些序列相似性，VLGR1很可能确实是一个GPCR。然而，家族2 GPCR的G蛋白偶联尚未被详细研究，因此，目前还无法确定可能直接参与信号转导的VLGR1的氨基酸残基。

VLGR1的前23个残基主要是疏水性的，由PSORT程序预测(19)形成一个未分离的信号肽，允许新生肽跨内质网移位。相反，两个下游蛋氨酸残基（M52和M80）后面没有假定的信号肽，尽管它们处于启动翻译的足够核苷酸环境中。这支持将M1确定为蛋白质的实际N末端。大的N-末端结构域具有21个潜在的N-连接糖基化位点（N-X-S/T，图3)与细胞外位置一致。表位标记的重组蛋白在细胞表面的表达进一步证明，它含有正确加工所需的所有氨基酸序列。

在假定的C末端细胞质结构域的开始处附近是两个连续的半胱氨酸残基，它们位于潜在的棕榈酰化序列中。许多其他GPCR也同样放置了棕榈糖基化的单一或成对半胱氨酸残基。这种共价修饰可能影响C末端结构域和细胞内膜之间的相互作用，从而调节C末端结构区对磷酸化的可及性(20). 事实上，VLGR1的C端细胞质尾部存在丝氨酸磷酸化的几个高概率位点(图3) (21). 在其他受体中，C末端细胞质域中丝氨酸残基的磷酸化参与激动剂刺激后的脱敏(22,23).

最后，C末端残基对应于含有所谓PDZ结构域的蛋白质识别的共有基序（Ser/Thr）-Xaa-（Val/Ile/Leu）(24). 这些蛋白质能够识别靶蛋白C末端的不同序列，被认为是将信号转导蛋白组装成功能性信号单元的支架(25). 一些GPCR，如代谢型谷氨酸受体，被具有PDZ结构域的蛋白质识别(26). 家族2中的一些但不是全部GPCR对PDZ结构域（包括降钙素受体）具有潜在的C末端识别序列(27)、甲状旁腺激素和血管活性肠肽(28)以及CD97(29)，但其中是否有任何功能尚待确定。

推测的胞外结构域具有类似Na的重复结构⁺/钙²⁺交换器

VLGR1的第二个区域与现有数据库条目相似，其残基跨度为30–1280。23个相似序列，E值为10⁻²到10⁻⁴除一个外，其余均为Na⁺/钙²⁺换热器(30). 与VLGR1相似的交换区位于大的细胞质环中，由两个酸性域组成，间距为120–130个残基(图9). 另一个与VLGR1显著相似的蛋白质是海绵聚集因子核心蛋白的大N末端片段，增殖微球菌(31). 为了确定其他相关蛋白质，使用E值<0.001的所有蛋白质进行PSI-BLAST迭代。E值<10的54个额外蛋白质⁻³已确定，其中大多数是额外的Na⁺/钙²⁺交换器。然而，10个代表整合素β4细胞质域的一部分(32)E值为10⁻²到10⁻⁵，其中两个是来自协同孢子虫sp.Na之间的序列相似性⁺/钙²⁺交换器、整合素β4和协同孢子虫蛋白质之前已经被发现(33).

将推测的VLGR1胞外结构域序列与其自身进行比较，发现自我同一性簇以大约120个氨基酸残基或其倍数间隔排列。重复单元1、2、3、6、7、8和9最容易对齐(图9). 每个重复序列中最保守的位置集中在45个残基的酸性核心中。为了确定这个核心序列是否是与Na共享的基序⁺/钙²⁺换热器，使用来自VLGR1重复单元6的45个残基用PSI-BLAST搜索数据库。在从鱿鱼到域的第一次迭代中发现了弱匹配（E=0.26）(乳白色乳杆菌)钠⁺/钙²⁺交换器，但第二次迭代确定了40个额外的Na⁺/钙²⁺E值为10的各种脊椎动物和无脊椎动物的交换器⁻²到10⁻⁷; 几乎在每个蛋白质中都发现了两个间隔120–130个残基的结构域。这些结构域相当于之前描述的这些蛋白质的Calx-β基序(33).

VLGR1和Na中重复序列的相似性⁺/钙²⁺换热器延伸到预测的二级结构；在45-残核内，大多数重复序列具有ββαβ结构，每个重复序列中β链的位置相似（未显示）。鉴于VLGR1和Na重复序列之间的序列和间隔（120–130个残基）的相似性⁺/钙²⁺换热器，可以合理地推测这些域具有类似的功能。

心脏肌膜Na⁺/钙²⁺交换剂，第一个强结合的酸性结构域⁴⁵覆盖实验中的钙，以及酸性残基的突变或缺失显著降低了钙²⁺结合。此外，这些突变或第二保守结构域的缺失，取消了细胞内钙离子对交换器的调节²⁺(三,4). 因此，如果VLGR1中的重复序列真的与Na中看到的重复序列相关⁺/钙²⁺换热器，它们可能会结合Ca²⁺或其他阳离子。事实证明是这样的⁴⁵钙覆盖实验的条件与Na结构域的条件非常相似⁺/钙²⁺对交换器进行了研究。

VLGR1的可能功能

对于那些具有较大胞外结构域的GPCR[例如.LH受体(34)]细胞外结构域本身通常能够独立于蛋白质的其余部分结合配体。因为VLGR1胞外区的部分结合Ca²⁺一种明显的可能性是VLGR1起到阳离子传感器的作用。

已知一个GPCR对Ca有反应²⁺：Ca²⁺甲状旁腺传感器(12). 该受体还有一个大的胞外结构域，含有酸性残基簇，但与代谢型谷氨酸受体最为相似，并且与VLGR1没有序列相似性。

细胞外钙的一些生理反应²⁺不能轻易归因于PCaR，因此存在额外的Ca²⁺已推断出感测受体。例如，培养的成骨细胞不表达PCaR，但对细胞外钙有反应²⁺，铝³⁺，Gd³⁺，或新霉素，但不是镁²⁺DNA合成增加(13). 这些阳离子与竞争阳离子相同⁴⁵覆盖实验中VLGR1融合蛋白的钙结合。然而，在钙敏感的成骨细胞系（未显示）中未检测到VLGR1，因此它不适合作为成骨细胞钙受体。尽管VLGR1融合蛋白与阳离子紧密结合，但我们推测VLGR1不是阳离子受体就其本身而言而是通过钙结合其生理配体²⁺-介导的相互作用。考虑到在其外结构域中具有其他钙结合基序的两个相对密切相关的受体具有大蛋白配体-拉曲毒素受体，这是合理的(16)和CD97用于衰减加速因子(18). 有趣的是，VLGR1外结构域的组织与海绵聚集因子主要蛋白的N末端段最为相似，增殖微球菌这种高度多态性的蛋白聚糖介导物种特异性细胞聚集。尽管重复结构域在聚集因子的组装和功能中的作用尚待阐明，但该蛋白为细胞外蛋白中存在Calx-β基序以及这些基序在蛋白质相互作用中的明显作用提供了先例。

VLGR1胞外结构域的潜在蛋白质相互作用伙伴可以通过下拉实验或与本研究中使用的细菌融合蛋白的“远西部”来检测，但尚不清楚哪种组织是此类实验的最佳蛋白质来源。尽管许多GPCR以与其功能相一致的组织特异性方式表达，但VLGR1在实体组织中广泛表达，尽管表达水平较低，但肝脏和脾脏除外，后者的表达无法检测到。目前尚不清楚是否在特定组织的离散结构中或在发育过程中的特定时间表达更高。

总之，Na中重复序列之间的相似性⁺/钙²⁺交换器和VLGR1中的交换器扩展了Calx-β阳离子结合基序的功能作用。在诸如阳离子交换器、海绵聚集因子、整合素和GPCR等广泛分化的基因超家族中，存在具有相关结构和功能的重复结构域，这使得我们很容易推测，与其他公认的Ca²⁺结合基序，类似的结构域将在不同类型和功能的其他蛋白质中发现。

材料和方法

cDNA的分离

一种定向的人肾上腺cDNA文库(35)在质粒载体pcD1中，是David Russell（达拉斯德克萨斯西南大学）的礼物。用含有牛甾体11β-羟化酶（CYP11B1）3′-非翻译区的部分长度cDNA进行杂交筛选，如下所述(5)，但过滤器在0.075的52℃下清洗米氯化钠，0.0075米柠檬酸钠和0.05%十二烷基硫酸钠。

通过5′-RACE（cDNA末端快速扩增，马里兰州盖瑟斯堡Life Technologies，Inc.）或锚定PCR协议从人类甲状腺或前列腺癌细胞系LnCAP获得额外的5′-cDNA序列。每个RACE步骤的特定引物(图1和表1)根据已知的cDNA或基因组序列合成。使用特异性引物2835进行验证性5′-RACE。

基因组克隆的分离

通过与VLGR1 cDNA杂交，筛选了噬菌体Lambda FIX或Lambda DASH（Stratagene，La Jolla，CA）中的人类和小鼠基因组文库。

CEPH Mega-YAC文库（由法国巴黎Jean Dausset研究所Denis LePaslier提供）使用引物对1061A-1066、1012-2025和139-2224进行PCR筛选。用于扩展VLGR1的5′端序列的矢量文库是使用海三、，南非兰特一、 和铝我从YAC 944b4中提取了与退火矢量引物2762和2763连接的DNA。如前所述，通过PCR进行筛选(36)使用矢量PCR引物2764或2793和特定VRGR1引物。

辐射混合映射

使用引物W518–7和2791对G-3斯坦福人类基因组中心小组（Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL）的83份DNA样本进行扩增(图1和三). 反应在Epicenter（威斯康星州麦迪逊）缓冲液J中进行，35个周期为94℃×30秒、55℃×30秒钟和72℃×2分钟。结果在斯坦福人类基因组中心服务器上进行分析（URL:shgc.stanford.edu/Mapping/rh/search.html) (9).

逆转录聚合酶链反应

正常人体组织取自纪念斯隆-凯特琳癌症中心组织采购服务处（纽约州纽约市）。使用酸性胍苯酚氯仿法（RNAzol，Biotecx，休斯敦，TX）制备RNA(37). 使用随机六聚体启动cDNA合成，并使用VLGR1引物305和322或β2-微球蛋白引物393和394对人类样本进行半定量RT-PCR(表1). PCR循环条件为94℃×5 min，此时塔克添加聚合酶，94 C×1 min，60 C×1 min.和72 C×40 sec，在72 C时每周期额外添加10 sec。在20、25和30个周期提取等分样品，并在琼脂糖凝胶中进行电泳。

为了确认组装的cDNA序列的完整性，重叠片段(图1和三)经RT-PCR扩增。在所有情况下，使用逐步降低协议，以1 C为增量将退火温度从60 C降低到45 C，然后依次为94 C×15秒、45 C×30秒和72 C×60秒，持续30个循环。选择引物对跨内含子进行扩增，因此使用基因组DNA的相应PCR产物要么大小不同，要么在相同条件下无法扩增（未显示）。此外，RT-minus控件也未能放大（未显示）。

全长cDNA的构建

用酶消化克隆5A1的插入物巴姆HI和Xba公司我和子克隆到pBluescriptKS+（Stratagene）。使用引物2819和2862或W518–5和2224从两个片段的LNCaP mRNA随机引物cDNA中扩增出附加5′序列的2.4 kb片段。PCR条件为95℃×5 min塔克加入聚合酶；然后进行35个95℃×1 min、50℃×1 In和72℃×3 min循环，在72℃下每循环增加5秒。此外，向W518–5/2224 PCR中添加3%甲酰胺。将分离的片段退火，然后用引物2836扩增（该引物添加了一个Nco公司初始ATG周围的I站点和Xba公司使用Pfu聚合酶（Stratagene）和Pfu缓冲液I，在以下条件下：95℃×2 min，然后进行30个95℃×1 min、40℃×1分钟和75℃×2分钟的循环，每个循环在75℃增加15秒Xba公司一、 并连接到Xba公司我消化了5A1亚克隆。通过完整测序验证结构。

VLGR1胞外结构域融合蛋白的表达

编码细胞外重复单元6-9（BD6-9，氨基酸残基706-1132，参见讨论)或8–9（BD8–9，残基940-1132）通过使用有义引物BD6S的全长cDNA的PCR扩增(6–9)或BD8S(8,9)和反义引物BD9AS。PCR产物连接到pET-24a的相应位点⁺向量（诺瓦根，麦迪逊，威斯康星州）。将含有BD6–9/pET-24或BD8–9/pET-24结构的BL21（DE3）pLysS细胞培养物（50 ml）培养至OD₆₀₀0.6，用1m感应米IPTG。2000年通过离心法在2小时后收集细胞×克解冻后，将细胞重新悬浮在SDS-PAGE加载缓冲液中，并使用Branson 200细胞破碎器进行三次超声处理。

钙覆盖层

⁴⁵钙覆盖层完全按照所述进行(38)除了蛋白质在12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离外。为了进行结合竞争实验，将BD8–9/pET-24转化的细菌裂解物的印迹切成单独的条带，并在含有1μCi/l的缓冲液中培养10分钟⁴⁵氯化钙₂，5米米氯化镁含量₂和不同浓度的CaCl₂，氯化钆_三，氯化铝_三或硫酸新霉素（西格玛，密苏里州圣路易斯）。然后清洗所有板条(38)，风干，暴露于放射自显影胶片1–7天。使用Eagle-Eye II视频成像设备（Stratagene）量化波段强度。

根据制造商的协议，使用增强化学发光试剂（伊利诺伊州阿灵顿高地Amersham Pharmacia Biotech）清洗和探测蛋白质印迹。

表位标记VLGR1在哺乳动物细胞中的表达

通过插入流感病毒血凝素（HA1）基因的54-bp片段，产生了VLGR1的表位标记结构(39)成为独一无二的Acc公司位于VLGR1开放阅读框5′端附近。将该结构亚克隆到pCI（Promega Corp.，Madison，WI）中，在巨细胞病毒（CMV）启动子的控制下产生哺乳动物表达盒。

在CMV启动子（CLONTECH Laboratories，Inc.Palo Alto，CA）的控制下，将HA标记的VLGR1表达质粒和编码绿色荧光蛋白的对照构建物分别转染到带有Fugene 6（Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN）的人胚肾（HEK）293细胞中。转染24小时后，用冰冷的PBS洗涤细胞，用PBS轻轻地从板上冲洗下来，并通过离心收集。细胞在0.5%NP-40中溶解，150 m米氯化钠，10米米将pH值为8.0的Tris-HCl和碎片制成颗粒。样品在样品缓冲液（50 m）中煮沸5 min米三重HCl，pH 8.0，10%十二烷基硫酸钠，4米尿素、12%甘油、2%2-巯基乙醇）。

如前所述，进行细胞表面蛋白生物素化和随后的沉淀(40). 转染24小时后，用PBS加1.0 m洗涤来自一个6孔培养板的HEK 293细胞米氯化镁₂，0.1米米氯化钙₂然后收获。用1.0 mg/ml磺基琥珀酰亚胺-6-（生物胺基）己酸盐（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）将细胞重新悬浮在2.0 ml PBS中，并在冰上培养1小时，偶尔摇晃。生物素标记细胞用PBS+100 m清洗两次米甘氨酸再次悬浮在同一缓冲液中，在冰上培养30分钟，以熄灭未反应的生物素。然后通过离心法收集细胞，并将其储存在−20 C下。

通过添加400μl 0.5%NP-40裂解缓冲液（10 m）对细胞进行裂解米三氯化氢，pH 8.0，150 m米NaCl，0.5%NP-40），含有1/100体积的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）和细胞碎片颗粒。等体积的2×RIPA（放射免疫沉淀分析）缓冲液（200 m米Tris-HCl，pH 7.4，300米米氯化钠，2米米向上清液中添加EDTA、2%TX-100、2%脱氧胆酸钠、0.2%十二烷基硫酸钠）。添加100微升Ultralink固定化链霉亲和素（Pierce Chemical Co.），将反应在室温下孵育1.5小时并持续摇晃。珠子在RIPA+500 m内清洗三次米NaCl和RIPA中三次去除非特异结合蛋白。结合蛋白在100μl样品缓冲液中煮沸5分钟洗脱。

在5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分馏每个实验中的可溶性蛋白质，并将其电印在Hybond ECL硝化纤维素（Amersham Pharmacia Biotech）上。用小鼠单克隆抗体HA.11（加利福尼亚州里士满市BabCO）、碱性过氧化物酶标记的抗小鼠H+L二级抗体（加利福尼亚州伯林盖姆市Vector Laboratories公司）和增强化学发光试剂检测Western blot。

确认

我们要感谢Streamson Chua和Carlos Bacino在分离VLGR1第一个cDNA克隆方面的贡献。我们感谢David Russell提供的人类肾上腺cDNA文库，Denis LePaslier（Centre d’Etude du Polymorphisme Humaine）协助识别YAC克隆，David Ward（耶鲁大学，纽黑文，CT）协助荧光就地杂交和Michael Si寻求技术援助。这项工作的一部分是在几位作者在康奈尔大学医学院（纽约州纽约市）时进行的。

这项工作得到了达拉斯儿童医疗中心儿童研究基金会的资助。H.N.、L.P.和K.M.C.分别得到了美国哲学学会、查尔斯·雷夫森基金会和克罗斯克基金会的研究金支持。P.C.W.由德克萨斯大学西南医学中心儿科内分泌科Audry Newman Rapoport杰出主席支持。

目前地址：加利福尼亚州阿祖萨市阿祖萨太平洋大学。

目前地址：路易斯安那州巴吞鲁日路易斯安那州立大学。

现住址：法国巴黎，75010，胡曼多态性练习中心，让·多塞特基金会。

当前地址：澳大利亚新南威尔士州悉尼法玛西亚公司。

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