血睾屏障处的封闭-局部粘附激酶蛋白复合物：镉模型的研究

迄今为止，已知哺乳动物睾丸，特别是啮齿动物睾丸中构成血睾屏障（BTB）的几种完整膜蛋白。这些包括紧密连接（TJ）蛋白(例如闭塞素、结合黏附分子A、克劳丁）、基础外质特异性蛋白(例如.N-钙粘蛋白）和缝隙连接蛋白(例如连接43）。然而，监管机构(例如影响这些蛋白质的蛋白激酶和磷酸酶），例如它们与细胞骨架肌动蛋白的相互作用，而肌动蛋白反过来又在TJ处赋予细胞黏附，这在很大程度上尚不清楚。我们在本文中报道了黏着斑激酶（FAK）是闭塞素的假定相互作用伙伴，而不是克劳丁-11或结合黏着分子a。免疫组织化学和荧光显微镜研究表明，FAK在成年大鼠睾丸生精上皮中的表达具有阶段特异性。在生精上皮细胞周期的几乎所有阶段，FAK与闭塞素在BTB共定位，但在第VIII-IX阶段，在BTB重组时显著减少，以促进初级精母细胞的转运。使用培养的支持细胞在体外具有已建立的TJ通透性屏障和TJ的超微结构，基础外质特化和桥粒样连接模仿了BTB体内在支持细胞界面，FAK与闭塞素和闭塞小带-1（ZO-1）共定位。当用CdCl处理这些Sertoli细胞培养物时₂为了干扰TJ-屏障功能，闭塞素与FAK和ZO-1同时进行了细胞内介导的内化。因此，这些发现表明FAK是闭塞蛋白-ZO-1蛋白复合物的整合调节成分，表明可以进行功能研究来研究FAK在BTB动力学中的作用。

在成年大鼠睾丸中，在精子发生的生精上皮周期的VIII-IX阶段，精原细胞和精原细胞在血睾屏障（BTB）处转运，同时分化为合子精母细胞(1，2). 因此，可以预见，BTB在上皮周期的第VIII（～29.1 h）和第IX（～7.7 h）阶段会经历广泛的重组(三)促进这些初级精母细胞在BTB的通过。虽然构成BTB的结构蛋白复合物是已知的(4)如闭塞蛋白/闭塞小带（ZO-1）、连接黏附分子-A（JAM-A）/ZO-1、克劳丁/ZO-1和N-钙粘蛋白/β-catenin，与这些结构成分协同作用以确定其与细胞骨架的关联和/或分离的调节因子尚不清楚。

用免疫组织化学方法在成年大鼠睾丸生精上皮的BTB处检测到粘着斑激酶（FAK），这是一种非受体蛋白酪氨酸激酶(5)，而其活化形式，p-FAK-Tyr³⁹⁷，主要定位于支持细胞延长精子细胞界面（大鼠从第8步精子细胞到第19步精子细胞）的顶端胞质特化（ES），与顶端ES组成蛋白β1整合素共定位并在结构上相互作用(5). 后续研究表明，对FAK-Tyr³⁹⁷是位于心尖ES的α6β1-整合素蛋白复合物的整合成分(6). 因为最近的研究表明，FAK是多个上皮细胞和内皮细胞紧密连接（TJ）和粘附连接（AJ）的关键调节器，以及细胞在TJ屏障上的移动，例如在病毒转染期间(7，8，9)（有关审查，请参阅参考。10，11，12)，我们认为有必要进行一项研究，以确定FAK是否确实是大鼠睾丸和培养的支持细胞中BTB的一个整合成分，该细胞具有模拟BTB的TJ屏障体内。我们还试图确定BTB处FAK的假定相互作用蛋白伙伴。

此外，现场研究表明，CdCl₂-诱导Sertoli细胞TJ-通透性屏障功能的破坏在体外是研究BTB动力学的新模型(13，14). 因此，我们使用了这个在体外评估在镉诱导TJ屏障损伤期间FAK与BTB完整膜蛋白相互作用的可能机制的模型。

材料和方法

动物

雄性Sprague-Dawley大鼠购自Charles River Laboratories（Kingston，NY）。洛克菲勒大学实验动物研究中心动物护理和使用委员会批准使用动物，协议编号为06018。

原始支持细胞培养

如上所述，从20日龄大鼠睾丸中分离支持细胞(15). 细胞被放置在Matrigel（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）涂层的12孔培养皿（Matrigel-free F12/DMEM中稀释1:7；Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO）或双室装置（Millipore Millicell HA（混合纤维素酯）过滤器）上，有效表面积为～0.6 cm²; Millipore Corp.，Billerica，MA），并在补充碳酸氢钠、庆大霉素、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白和杆菌肽的无血清F12/DMEM中培养(16). 细胞在35℃和95%空气-5%CO下培养₂（vol/vol）在潮湿的大气中。大约48小时后，对细胞进行低渗处理[20m米Tris（pH 7.4），2.5分钟，22℃]，用于溶解残余生殖细胞(17). 因此，用于我们研究的Sertoli细胞培养物的细胞纯度高于98%，而所述的生殖细胞和/或Leydig细胞的污染可以忽略不计(18). 值得注意的是，根据形态学和功能分析，如所选蛋白质和/或基因的表达，这些支持细胞已分化、停止分裂，并且与从成年大鼠睾丸分离的支持细胞没有区别(例如.肌管蛋白，N-Ras，Smad2，MEKK2）(19，20). 在这个在体外模型中，Sertoli细胞形成功能性TJ通透性屏障(21)并具有TJ和基底ES的超微结构(16)，模仿BTB体内。

通过量化支持细胞上皮的跨上皮电阻（TER）评估支持细胞TJ-通透性屏障

评估培养的支持细胞中功能性TJ通透性屏障的建立在体外，新鲜分离的细胞在1.2×10的条件下培养⁶每厘米细胞数²在Matrigel-coated两院制单元上。将每个单位放置在24孔培养皿的孔上，在顶部和底部培养皿中均含有0.5 ml F12/DMEM。如前所述，通过定量穿过支持细胞上皮的TER，每天监测TJ屏障的组装，持续7天(21). 评估镉对TJ屏障功能的影响，CdCl₂在1和3μ米在第4天，当TJ屏障建立时，在两房单位的顶室和基底室被纳入F12/DMEM。在治疗前后（8小时）测量上皮细胞的TER，并用F12/DMEM清洗细胞两次以去除CdCl₂之后。对照组为溶媒对照组（0.9%NaCl）和未经任何处理的细胞。每天在TER测量后更换每个双腔单元的培养基。每个时间点有三个重复的两院制单位。

电子显微镜

如前所述，电子显微镜是在洛克菲勒大学生物成像资源中心进行的(22)，以监测支持细胞培养中BTB超微结构的存在（0.5×10⁶每厘米细胞数²在Matrigel-coated盘子上，以模仿BTB的d 6）结尾体内。

免疫组织化学

用组织染色法对大鼠睾丸中FAK进行免疫组织化学定位-Plus（加）试剂盒（Zymed Laboratories，Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）如前所述(16). 简言之，成年大鼠睾丸固定在Bouin固定剂中，脱水，石蜡包埋，切片至5μm。将切片脱蜡并用3%过氧化氢在甲醇中（vol/vol）处理以阻断内源性过氧化物酶活性后，用0.1%Triton X-100（vol/vol）使切片透化。随后用兔抗FAK抗体孵育切片(补充表1，作为补充数据发布在内分泌学会期刊在线网站上，网址为http://endo.endojournals.org)然后用生物素化山羊抗兔IgG和链霉亲和素过氧化物酶，用3′3-二氨基联苯胺HCl底物-色素混合物染色，用苏木精复染，装裱。使用内置于奥林巴斯BX61显微镜（奥林巴斯美国公司，纽约州梅尔维尔）中的奥林巴斯DP71 12.5 MPa数码相机拍摄光显微照片。图像是使用奥林巴斯MicroSuite FIVE（1224版）软件包（奥林巴斯Soft Imaging Solutions Corp.，Lakewood，CO）采集的，转换为TIFF格式，并由Adobe PhotoShop在Adobe Creative Suite（3.0版；Adobe Systems，Inc.，Mountain View，CA）中进行分析。还进行了一级抗体被兔IgG替代的阴性对照。

免疫荧光显微镜

免疫荧光显微镜基本上如所述进行(23). 简言之，将成年大鼠睾丸的冷冻切片（～7μm）安装在聚乙烯上-我-赖氨酸涂层载玻片，用多聚甲醛固定，用Triton X-100渗透，用BSA封闭，用一级抗体孵育(补充表1)，然后用与AlexaFluor488偶联的二级抗体孵育(绿色)或AlexaFluor555(红色)（分子探针，尤金，俄勒冈州）。使用ProLong Gold防褪色试剂和4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（一种核蓝色染色剂）（Invitrogen）将载玻片安装在盖玻片上。使用兔或鼠IgG代替一级抗体进行阴性对照。为了进行细胞染色，将Sertoli细胞以0.05×10的比例涂布在Matrigel-coated盖玻片上⁶每厘米细胞数²并在大约48小时后接受低张治疗，如前所述(17)，以溶解残留的生殖细胞。第4天，用载体（0.9%NaCl）或CdCl培养细胞₂(3 μ米)在35℃下持续0、3、6和9小时，并按所述进行免疫荧光染色。对于肌动蛋白染色，如上所述处理细胞，并使用罗丹明缀合的鬼笔肽（Invitrogen）代替抗体。对实验中9到12个随机选择的区域中的至少500个细胞进行拍照和评分，并使用不同批次的Sertoli细胞培养物将每个实验重复至少三到四次。

免疫印迹分析和免疫共沉淀（co-IP）

按照说明进行免疫印迹分析(23，24). 初级和次级抗体的来源及其工作稀释液列于补充表1Co-IP按所述进行(24). 简言之，成年大鼠睾丸裂解物在免疫沉淀缓冲液[50 m米三分之一，0.15米氯化钠，1%（体积/体积）非碘P-40，1 m米EGTA，2米米N-乙基马来酰亚胺，10%甘油（体积/体积），1 m米苯甲基磺酰氟、15μl/ml磷酸酶抑制剂鸡尾酒1（Sigma-Aldrich）、15μl/ml磷酸酶抑制物鸡尾酒2（Sigma Aldrich。Co-IP的每个样品管使用约300μl中约700μg的蛋白质。

统计分析

全部在体外本文报道的培养实验使用重复或三次的培养皿或使用不同批次的Sertoli细胞的双室单位重复至少三到四次。对于体内实验中，每个时间点至少使用四只大鼠。使用重复测量模型和Dunnett检验，通过双向方差分析进行统计分析，以使用GB-STAT统计分析软件包（版本7；Dynamic Microsystems，Silver Spring，MD）比较治疗组和相应对照组之间的变化。因此，我们考虑了治疗组蛋白质水平（或TER）的变化与.在这些分析中，对应的控制（第一变量）以及作为时间的函数（第二变量）。

结果

FAK在BTB的阶段特异性表达及其与闭塞素相互作用形成闭塞素-FAK蛋白复合物

图1A，a–h，显示FAK在成年大鼠睾丸生精上皮中的阶段特异性表达。免疫反应性FAK主要在基底室附近发现，与其在BTB的定位一致。在生精上皮周期的所有阶段，FAK均在BTB高水平表达，表明其在BTB维持中的重要性。然而，其染色在第VIII-IX期显著减少与.其他阶段(图1A、e和f与b–d、g和h；值得注意的是图1Aa是一种用正常兔IgG替换一级抗体的对照，说明b–h中显示的染色对FAK是特异的），当BTB在这些阶段进行重组以促进初级精母细胞的转运时。为了进一步证实FAK确实是BTB的一个组成部分，对其与TJ整合膜蛋白闭塞素的共定位进行了检测。事实上，FAK与闭塞素共同定位在BTB的同一位置(图1B，a–h），说明FAK可能是BTB的监管组成部分。此外，FAK似乎也定位于固有膜的细胞区，如肌样细胞和/或淋巴管内皮，以及间质中的莱迪格细胞(图1B).

因为FAK在睾丸期特异性表达，与观察到的闭塞蛋白类似(25)，这两种蛋白质与BTB共定位(图1B)并且在第八期肾小管的BTB处也显著减少(图1A) (25)推测FAK可以在结构上与BTB处的闭塞素相互作用，形成调节蛋白复合物。为了验证这一假设，使用睾丸裂解物对occludin和FAK进行了Co-IP与控件。Co-IP实验结果如所示图1C在正常大鼠睾丸中，FAK在结构上与闭塞素相互作用，但与JAM-A和克劳丁-11没有相互作用（数据未显示）。为了说明这些实验中使用的抗FAK抗体的特异性，图1D是一种使用睾丸和生精小管裂解物的免疫印迹，产生约125 kDa的显著蛋白带，与FAK的表观分子量一致。

支持细胞TJ-通透性屏障的组装及FAK在支持细胞中的表达和细胞分布与其他BTB相关蛋白在体外

接下来我们研究了FAK是否在功能上与Sertoli细胞TJ屏障的组装有关在体外当支持细胞培养6天时在体外（见黑色箭头在里面图2A这是培养的支持细胞的典型特征在体外)模拟BTB的超微结构体内如基础ES和共存TJ(图2，A–C）和桥粒（ds）（绿色，见中典型的ds电子密度物质图2A). 例如，培养的两个相邻的Sertoli细胞在体外显示基础ES超微结构（蓝色），以肌动蛋白丝的存在为代表(黑色箭头在里面图2C尽管这些肌动蛋白丝的发育程度低于所发现的体内可能是因为包埋过程）夹在内质网（ER）和支持细胞质膜之间(图2，A–C），TJ位于两个Sertoli细胞之间（参见红色箭头)在放大区域图2B和所示图2C这些电子显微镜数据，再加上通过评估整个支持细胞上皮的TER得出的功能数据，说明TER从第1天到第3天增加，最终证明这些培养细胞正在组装功能性TJ屏障，到第4天，TER达到稳定，一直持续到实验结束的第7天(图2D).

在组装这个TJ通透性屏障的过程中，观察到TJ整体膜蛋白闭塞素和JAM-A的稳态水平的诱导(图2、E和F），显示了用于形成BTB的TJ构建块的增加在体外然而，克劳丁-11也是一种TJ-整合膜蛋白，在TJ-屏障组装开始时含量较高，但在形成TJ屏障时显著减少(图2，E和F），说明该蛋白可能不需要用于BTB的维持，与早先的报告一致，即成年大鼠的BTB处claudin-11显著减少与.幼鼠(26).

有趣的是，细胞培养后FAK的稳态水平显著下降，但在整个培养过程中仍保持在相对稳定的水平，而对FAK-Tyr³⁹⁷水平显著提高(图2，E和G），表明FAK与对FAK-Tyr的相对比率³⁹⁷可能对BTB的组装和维护很重要在体外。

为了进一步验证FAK确实是BTB的成分，使用荧光显微镜来确认FAK和pFAK-Tyr的定位³⁹⁷在培养的支持细胞中。大多数FAK染色定位于支持细胞-支持细胞界面和细胞核，在细胞胞浆中检测到的FAK染色相对较少(图2H). 相比之下，p-FAK-Tyr的含量要少得多³⁹⁷在细胞-细胞界面检测到，但大多数在细胞胞浆中发现，在细胞核中发现一些染色(图2). 用于免疫荧光显微镜的这两种抗体的特异性通过使用Sertoli细胞裂解物的免疫印迹进行确认，如图所示图2、Hc和Ic。

氯化镉的影响₂支持细胞骨架F-actin、TJ-屏障功能和BTB-相关蛋白的稳态水平在体外

随后，我们使用这个支持细胞培养系统作为模型来研究闭塞素/FAK复合物对BTB功能的作用在体外由于闭塞素是BTB的一种基于肌动蛋白的TJ蛋白，我们首先评估镉是否会引起肌动蛋白细胞骨架的改变，而肌动蛋白是闭塞素用于附着的。用罗丹明结合的卵磷脂监测3μg处理细胞后F-actin在支持细胞中的分布米氯化镉₂。图3Aa图示了培养的支持细胞中典型的F-actin丝及其组织和排列在体外持续4天。使用CdCl 3小时后₂暴露后，发现F-肌动蛋白丝结构紊乱(图3Ab)恶化了6小时(图3Ac). 除了两个治疗组肌动蛋白丝的明显紊乱外与.控件(图3A、b和c与.a），肌动蛋白丝似乎被碎片化了(白色箭头在里面图3A、b和c）。因此，CdCl的这些影响₂在支持细胞的细胞骨架F-actin丝上显示，在这些时间点，CdCl₂会影响Sertoli细胞的TJ屏障。功能性TJ屏障在第4天在这些培养物中组装，通过细胞上皮上稳定的TER证实了这一点(图3B). 此时，用氯化镉处理细胞₂、1和3μ米持续8小时；然后清洗细胞以去除CdCl₂在接下来的3天中，每隔24小时监测一次上皮细胞的TER₂与对照组相比，TER显著且呈剂量依赖性下降，显示出剂量依赖性破坏支持细胞TJ屏障(图3B). CdCl的这种破坏作用₂对支持细胞TJ屏障的损伤是不可逆的，因为即使在从培养基中去除毒物后，受损的BTB也无法重建。如前所述，这些浓度对Sertoli细胞无细胞毒性(13，14).

接下来我们评估了CdCl的影响₂与TJ相关的蛋白质稳态水平的支持细胞暴露(例如JAM-A、claudin-11、clodin和ZO-1）、半桥粒（β1-整合素）以及一些已被报道调节其他上皮和/或睾丸连接重构的信号分子(例如.FAK、c-Src和p38 MAPK及其各自的磷酸化形式，即p-FAK-Tyr³⁹⁷，p-FAK-Tyr⁵⁷⁶，对Src-Tyr⁵²⁹和p-p38 MAPK）。细胞与载体（0.9%NaCl）或3μ米氯化镉₂，并在0、6、9和24小时后终止。值得注意的是，闭塞素和ZO-1，分别是TJ整合膜蛋白和适配器，以及克劳丁-11对镉的敏感性明显高于分析的其他蛋白，因为它们的水平在大约6-9小时的CdCl后降低₂暴露，而大多数研究的蛋白质仅在24小时后才减少(图3，C–G）。在所研究的信号分子中，CdCl处理6小时后，显著诱导了p-p38 MAPK₂但非磷酸化形式p38的稳态水平对CdCl没有反应₂处理(图3、C和G）。

氯化镉的影响₂闭塞素/ZO-1/FAK蛋白复合物及其在支持细胞中的细胞定位在体外

因为FAK在结构上与闭塞素相互作用，但闭塞素也已知与ZO-1以1:1的化学计量比形成蛋白质复合物(27，28)，我们试图用闭塞素研究FAK的分布(图4A)和ZO-1(图4B)CdCl之后₂治疗。FAK和闭塞素在对照支持细胞中共同定位于同一位置(图4A、a–c）和CdCl₂-处理过的细胞(图4A，d–i），如在合并图像中观察到的(图4A、c、f和i）。然而，在CdCl之后₂早在暴露3小时时，这两种蛋白质就从细胞-细胞界面重新分布到胞质溶胶中(图4A，d–f），9小时后更明显(图4A，g–i）。有趣的是，FAK还与ZO-1共同定位于对照细胞的细胞-细胞界面(图4B，a–c），说明FAK确实是闭塞素/ZO-1蛋白复合物的组成部分。此外，CdCl后类似的蛋白质再分配模式₂观察到ZO-1和FAK的闭塞素和FAK治疗(图4，B与.A）。这些结果表明FAK可能参与CdCl₂-诱导闭塞素和ZO-1重新分布，因为已知TJ和AJ的整体膜蛋白磷酸化会影响其细胞分布（有关综述，请参阅参考文献。29和30)并且可能闭塞素和/或ZO-1是FAK的底物。

氯化镉₂-在支持细胞中诱导的闭塞素重新分布显然是通过内吞小泡介导的过程介导的

因为先前的研究表明，睾丸细胞连接蛋白的内吞和/或再循环是诱导BTB重组以促进初级精母细胞在BTB的转运的重要机制(23，31)和CdCl₂研究表明，可以诱导闭塞素从支持细胞界面重新分布到细胞质，我们设想毒素诱导的BTB破坏可能通过这些途径介导。采用双标记免疫荧光显微镜评估闭塞素和早期内体标记物早期内体抗原-1（EEA-1；图5A)和氯氰菊酯(图5B)，一种已知参与BTB蛋白质内吞的内吞蛋白(23，31)，在CdCl之后₂治疗与控件。在对照细胞中，闭塞素和EEA-1的共定位相对较少(图5A，a–c），以及闭塞素和氯氰菊酯之间(图5B检测到a–c）。然而，与CdCl孵育3小时后₂，闭塞素在细胞质中与EEA-1共定位(图5A，d–f）以及氯菊酯(图5B，d–f），9小时后，这种关联变得更加明显(图5Ag–i和Bg–i），表明闭塞素在CdCl上的定位错误₂治疗是由于TJ-整合膜蛋白在BTB的内化。此外，CdCl后ZO-1和EEA-1的共定位₂治疗方式也类似(补充图1，作为补充数据发布在内分泌学会期刊在线网站上，网址为http://endo.endojournals.org). 以前曾报道过该实验室使用的抗EEA-1和甲氰菊酯抗体的特异性(23). 尽管免疫荧光显微镜显示闭塞素和EEA-1之间以及闭塞素和氯氰菊酯之间的共定位增加，但治疗6 h后免疫印迹法观察到EEA-1和氯氰化物的稳态水平没有变化；治疗24小时后仅检测到氯氰菊酯轻度下降(图5、C和D）。

讨论

闭塞素/ZO-1在睾丸BTB中的作用

成年哺乳动物睾丸生精上皮中的BTB对精子发生至关重要。除了赋予细胞极性的作用外，它还创造了一种独特的免疫屏障，将减数分裂后生殖细胞的发育与体循环隔离开来(4，32，33). 然而，BTB与其他血组织屏障（如血脑屏障）不同，它是一个高度动态的结构，因为它在上皮周期的第VIII-IX阶段经历了广泛的重组，以促进初级精母细胞的转运(1). 因此，可以设想BTB必须受到严格调节，以协调精子发生过程中的细胞事件。为了进行功能研究以了解BTB动力学的生物学和调控，必须充分阐明其组成。迄今为止，已知构成啮齿动物睾丸中相邻支持细胞之间BTB的完整膜蛋白包括：TJ蛋白(例如闭塞素、JAM-A和克劳丁）；基础ES蛋白(例如.N-钙粘蛋白，连接蛋白-2）；和缝隙连接蛋白(例如连接43）(4，29). 然而，外围监管机构(例如蛋白激酶和磷酸酶）与这些完整膜蛋白在结构上相关的几乎是未知的。根据其他上皮细胞调节TJ-屏障功能的研究，改变BTB整体膜蛋白磷酸化状态的蛋白激酶可能会影响细胞粘附状态(29，30)在上皮细胞周期的第VIII-IX阶段，例如通过与下面的细胞骨架网络分离，从而“破坏”和/或“打开”TJ屏障，以促进初级精母细胞在BTB的通过。例如，在大多数上皮细胞的TJ纤维中发现的闭塞素主要在Ser/Thr和Tyr残基处磷酸化(34，35)而磷酸化程度较低的闭塞素没有组装成TJ纤维，而是局限于基底外侧膜(34，36).

Occludin/ZO-1/FAK是BTB的一种新型调节蛋白复合物

FAK是一种非受体蛋白酪氨酸激酶，是整合素介导的信号转导途径中已知的调节剂(8，9，10，11，37，38，39)调控一系列细胞事件，包括细胞运动、病毒转染、凋亡、细胞分化、细胞粘附、连接动力学等。文献中的大多数研究表明，FAK是基于整合素的信号通路的调节剂，与Src和ILK协同工作以调节局部接触的细胞功能(40). 然而，早期对成年大鼠睾丸的研究表明，两种激活形式的FAK，即对-FAK-Tyr³⁹⁷和p-FAK-Tyr⁵⁷⁶，主要位于心尖ES，是心尖ES的组成部分(5)，这是一种睾丸特异性非典型AJ型，仅限于Sertoli细胞精子（第8步及以后）(41). 在顶点ES，p-FAK-Tyr³⁹⁷表格a真诚地α6β1-整合素-层粘连蛋白-α3β3γ3复合物(42，43，44，45)粘附复合物(5)调节发育中精子细胞与支持细胞之间的粘附。事实上，随后的研究表明，p-FAK/β1-整合素复合物在精子形成之前一直存在于心尖ES(6). 有趣的是，在早期的一项研究中，BTB也检测到FAK(5). 然而，其阶段特异性、结合伙伴及其在BTB中的功能是已知的。在此，FAK被证明是BTB的一个组成部分，与之前的报告一致(5). 最重要的是，该蛋白在BTB显示出阶段特异性定位，在上皮周期的第VIII-IX阶段，当初级精母细胞在BTB转运时，其表达显著降低(1)，这也与先前报道的occludin在BTB的阶段特异性表达模式一致(25). 在我们的初步调查中，以检查BTB的FAK约束合作伙伴与对-FAK-Tyr³⁹⁷和对-FAK-Tyr⁵⁷⁶在与β1整合素相互作用的心尖ES处，我们认为FAK也会与BTB处的整合素形成复合物，因为BTB由啮齿动物睾丸中共存的TJ、基底ES、缝隙连接和类ds-连接组成。然而，几乎所有的β1整合素染色都在心尖ES处检测到(44，46)，与之前的报告一致(43)对于在基底室中检测到的β1-整合素，随后的研究表明它是半桥粒的组成部分，与α2-层粘连蛋白共定位(46)是啮齿类动物睾丸基膜的组成部分(47). 尽管α6β4整合素被假定为基底ES的一种可能成分(48)，我们未能与FAK联合免疫沉淀β4整合素。此外，JAM-A和claudin-11（均为大鼠睾丸BTB处的假定TJ-整合膜蛋白）均与FAK无关（我们未发表的观察结果）。有趣的是，如Co-IP所示，闭塞素在结构上与FAK相互作用，这与双标记免疫荧光显微镜的结果一致。通过使用在体外CdCl处理Sertoli细胞的模型₂存在模拟体内障碍物。这些发现表明，CdCl后支持细胞中闭塞素和ZO-1的内化₂-诱导的TJ屏障破坏也伴随着FAK，明确证明存在一种新的闭塞蛋白/ZO-1/FAK复合物。然而，FAK是否调节闭塞素粘附功能以及闭塞素是否也可以通过TJ处的FAK介导信号功能尚待确定。此外，BTB处的FAK是否在除Tyr-397和Tyr-576以外的Tyr残基处激活尚待确定，它们是FAK的两种激活形式，是心尖ESβ1-整合素粘附复合物的整合结构成分(5，6). 在此背景下，值得注意的是，在培养的Sertoli细胞中在体外利用已建立的BTB超微结构，FAK定位于细胞-细胞界面，但大多数对FAK-Tyr³⁹⁷在支持细胞胞浆中而不是在细胞-细胞界面中检测到，可能是因为这些培养物缺乏顶端ES（注：生殖细胞在低渗处理步骤中被溶解）。因此，对FAK-Tyr³⁹⁷无法定位于ES顶端，因此大部分染色都是在细胞胞浆中发现的。因此，这些观察进一步验证了对FAK-Tyr的概念³⁹⁷是顶点ES的一个组件(5). 基于本文报告的结果，我们假设BTB对镉毒性的异常敏感性可能是通过其对FAK的影响介导的；这反过来改变了闭塞素/ZO-1粘附复合物的磷酸化状态，该复合物在BTB具有TJ通透性屏障功能(图6). 这种相互作用的最终结果是诱导闭塞素/ZO-1/FAK复合物的加速内吞，从而破坏BTB的稳定性并导致其破坏。然而，睾丸可能利用这一方案在上皮周期第八阶段诱导BTB重组，以促进初级精母细胞在BTB的转运。在此背景下，值得注意的是，已知BTB完整性受细胞因子调节(例如TGF-β3、TNF-α）和睾酮，其中细胞因子受到干扰(19，21，25)睾丸激素促进(26)支持细胞TJ-通透性屏障功能，可能由其对BTB蛋白质内吞、再循环和/或跨细胞作用的差异效应介导(23). 然而，我们没有包括这些试剂，以避免细胞培养中的额外参数影响和/或使镉模型中的实验结果复杂化；因此，我们在本文中报告的观察到的效应可以完全归因于镉的影响，而不是多种因素相互作用的净结果。

总之，我们在成年大鼠睾丸BTB处发现了一种新的闭塞素/ZO-1/FAK蛋白复合物。这一发现为设计功能实验以研究其在BTB动力学中的调节作用提供了基础。

致谢

我们感谢洛克菲勒大学生物成像资源中心的Eleana Sphicas女士在电子显微镜研究方面提供的卓越技术援助。

缩写

 
• AJ、，

  粘附连接；

 
• 顺便说一句，

  血睾屏障；

 
• Co-IP公司，

  免疫共沉淀；

 
• DAPI、，

  4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚；

 
• ds、，

  桥粒；

 
• EEA-1，

  早期内体抗原-1；

 
• 呃，

  内质网；

 
• 锿，

  胞质特化；

 
• FAK（传真），

  粘着斑激酶；

 
• JAM-A、，

  结合粘附分子A；

 
• TER中，

  跨上皮电阻；

 
• TJ、，

  紧密连接ZO-1，闭塞小带-1。

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