筛选和识别环状泰勒虫牛B细胞亚群编码可变分泌蛋白-950454（SVSP454）相互作用蛋白

摘要

背景

环状泰勒虫是一种原生动物寄生虫，可以感染和转化牛B细胞、巨噬细胞和树突状细胞。转化的机制尚不清楚，一些寄生虫分子已被鉴定，它们通过调节宿主信号通路促进细胞增殖。亚减数分裂可变分泌蛋白（SVSP）泰勒菌属可能影响宿主细胞表型，但其功能尚不明确。因此，在本研究中，我们探索了SVSP454与宿主细胞蛋白的相互作用，以研究其分子机制环状木霉与宿主细胞的相互作用。

方法

SVSP蛋白的转录水平环状木霉使用qRT-PCR分析不同生命阶段和转化细胞传代之间的SVSP454。然后，以SVSP454为诱饵，利用酵母双杂交（Y2H）系统从牛B细胞cDNA文库中筛选其相互作用蛋白。通过共免疫沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补（BiFC）分析，进一步鉴定了宿主细胞与SVSP454的潜在相互作用蛋白。

结果

SVSP454在人类的所有三个生命阶段都被转录环状木霉但在分裂期转录最高。然而，随着培养物的传代，SVSP454的转录水平不断下降。两种蛋白质，Bos金牛座线圈域181（CCDC181）和Bos金牛座筛选线粒体核糖体蛋白L30（MRPL30）。进一步鉴定了宿主的蛋白质CCDC181和MRPL30与SVSP454直接相互作用。

结论

本研究以SVSP454为诱饵质粒，利用Y2H系统筛选出其捕食蛋白CCDC181和MRPL30。然后，我们通过Co-IP和BiFC分析证明了SVSP454与CCDC181和MRPL30直接相互作用。因此，我们推测SVSP454-CCDC181/SVSP454MRPL30是一个相互作用的轴，通过一些重要的信号分子调节宿主的微管网络和翻译过程。识别SVSP454与CCDC181和MRPL30的相互作用将有助于阐明环状木霉.

图形摘要

背景

环状泰勒虫是一种由海洛玛蜱类，是热带泰勒虫病的病原。热带泰勒虫病导致110多万头牛死亡，热带和亚热带地区每年损失约数亿美元[1].环状泰勒虫与一起帕尔瓦锥虫因其能够诱导受感染细胞不受控制的增殖而被称为“转化物种”[2]. 这两个细胞的靶细胞T。物种不同，其中环状木霉主要感染B细胞、巨噬细胞和树突状细胞，而帕尔瓦锥虫侵入T和B淋巴细胞。然而，这两种寄生虫的感染都可能导致急性淋巴增生性疾病，这种疾病与人类白血病有一些共同的临床特征[三]. 除了不受控制的增殖外环状木霉也有其他癌症特征，例如转移和侵袭性增加，以及细胞能量代谢失控[三,4,5,6]. 由环状木霉是可逆的，一旦细胞被杀螨药物治疗，它们就会失去癌样特征并经历程序性凋亡[7].

为了驱动宿主细胞转化环状木霉已被证实可阻断有助于细胞永生的宿主信号通路，如EB1和TaPin1[8,9,10]. 然而，详细的机制环状木霉控制宿主细胞，以及寄生分子对类癌表型的影响，目前尚不清楚。了解泰勒菌属，基因组环状木霉测序，预测3792个推测蛋白[11]. 在巨鞭毛虫阶段表达并释放到细胞质或在寄生虫表面表达的蛋白质可能参与了转化过程[11].环状泰勒虫符合这些标准的裂殖体AT-hook蛋白（TashAT）家族蛋白被证实定位于宿主细胞核并影响宿主细胞表型和增殖[三,12]

SVSP多基因家族是另一个大基因家族，主要在两者的分裂期表达帕尔瓦锥虫和环状木霉，并被怀疑参与宿主细胞转化、入侵和免疫逃避[三,13,14]. 大多数SVSP基因分布在亚群中，具有独特的特征，包括长度的多样性、非典型密码子的使用和广泛的核苷酸变异性。此外，大多数SVSP具有信号肽，并且定位于宿主细胞的核和细胞质区域[11,15]这使得SVSP分子更有可能干扰宿主细胞信号“中枢”来调节宿主细胞功能。

因此，在本研究中，我们探讨了SVSP蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用。首先，将SVSP454的mRNA水平与环状木霉qPCR检测不同生命阶段和不同传代转化细胞。然后，我们以SVSP454为诱饵质粒，通过酵母双杂交系统筛选宿主的相互作用蛋白。我们使用共免疫沉淀（Co-IP）分析证明SVSP454与CCDC181和MRPL30相互作用。通过双分子荧光互补（BiFC）分析，证实了SVSP454与CCDC181和MRPL30在细胞环境中的相互作用。相互作用蛋白的亚细胞共定位表明，它们的相互作用发生在细胞内。此外，利用流式细胞术观察诱饵与被捕食蛋白相互作用过程中发出的中值荧光强度（MFI）。

方法

细胞培养

环状木霉裂殖体感染细胞系由中国兰州兽医研究所（LVRI）媒介和媒介传播疾病（VVBD）实验室提供。细胞培养在RPMI 1640培养基（以色列基布茨拜特哈梅克生物工业公司）加10%胎牛血清（以色列基布茨拜特海梅克生物产业公司）和100 mg/ml青霉素/链霉素中，并在含有5%CO的培养箱中保持37°C₂HEK293T细胞从中国上海中国类型培养收集中心获得，并在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）（美国纽约州吉布科）中培养（美国纽约市吉布科）。

定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

总RNA环状木霉-不同传代（F10、F20、F55、F110和F165）的感染细胞，以及环状木霉根据用户手册，使用RNeasy Mini试剂盒（德国杜塞尔多夫QIAGEN）提取感染。然后通过PrimeScript™RT试剂盒和gDNA橡皮擦（Perfect Real Time）合成cDNA（中国大连塔卡拉）。SVSP454（登录号：XM950454.1）的特异性引物如下：SVSP454-F（5′-TAAAGGAAATGGGTGTCTA-3′）和SVSP454-R（5′-CATTGTGCTAAGGCTAACG-3′）。qPCR反应在最终体积为20μL的溶液中进行，其中含有10μL TB Green®Premix Ex Taq™II（Tli RNaseH Plus）（2×）（TaKaRa，中国大连），每个引物10μM，0.4μL ROX参考染料II（50×）（中国大连）、2μL cDNA模板和10μL Easy Dilition for Real Time PCR System（TaKaRa，中国辽宁大连）。和未感染牛PBMC的cDNA环状木霉在qPCR系统中用作阴性对照。qPCR方案包括在95℃下初始变性30 s，然后进行40个周期的2步PCR（95℃5 s，60℃34 s）和分离阶段（95℃15 s，60°C 1 min，95°C 15 s）。使用安捷伦科技公司Stratagene MX3005P热循环器（美国加利福尼亚州）扩增qRT-PCR。环状木霉β-actin的转录水平用于归一化。β-肌动蛋白的特异性引物环状木霉分别为β-肌动蛋白-F（5′-GAGACACCTACACAGCATCATG-3′）和β-肌动蛋白-R（5′-CACTTGATCTTCATGGTGCTGGG-3′）。SVSP454的相对转录水平使用比较周期阈值（2^{−ΔΔ计算机断层扫描})Ct方法。

蛋白质印迹

使用RIPA裂解缓冲液（Beyotime，#P0013B）对细胞进行裂解，该缓冲液含有磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Roche，#4906845001）和蛋白酶抑制剂（罗氏，#4693132001），并在冰上培养20分钟。在裂解步骤之后，将细胞裂解物在14000×克在4°C下放置10分钟，以收集上清液。使用Pierce™BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，#23225）测定蛋白质浓度。用12%的SDS-PAGE分离等量的蛋白质，并转移到PVDF膜上（美国马萨诸塞州米利浦）。在室温（RT）下，用含有5%BSA（美国华盛顿州Amresco）的1×TBST缓冲液封闭PVDF膜2小时。用TBST缓冲液洗涤三次，每次5分钟后，添加主要抗体，即小鼠抗FLAG标签单克隆抗体（Sigma，#F1804）或兔抗MYC标签单抗（CST，#2278S），并在4°C下培养过夜。清洗后，在RT下轻轻摇晃1h，用HRP结合的山羊抗鼠抗体（Abcam，#ab6789）或驴抗兔IgG抗体（Abcam，#ab6901）探测膜。最后，用TBST清洗膜四次，并使用SuperSignal™West Pico PLUS化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，#34577）检测膜上的蛋白质。从Thermo Fisher Scientific（#MA5-15738）购买了一种来源于小鼠的GAPDH负载控制单克隆抗体（GA1R），作为评估蛋白质水平的标准。

SVSP454蛋白的亚细胞定位环状木霉-受感染细胞

环状木霉-感染细胞（2.0–3.0×10⁵)在不同的传代（F10、F20、F55、F110和F165）中，将其接种在12孔细胞培养板中的玻片（NEST）上。培养24h后，用PBS洗涤两次，然后在室温下用4%多聚甲醛固定30min。用PBS清洗三次后，在室温下用0.5%Triton X-100渗透细胞10分钟。在三次清洗后，用3%牛血清白蛋白（BSA）在37°C的PBS中封闭细胞1小时。对于免疫荧光分析，在清洗平板三次后，将细胞与500μL兔源SVSP454一级抗体（数据未显示）在37°C下用1%BSA的PBS中以1:100稀释培养1h。用PBS洗涤五次后，用Alexa Fluor 488二级抗体（美国生命科技公司）在37°C下以1:1000稀释1小时对细胞进行染色。在四次清洗后，将细胞与Hoechst 33342（美国生命技术公司）在1:2000稀释液中孵育，以便在37°C下进行核染色10分钟。用PBS冲洗掉剩余的荧光色素后，将细胞与Alexa Fluor™594 Phalloidin一起在37°C下以1:100的稀释度孵育30分钟，用于细胞骨架染色（Life Technologies，USA）。清洗后，在共聚焦显微镜（徕卡TCS）下用63倍油物镜观察细胞。每张幻灯片至少检查100个随机单元格，并从每张幻灯片中选择最具代表性的图像进行演示。此外，SVSP454的亚细胞定位环状木霉-使用CELLO v.2.5，一种CELLular下移预测因子预测感染细胞系(网址：http://cello.life.nctu.edu.tw/).

诱饵质粒的构建与分析

目的基因片段通过PCR从环状木霉-感染细胞。根据SVSP950454（登录号：XM950454，SVSP454）的参考序列设计特异性引物，核苷酸序列为：SVSP454-F（5′-CCGGAATTC公司ATGAATAAATATATAACATAT-3′）和SVSP454-R（5′-TGCACTGCAG公司ATCCTCCGATTTATCATATTT-3′），限制位点下划线。PCR反应的最终体积为50μL，其中包含10μL 5×PrimeSTAR GXL缓冲液（中国大连TaKaRa）、4μL dNTP混合物（2.5 mM）、20μM每个引物、1μL PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（中国大连塔卡拉）、4µL cDNA模板和17μL ddH₂O、PCR反应程序如下：35个变性周期（98°C 10 s，50°C 15 s，68°C 20 s），最后在68°C下延伸10 min。使用Cycle-Pure试剂盒（美国OMEGA Bio-Tek）纯化PCR产物，然后用限制性内切酶消化限制酶和心理创伤指数（赛默飞世尔科技公司，#FD0274和#FD0614）。然后将产物连接到pGBKT7质粒上，该质粒用之前描述的相同酶消化。最后，利用双限制性内切酶消化和测序（中国上海桑贡生物技术有限公司）对重组SVSP454-pGBKT7质粒进行了进一步鉴定，仅将阳性质粒用作诱饵质粒进行进一步实验。

诱饵质粒的自激活和毒性测定

为了确定诱饵质粒是否具有自激活或有毒的能力，根据《快速简便酵母转化混合物》（美国加利福尼亚州克朗泰克）用户手册，将诱饵质粒和pGBKT7载体（空载体）分别转化为Y2H Gold活性细胞。随后，将转化体培养在30°C的SD/-Trp（SDO）、SD/-Trop/X-α-Gal（SDO/X）和SD/-Trp/X-β-Gal/AbA（SDO/W/A）琼脂平板上，培养3-5天。只有生长在SDO和SDO/X板上的菌落是白色或非常淡的蓝色，在SDO/X/A板上没有观察到菌落。诱饵质粒未被自动激活。如果诱饵质粒有毒，菌落的大小将显著小于含有空载体质粒的菌落。诱饵质粒既没有毒性也没有自激活性，可用于以下Y2H筛选实验。

Y2H筛选

采用Y2H筛选系统筛选重组SVSP454-pGBKT7（诱饵质粒）与牛B细胞cDNA文库（猎物质粒）之间的相互作用蛋白[16]. 根据用户手册，使用酵母标记™酵母转化系统2（美国加利福尼亚州克隆泰克），在文库规模下将诱饵质粒和猎物质粒共转化为Y2H Gold活性细胞。然后将转化体置于DDO/X/A琼脂平板上，并在30°C下培养5天。将蓝色菌落再次放置在DDO/X/A琼脂平板上进行再次筛选，以消除假阳性菌落。最后，从第二次筛选中提取蓝色菌落，并在30°C的QDO/X/A琼脂平板上培养3-5天。将蓝色菌落再次培养到QDO/X/A琼脂平板上。此外，作为阴性对照的pGADT7-T和pGBKT7-Lam被共转化为Y2H Gold细胞。pGADT7-T和pGBKT7-53质粒作为阳性对照，共同转化为Y2H Gold细胞。将两种共转化物在30°C的DDO和DDO/X/A琼脂平板上培养3-5天。

Y2H系统筛选后，用Matchmaker™Insert Check PCR Mix（美国加利福尼亚州克朗泰克）进行菌落PCR，以鉴定蓝色菌落。

假定猎物质粒的拯救

根据用户手册，使用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit（Clonetech，California，USA）从确定的蓝色菌落中提取假定的食饵质粒。随后，将3μL纯化的猎物质粒转化为大肠杆菌用于质粒DNA提取和测序分析的DH5α活性细胞。

阳性猎物基因分析

通过分析NCBI中具有BLAST功能的假定猎物质粒序列，确定了相应的牛基因[17]. 通过UniProt数据库分析已确认的牛基因的蛋白质结构和功能(网址：http://www.uniprot.org/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/).

诱饵和猎物蛋白的表达及亚细胞定位

通过将猎物基因克隆到p3×FLAG-CMV载体质粒中，并用限制性内切酶消化后构建重组p3×FLAG-CMV猎物质粒印地安三世/巴米希（赛默飞世尔科技公司，#FD0504和#FD0054）或印地安三世/XbaI公司（赛默飞世尔科技公司，#FD0504和#FD0684）。通过将带有C末端MYC标记的诱饵基因克隆到巴米希/XhoI公司（Thermo Fisher Scientific，#FD0054和#FD0694）消化pcDNA3.1+载体质粒。HEK293T细胞接种在6孔细胞培养板中的玻片上，密度为5×10⁵细胞/ml。当细胞融合到70-90%时，使用脂质体3000（Thermo Fisher Scientific，#L3000015）将诱饵和/或猎物质粒转染或共转染到HEK293T细胞中。此外，作为阴性对照的空载体（p3×FLAG-CMV和pcDNA3.1+）也被转染到细胞中。转染24小时后，用4%多聚甲醛在室温下固定细胞30分钟。用PBS洗涤后，用0.1%Triton X-100在室温下渗透细胞15分钟。洗涤后用3%BSA在PBS中封闭细胞1小时。为了进行免疫荧光分析，将细胞与来自小鼠的1:200稀释抗MYC标记单克隆抗体（CST，#2276S）或兔抗FLAG标记单抗（Sigma，#F7425）在4℃孵育过夜。用PBS冲洗五次后，用山羊抗鼠Alexa Fluor 488或驴抗兔594结合二级抗体（美国Life Technologies）在PBS中以1:1000的稀释度用3%BSA在室温下进行1小时的染色。冲洗步骤结束后，用1:2000稀释的Hoechst 33342培养细胞（美国Life-Techst）RT下核染色15分钟。然后在共聚焦显微镜（徕卡TCS）下用63倍油物镜观察细胞。对于每张幻灯片，我们检查了100多个随机单元，我们选择的每张幻灯片的图像是本研究中最具代表性的。

免疫共沉淀（Co-IP）分析

HEK293T细胞接种在10-cm细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific）中，培养温度为2×10⁶每个培养皿的细胞数。培养14小时后，将10µg的每个构建的诱饵质粒和构建的猎物质粒共转染到细胞中。48小时后，用冷PBS清洗细胞两次，并用600μL IP/裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific）在含有磷酸酶抑制剂混合物（Roche，#4906845001）和蛋白酶抑制剂（Roche，#4693132001）的冰上进行裂解。然后在16000×克在4°C下保持10分钟。使用Pierce™Co-Immunoproprection试剂盒（Thermo Fisher Scientific，#26149），使用小鼠抗FLAG标签单克隆抗体（Sigma，#F1804）进行免疫沉淀实验，并根据试剂盒提供的方案进行程序。接下来，作为阴性对照的空载体（p3×FLAG-CMV和pcDNA3.1+）也被共同转染到HEK293T细胞中。Co-IP的洗脱液经过western印迹，并用小鼠抗FLAG标签单克隆抗体和兔抗MYC标签单抗（CST，#2278S）进行检查。

双分子荧光互补（BiFC）分析

BiFC分析是一种通过荧光显微镜或流式细胞术直观显示活细胞中蛋白质相互作用的技术性直接分析方法。BiFC方法基于绿色荧光蛋白（GFP）变体金星的两个非荧光互补片段之间的关联。两个维纳斯片段融合到诱饵和猎物蛋白质（一种相互作用的蛋白质对）上，当它们在同一细胞中共存并相互作用时，它们彼此接近，导致结构互补以及明亮的荧光信号[18]. 此外，该分析可用于观察相互作用蛋白的亚细胞定位[18].

pBiFC-VN173（Addgene，22010）和pBiFC-VC155（Addgene，22011）载体是从Addgene获得的[19]. pBiFC-VN173-bait质粒和猎物质粒是通过将诱饵或猎物基因克隆到后面的-三/萨尔-我（Thermo Fisher Scientific，#FD0504和#FD0644）消化的pBiFC-VN173载体。pBiFC-VC155通过将诱饵或猎物基因克隆到pBiFC-VC155载体中，在萨尔-我/千磅-我（Thermo Fisher Scientific，#FD0644和#FD0524）消化。将pBiFC-VN173-bait及其猎物质粒、pBiFC-VC155-bait及猎物质粒分别转染HEK293T细胞。此外，使用Lipofectamine 3000将pBiFC-VN173-bait/pBiFC-FC155-prey或pBiFC-VN155-bait/p BiFC-VC173-prey对共转染到HEK293T细胞中。此外，空的pBiFC-VN173和pBiFC-VC155载体作为对照，也被转染到HEK293T细胞中。转染24小时后，按照上述方法进行共焦实验。在清洗、固定、渗透和封闭后，用100倍稀释的兔抗-HA-tag单克隆抗体（CST，#3724S）或200倍稀释的鼠抗FLAG单克隆抗体在4℃孵育过夜，对细胞进行染色。清洗后，将细胞与山羊抗鼠Alexa Fluor 594或驴抗兔594结合抗体（美国生命科技公司）在室温下以1:1000的稀释度孵育1小时。用Hoechst 33342（美国生命科技公司）对细胞核染色后，在共焦显微镜下对细胞进行检查（徕卡TCS）。

流式细胞术

HEK293T细胞（5×10⁶细胞/ml）在6孔培养板（美国康宁）中培养。当细胞融合率为70-90%时，将pBiFC-VN173-诱饵/猎物质粒和pBiFC-VC115-诱饵/猎物质粒分别转染到HEK293T细胞中。此外，当细胞密度为70-90%时，将pBiFC-VN173-bait/pBiFC-VC155-prey和pBiFC-FN155-bait/p BiFC-VC173-prey对共转染到HEK293T细胞中。转染48小时后，用荧光显微镜检查转染细胞的Venus荧光。用PBS洗涤两次后，用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）消化细胞（美国纽约州吉布科）。然后用冷PBS清洗细胞，并在4°C下以800 rpm离心3分钟，以去除剩余的胰蛋白酶–EDTA。最后，将细胞样品重新悬浮在冷PBS中，并使用BD-Accuri™C6 Plus流式细胞仪（美国）检测平均荧光强度（MFI）。

数据和统计分析

我们的研究使用GraphPad Prism 7进行统计分析。结果表示所有图形的三次重复独立实验的平均±标准误差。使用非配对双尾Student’s进行统计分析t吨-测试以确定组间差异的显著性。NS，不显著(第页 > 0.05）*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，以及***第页 < 0.001.

结果

SVSP950454在mRNA水平的转录谱

如图所示1a、 SVSP454基因主要在环状木霉分裂期，与以往研究结果一致[11,15].

图1

SVSP950454在mRNA水平的转录谱。一SVSP454在不同阶段的mRNA水平环状木霉.b条SVSP454在不同细胞培养通路中的mRNA水平环状木霉-受感染细胞

qPCR结果表明，SVSP454的转录水平从第F10代到第F165代逐渐降低环状木霉-感染细胞（图1b） ●●●●。

SVSP454在环状木霉-受感染细胞

根据CELLO v.2.5的分析结果，SVSP454被确定主要分布于环状T-感染细胞（图2). 为了进一步确认SVSP454蛋白在环状木霉-感染细胞后，进行共聚焦显微镜检测（图三). 共焦实验的结果与CELLO v.2.5的结果一致。此外，该蛋白主要分布在环状木霉-不同传代的感染细胞，包括F10、F20、F50、F110和F165。

图2

使用CELLO v.2.5的SVSP950454亚细胞定位示意图。ER代表内质网

图3

SVSP454蛋白在环状T-感染细胞。面板I至V表示SVSP454蛋白在相应细胞培养通道（F10、F20、F55、F110和F165）中的亚细胞分布环状木霉-感染细胞。面板VI和VII显示了环状木霉-感染细胞。SVSP454蛋白（第一组到第五组）和TaSP蛋白（第六组）用兔抗SVSP454TaSP多克隆抗体染色，分别以1:100的比例稀释，然后用山羊抗兔抗体结合Alexa Fluor 488以1:1000的稀释度培养细胞。以1:2000的稀释度使用Hoechst 33342标记细胞核，以1:100的稀释度用Alexa Fluor™594卵磷脂对细胞骨架进行染色。共焦显微镜观察SVSP454的亚细胞定位

诱饵质粒的构建与鉴定

SVSP454基因是从环状木霉-感染细胞。SVSP454基因ORF长度为1377bp，编码459个氨基酸，蛋白质分子量约为54kDa。然而，参考基因的ORF为1287bp，编码429aa。获得的序列与参考序列的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.9%和80.2%。此外，通过生物信息学分析确定该蛋白包含一个信号肽（1–22 aa）和一个FAINT结构域（354–432 aa），这是在SVSP家族中发现的典型区域环状木霉（图4)

图4

SMART分析SVSP454（诱饵质粒）的基因结构

诱饵质粒的自激活和毒性测定

在Y2H筛选之前，我们测定了诱饵质粒的自激活能力和毒性。结果表明，SVSP454诱饵质粒在SDO和SDO/X平板上生长的菌落大小与空载体在同一平板上培养的菌落相似（图5a） ●●●●。因此，研究结果表明诱饵质粒无毒。此外，在SDO和SDO/X平板上培养时，含有诱饵质粒的菌落的颜色为白色和猎物蓝色（图5a） 这表明诱饵质粒在Y2H筛选系统中没有自动激活。根据特定PCR结果，SVSP454的转化效率为88.89%（图5b） ●●●●。

图5

使用Y2H系统筛选与SVSP454相互作用的蛋白质。一诱饵质粒（pGBKT7-SVSP454）在Y2H Gold细胞中的自激活能力和毒性检测。b条pGBKT7-SVSP454诱饵质粒转化效率的鉴定。采用SVSP454的特异性引物，随机选择菌落并进行菌落PCR鉴定。M： DL 2000 DNA标记；1–18：菌落在带有SVSP454诱饵质粒的SDO板上生长。c（c）筛选与SVSP454诱饵质粒相互作用的假定猎物蛋白。诱饵质粒和被捕食质粒的共转化产物分别在DDO/X/A和QDO/X/A平板上生长。将SVSP950454诱饵和pGBKT7空质粒转化为Y2H Gold细胞，并在不同的平板上培养。将阴性对照（pGADT7-T和pGBKT7-Lam）质粒和阳性对照（pGA DT7-T与pGBKT_53）质粒共转化为Y2H Gold细胞，并在30°C的DDO和DDO/X/A平板上培养

Y2H筛选

我们使用Y2H系统来筛选与SVSP454相互作用的潜在蛋白质。在DDO/X/A板上培养的诱饵和猎物质粒转化体的蓝色菌落被连续挑选并在DDO/X/A和QDO/X/A板上孵育，以进一步筛选可能的蛋白质（图5c） ●●●●。通过测序分析和猎物质粒拯救鉴定了获得的潜在相互作用的猎物质粒。

推测的猎物蛋白质分析

为了鉴定与SVSP454相互作用的潜在猎物蛋白的核苷酸序列，使用特异性引物pGADT7-F/R对获得的两个猎物质粒进行了测序。核苷酸片段使用NCBI中的BLAST工具进行了分析Bos金牛座线圈域181（CCDC181，NM_001205801.1）。该序列从118到1089与CCDC181对应，编码327个氨基酸（aa）。UniProt和STRING分析[20]表明CCDC181是一种微管结合蛋白，定位于伸长精子细胞的微管manchette，在残基45-65和415-435处含有两个螺旋结构域，与微管结合功能有关。对于另一个猎物质粒，其核苷酸序列与Bos金牛座线粒体核糖体蛋白L30（MRPL30，BC_112734.1）为99.08%。后一个被捕食质粒的序列编码161 aa的完整MRPL30 CDS区域。MRPL30属于通用核糖体蛋白UL30家族，含有转运肽（1–34 aa）结构域。就其生物过程而言，如UniProt和STRING分析所示，MRPL30参与翻译和结构组成核糖体。

SVSP454及其潜在相互作用蛋白的表达和亚细胞定位

在进行Co-IP分析之前，成功获得了MYC标记SVSP454及其潜在结合蛋白（FLAG标记CCDC181和FLAG标记MRPL30）的重组质粒。然后，在HEK293T细胞中分别或成对表达MYC-标记的SVSP454、FLAG-标记的CCDC181和FLAG-标签的MRPL30（图6a、 b）。在细胞质中观察到这些蛋白的亚细胞定位。

图6

SVSP454及其猎物蛋白（CCDC181和MRPL30）在HEK293T细胞中的表达和亚细胞定位。SVSP454（4µg）及其潜在相互作用蛋白CCDC181一或成对（SVSP454（2微克）-CCDC181（2微格）和SVSP454[2微克]-MRPL30[2微格]），b条转染到HEK293T细胞，用小鼠抗MYC标记单克隆抗体或兔抗FLAG标记单抗染色，并用山羊抗小鼠Alexa Fluor 488-或驴抗兔594-结合抗体孵育。细胞核用Hoechst 33342染色

Co-IP法检测SVSP454与其猎物蛋白的相互作用

为了证实上述相互作用，我们将MYC-标记的SVSP454及其潜在的相互作用蛋白（FLAG-标记的CCDC181和FLAG-标签的MRPL30）转染到HEK293T细胞中，并证明CCDC181和MRPL30都与SVSP453相互作用，如Co-IP分析结果所示（图7a、 b）。

图7

SVSP454与CCDC181和MRPL30相互作用。共免疫沉淀（Co-IP）和免疫印迹（IB）鉴定表达SVSP454-MYC（10µg）的HEK293T细胞及其潜在的相互作用蛋白标记的CCDC181（10μg）(一)和SVSP454-MYC（10µg），以及标记有FLAG的MRPL30（10μg）(b条). WCL代表无IP的整个HEK293T细胞裂解物的IB分析

SVSP454在细胞中直接与CCDC181和MRPL30相互作用

为了进一步研究SVSP454与CCDC181和MRPL30在细胞环境中的相互作用，进行了BiFC分析，以研究SVSP45如何被其相互作用蛋白靶向。金星（VN）的N末端残基2至173（位于pBiFC-VN173中）和C末端残基154至238（VC）（位于pBiFC-VC155中）分别融合到SVSP454或CCDC181和MRPL30的C末端（图8a） ●●●●。当SVSP454-VN、SVSP454-VC、CCDC181-VN、CCDC81-VC、MRPL30-VN和MRPL30-VC在HEK293T细胞中分别表达时，流式细胞术未观察到荧光信号（图8b） ●●●●。然而，当SVSP454-VN或SVSP454-VC分别与互补的CCDC181-VC或CCDC181-VN和MRPL30-VC或MRPL30-VN配对时，检测到强荧光信号（图8c） ●●●●。

图8

SVSP454在细胞环境中与CCDC181和MRPL30结合。一BiFC分析的重组质粒构建示意图。VN和VC融合到SVSP454及其相互作用蛋白（CCDC181和MRPL30）的C末端，每个融合蛋白的N末端也包含一个FLAG或HA标签。b条如图所示，在HEK293T细胞中单独或成对表达SVSP454-VN、SVSP454-VC、CCDC181-VN、CCDC81-VC、MRPL30-VN、MRPL30-VC、SVSP4.54-VN-CCDC181-VC、SVSP45 4-VN-MRPL30-VC、SVSPS454-VC-CCDC181-VN和SVSP454-1VC-MRPL30-VN。将4微克质粒转染到HEK293T细胞中。通过流式细胞术检测BiFC荧光信号的MFI，并将其表示为相对于对照HEK293T细胞信号的MFI值。误差条表示三个独立的BiFC实验的SD。c（c）HEK293T细胞与SVSP454-VN-CCDC181-VC（4μg）、SVSP454-VN-MRPL30-VC（4μg/对）、SVSPS454-VC-CCDC181-VN（4μg.对）和SVSP454-VC-MRPL30-VN（4微克）共转染。空载体pBiFC-VN173（4μg）和pBiFC-VC155（4微克）作为阴性对照，分别转染HEK293T细胞

为了研究SVSP454-CCDC181和SVSP454-MRPL30的特异性和亚细胞共定位，通过共焦显微镜观察BiFC荧光信号。当表达对SVSP454-VN/CCDC181-VC和SVSP454-VC/MRPL30-VN时，检测到强烈的绿色BiFC荧光信号，这与流式细胞术结果一致（图8b、 c）。绿色BiFC信号与SVSP454抗FLAG或HA标记抗体的红色荧光信号共定位（图8c） 在HEK293T细胞中显示出核周亚细胞定位。这些结果表明SVSP454在细胞内与CCDC181和MRPL30相互作用。

讨论

环状泰勒虫导致牛的急性感染，给发病地区带来巨大的经济负担。它可以转化宿主细胞并导致类癌表型。一个吸引人的问题是：环状木霉分子有助于这些宿主细胞癌症特征。因此，研究环状木霉主持人提供了对环状木霉-诱导发病机制。尽管一些分子被报道影响环状木霉-通过调节宿主信号中枢诱导转化、代谢和入侵[8,9,10,21]到目前为止，有关分泌型多家族（SVSP）与宿主相互作用的相关作用的证据还没有提出。其中，SVSP454是SVSP多基因家族的成员，被用作诱饵来探索其在宿主细胞中的相互作用分子。

虽然SVSP454在分裂子、子孢子和裂殖子阶段表达环状木霉，分裂期的表达水平环状木霉是最高的（图1a） ，这与之前的结果一致[11,15]. 特别有趣的是，SVSP454的转录水平随着环状木霉-转化细胞（图1b） ●●●●。因此，我们认为它可能参与了环状木霉通过干扰一些宿主细胞蛋白质。此外，SVSP家族被怀疑与免疫逃避有关[14]. SVSP454的亚细胞分布主要在细胞核和细胞外区域环状木霉感染细胞。这些发现表明，SVSP454可能通过与宿主蛋白相互作用来执行其特定功能环状木霉裂殖体转化细胞。

对于与参考SVSP454基因只有80-88%序列一致性的最可能解释是，参考基因组是从土耳其首次分离的安卡拉C9克隆获得的[11]而我们获得的SVSP454序列是针对一个在中国新疆首次分离的寄生虫感染株系测定的。因此，在本研究中鉴定与SVSP454相互作用的宿主蛋白是很重要的。测序和BLAST分析结果表明，与SVSP454相互作用的潜在猎物质粒是来自牛的CCDC181和MRPL30。为了进一步确定SVSP454是否与Y2H系统筛选的蛋白质相互作用，进行了共免疫沉淀（Co-IP）分析，以确定SVSP45与其猎物蛋白质之间的相互作用。在进行Co-IP之前，我们构建了含有标记诱饵和猎物质粒的MYC或FLAG的重组质粒，它们在HEK293T细胞中单独或成对表达。通过共焦显微镜观察到荧光（图6). Co-IP结果表明SVSP454与CCDC181和MRPL30相互作用（图7). 此外，SVSP454-MRPL30和SVSP454-CCDC181对在活细胞中的相互作用通过BiFC分析得到证实，并且在HEK293T细胞的细胞内室中研究了相互作用对的亚细胞共定位（图8b、 c）。因此，在本研究中，通过Co-IP和BiFC分析发现SVSP454与CCDC181和MRPL30相互作用。

CCDC181是牛的线圈-线圈结构域181，是一种微管结合蛋白，在残基45-65和415-435处包含两个线圈结构域。虽然其分子功能尚不清楚，但一些研究表明，它在单倍体雄性生殖细胞中与HOOK1相互作用[22]是一个与肺腺癌进展和预后相关的甲基化驱动基因[23,24]，人乳头瘤病毒相关口咽鳞状细胞癌[25]，前列腺癌[26,27,28,29]和乳腺癌[30]. 因为环状木霉-转化的宿主细胞具有癌症标志，我们建议CCDC181可能在未来的研究中用作热带泰勒虫病的生物标记物。此外，作为一种微管结合蛋白，SVSP454和CCDC181之间的相互作用可能参与宿主细胞有丝分裂期间的微管网络动力学，这与TaSP的研究结果类似[31]和TaMISHIP[32]它们通过与CLASP1、EB1、CD2AP相互作用，调节宿主细胞骨架，形成相互作用网络。因此，本研究结果表明，SVSP454具有通过稳定CCDC181来调节宿主微管动力学的潜在功能，并具有SVSP454-CCDC181-微管轴来劫持宿主细胞进行增殖。

另一种已鉴定的蛋白质，线粒体核糖体蛋白L（MRPL30），属于通用核糖体蛋白质UL30家族。根据UniProt和STRING分析，其功能可能涉及翻译和核糖体结构。迄今为止，关于MRPL30的研究很少，但一项研究报告称它可能是2型糖尿病和肥胖的候选基因[33]. 在本研究中，我们证明SVSP454与MRPL30直接结合。虽然涉及MRPL30的生物过程尚不清楚，但我们的研究结果将为今后研究SVSP454-MRPL30相互作用如何调节宿主信号传递和寄生虫存活铺平道路。

结论

以SVSP多基因家族成员SVSP454为诱饵质粒，利用Y2H系统筛选出其捕食蛋白CCDC181和MRPL30。然后，我们通过Co-IP和BiFC分析证明SVSP454与CCDC181和MRPL30直接相互作用。因此，我们推测SVSP454-CCDC181/SVSP454MRPL30是一个相互作用的轴，通过一些重要的信号分子调节宿主的微管网络和翻译过程。然而，Y2H系统筛选只进行了一次，在我们的研究中可能会遗漏一些其他相互作用的宿主蛋白。在未来的研究中，我们将继续探索新的SVSP454相互作用蛋白。遗憾的是，关于CCDC181和MRPL30功能的报道有限，这为研究SVSP454-CCDC181和SVSP454-MRPL30相互作用的分子机制提供了很少的机会。