中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子（MANF）通过减轻Aβ诱导的内质网应激来对抗Aβ毒性

摘要

背景

淀粉样β肽（Aβ）的细胞外积聚是阿尔茨海默病（AD）的病理特征之一，并导致神经元的丢失。中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子（MANF）是内质网应激诱导的神经营养因子。许多研究小组，包括我们的研究小组，已经证明MANF可以挽救帕金森氏病和脑缺血等几种神经疾病中的神经元缺失。然而，MANF是否对AD中的Aβ神经毒性发挥保护作用尚不清楚。

方法

在本研究中，MANF在Aβ中的特征表达_1–42-通过免疫荧光染色、qPCR和Western blot分析处理后的神经细胞以及APP/PS1转基因小鼠大脑中的神经细胞。在Aβ_1–42还调查了接触情况。

结果

结果表明，APP/PS1转基因小鼠和Aβ_1–42-处理过的神经元细胞。MANF过表达或rhMANF治疗对Aβ有部分保护作用_1–42-诱导神经元细胞死亡，与裂解的caspase-3显著减少相关，而MANF敲除siRNA加重了Aβ_1–42细胞毒性包括caspase-3激活。进一步研究表明，Aβ_1–42暴露，而MANF的击倒具有相反的效果。

结论

这些发现表明，MANF可能通过减轻内质网应激对Aβ诱导的神经毒性发挥神经保护作用，这表明MANF作为AD的候选治疗药物是可行的。

背景

阿尔茨海默病（AD）是一种与衰老相关的、进行性的、临床上无法治愈的神经退行性疾病，最终导致痴呆。AD的一个典型病理特征是老年性斑块，主要由淀粉样β肽（Aβ）组成，淀粉样前体蛋白（APP）通过β-和γ-分泌酶裂解而产生[1,2,三]. 众所周知，Aβ的生成增加、齐聚和聚集是AD发病的关键因素[4,5,6]. 虽然确切的机制尚不清楚，但已经证明Aβ介导神经元细胞毒性，最终导致大量神经元丢失和变性[三,7].

最近，多项研究表明，Aβ聚集诱导神经元内质网应激，从而引发未折叠蛋白反应（UPR）[8,9]. 许多研究小组报告说，AD患者的UPR激活增加。在AD大鼠海马神经元中检测到ER应激标记物免疫球蛋白结合蛋白（BiP）/GRP78和UPR转导蛋白，如磷酸化胰腺ER激酶（p-PERK）、真核细胞起始因子2（eIF2α）、肌醇需要酶1（IRE1）和激活转录因子6（ATF6）[10,11]. 如果引发应激的时间延长，UPR可以通过激活C/EBP同源蛋白（CHOP）触发细胞死亡程序，CHOP是C/EBP家族转录调控蛋白，也称为生长停滞和DNA损伤诱导基因153（GADD153）[12]. 由于神经元对毒性Aβ高度敏感，内质网应激介导的细胞死亡可能在AD的发病机制中起重要作用。

中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子（MANF）属于神经营养因子家族的第四家族，是一组重要的分泌蛋白，在神经元发育过程中调节神经元的生死[13,14,15]. MANF及其同系物脑多巴胺神经营养因子（CDNF）已被确定用于保护和拯救帕金森病大鼠6-OHDA模型中脑多巴胺能神经元[15,16,17,18,19,20]. 更重要的是，我们之前的研究表明MANF是一种分泌蛋白，内质网应激上调了其表达和分泌[13,14]. 还发现MANF在哺乳动物组织中广泛表达，并且在疾病过程中受到不同内质网应激的不同调节[13,14,21,22,23,24,25,26]. 我们以前的研究表明，MANF可以保护缺血损伤诱导的神经元死亡[13,27,28,29]. 脑内注射重组人MANF蛋白（rhMANF）或rAAV-介导的MANF基因也可减少中风动物的脑梗死和神经细胞凋亡[29,30]. 此外，MANF的细胞保护作用不仅限于神经元，还包括心肌细胞[31]，胰腺胰岛素分泌β细胞[24,25,32,33]，视网膜细胞[26]等，提示MANF在不同病理条件下可能具有重要功能。

由于MANF能够挽救几种神经系统疾病中的神经元丢失，我们对MANF诱导的概况以及在Aβ病理学中的潜在意义感兴趣。在本研究中，我们发现APP/PS1转基因小鼠以及Aβ处理的神经元细胞中MANF和ER应激标记物BiP和CHOP的表达增加_1–42，评估MANF对Aβ神经毒性的保护作用，并探讨其潜在机制。

方法

材料和试剂

Aβ_1–42肽3-（4，5-二甲酰噻唑-2-y1）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）、衣霉素（TM）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。神经基础培养基，B27，我-谷氨酰胺、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自Gibco（美国马里兰州盖瑟斯堡）。如前所述，重组人MANF蛋白和单克隆抗MANF抗体已被描述[23,28,29].

动物

PrP-hAPP/hPS1双转基因小鼠来自中国医学科学院实验动物研究所（中国北京）。怀孕的Sprague-Dawley（SD）大鼠（SPF级）来自安徽省实验动物中心（中国合肥）。将动物置于温度（25±2°C）和光照（12小时光/暗循环）的标准条件下。动物实验程序得到安徽医科大学动物护理和动物使用伦理委员会的批准。

低聚Aβ肽的制备

Aβ_1–42将肽粉溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，最终浓度为2 mM。然后，肽在液氮中快速冷冻。使用前，将脂溶性肽在37°C下孵育1周，然后在培养基中溶解至工作浓度进行处理。电子显微镜下观察Aβ肽的结构。Aβ_1–42多肽具有直径约100nm的棒状和球状结构。

初级神经元培养

如前所述，对怀孕大鼠E17胚胎大脑皮层的初级神经元进行培养[29]. 简单地说，大鼠的胚胎被斩首，大脑半球被无菌地移入Hank的平衡盐溶液（HBSS）中。脑膜切除后，将大脑皮层切成小块，用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下消化20分钟，用巴斯德吸管轻轻吸管机械分离，然后在400 g下离心5分钟。将细胞颗粒重新悬浮在补充有2%B27和0.5 mM的神经基础培养基中我-谷氨酰胺，然后在预先涂有聚乳酸的24孔培养板上培养-我-37°C和5%CO条件下的赖氨酸₂在潮湿的空气中。原代培养的神经元在10-14天时用Aβ肽或TM处理，然后用免疫荧光染色。

细胞转染

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞和小鼠神经母细胞癌N2a细胞来自中国科学院细胞生物学研究所（中国上海）。细胞在添加10%FBS的DMEM中培养，并保持在5%CO中₂温度为37°C。MANF-Flag质粒[13]或根据制造商的说明，将MANF siRNA（5′-GGACCUC A AAGACAGAUTT-3′，上海基因制药有限公司）转染到含有Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）的N2a细胞中。转染后24小时，用Aβ处理N2a细胞_1–42（10μM）24小时或TM（2.5μg/ml）12小时。

细胞活力测定

如前所述，通过MTT试验评估细胞活力[23,34]. 简而言之，细胞被镀成96个板（1×10⁴每孔细胞数）并与Aβ孵育_1–42在37°C下持续指定时间。向每个孔中加入MTT（500μl，5 mg/ml），并在37°C下孵育4小时，然后加入100μl DMSO以溶解甲赞晶体。使用微孔板阅读器在570 nm处测量吸光度（Thermo，Varioskan Flash，芬兰）。实验重复三次，每次重复三次。

Annexin V/PI双重染色流式细胞术

为了评估细胞凋亡，根据制造商的说明，使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（中国Bestbio）用AnnexinV和碘化丙啶（PI）对细胞进行染色，并使用FACSVerse流式细胞仪（美国BD Biosciences）进行流式细胞术检测。

标记法

根据制造商的说明，使用TUNEL试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）测量细胞凋亡。在荧光显微镜下（日本东京奥林巴斯），在至少四个独立切片的五个随机选择的区域中，用盲法观察和计数TUNEL阳性细胞。

定量实时聚合酶链反应

用Trizol试剂（Invitrogen，15596018）从细胞中提取总RNA，然后进行逆转录合成cDNA。用SYBR绿定量PCR（qPCR）对基因转录物进行定量。引物如下：人类商业保险基因，正向5′-ACCTGGGTTAGTAGGGTGTG-3′和反向5′-TTGGCCTGAGT AAAGATGTG-3′；人类CHOP公司基因，正向5′-GGAGCTGGAAGCCTGG TATGA-3′和反向5′-TCCCTGTCAGGCGCTCGATT-3′；人类MANF公司基因，正向5′-TCACATTCCACCACT-3′和反向5′-CAGGTCGATCTGC TTGTCATAC-3′；人类GAPDH公司基因，正向5′-CACTCCTCCCACCTTG-3′和反向5′-CCACCCCTGTTGCTGT-3′。基因转录物的表达被标准化为GAPDH mRNA的水平。qPCR是使用ABI7500仪器（美国应用生物系统公司）进行的。

免疫组织化学

将丙酮固定的脑冷冻切片在PBS中再水化，并在0.3%的H中猝灭内源性过氧化物酶活性₂O（运行）₂在无水甲醇上放置20分钟。将切片与小鼠抗MANF抗体在4°C下孵育过夜。在PBS中清洗后，将切片与适当的生物素化二级抗体在37°C下孵育1小时。然后在37°C下用辣根过氧化物酶结合链霉亲和素（HRP-SA）培养15分钟。应用3,3-二氨基联苯胺四氢氯化物（DAB）约1-3分钟进行免疫组织化学研究。然后用苏木精对切片进行复染，在分级乙醇中脱水，在二甲苯中清除，然后在光学显微镜下观察。

免疫荧光染色

用多聚甲醛固定细胞，在含有0.5%Triton X-100和5%BSA的PBS中渗透/封闭。将细胞与以下主要抗体孵育：兔抗BiP抗体（1:500，protentech，11587-1-ap）、兔抗CHOP抗体（1:400，proteitech，15204-1-ap）或小鼠抗MANF抗体在4°C下过夜，然后在37°C下使用Alexa Fluor 488-共轭或568-共轭IgG（1:500，Invitrogen，A11029，A11036）1小时；DAPI（5mg/ml）染色细胞核。图像是在荧光显微镜下拍摄的（奥林巴斯，东京，日本），具有恒定的采集参数。大脑切片的免疫荧光染色如前所述[29]. 使用以下主要抗体：兔抗NeuN抗体（1:100，Abcam，ab177487）、兔抗BiP抗体（1:500，protentech，11587-1-ap）、兔抗CHOP抗体（1:400，proteitech，15204-1-ap）或小鼠抗MANF抗体。

蛋白质印迹

如前所述，将细胞裂解物制备用于SDS-PAGE[23,34]. 将蛋白质转移到PVDF膜上，并在室温下将其封闭在5%脱脂牛奶中1 h，然后在4°C下与以下主要抗体孵育过夜：兔抗MANF抗体（1:1000，Abcam，ab67271），兔抗BiP抗体（1:100，protentech，11587-1-ap），兔抗CHOP抗体（1:1000，protentech，15204-1-AP），兔抗磷酸化eIF2α抗体s） 、兔抗ATF6抗体（1:1000，Proteintech，24169-1-AP）、兔抗裂解酶3抗体（1:11000，CST，9664S）、鼠抗α-微管蛋白（1:1000、sigma，t6199）和兔抗GAPDH（1:1000；Elabscience，E-AB-20059）。在TBST中洗涤多次后，将膜与辣根过氧化物酶结合的次级IgG孵育1h。使用增强化学发光试剂盒（美国新泽西州Amersham Biosciences）开发印迹剂。使用ImageJ软件进行密度分析。

统计分析

数据表示为来自至少三个独立实验的平均值±SD，并使用Tukey事后检验的单向方差分析（ANOVA）进行分析。值为第页小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

Aβ_1–42神经元细胞活性下降与凋亡诱导

用不同浓度的Aβ处理SH-SY5Y细胞_1–42（2.5、5、10、20和40μM）或10μM Aβ_1–42不同时间（2、4、8和16小时）。MTT结果显示Aβ_1–42以剂量和时间依赖的方式抑制细胞活力（图1a、 b）。TUNEL染色用于区分凋亡细胞和存活细胞。Aβ_1–42TUNEL阳性细胞的百分比显著增加，尤其是在20和40μM时（图1c、 d）。采用Annexin V/PI双重染色的流式细胞术也证实了Aβ治疗_1–42剂量依赖性地增加了凋亡细胞的数量（图1e、 f）。一直以来，Aβ显著诱导裂解caspase-3蛋白的水平_1–42或ER应激诱导剂TM（2.5μg/ml）处理（图2d、 e）。这些结果表明Aβ_1–42降低神经元细胞活力并诱导细胞凋亡。

图1

Aβ_1–42降低人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的细胞活力并诱导细胞凋亡。MTT分析显示aβ后SH-SY5Y细胞的活性显著下降_1–42剂量照射(一)和时间相关(b条)方式*对 < 0.05, **对 < 与对照组相比为0.01。c（c）SH-SY5Y细胞与含有10%FBS的DMEM、无血清DMEM或含有不同浓度Aβ_1–42（5、10、20和40μM）分别持续24小时。TUNEL染色（绿色）检测凋亡细胞。DAPI用于测定粗核数。比例尺=50μm。d日TUNEL阳性细胞数量的定量分析c（c）. *对 < 0.05, **对 < 0.01，与无血清组相比。e（电子）利用Annexin V/PI染色进行的FACS分析显示，不同浓度的Aβ处理后SH-SY5Y细胞凋亡增加_1–42与无血清组比较24h。（f）对大肠杆菌中凋亡细胞数量的定量分析*对 < 0.05, **对 < 0.01，与无血清组相比。所有定量数据均表示为至少三个独立实验的平均值±SD。秒（−）无血清，控制器控制

图2

Aβ_1–42诱导SH-SY5Y细胞内质网应激和MANF表达上调。一SH-SY5Y细胞与含有10%FBS的DMEM、无血清DMEM和含有Aβ_1–42（10μM）24小时，或含膜霉素（TM）的DMEM（2.5μg/ml）12小时。细胞核用DAPI（蓝色）染色。放大后的图像分别显示MANF和BiP的表达和细胞分布。比例尺=10μm。b条与10%FBS、无血清DMEM和含有Aβ的DMEM孵育的SH-SY5Y细胞的MANF（红色）和CHOP（绿色）免疫荧光标记的代表性图像_1–42（10μM）持续24小时，或含有TM（2.5μg/ml）的DMEM持续12小时。放大的图像分别显示了MANF和CHOP的表达和细胞分布。比例尺=10μm。c（c）定量MANF公司,商业保险、和CHOP公司含有10%FBS的DMEM、无血清DMEM和含有Aβ_1–42（10μM）持续24小时，或含有TM（2.5μg/ml）的DMEM持续12小时。GAPDH公司用作对照。d日如图所示，SH-SY5Y细胞中MANF、BiP、CHOP和裂解caspase-3的蛋白水平。α-微管蛋白作为负荷对照。e（电子）通过密度测定法对d中归一化为α-微管蛋白的蛋白质水平进行定量。所有定量数据均表示为至少三个独立实验的平均值±SD*对 < 0.05, **对 < 0.01.C类-半胱氨酸天冬氨酸酶-三裂解半胱天冬酶-3，TM（TM）衣霉素

Aβ_1–42诱导内质网应激并上调神经元MANF表达

澄清Aβ_1–42治疗导致神经细胞内质网应激，即已知由内质网胁迫诱导的内质网伴侣BiP水平[35]用免疫荧光染色和WB法检测SY5Y细胞中的。与对照组或无血清组BiP的弱表达不同，在Aβ中检测到BiP的荧光信号显著增加_1–42-处理过的细胞以及经TM-处理的细胞（图2a、 放大面板）。CHOP是一种应激诱导核蛋白[36]，通常用作内质网应激诱导细胞凋亡的标志物[37]. 免疫荧光染色显示CHOP免疫反应性显著增强，aβ核定位明显_1–42-处理过的细胞（图2b、 放大面板）。在用TM处理的SY5Y细胞中也观察到类似的结果（图2b、 放大面板）。与无血清组相比，Aβ中BiP和CHOP的mRNA和蛋白水平显著升高_1–42-处理过的SY5Y细胞以及TM-处理过的细胞（图2c–e）。经Aβ处理的原代培养神经元中也显示BiP和CHOP的免疫反应增强（附加文件1：图S1）。这些结果表明Aβ_1–42诱导神经细胞内质网应激。

早期研究表明，MANF是一种内质网应激敏感蛋白[13]，所以我们想知道Aβ暴露是否可以上调MANF表达。在对照细胞中发现少量MANF，在细胞质中呈弥散分布，而在Aβ处理的细胞中MANF的免疫反应性明显增强_1–42以及在TM处理的细胞中（图2a、 b），这与我们在原培养神经元中的数据一致（附加文件1：图S1）。此外，Aβ和TM诱导的MANF表达均为核周分布（图2a、 和b，放大面板）。我们还发现Aβ中MANF的蛋白和mRNA水平_1–42-处理后的细胞比无血清组的细胞高很多（图2c–e）。这些结果表明，Aβ暴露上调了神经元中MANF的表达。

APP/PS1双转基因小鼠脑内质网应激和MANF表达

为了进一步证实Aβ病理学与MANF增加之间的关系，我们观察了MANF在野生型或APP/PS1双转基因小鼠大脑中的表达特征，这些小鼠在大脑中表现出显著的β-淀粉样蛋白沉积（附加文件2：图S2）。研究发现，在年龄匹配的WT小鼠的许多脑区都可以检测到MANF，包括海马（图三（a，a1，a2）和皮层（图三（c，c1，c2），但染色较弱。相反，海马中MANF的免疫反应性显著增强（图三（b，b1，b2，b3）和皮层（图三（d，d1，d2，d3））。为了进一步研究MANF阳性细胞的亚群，我们用针对MANF和NeuN（一种神经元特异性核蛋白）的抗体进行了双重免疫荧光染色。我们发现MANF主要在神经元中表达，尽管一些NeuN阴性细胞也表现出MANF阳性免疫反应。（图三（f，g）），Western blot如图所示三（e） 还证实，与年龄和性别匹配的WT小鼠相比，APP/PS1小鼠的大脑中MANF水平显著增加，尤其是在6个月大的APP/PS1小鼠中。此外，与WT小鼠相比，APP/PS1小鼠的BiP-或CHOP阳性细胞主要分布在皮层和海马中（附加文件三：图S3）。上述结果表明，在APP/PS1转基因小鼠的大脑中诱导了内质网应激和MANF表达。

图3

APP/PS1转基因小鼠大脑中MANF的表达。6月龄WT小鼠（a，c）和APP/PS1小鼠（b，d）海马（a，b）和皮层（c，d）MANF的DAB染色。注意到与WT小鼠（a1，c1）相比，APP/PS1小鼠（b1，d1）大脑中MANF表达上调。面板a2和c2分别是a1和c1中的放大图像。面板b2、b3和面板d2、d3分别是b1和d1的放大图像（红色箭头所示），以显示海马和皮层中MANF的细胞分布。比例尺=100μm（a–d）或20μm（a1、a2、b1、b2、b3、c1、c2、d1、d2和d3）。（e） 4个月龄和6个月龄雄性APP/PS1小鼠以及年龄和性别匹配的野生型（WT）小鼠的海马和皮层中MANF的水平。右侧面板显示了MANF水平的定量分析。数据以平均值±SD表示，每组使用四只小鼠*对 < 0.05, **对 < 0.01. （f） APP/PS1转基因小鼠大脑皮层中MANF（红色）和NeuN（绿色）免疫荧光标记的代表性图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。（g） f中的放大图像显示MANF和NeuN的共定位。比例尺=10μm。米月份，重量野生型

MANF对神经细胞抗Aβ毒性的保护作用

我们发现，Aβ在神经元细胞系和培养的原代神经元中诱导MANF表达。因此，我们假设MANF的诱导在神经元遭受诸如Aβ暴露等侮辱时对其具有保护作用。为了证明这一点，我们评估了MANF对Aβ诱导的神经元细胞活性的影响_1–42在N2a细胞中敲除或过度表达后，减少或增加MANF表达（图4a） ●●●●。研究发现，MANF过度表达可使细胞免受10μM Aβ的毒性作用_1–42在一定程度上与载体转染细胞相比（图4b） ●●●●。相反，与NC siRNA转染的细胞相比，用siRNA敲低内源性MANF进一步增强了Aβ毒性（图4c） ●●●●。TUNEL染色还显示，与NC-siRNA转染细胞相比，在Aβ暴露下，MANF基因敲除显著增加了TUNEL阳性细胞的数量，而MANF过度表达则具有相反的效果（图4d、 e）。Western blotting显示Aβ后MANF击倒细胞中CHOP和裂解caspase-3水平显著升高_1–42这进一步证实了MANF对Aβ诱导的神经毒性的保护作用_1–42（图4f） 。更有趣的是，我们注意到MANF敲除也略微增加了TUNEL阳性细胞的数量和CHOP水平，即使在缺乏Aβ的情况下_1–42与NC-siRNA转染细胞相比（图4d–f），表明即使在生理条件下，MANF对神经元的存活也是不可或缺的。

图4

MANF对Aβ有保护作用_1–42-诱导细胞毒性。一转染MANF-Flag质粒或MANF-siRNA的N2a细胞中MANF水平。b条MANF过度表达增加Aβ细胞的活性_1–42-处理细胞与pcDNA3.1载体转染细胞进行比较。用pcDNA3.1载体或MANF-Flag质粒转染N2a细胞。转染后24小时，用Aβ处理细胞_1–42（10μM），用于指定的时间，并用于MTT分析*对 < 0.05，与相应时间点的载体转染细胞相比。c（c）内源性MANF敲除对Aβ易损性的影响_1–42（10μM）对N2a细胞的细胞毒性。用NC siRNA或有效的MANF siRNA转染N2a细胞。转染24小时后，用Aβ处理细胞_1–42（10μM），用于指定的时间，并用于MTT分析*对 < 0.05，与相应时间点的NC-siRNA-转染细胞相比。d日MANF对Aβ诱导的细胞凋亡的影响_1–42N2a细胞瞬时转染MANF-Flag或MANF-siRNA，然后用Aβ_1–42（10μM）再持续24小时。TUNEL染色检测凋亡细胞。细胞核用DAPI染色。比例尺=100μm。e（电子）TUNEL阳性细胞数量的定量分析d日从每组四个部分的五个随机选择的区域中对TUNEL阳性细胞进行计数*对 < 0.05, **对 < 0.01.（f）在Aβ中测定CHOP和裂解caspase-3的蛋白水平_1–42-用MANF-Flag或MANF-siRNA转染处理过的N2a细胞。GAPDH作为负荷对照。所有定量数据均表示为三个独立实验的平均值±标准差

我们早些时候报道了缺血性脑中分泌MANF的功能[28,38,39]. 为了进一步评估分泌型MANF是否对aβ毒性具有神经保护作用，我们评估了重组人MANF蛋白（rhMANF）对aβ_1–42-诱导细胞毒性。如前所述，表达并纯化重组人MANF[29]. 在Aβ之前，用不同浓度的rhMANF（0.5、1和2 mg/ml）预处理SH-SY5Y细胞4 h_1–42治疗。Aβ治疗后24小时_1–42（10μM），用MTT法测定细胞活力。发现rhMANF逆转了Aβ诱导的细胞活力下降_1–42剂量为2 mg/ml（图5a） ●●●●。如图所示5b、 与仅在Aβ中相比，2 mg/ml剂量的rhMANF在不同时间点显著提高了细胞活力_1–42-在没有rhMANF的情况下处理细胞。裂解的胱天蛋白酶-3的水平也随着rhMANF处理而降低（图5c、 d）。这些结果证实了rhMANF对Aβ细胞毒性的保护作用。

图5

重组人MANF蛋白（rhMANF）对Aβ的保护作用_1–42-诱导细胞毒性。一在Aβ存在下rhMANF对细胞活力的剂量依赖性影响_1–42暴露。在Aβ_1–42（10μM）处理额外24小时，并处理用于MTT分析*对 < 0.05，与仅用Aβ处理的细胞相比_1–42.b条在Aβ存在下rhMANF对细胞活性的影响_1–42SH-SY5Y在Aβ_1–42（10μM）处理指定时间并处理用于MTT分析*对 < 0.05，与仅Aβ相比_1–42-在指定的时间点处理细胞。c（c）用Aβ_1–42（10μM），使用或不使用rhMANF 24小时。GAPDH被用作负荷控制。d日指示蛋白质的密度定量标准化为c*对 < 0.05, **对 < 0.01，与仅用Aβ处理的细胞相比_1–42.^#对 < 0.05,^##对 < 0.01,^###对 < 0.001，与对照组比较。所有定量数据均表示为平均值+至少三个独立实验的SD。C类-半胱氨酸天冬氨酸酶-三裂解半胱天冬酶-3

MANF对Aβ有保护作用_1–42通过减弱内质网应激产生的毒性

先前的研究表明，MANF通过调节脑缺血模型中的UPR相关基因来保护ER应激诱导的细胞死亡[28,29]. 我们想知道MANF是否通过减轻内质网应激来减轻Aβ诱导的毒性。为了验证这一假设，将MANF-Flag质粒或MANF-siRNA转染到N2a细胞中，分别过度表达或击倒内源性MANF。我们发现，MANF过度表达显著降低了内质网应激相关分子的水平，如Aβ中的BiP、ATF6、磷酸化IRE1、剪接XBP1（XBP1s）、磷酸化eIF2α、ATF4和CHOP_1–42-处理后的细胞与载体转染细胞中的细胞进行比较（图6a、 c，第6车道vs第5车道）。同样，Aβ诱导MANF-Flag转染细胞凋亡标记裂解caspase-3的水平也降低_1–42曝光（图6a、 c，第6车道对第5车道）。相反，与NC-siRNA转染细胞相比，MANF敲除上调了BiP、ATF6、磷酸-IRE1、XBP1s、磷酸-eIF2α、ATF4、CHOP和裂解caspase-3的表达（图6b、 d，第6车道对第5车道）。我们还发现，MANF降低了TM诱导的这些UPR-相关蛋白的水平（图6a–d，9号车道vs 8号车道）。这些结果表明，MANF通过抑制UPR信号通路的激活来减轻Aβ诱导的内质网应激，这可能有助于神经元保护。

图6

MANF对Aβ有保护作用_1–42通过抑制内质网应激产生毒性。一MANF过度表达对Aβ中BiP、ATF6、磷酸化IRE1、XBP1s、磷酸化eIF2α、ATF4、CHOP和裂解caspase-3水平的影响_1–42-处理过的细胞。在Aβ前用pcDNA3.1-MANF-Flag质粒及其空载体转染N2a细胞_1–42（10μM）处理24小时或TM（2.5μg/ml）处理12小时并处理WB。b条MANF敲除对Aβ中BiP、ATF6、磷酸化IRE1、XBP1s、磷酸化eIF2α、ATF4、CHOP和裂解caspase-3水平的影响_1–42-处理过的细胞。在Aβ前用NC-siRNA或MANF-siRNA转染N2a细胞_1–42（10μM）处理24小时或TM（2.5μg/ml）处理12小时，然后处理WB。c（c）α-微管蛋白水平的蛋白质定量。d日标准化α-微管蛋白水平的蛋白质定量b条所有定量数据均表示为至少三个独立实验的平均值±SD*对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.01.TM（TM）衣霉素，C类-半胱氨酸天冬氨酸酶-三裂解半胱天冬酶-3

更有趣的是，MANF敲低在一定程度上增加了BiP水平，尽管在MANF-Flag转染的细胞和载体转染的细胞之间没有观察到BiP表达的显著差异（图6a–d，车道2对车道3）。此外，在缺乏Aβ的MANF敲除细胞中，还发现ATF6、磷酸化IRE1、磷酸化eIF2α、ATF4和CHOP水平降低_1–42或TM（图6b、 通道2与通道3），表明MANF可能缓解内质网应激，以维持生理条件下的细胞内环境稳定。

为了阐明rhMANF对Aβ诱导的内质网应激是否有类似的作用，我们用Western blot法测定了与rhMANF和Aβ孵育的SY5Y细胞中的UPR相关蛋白_1–42发现2 mg/ml rhMANF以剂量依赖性方式降低了aβ_1–42-处理过的细胞（图5c、 d），表明rhMANF也可以减轻Aβ诱导的内质网应激。

讨论

在本研究中，我们证明了MANF在保护神经细胞免受Aβ诱导的毒性中的作用。我们在这里表明，暴露于Aβ的培养神经元细胞中MANF表达上调_1–42以及APP/PS1小鼠的大脑中。MANF或rhMANF治疗的过度表达对Aβ有保护作用_1–42-诱导N2a细胞和SH-SY5Y细胞死亡，而MANF基因敲除加重了Aβ细胞毒性。此外，MANF对Aβ的神经保护作用_1–42-诱导的细胞毒性与抑制内质网应激有关，其表现为抑制UPR信号级联、CHOP表达减少和caspase-3裂解。这些结果表明，MANF可能是治疗AD的一个可行的治疗靶点。

据报道，Aβ诱导内质网应激导致神经元凋亡，并最终参与AD的发病机制[40,41,42]. 在本研究中，我们发现Aβ_1–42剂量和时间依赖性降低细胞活力，增加细胞凋亡。进一步研究表明，在Aβ暴露下，原代培养的大鼠神经元和SH-SY5Y细胞中UPR相关蛋白的表达上调，包括BiP、ATF6、磷酸化IRE1、XBP1s、磷酸化eIF2α、ATF4和CHOP。这些结果表明Aβ_1–42诱导ER应激，从而介导神经元细胞凋亡。虽然内质网应激介导的Aβ神经毒性的分子机制仍不清楚，但许多研究证实，Aβ触发神经元中的UPR，伴随着BiP和PERK-eIF2a通路等保护性通路的激活，以及CHOP和caspase-4等UPR的凋亡通路的激活[43].

我们之前的研究已经确定MANF是12个常见UPR上调基因中的一个，ER应激诱导剂TM在原代培养神经元中诱导了MANF的表达[13]. 哺乳动物MANF启动子包含内质网应激反应元件ERSE和ERSEII，它们对于XBP1和ATF6结合导致MANF表达上调以响应内质网胁迫很重要[14,22,44,45]. 在本研究中，Aβ_1–42治疗显著增加了XBP1s和ATF6的表达，这至少部分有助于MANF的上调，随后其他UPR相关蛋白的表达增加。与我们在培养的带有Aβ的神经元细胞中的结果一致，与年龄和性别匹配的野生型小鼠相比，APP/PS1小鼠中MANF的表达也显著上调，尤其是在6个月大的APP/PS1小鼠中，这表明MANF表达的增加与AD的严重程度相关。但4月龄和6月龄野生型小鼠的MANF水平没有差异，这表明衰老不可能是MANF上调的原因。同时，我们发现MANF主要表达在APP/PS1小鼠脑内的神经元中，这与大鼠缺血模型中MANF表达的特点相一致[27,29]. 虽然一些NeuN阴性细胞也表现出MANF免疫反应，但MANF在这些细胞中的作用仍需进一步研究。此外，我们注意到MANF、BiP和CHOP的免疫反应性较弱，并在没有Aβ的SY5Y细胞的细胞质中扩散_1–42然而，在Aβ处理的大多数细胞中观察到核周MANF免疫阳性信号增加_1–42或TM以及APP/PS1小鼠大脑中。同时，我们发现Aβ处理的细胞胞浆中BiP的免疫反应显著上调，CHOP的核转位显著上调_1–42或TM，这意味着UPR激活。MANF在不同病理状态下的细胞分布可能是一个有趣的问题。我们以前的研究表明，MANF主要定位于TM-处理细胞的核旁区域，并证明其定位于内质网和高尔基体[13]. 相反，由脑缺血刺激诱导的MANF与DAPI没有重叠，这表明MANF定位于胞浆中，而局部缺血并未诱导其重新定位[29]然而，在少数经TM或LPS处理的原代培养的成纤维样滑膜细胞以及抗原诱导的关节炎兔模型的滑膜组织中观察到核MANF免疫阳性信号[23]. MANF在不同病理状态下呈现不同细胞分布的原因值得进一步研究。

MANF是神经营养因子家族的一个新成员，已证明其在内质网应激期间上调，并在体内或体外保护多个细胞群体免受内质网胁迫诱导的细胞死亡[13,19,31,46]尤其是PD和脑缺血[19,47,48]. 在本研究中，我们发现MANF的过度表达减弱了Aβ_1–42-诱导神经细胞死亡，而MANF基因敲除加重了Aβ_1–42神经毒性。MANF是否直接参与普遍定期审议的调节，从而在细胞保护中发挥关键作用，目前尚不清楚。先前的研究报道，MANF可能促进内质网中半胱氨酸桥的形成和蛋白质折叠，从而减少因未折叠或错误折叠蛋白质的积累而引起的内质网应激[49]. 最方便和直接的证据是胰腺特异性Manf^−/−由于β细胞质量的逐渐减少和UPR（包括拼接的Xbp1和Chop mRNA）的激活，小鼠发展为严重的胰岛素依赖性糖尿病，这意味着MANF缺乏可能导致未解决内质网应激后UPR的激活[32]. 我们之前的研究还表明，脑室内注射rhMANF可以降低局灶性脑缺血诱导的BiP/Grp78、phosp-IRE1和XBP1s的升高水平，但不影响CHOP的表达[28]. 另一种神经营养因子——胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）通过脑室注射Aβ可阻止CHOP移位到兔脑细胞核[50]. 在本研究中，我们观察到与载体转染细胞相比，MANF过表达细胞中UPR相关分子BiP、ATF6、磷酸化IRE1、XBP1s、磷酸化eIF2α、ATF4、CHOP和凋亡标记裂解caspase-3的水平不同程度地降低，而MANF敲除进一步增加了这些UPR相关蛋白，这表明MANF通过抑制UPR信号激活减轻Aβ诱导的内质网应激，从而导致CHOP和caspase-3裂解减少。此外，我们目前的数据显示，所有三个UPR传感器都在一定程度上被Aβ激活，因为CHOP不仅是ATF4的转录靶点，而且也是XBP-1和ATF6的转录靶，这在所有三个分支之间提供了明显的可能联系[51,52]Aβ病理学中的哪条通路是CHOP诱导和神经元死亡的主要原因需要进一步探索。

另一方面，晶体结构分析表明，MANF的C末端结构域（C-MANF）与Ku70蛋白的SAP结构域具有最高的结构同源性，Ku70蛋白是一种众所周知的促凋亡Bcl-2-相关X蛋白（Bax）抑制剂[53]. 细胞研究证实了这一点，即MANF与Ku70一样有效地保护神经元[53,54]. 基于此，我们不能排除MANF的直接抗凋亡活性部分有助于其对Aβ神经毒性的保护作用的可能性。

最重要的是，据报道，MANF既是一种分泌性神经营养因子，又是一种细胞内蛋白[55]. 先前的研究表明，MANF在脑缺血和心肌缺血中具有基于分泌的保护作用[27,28,29]. 相反，当rhMANF直接添加到培养的新生小鼠SCG神经元的培养液中时，未观察到对Bax依赖性凋亡的保护作用[53]. 虽然rhMANF通常用于分泌型MANF蛋白功能的研究，但体内和体外实验采用不同浓度的rhMANF-，这取决于不同类型的细胞或疾病模型[23,24,26,28,29,30,31,38,39,48,56,57,58]. 在这里，我们在初步实验中尝试了几种浓度的rhMANF，最后我们发现0.5、1和2 mg/ml的rhMANF浓度足以防止Aβ诱导的神经毒性并缓解内质网应激。迄今为止，虽然蛋白激酶C（PKC）信号在MANF下游被激活，但MANF的信号转导受体尚未确定[58]. 因此，MANF是否以及如何以专制/旁分泌的方式行事需要更多的研究。

结论

MANF通过减轻Aβ诱导的内质网应激来对抗Aβ毒性，这可能是包括AD在内的病理性内质网胁迫相关神经退行性疾病的潜在靶点之一。