大脑中动脉闭塞和光血栓中风模型晚期脑缺血时淋巴细胞的浸润和持久性

摘要

背景

有证据表明，淋巴细胞在脑内的浸润有助于脑缺血后的急性神经损伤。然而，脑缺血后晚期脑过滤淋巴细胞的时空动态尚不清楚。

方法

C57BL/6（B6）小鼠接受假手术、光血栓形成或60分钟短暂大脑中动脉闭塞（MCAO）手术。评估梗塞体积、神经系统缺陷、活性氧（ROS）和炎症因子的产生、脑浸润淋巴细胞及其活化以及促炎细胞因子IFN-γ的产生。用免疫染色法检测了缺血性卒中患者死后组织切片中的脑浸润淋巴细胞。

结果

在遭受短暂性MCAO或光血栓中风的小鼠中，我们发现缺血大脑中的淋巴细胞浸润持续到手术后至少14天，在此期间，脑梗塞体积显著减少。这些脑过滤淋巴细胞表达活化标记CD69，并产生前炎症细胞因子，如IFN-γ，伴随着活性氧（ROS）的持续增加和大脑中炎症细胞因子的释放。此外，在缺血性卒中晚期患者的尸检脑切片中观察到脑过滤淋巴细胞。

结论

我们的结果表明，脑缺血急性期后，淋巴细胞的脑内渗滤持续存在，有助于进一步研究揭示淋巴细胞在中风晚期的确切作用。

背景

浸润缺血性脑区的外周血淋巴细胞参与炎症反应，催化神经元死亡，恶化急性缺血性卒中（AIS）的临床结局[1,2,三]. 此前的研究主要关注脑缺血急性期（即发病后数小时至数天）脑过滤淋巴细胞的动力学和功能[4,5,6,7,8,9,10]. 在急性缺血性卒中中，大多数浸润性淋巴细胞亚群会损害神经结构并加重卒中结局[11,12,13,14,15]. 例如γδT、CD8⁺T、 NK细胞在中风发作后导致急性脑损伤[16,17]据报道，调节性T细胞和B细胞具有保护作用[18]. 然而，对于脑缺血后期脑过滤淋巴细胞的存在和功能状态知之甚少。

短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）和光血栓缺血是两种常用的研究中风神经炎症的小鼠模型。虽然在这两种模型的缺血早期，缺血后炎症和损伤已经有很好的记录，但在后期，细胞免疫反应的特征尚未得到充分研究。

在这项研究中，我们测定了小鼠在光血栓形成和MCAO后14天内的脑过滤淋巴细胞的动力学、活化和细胞因子生成情况，在此期间，脑梗塞体积显著减少，并与缺血性卒中患者死后的人类脑组织相结合。我们的结果表明，脑缺血后，淋巴细胞反应至少可以在大脑中持续数周。

方法

小鼠

外螺纹C57BL/6（B6、H2^b条)小鼠和Rag2^−/−γc^−/−小鼠（H2^b条)从Taconic（美国加利福尼亚州Oxnard）购买。突变小鼠回交至B6背景至少12代。小鼠保持在特定的无致病条件下，并在10-12周龄时使用。它们被安置在标准的明暗循环条件下，每个笼子不超过五只动物，可以随意获得食物和水。在所有实验中，使用了年龄匹配的同窝雄性。所有动物实验均按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。所有程序均由巴罗神经研究所和天津神经研究所动物护理和使用委员会批准。

大脑中动脉短暂闭塞术

如前所述，成年雄性10至12周龄小鼠受到大脑中动脉（MCAO）短暂腔内闭塞引起的60分钟局灶性脑缺血[19,20,21,22,23]. MCAO在吸入3.5%异氟醚诱导的麻醉下进行，并通过吸入1.0-2.0%异氟烷维持在70%N₂O和30%O₂。在整个手术过程中，使用直肠探头监测体温，并使用加热垫将体温保持在37.0±0.5°C（Sunbeam，Neosho，MO，USA）。在MCAO前后以及再灌注前后立即使用激光多普勒探头（型号P10，Moor Instruments，Wilmington，DE，USA）监测脑血流5分钟。用6–0尼龙制成的圆形单丝通过阻断大脑中动脉诱导局灶性脑缺血60分钟。MCAO 60分钟后，将闭塞丝轻轻抽出至颈总动脉，以允许再灌注。小鼠死亡或闭塞期间或再灌注10分钟后的脑血流（CBF）不满意时被排除在外。研究中使用了在整个缺血期间残留CBF小于缺血前水平20%，且在再灌注后10分钟内CBF恢复>80%的小鼠。假手术小鼠也接受了相同的手术程序，但灯丝的前移不足以阻塞大脑中动脉。7T-MRI用于确定MCAO后1-14天的梗死体积[19]. 在MCAO模型中，死亡率为13.4%（97例患者中的13例），排除率为18.5%（97例中有13例为不充分再灌注，97例中5例为mNSS评分系统设定的标准限制）。

光血栓卒中程序

如前所述进行了光血栓闭塞[24]. 通过吸入3.5%异氟醚对接受光血栓手术的小鼠进行麻醉，并通过吸入1.0-2.0%异氟烷（70%N）维持麻醉₂O和30%O₂照明前5分钟，用150 mg/kg的孟加拉玫瑰（美国密苏里州圣路易斯Sigma Aldrich）腹腔注射小鼠。接受孟加拉玫瑰红后，将小鼠置于立体定向仪中（美国伊利诺伊州伍德戴尔市斯托尔廷公司）。发现了脑桥，并将直径为4毫米的光纤电缆末端放置在头骨顶部，以脑桥为中心，并在脑桥外侧约2毫米处。在注射Rose Bengal溶液五分钟后，打开带有绿色带通滤波器的冷光源（Schott KL 1600 LED，Elmsford，NY，USA）（Thor Labs，Newton，NJ，USA），并照射头骨20分钟。一旦照射该区域20分钟，将小鼠从立体定向仪中取出，缝合切口并消毒。假手术小鼠接受相同的手术程序，但不注射孟加拉玫瑰。小鼠在死亡或不满意的改良神经系统严重程度评分时被排除在外[排除光血栓形成后24小时（治疗前）mNSS评分<6或高于13分]。在光血栓中风模型中，死亡率为6%（总84分中的5分），排除率为8.3%（总84份mNSS评分中的7分）。

行为评估

如我们之前描述和发表的报告所述，在缺血性卒中后第1、3、7和14天进行行为测试[19,20,25,26,27,28]. 改良神经严重度评分（mNSS）测试包括运动、感觉、反射和平衡评估。评分标准如下：分数为13-18表示严重受伤，7-12表示中度受伤，1-6表示轻度受伤。手术结束后，每只小鼠在中风恢复后进行0到18分的评分。手术后24小时（治疗前）得分<6分或高于13分的小鼠未被纳入研究。在所有实验中，由于mNSS评分系统的标准限制，排除了12只小鼠。

在去除粘连试验中，在缺血半球对侧前肢上贴上一块0.35×0.45 cm的粘连贴片[29]. 然后把老鼠放进笼子里。记录接触和去除胶带所需的时间，时间限制为120秒。转角测试用于评估感觉运动和姿势不对称[30]. 所有受试小鼠都被允许进入一个30°角的角落，这需要受试者向左或向右转弯才能离开角落。这被重复并记录了十次，两次试验之间至少有30秒，并计算了右转弯占总转弯数的百分比。如前所述，用前肢放置试验评估小鼠对前肢前移引起的触须刺激的反应能力[22]. 简单地说，用鼻子抱着的动物被放置在与桌面平行的位置上，然后缓慢地上下移动，让头部一侧的触须沿着桌面擦过。对受损（左）前肢的难治性放置进行评估，并根据10个连续试验中成功放置前肢的次数计算得分。按照之前的报告进行了旋转试验[31]. 将假手术组或中风组的小鼠置于加速旋转杆上。在5分钟内，速度从4 rpm增加到40 rpm（加速率增加到20 rpm/min）。每天对小鼠进行三次测试，两次测试间隔至少5分钟。失明的研究人员记录了从旋转杆上落下的潜伏期[31].

神经影像学

正如我们之前描述的那样，使用7T小动物MRI（Bruker Daltonics Inc.，Billerica，MA，USA）评估两种缺血性中风模型的梗死面积，MRI使用72 mm线性发射线圈和小鼠表面接收器线圈进行小鼠脑成像[19,32]. 小鼠通过吸入3.5%异氟醚进行麻醉，并通过吸入1.0-2.0%异氟烷维持麻醉状态₂O和30%O₂戴着口罩。在MRI扫描期间（每只小鼠10分钟），动物的呼吸由一个小型动物监测和门控系统（SA Instruments，Stoney Brook，NY，USA）通过位于腹部下方的枕头传感器持续监测。将小鼠置于加热循环水毯上（马萨诸塞州比勒里卡市布鲁克），以保持正常体温（36-37°C）。脂肪抑制快速采集放松增强序列（RARE）脑轴位二维多层T2加权图像（TR=4000 ms，有效TE=60 ms，平均数=4，FOV=19.2 mm×19.2 mm，矩阵大小=192×192）。使用多层梯度回波序列（MGE，TR=120ms，回波时间=3.0，6.0，9.0，12.0，15.0，18.0，21.0，24.0，27.0，30.0 ms，视野=35.0×35.0 mm，矩阵=128×128，层厚=1.0 mm，翻转角度80°）获取10个梯度回波用于T2*成像。使用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）分析MRI数据。

使用Xenogen IVIS200成像仪（Caliper LifeSciences，Hopkinton，MA，USA）采集活体生物发光图像以检测大脑中活性氧（ROS）的生成[19,32,33]. 如我们和其他人之前所述，使用鲁米诺评估ROS生成[22,23,26,33]. 简言之，小鼠腹腔注射200mg/kg鲁米诺（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。注射鲁米诺后10分钟，拍摄生物发光图像。使用感兴趣区域工具定义和测量大脑内的化学发光强度。数据以每秒每厘米光子数的形式收集²使用Living Image软件（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA）。

细胞分离、标记和被动转移

如前所述，使用红细胞裂解缓冲液（BD Biosciences）分离C57BL/6小鼠的脾细胞[19,34]. 对于SPIO-Molday ION罗丹明-B（MIRB）标记试验，使用流式细胞仪对淋巴细胞进行分类，并在含有10%FBS的RPMI培养基（美国纽约州格兰德岛英威特罗根）中，以25μg/ml的浓度与MIRB（美国马萨诸塞州伍斯特生物物理检测实验室）进行培养，我-5%CO下的谷氨酰胺（2 mM）、IL-2（10μg/ml）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（0.1 mg/ml）₂/37°C，如前所述[20]. MIRB培养24小时后，离心细胞（400 g，持续5分钟）并用PBS洗涤两次，以去除细胞外MIRB。进一步，2×10⁷然后通过尾静脉将200μl PBS中的MIRB标记淋巴细胞注入Rag2^−/−γc^−/−受体小鼠。转移后，Rag2^−/−γc^−/−受体接受假手术、60分钟MCAO或光血栓形成手术。

流式细胞术

如前所述，用于FACS评估的淋巴细胞是从脾脏或大脑中分离出来的[19,32,34]. 简而言之，使用红细胞裂解缓冲液（BD Biosciences）分离脾细胞。对于大脑单核细胞分离，在灌注冷PBS后，将整个大脑解剖，切成小块，并在37°C的DMEM中用1 mg/ml胶原酶IV消化30分钟，以获得单个细胞。将单个细胞重新悬浮在70%的percoll中，并转移到15 ml试管中，然后覆盖37%的percoll。在室温下以1800rpm离心20分钟后收获单核细胞（无制动）。抗体标记有以下荧光标记之一：异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、PerCP-Cy5.5、别藻蓝蛋白（APC）、PE-Cy7或APC-Cy7。本研究中使用了以下抗体：CD3（145-2C11，553066，BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞，美国）、CD4（RM4-5，552775，BD bioscience，加利福尼亚州圣何塞，美州）、CD8（53-6.7，557654，BD生物科学，加利福尼亚州，美国），NK1.1（PK136，551114，BD BIOS，加利福尼亚州San Jose，美国）和B220（RA3-6B2，553093，BD Biosciences，干扰素-γ（XMG1.2，505814，Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥，美国），CD69（H1.2F3，104508，Biolelend，加利福尼亚，美国）。在FACSAria（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）上进行流式细胞术测量，并使用FACSDiva和Flowjo 7.6软件（Informer Technologies，Ashland，OR，USA，）进行分析。

免疫染色

免疫染色如我们之前所述[19,25,26,32,35,36]. 简单地说，小鼠被安乐死，灌注后取出整个脑组织，用4%多聚甲醛固定，然后用15%和30%蔗糖脱水。将整个大脑植入OCT中，以制备冰冻切片。将30μm厚的冷冻切片在5%的山羊或驴血清中在室温下封闭1h。将组织切片与抗小鼠CD4（MT310，sc-19641；美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司）、CD8（ab4055，Abcam，Cambridge，MA，USA）、NKp46（MAB2225，研发系统，明尼阿波利斯，美国）的一级抗体在4℃孵育过夜，然后与适当的荧光结合二级抗体孵育。细胞核与4′，6-二氨基-2-苯基吲哚共染色（DAPI；Abcam，Cambridge，MA，USA）。对于人脑组织染色，使用了抗人CD4（MAB379-100，R&D systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）、CD8（MAB1509，R&Dsystems，明尼阿波利s，明尼亚波利斯，美国）和NKp46（MAB1850，R＆Dsystems）的一级抗体。在荧光显微镜上采集图像（奥林巴斯，型号BX-61，美国宾夕法尼亚州中央谷）[19,32,34]. 免疫染色后，通过整个组织块每十个组织切片计数阳性细胞数。脑切片中阳性细胞的数量表示为免疫标记细胞相对于DAPI评估的细胞总数的百分比[20,37]. 使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）进行图像分析。

酶联免疫吸附试验

使用定制的ELISA试剂盒（SA Biosciences，Valencia，CA，USA）测量脑匀浆中的细胞因子。使用Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Fremont，CA，USA）从小鼠脑中提取蛋白质匀浆，并在4°C下以13000 rpm离心20 min，收集上清液。根据制造商的说明，在1:20稀释液中检测细胞因子水平，并使用96-well微孔板阅读器在450 nm波长下分析反应（680型；美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）。

人脑组织

中风患者的石蜡包埋脑组织切片取自太阳健康研究所（亚利桑那州太阳城）和俄亥俄州立大学病理学系（俄亥俄州哥伦布）。在本研究中使用的10个人体样本中，从中风发病后7-14天内死亡的患者（男性，2个；女性，3个）中获取了5个组织。脑卒中病灶位于大脑中动脉供血的皮质区。组织取自大脑中动脉灌注区。五个对照切片来自死于非神经系统疾病（创伤，1；肾衰竭，1；胃癌，1；肝癌，2）的患者（男性，2；女性，3），所选组织切片的位置与中风患者相匹配。所有患者在死亡时均无急性心肌梗死、心力衰竭、自身免疫性疾病、血液系统疾病或中风前任何感染。缺血性卒中患者和对照组的平均死亡年龄无显著差异（卒中患者，76.2±7岁；对照组，79.5±9.2岁，平均值±SEM；第页 > 0.05，学生的吨测试）。死亡后4小时内收集脑组织。

统计分析

使用SAS 9.1软件（SAS Institute Inc.Cary，NC，USA）进行功率分析和样本量计算。该实验设计基于以前的出版物和类似的机械研究[19,32,34,38,39]. 排除标准在单独的方法部分中进行了描述。随机分组基于Microsoft Excel软件中的随机数生成器功能。所有结果均由不分不同组的研究人员进行分析。数据以平均值±标准误差表示。统计显著性由双尾非配对学生的吨对两组进行测试，对三个或更多组进行单向方差分析（ANOVA），然后进行Tukey事后检验，或对双向方差分析，然后进行Bonferroni事后检验以进行多重比较。的值第页 < 0.05被认为是显著的。所有统计分析均使用Prism 6.0软件（GraphPad，加州圣地亚哥，美国）进行。

结果

光血栓卒中和MCAO模型中缺血损伤随时间的评估

7T-MRI T2-w成像用于测量缺血性卒中后一段时间（第1天、第3天、第7天和第14天）的梗死灶。光血栓形成和MCAO在1-3天时都有明显的缺血损伤，T2-w图像上呈现异质性高信号（光血栓形成vs.假手术，n个 = 每组10人，第页 < 0.01; MCAO与假手术，n个 = 每组10人，第页 < 0.01; 图1a个,b条). 第7天后，MCAO和光血栓小鼠的T2-w图像均显示高强度信号下降。自光血栓形成后第7天起，在光血栓形成小鼠的病变区域周围观察到低强度信号，这表明光血栓形成鼠形成了胶质瘢痕，免疫染色也证实了这一点（图2). 术后14天的MRI T2-w信号在光血栓模型中仍可观察到，但在MCAO模型中几乎未观察到（图1 a、 b条). 然而，在两种模型中，术后第14天，表达Iba-1的小胶质细胞在梗死灶周围积聚，功能标记物CD68表达，提示缺血14天后小胶质细胞的功能激活状态（图2，请参阅附加文件1).

图1

小鼠遭受60分钟MCAO或光血栓形成后的脑梗塞体积和神经功能缺损。C57BL/6（B6）小鼠接受假手术、光血栓形成或60分钟MCAO手术。在手术后第1、3、7或14天，对小鼠进行MR成像和神经评估。一典型的MRI图像显示了假手术、光血栓形成或MCAO小鼠梗死体积的时间进程（用红色勾勒）。b条线形图显示了术后指定时间点光血栓形成和MCAO小鼠梗死体积的量化。c（c）累积数据说明了术后第1天至第14天对光致变色和MCAO小鼠的指示神经评估（包括mNSS评分、前肢放置测试、粘合剂去除测试、转角测试和旋转棒测试）。n个 = 每组10只小鼠。误差线代表s.e.m**第页 < 0.01，假手术组与中风组（光血栓形成/MCAO）的双向方差分析

图2

小鼠脑缺血后第14天，脑卒中病变减少。光凝性卒中后14天，显示梗死中部和膀胱周围区域（虚线分隔）病变的脑切片免疫染色(一)和MCAO(b条). 比例尺：100μm（左），40μm（右）

为了确定光血栓形成和MCAO模型中的神经缺陷，我们进行了一系列关于感觉运动功能的行为测试，包括mNSS评分、前肢放置测试、粘附-移动测试、转角测试和旋转试验。如图所示1c个行为测试表明，光血栓形成小鼠和MCAO小鼠在第1天到第3天出现最大的神经损伤。功能恢复从中风后第7天开始。与假对照组相比，光血栓形成和MCAO小鼠在中风后14天内逐渐自发恢复，但仍表现出神经功能缺损（光血栓形成组与假组，n个 = 每组10人，第页 < 0.01; MCAO与假手术，n个 = 每组10人，第页 < 0.01; 图1c个). 这一结果表明，脑缺血后受损的行为结果持续14天。

光血栓形成和MCAO模型脑缺血后期持续炎症

迄今为止，已经在许多实验模型和人体标本中研究了缺血性中风急性期的脑炎症。但炎症细胞的长期特征仍不清楚。因此，我们接下来研究了光血栓中风模型和MCAO模型脑缺血晚期中枢神经系统的炎症状态。如图所示三在脑缺血后14天，光血栓小鼠的活性氧（ROS；作为炎症参数之一）水平显著高于假小鼠，而MCAO小鼠的ROS水平略高于假小鼠（光血栓与假小鼠，n个 = 每组6个，第页 < 0.01; MCAO与假手术，n个 = 每组6个，第页 > 0.05; 图3a年,b条).

图3

小鼠发病后第14天缺血脑内ROS和炎症因子的产生。C57BL/6（B6）小鼠接受假手术、光血栓形成或60分钟MCAO 14天。一术后第14天，生物发光图像显示光血栓形成和MCAO小鼠产生ROS。b条定量分析显示光血栓形成和MCAO小鼠在缺血14天后产生ROS。n个 = 每组6只小鼠。c（c）缺血14天后，从光血栓形成和MCAO小鼠中获取脑组织。以假手术小鼠的脑组织作为对照。制备脑匀浆，并使用定制的小鼠细胞因子ELISA试剂盒测量细胞因子浓度，包括IL-1α、IL-1β、IFN-γ、MCP-1、IL-6、TNF-α和CD69。结果显示来自三个独立的实验，每组4只小鼠。误差线代表s.e.m*第页 < 0.05**第页 < 0.01，假手术组与中风组（光血栓形成/MCAO）的单因素方差分析

使用定制的小鼠细胞因子ELISA小组，我们评估了术后14天光血栓形成和MCAO小鼠脑匀浆中促炎细胞因子的表达。我们发现，与假手术对照组相比，14天的光血栓形成和MCAO均显示促炎细胞因子释放上调，包括IL-1α、IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α和CD69（光血栓形成vs.假手术，n个 = 每组4个，IL-1α、IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α和CD69，第页 < 0.01; MCAO与假手术，n个 = 每组4例，IL-1α，IFN-γ，IL-6，第页 < 0.05；CD69，第页 < 0.01），表明脑缺血后14天，脑炎症持续存在（图3立方厘米).

光血栓形成和MCAO小鼠脑缺血晚期淋巴细胞浸润和活化持续

由于淋巴细胞浸润在缺血延迟期显著促进了脑炎症，我们进一步比较了光血栓形成和MCAO小鼠在脑缺血14天后的脑淋巴细胞浸润。我们使用了Molday ION罗丹明B（MIRB），这是一种35 nm的超小、超顺磁性氧化铁粒子（USPIO），对免疫细胞无毒，可以通过MRI显示[20]. 从野生型小鼠获得淋巴细胞，在体外用MIRB标记，然后被动转移到Rag2^−/−γc^−/−受体小鼠（缺乏T、B、NK和NKT细胞）。使用7T-MRI，我们在MCAO后7天内无创追踪炎症浸润。我们发现，在两种模型中，MIRB标记的淋巴细胞（在MRI上显示为低强度点）可以在手术后7天被追踪，但在光血栓小鼠中具有显著更强的信号强度，表明淋巴细胞在中风后7天炎症性浸润到脑中（光血栓形成与假手术，n个 = 每组8个，第页 < 0.01; MCAO与假手术，n个 = 每组8个，第页 > 0.05; 图4a类,b条).

图4

小鼠发病后第14天，缺血脑内仍有淋巴细胞浸润。一从C57BL/6（B6）小鼠脾脏分离淋巴细胞，并与MIRB共同培养。2 × 10⁷然后将MIRB标记的细胞过继转移到Rag2中^−/−γc^−/−小鼠随后进行假手术或中风手术。MRI图像显示，在Rag2缺血的大脑中，低强度的点表示MIRB标记的淋巴细胞^−/−γc^−/−老鼠。b条总结的结果显示，接受假手术或MCAO手术的小鼠中MIRB标记的淋巴细胞的信号。n个 = 每组8只小鼠。c（c）流式细胞仪分析的点图显示CD4⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 中风后14天来自光致变色或MCAO操作小鼠大脑的单细胞悬浮液中的红细胞、NK细胞和B细胞。d日条形图总结了用于量化CD4的累积数据⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 中风后14天，光血栓形成或MCAO操作小鼠大脑中的NK和B细胞群。n个 = 每组8只小鼠。e（电子）术后14天，典型的免疫染色图像显示CD4浸润⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 光血栓形成和MCAO小鼠缺血损伤区周围的NK细胞。红色：CD4、CD8或NKp46；蓝色：DAPI。比例尺：40μm，20μm（插图）。（f）定量分析显示浸润的CD4⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 缺血14天后，光血栓形成小鼠和MCAO小鼠同侧脑的NK细胞计数。n个 = 每组5只小鼠。误差线代表s.e.m*第页 < 0.05; **第页 < 0.01，假手术组与中风组（光血栓形成/MCAO）的单向方差分析

脑浸润CD4⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 术后14天，在光血栓形成和MCAO小鼠中均可观察到NK和B细胞。我们发现CD4显著增加⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 中风模型中NK细胞与假小鼠的比较。比较两种模型，CD4更多⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 光血栓模型中的NK细胞比MCAO模型中的细胞多，而在两种模型之间的B细胞群没有观察到差异（光血栓与假血栓，n个 = 每组8个，CD4⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 NK和B细胞，第页 < 0.01; MCAO与假手术，n个 = 每组8个，CD4⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 NK细胞，第页 < 0.05; B细胞，第页 < 0.01; 图4c类,d日; 光血栓形成与假手术，n个 = 每组5个，CD4⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 NK、，第页 < 0.01; MCAO与假手术，n个 = 每组5个，CD4⁺T细胞和NK细胞，第页 < 0.05；图第四版,（f）). 这一结果表明，在脑缺血延迟期可以观察到淋巴细胞浸润，这可能与脑卒中后长期损伤有关。

接下来，进一步研究CD4增加的可能作用⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 以及晚期缺血脑中NK细胞的浸润，我们比较了光血栓形成小鼠和MCAO小鼠与假对照组大脑中这些细胞的激活情况。我们发现，与假小鼠相比，激活淋巴细胞标记物CD69和IFN-γ在两种中风模型中均过度表达，但在术后14天，光血栓小鼠比MCAO小鼠表达更多。值得注意的是，在光血栓小鼠中，CD4中IFN-γ的表达显著增加⁺T细胞，在CD8中不明显⁺T或NK细胞（IFN-γ：光血栓形成vs.假手术，n个 = 每组8个，CD4⁺T细胞，第页 < 0.01，CD8⁺T细胞和NK细胞，第页 < 0.05; MCAO与假手术，n个 = 每组8个，CD4⁺T细胞，第页 < 0.05; CD69：光血栓形成与假手术，n个 = 每组8个，CD4⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 和NK细胞，第页 < 0.01; MCAO与假手术，n个 = 每组8个，CD4⁺T细胞，第页 < 0.05; 图第5页–c（c）). 由于IFN-γ是介导Th1应答的关键细胞因子，而Th1应答被认为是促进缺血性脑损伤的关键因素，这些结果表明，浸润淋巴细胞的激活，尤其是表达IFN-γ的CD4⁺T细胞可能参与缺血性卒中的晚期。然而，在两种模型中，假手术组和缺血组的脾淋巴细胞和循环淋巴细胞数量没有显著差异（图6).

图5

小鼠脑缺血后第14天，脑浸润淋巴细胞表达CD69和IFN-γ。一流式细胞术斑点图显示CD4中IFN-γ和CD69的表达⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 中风后14天，来自光血栓形成或MCAO操作小鼠大脑的单细胞悬浮液中的NK细胞。b条,c（c）条形图总结了量化IFN-γ的累积数据(b条)和CD69(c（c）)CD4表达⁺T、 CD8细胞⁺T、 以及中风后14天来自光血栓形成或MCAO操作小鼠大脑的NK细胞。n个 = 每组8只小鼠。误差线代表s.e.m**第页 < 0.01，假手术组与中风组（光血栓形成/MCAO）的单向方差分析

图6

小鼠脑缺血后第14天外周血淋巴细胞亚群的评估。一流式细胞术的点图显示CD4的门控策略⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 中风后14天，光血栓形成或MCAO操作小鼠脾脏单细胞悬浮液中的NK和B细胞。b条条形图总结了CD4的累积数据⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 中风后14天，光血栓形成或MCAO操作小鼠脾脏的NK和B细胞计数。c（c）条形图总结了CD4的累积数据⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 中风后14天，光血栓形成或MCAO操作小鼠血液中的NK和B细胞计数。n个 = 每组8只小鼠。误差线代表s.e.m

啮齿动物模型模拟缺血脑卒中延迟期患者的炎性脑浸润

人类缺血性中风是一种异质性疾病，在不同阶段具有复杂的病理生理学，因此在一个动物模型中模拟人类中风的各个方面是不可行的。这里我们检测了CD4的脑浸润⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 以及中风发病后7-14天内死亡的缺血性中风患者尸检脑切片中的NK细胞。缺血性卒中患者梗死灶周围的T细胞和NK细胞显著增加（卒中与对照组相比，n个 = 15节，第页 < 0.01; 图7). 这一结果与小鼠模型中的淋巴细胞浸润相平行，表明炎症浸润在中风患者和小鼠模型中持续存在，这为使用小鼠模型来镜像缺血性中风患者提供了证据，研究脑缺血延迟期的免疫炎症特征。

图7

缺血性卒中患者发病后延迟期脑内淋巴细胞浸润持续存在。一代表性免疫染色图像显示CD4⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 以及缺血性中风患者脑病变周围区域的NK细胞。b条条形图显示CD4的定量⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 以及晚期缺血性中风患者和对照组的NK细胞。n个 = 5例缺血性脑卒中患者15节；n个 = 来自5名非神经系统疾病对照组的15个切片。比例尺：20μm，10μm（插图）。误差线代表s.e.m**第页 < 0.01假手术与中风患者的双尾非配对Student’s吨测试

讨论

在这项研究中，我们证明在两种实验性中风模型中，当脑梗死显著减少时，淋巴细胞浸润在脑缺血后期持续存在。我们注意到，随着浸润淋巴细胞的激活，脑滤过淋巴细胞中ROS生成增加，炎症因子释放增加，IFN-γ和CD69上调，这表明淋巴细胞可能在缺血后期保留其影响脑内炎症微环境的能力。

渗透免疫细胞通过产生各种效应分子或炎症介质来协调大脑炎症环境[40]. 在这项研究中，我们发现在两种模型中，脑缺血后的炎症持续到14天，在中风后期，光血栓小鼠比MCAO小鼠在大脑中诱导了更高水平的炎性细胞因子/趋化因子，以及更多的外周淋巴细胞浸润。这一结果可能是由于这两种模型的不同特点造成的：光血栓形成产生永久性和持续性损伤，这是由于自由基的产生和小血管中血栓的产生。相反，腔内闭塞的短暂MCAO导致主血管暂时闭塞，再灌注和侧支血管灌注可解决此问题。此外，受伤后至少7天到14天内，光血栓形成区域周围的血脑屏障发生明显破坏[41]而MCAO的血脑屏障破坏在4天内得到解决[42]这表明MCAO小鼠在受伤14天后血脑屏障更加完整。这一因素可能解释了在淋巴细胞浸润中观察到的差异。另一种可能性是光血栓形成时外周血凝固。为了抵消病变中可能存在的外周血混杂，我们还用ET-1/L-NAME注射建立了ET-1局灶性中风模型。我们在ET-1模型脑缺血后第14天观察到淋巴细胞浸润，这支持了我们的发现，即脑缺血后期的炎症浸润（参见附加文件2). 我们进一步进行了实验，通过在光血栓形成之前或之后立即注射淋巴细胞，测试大脑血管内的凝血如何影响光血栓形成模型中观察到的ROS生成和MIRB标记的细胞信号。与中风前细胞移植相比，中风后移植小鼠的ROS生成和MIRB信号略有降低，但无显著性。该数据表明凝血可能在梗死区产生人工信号，但它可能不会显著影响脑缺血后淋巴细胞浸润诱导的炎症（参见附加文件三). 我们的研究表明，在缺血后期，淋巴细胞可能保留其影响脑内炎症微环境的能力。Cotrina ML等报道，与MCAO相比，光血栓卒中后7天内炎症反应增强，周边浸润增加，但没有研究比较两种模型的长期卒中结果[43]. 我们的研究还评估了中风后的神经预后，显示在两种模型中，神经缺损在脑缺血后的晚期仍然存在。Vanderputt C等人通过MRI表征了光致变色中风模型中的炎症反应[44]这与我们的MRI结果一致。

据报道，淋巴细胞（如T细胞）在缺血性中风中的早期有害作用[16,17]. 证据表明CD4⁺T和CD8⁺在实验性中风模型中，T淋巴细胞（而非B淋巴细胞）参与炎症血栓形成、脑损伤和神经功能缺损[16,17]. 为了确定脑过滤淋巴细胞的命运，我们测量了缺血性脑损伤缓解期这些细胞的存在、激活和功能状态。这些淋巴细胞的活化标记CD69和细胞因子（如IFN-γ）的表达表明它们具有调节大脑炎症环境的能力。有趣的是，我们发现中风小鼠中IFN-γ的高表达，尤其是CD4⁺T细胞。这一发现表明，T细胞可能参与组织重塑过程，并在缺血性卒中缓解期影响疾病结局。然而，尚不清楚T细胞等淋巴细胞亚群如何影响脑缺血诱导的脑损伤，哪些慢性因素和哪些神经-免疫途径可能起作用。这些方面肯定需要在未来的研究中进行调查。

虽然人类中风患者淋巴细胞反应的精确时间和空间动力学可能与实验性中风模型中发现的不完全匹配，因为人类中风患者的整体疾病时间过程通常明显更长，值得注意的是，脑缺血延迟期患者的脑切片中也可见淋巴细胞持续浸润。将两种小鼠模型与脑卒中患者进行比较，MCAO模型在血管闭塞和临床病例预期的再灌注方式上更为相似，因此更好地反映了缺血性脑卒中患者。而光血栓形成由于其持续而明显的炎性浸润，可能是研究脑损伤晚期脑炎症的一种有用的动物模型。这一发现需要进一步研究，以更好地了解浸润淋巴细胞在脑缺血晚期的作用。

结论

总之，我们证明淋巴细胞浸润在晚期脑缺血期间持续存在。这些细胞中效应分子的激活和表达表明它们可能参与缺血性脑损伤的缓解期。这些发现可能为未来进一步研究提供更好的知识基础，以揭示淋巴细胞反应在中风晚期的确切作用。