YAP通过RAC1-ROS-mTOR途径促进肝细胞癌的多药耐药并抑制自噬相关细胞死亡

摘要

背景

多药耐药是肝细胞癌（HCC）化疗失败的主要原因。YAP是Hippo通路的一个关键效应器，已被证明有助于癌症的进展、转移和侵袭。然而，YAP在介导耐药性中的潜在作用仍不清楚。

方法

采用RT-qPCR和western blot检测肝癌细胞株中YAP的表达。利用CCK-8分析、流式细胞术、异种移植物肿瘤模型、免疫化学和GFP-mRFP-LC3融合蛋白来评估YAP在体外和体内对HCC细胞的多药耐药性、细胞内ROS产生和自噬的影响。通过自噬抑制剂和拯救实验来阐明YAP促进肝癌细胞化疗耐药的机制。

结果

我们发现BEL/FU是一种典型的肝癌细胞株，具有化疗耐药性，表现出YAP的过度表达。此外，shRNA或维替泊芬对YAP的抑制通过体外和体内自噬相关细胞死亡使BEL/FU细胞对化疗药物敏感。从机制上讲，YAP沉默通过增加RAC1驱动的ROS显著增强自噬流量，这有助于肝癌细胞中mTOR的失活。此外，自噬拮抗剂逆转了化疗药物治疗下YAP沉默对细胞死亡的增强作用。

结论

我们的研究结果表明，YAP上调通过RAC1-ROS-mTOR途径赋予HCC细胞多药耐药性，从而抑制自噬相关的细胞死亡。阻断YAP可能成为克服肝癌化疗耐药性的一种有希望的新治疗策略。

背景

肝细胞癌（HCC）仍是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内发病率和死亡率都很高[1,2]尽管诊断和治疗有了巨大的发展。手术切除和肝移植为HCC提供了可治愈的机会，但不幸的是，它们不适合大量晚期HCC患者[三,4]. 这些晚期HCC患者可以从替代治疗中受益，包括动脉化疗栓塞（TACE）、分子靶向治疗和过渡性化疗[5,6].

然而，这些姑息性治疗往往受到肝癌化疗耐药，尤其是多药耐药（MDR）发生的限制[7]. MDR肿瘤细胞的特点是对一种化疗药物产生耐药性，同时对具有不同结构和机制的其他药物产生交叉耐药性[8,9]. MDR涉及多种机制，包括ABC转运蛋白家族的过度表达[10]，上皮-间充质转化（EMT）[11]，癌细胞调节[12]凋亡诱导、DNA损伤和修复、自噬诱导[13]. 在癌症化疗干预期间克服MDR是一个巨大的挑战[13]. 因此，迫切需要揭示MDR的确切分子机制。

Hippo信号通路对多种细胞过程至关重要，包括增殖、器官发育、干细胞生物学、细胞存活和肿瘤发生[14,15,16]. 该途径通过调控其核心下游效应物yes-associated protein（YAP）参与转录活性，YAP可被大肿瘤抑制因子1/2（LATS1/2）直接磷酸化和失活，导致YAP滞留在细胞质中[17]. Hippo通路的减弱可诱导YAP与DNA结合转录因子和TEA结构域家族成员（TEAD）相互作用，随后，其移位到细胞核并激活基因表达[18,19]. 先前的证据表明，YAP的高表达与恶性肿瘤的不良临床结局密切相关[20,21]. 此外，YAP已被确定调节癌干细胞样行为和EMT，这两者对MDR至关重要[22,23]. 这些发现表明，YAP是癌症进展的关键因素，在MDR的发展中具有潜在作用。

在这里，我们证明了YAP的上调通过调节RAC1活性氧物种（ROS）-mTOR通路抑制自噬相关细胞死亡，从而促进MDR，并且以YAP为靶点可能是提高肝癌对化疗敏感性的替代方法。

结果

YAP在多药耐药细胞系BEL/FU中高表达，并促进BEL-7402对化疗的耐药性

我们之前的研究证实，来自BEL-7402细胞系的BEL/FU细胞同时且稳定地对5-氟尿嘧啶（5-FU）和阿霉素（DOX）耐药[24]. 我们首先通过qRT-PCR和western blot分析比较了BEL/FU细胞和亲本BEL-7402细胞中YAP和ATP转运蛋白（ABCC4、ABCC6、ABCB1和ABCB4）的水平。在蛋白和mRNA水平上，BEL/FU细胞中的YAP显著增加（图1a、 b）。在BEL/FU细胞中，ABCC4、ABCC6、ABCB1和ABCB4的mRNA表达显著增加，而YAP敲除并没有降低ATP转运的RNA水平（图1c） ●●●●。此外，包括LATS1、Mob1和p-Mob1在内的多种YAP上游抑制剂在BEL/FU细胞中减弱（图1a） ●●●●。鉴于YAP的生物学功能归因于其核-细胞质易位[17]有必要检测细胞质和细胞核内的YAP含量。YAP在BEL/FU细胞核内积聚（图1d） ●●●●。凋亡减少、IC增加进一步支持了这些观察结果₅₀在5-Fu或DOX治疗下，YAP稳定过度表达的BEL-7402细胞中，裂解caspase-3和裂解PARP的表达水平降低（图1e–h）。

图1

YAP对肝癌细胞株的多药耐药性至关重要。一western blot分析BEL/FU和BEL-7402细胞系中YAP的蛋白表达和Hippo通路的主要成分。β-肌动蛋白作为负载对照。b条BEL/FU和BEL-7402细胞系中YAP的mRNA水平。c（c）BEL/FU和BEL/7402细胞中ABCC4、ABCC6、ABCB1和ABCB4的mRNA水平（左面板）。在有或无YAP敲除的BEL/FU细胞中，ABCC4、ABCC6、ABCB1和ABCB4的mRNA水平（右面板）。d日细胞核和细胞质YAP在BEL/FU和BEL-7402细胞系中的表达。NP：核蛋白，CP：细胞质蛋白。β-肌动蛋白或层粘连蛋白A用作负荷对照。e（电子）,（f）用PBS、5-Fu（20µg/ml）或DOX（0.5µmol/ml）处理48 h后，用流式细胞仪分析凋亡的BEL-7402细胞中YAP过度表达或不过度表达的细胞百分比。克western blot分析5-Fu（20µg/ml）或DOX（0.5µmol/ml）处理48 h后，在有或无YAP过度表达的BEL-7402细胞中，凋亡标记物、裂解PARP和裂解caspase-3的数量。小时IC₅₀采用CCK-8分析法分析有或无YAP过度表达（分别表示为YAP-OE和YAP-Ctrl）的BEL-7402细胞中5-Fu和DOX的值。数据表示为平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，ns，无显著性

体外抑制BEL/FU细胞中的YAP可有效克服MDR

接下来，我们进一步研究了抑制YAP是否可以减轻BEL/FU细胞的MDR。正如预期的那样，在用5-FU或DOX处理的BEL/FU细胞中，有效的YAP抑制剂维他泊芬显著抑制了细胞增殖和集落形成（图2a、 b、e、f）。此外，通过降低IC证实了BEL/FU细胞对5-FU或DOX的敏感性₅₀使用CCK-8测定的值（图2c、 d）。与这一发现一致，当在5-FU或DOX存在下用lenv-shRNA稳定地敲除YAP时，凋亡的BEL/FU细胞的百分比增加（图2g–j；其他文件1：图S1A）。然而，在没有5-FU或DOX治疗的情况下，YAP敲除几乎没有改变凋亡的BEL/FU细胞的比率。此外，在BEL/FU细胞中，YAP敲除提高了PARP和caspase-3蛋白的裂解量（附加文件1：图S1B）。

图2

抑制YAP可克服BEL/FU细胞的多药耐药性。一,b条通过CCK-8分析评估用5-FU（0.3 mg/ml）或DOX（2µmol/ml）治疗后BEL/FU细胞的增殖情况（含或不含YAP拮抗剂维替泊芬（0.3µg/ml））。c（c）,d日IC₅₀在维替泊芬或PBS存在的情况下，BEL/Fu细胞中5-Fu或DOX的值。e（电子）,（f）在5-FU（0.3 mg/ml）或DOX（2µmol/ml）加或不加维替泊芬（0.3µg/ml）的情况下评估BEL/FU细胞的集落形成。克–j个流式细胞术检测5-FU（0.3 mg/ml）或DOX（2µmol/ml）处理48h后，有或无YAP敲除的BEL/FU细胞的凋亡。数据表示为平均值±标准偏差。**p<0.01

YAP抑制剂维替泊芬使BEL/FU细胞对体内化疗敏感

为了验证YAP在体内对肝癌化疗耐药性的调节，使用皮下异种移植瘤模型进行了维替泊芬与5-Fu或DOX联合治疗。结果表明，5-Fu、DOX或单独使用维替泊芬治疗肿瘤生长受到适度抑制，但维替泊芬与5-Fu或DOX联合使用显著抑制肿瘤生长（图4a） ●●●●。接受维替泊芬和5-Fu或DOX联合治疗的组显示肿瘤病灶最小，重量最小（图4a–c）。这些数据表明，YAP抑制剂维替泊芬是一种有效克服肝癌细胞MDR的假定措施。

鉴于DOX/5-Fu的细胞毒性依赖于细胞内ROS的积累[25,26]ROS衰减介导的化疗耐药，通过增加ROS或破坏氧化还原平衡克服MDR的新方法[27]以及Hippo-YAP信号在氧化应激反应中的意义[28,29]，我们推测MDR可能是由于细胞内ROS的积累，通过抑制YAP而被消除的。

值得注意的是，正如8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）的强染色所示，接受维替泊芬和5-Fu或DOX联合治疗组的异种移植瘤组织中检测到的ROS最多，8-OHdG是氧化DNA损伤的指示物（图三d；其他文件1：图S1F）。此外，维替泊芬联合5-Fu或DOX组肿瘤组织中的凋亡率显著高于其他组（图三e、 f）。哺乳动物靶向雷帕霉素（mTOR）信号通路对细胞生存至关重要，ROS增加可显著抑制其活性[30].

图3

YAP在体内使BEL/FU细胞具有化疗耐药性。患有皮下异种移植瘤的Balb/c裸鼠每3天腹腔注射PBS、5-Fu（20 mg/kg）、DOX（1 mg/kg）和verteporfin（10 mg/kg）或verteporvin与5-Fu或DOX的组合。一肿瘤外观。b条肿瘤体积。c（c）肿瘤重量。d日通过肿瘤组织的IHC分析（比例尺：50µm/25µm）检查p-mTOR、p-S6和8-OHdG的表达。e（电子）,（f）通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析（比例尺：50µm）分析肿瘤组织中的细胞凋亡。10个随机放大场（200×）中凋亡细胞的平均数量。数据表示为平均值±标准偏差。**p<0.01

在此，免疫组织化学（IHC）结果显示，在接受维替泊芬和5-Fu或DOX联合用药组的肿瘤组织中，磷酸化mTOR（p-mTOR）和磷酸化S6核糖体蛋白（p-S6）的染色最弱，这两种重要的mTOR信号活化蛋白（图三d；其他文件1：图S1D）。该观察结果表明，维替泊芬联合5-Fu或DOX治疗阻碍了mTOR信号通路。总之，我们的研究结果表明，维替泊芬与5-Fu或DOX联合治疗通过ROS积累和mTOR信号终止提高了肝癌对化疗的敏感性。

YAP沉默促进RAC1上调，导致ROS生成

为了证实YAP在抑制ROS生成中的作用，利用流式细胞术在体外用5-FU处理的shYAP-1#检测BEL/FU细胞中的ROS含量。在5-Fu治疗下，YAP敲除显著增加了BEL/Fu细胞中的ROS生成（图4a、 b）。活性氧的产生受RAC1调节，RAC1是调节细胞死亡、迁移和增殖的关键分子[31]. Western blot分析显示，YAP沉默显著上调RAC1表达，但YAP过表达减弱RAC1表达。此外，通过基于组织芯片的IHC分析，YAP表达与RAC1表达和ROS生成呈负相关（图4c–e）。支持这一发现，在与维替泊芬和5-FU或DOX联合治疗下，ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以有效保护BEL/FU细胞的活性（图4f、 g）。总之，YAP沉默介导的RAC1上调是BEL/FU细胞ROS生成的原因。

图4

YAP下调RAC1，导致ROS生成减弱。一,b条使用CellROX™试剂通过流式细胞术检测5-FU（0.3mg/ml）处理48小时后BEL/FU细胞中的细胞内ROS。NAC（0.75 mM）用于清除ROS。c（c）western blot检测YAP敲除或过表达的BEL/FU细胞RAC1蛋白水平。d日,e（电子）通过IHC（比例尺：50µm/25µm）在HCC组织芯片（n=120）中检测YAP、RAC1和8-OHdG的表达。根据IRS，YAP水平与RAC1和8-OHdG的表达呈负相关。（f）,克NAC可消除维替泊芬（0.3µg/ml）和5-FU（0.3 mg/ml）或DOX（2µmol/ml）联合治疗诱导的BEL/FU细胞生长抑制。数据表示为平均值±标准偏差。**p<0.01

YAP抑制通过自噬相关细胞死亡强烈逆转化疗耐药

因为YAP过度表达可以阻止ROS的积累，而ROS的积聚与化疗期间自噬的启动相关的细胞死亡有关[32,33]，LC3B-I转化为LC3B-II（以细胞溶质形式转化为膜结合的层状形式，这是自噬激活的标志[30])评估以确定YAP与自噬的相关性。进一步研究中使用了YAP高表达（BEL/FU和SK-Hep1）或低表达（BEL-7402和HCC-LM3）的细胞株（附加文件1：图S1D）。

如图所示5a–d和附加文件2：图S2A-D，在厄尔平衡盐溶液（EBSS）饥饿条件下，无论是否存在氯喹（CQ），自噬体与溶酶体融合的抑制剂，在BEL/FU和SK-Hep1细胞中LC3B-II转换升高，但在BEL-7402和HCC-LM3细胞中降低。串联LC3B-RFP-GFP荧光显微镜分析进一步证实了这一观察结果，其中YAP shRNA显著增加了自噬体和自溶体的形成，这意味着YAP敲除增强了自噬性通量（图5e） ●●●●。

图5

YAP敲除促进了肝癌细胞的自噬和自噬相关的细胞死亡。一–d日在含有或不含有CQ（100µM）的完整培养基或EBSS溶液条件下，在含有YAP敲除或过表达的HCC细胞系（BEL/FU、SK-Hep1、BEL-7402和HCC-LM3）中测量自噬标记物LC3B的量6小时。e（电子）转染GFP-mRFP-LC3B融合蛋白后，在有或无YAP敲除的BEL/FU细胞中检测自噬体（黄色斑点）和自溶体（红色斑点）。左侧面板，代表性图像。右侧面板，单个细胞内自噬体和自溶体的定量（来自5个随机字段）（比例尺：25µm）。（f）–我用自噬抑制剂3-MA（5 mM）或CQ（100µM）处理YAP敲除的BEL/FU细胞48小时，或在5-FU（0.3 mg/ml）存在下敲除ATG5或BECN1。收集所有细胞，通过流式细胞术（F，G）进行凋亡分析，或通过western blot检测PARP和caspase-3的蛋白水平小时,我β-肌动蛋白用作负荷控制。数据表示为平均值±标准偏差。**p<0.01

接下来，我们评估了在5-Fu存在下，YAP敲除诱导的自噬流量对细胞死亡的影响。在用CQ或3-甲基腺嘌呤（3-MA）（一种早期自噬抑制剂）处理后，YAP敲低的BEL/FU细胞中凋亡细胞的百分比以及裂解的PARP和裂解的胱天蛋白酶-3的蛋白水平被显著抑制（图5f、 h）。此外，在对ATG5和BECN1进行siRNA阻断自噬后，YAP敲除的BEL/FU细胞中观察到凋亡细胞减少、PARP裂解和caspase-3裂解（图5g、 i；其他文件1：图S1C），两者都是关键的自噬相关基因[30]. 这些发现表明，肝癌中YAP介导的MDR与自噬相关细胞死亡的减少有关。

YAP介导的ROS衰减导致mTOR通路激活，该通路负责抑制自噬相关的细胞死亡

mTOR是自噬的典型中枢抑制物，可通过清除活性氧而激活[30]. 在当前研究中，建议由YAP调节mTOR。首先，雷帕霉素对mTOR的抑制显著增加了自噬流量和细胞死亡，证明了向LC3B-II的转化增加，并增加了裂解PARP和裂解caspase-3的蛋白水平（附加文件1：图S1E，G）。其次，在BEL/FU和SK-Hep-1细胞系中，YAP敲除显著降低了mTOR信号的多个激活蛋白，包括p-mTOR、p-S6和磷酸化翻译抑制蛋白4E-BP1（p-4E-BPl）（图6a、 b；其他文件2：图S2E，F）。用YAP拮抗剂维替泊芬治疗后，p-mTOR、p-S6和p-4E-BP1的蛋白水平呈时间依赖性降低（图6c；其他文件2：图S2I）。相反，在BEL-7402和HCC-LM3细胞系中，这些蛋白被YAP过度表达激活（图6d、 e；其他文件2：图S2G，H）。此外，IHC分析表明，YAP表达与p-mTOR和p-S6水平呈正相关（图6g、 h）。第三，在BEL/FU细胞中，活性氧清除剂NAC可以显著恢复YAP敲除诱导的p-mTOR、p-S6和p-4E-BP1抑制（图6f；其他文件2：图S2J）。总之，YAP敲除能够通过ROS生成抑制mTOR通路，导致自噬相关的细胞死亡。

图6

YAP调节肝癌细胞mTOR通路的激活。一–（f）在YAP过表达或被shRNA或拮抗剂维替泊芬抑制的肝癌细胞系（BEL/FU、SK-Hep1、BEL-7402和HCC-LM3）中分析mTOR、p-mTOR，S6，p-S6，4E-BP1和p-4E-BPl的蛋白水平。NAC（0.75 mM）处理部分逆转了YAP敲除诱导的mTOR通路抑制。克,小时通过IHC（比例尺：50µm/25µm）在HCC组织芯片（n=120）中检测YAP、p-mTOR和p-S6的表达。根据IRS，YAP水平与p-mTOR和p-S6的表达呈正相关

讨论

化疗被广泛接受为晚期癌症最常见的临床治疗之一。然而，长期接受化疗的患者往往对化疗药物没有反应。MDR仍然是癌症临床治疗成功和有效的主要障碍，因为它会导致转移和复发，这两种情况都会导致不良结果[24,34]. 因此，揭示MDR的潜在机制将为改进癌症化疗提供一个巨大的机会。在这里，我们发现通过抑制ROS介导的自噬相关细胞死亡，YAP的上调促进了肝癌中的MDR。此外，阻断YAP使肝癌对化疗药物敏感。

最近的证据表明，YAP蛋白水平的积累是各种癌症化疗期间微转移和耐药性的重要因素[34,35,36]. 与这些结果一致，我们的数据显示YAP在BEL/FU细胞中高表达，这是一种对化疗耐药的肝癌细胞系。体内外服用YAP拮抗剂维替泊芬后，BEL/FU细胞MDR逆转进一步支持了这些观察结果。此外，外源性YAP过表达降低了凋亡细胞的百分比，升高了IC₅₀5-Fu或DOX处理下BEL-7402细胞的值。此外，靶向YAP还能够使各种类型的癌细胞对化疗药物敏感[37,38,39]这表明YAP可以被认为是一种抗肿瘤靶点，尤其是对于包括肝癌在内的难治性恶性肿瘤。

此外，YAP能够维持膀胱癌的抗氧化潜力、细胞存活和化疗耐药性[40]依赖癌细胞对活性氧的脆弱性[41]. 抑制抗氧化剂或恢复细胞内活性氧水平正日益被视为对抗化疗耐药恶性肿瘤的有效策略。蒽环类药物和紫杉醇的应用支持了这一观点，它们可以通过增加细胞内ROS水平在一定程度上促进抗癌反应[42]. 然而，由于耐药恶性肿瘤清除细胞内活性氧的能力较强，这种化疗容易失败[43]. 因此，以YAP为靶点可能是克服包括肝癌在内的癌症耐药性的理想选择。事实上，在目前的研究中，YAP敲除显示出很强的能力来提高细胞内ROS的生成，并将BEL/FU细胞重新敏感为5-FU或DOX。肝癌组织中YAP表达与ROS水平呈负相关，在5-FU环境下用ROS清除剂NAC治疗后，BEL/FU细胞恢复增殖，YAP沉默，进一步证实了这一结果。YAP介导的ROS还原和化疗耐药过程依赖于RAC1抑制，RAC1是氧化和ROS生成的关键调节因子[31]. 此外，这项工作进一步验证了YAP抑制剂维替泊芬和5-Fu的联合使用可以导致ROS的产生和体内肿瘤生长的抑制。因此，YAP抑制ROS积累的诱导将是克服化疗耐药性或改善难治性癌症治疗的一种有前途的机制。

细胞内ROS积累可负向调节多种生存信号通路，并增强癌细胞的自噬流量[44]. mTOR蛋白在抑制自噬和维持细胞生长中起关键作用，很容易被外源性H灭活₂O（运行）₂[42]. 考虑到这些发现，mTOR和自噬过程被认为与YAP介导的BEL/FU细胞的化疗耐药性有关。值得注意的是，我们的数据显示，mTOR蛋白的激活被YAP敲除显著抑制，随后被ROS清除剂NAC恢复。此外，YAP沉默导致LC3B-I/II转变（代表自噬体的形成）和自噬小体数量增加，如使用串联LC3B-mRFP-GFP荧光分析的黄色圆点所示。尽管自噬已被报道为癌症发生、发展和化疗耐药的保护因子，但越来越多的证据表明，自噬流量增加和延长会促进细胞死亡，并成为抗肿瘤治疗中肿瘤抑制的一种新机制[45,46,47]. 阻断自噬已被确定为通过促进细胞死亡来增强癌细胞对包括伊马替尼、吉非替尼和埃洛替尼在内的抗肿瘤药物的抵抗力[48,49]. 因此，我们的研究表明，在YAP沉默和5-FU治疗的背景下，自噬抑制剂CQ和3-MA或抗BECN1或ATG5的siRNA可显著降低BEL/FU细胞的凋亡细胞比率。此外，雷帕霉素诱导的自噬激活促进了BEL/FU细胞的细胞死亡，这与之前的研究结果一致，该研究认为雷帕霉素和替莫唑胺联合使用可以克服人脑胶质瘤对替莫唑酰胺的耐药性[50].

尽管自噬在肿瘤发生和化疗耐药发展中具有“两面性”作用，包括促肿瘤和抗肿瘤活性[48,49]许多研究试图通过联合治疗和增强自噬流量来提高乳腺癌对三苯氧胺的敏感性或克服化疗耐药性[48]. 越来越多的证据表明，广泛用于结肠癌、乳腺癌和胰腺癌的两种药物卡培他滨和吉西他滨能够通过触发过度的自噬流量和自噬相关的细胞死亡来抑制肿瘤的进展[51]. 考虑到自噬是一个依赖于环境的过程，受到各种因素的调节，包括微环境、细胞类型和状态，需要更多的知识来阐明自噬在化疗耐药和细胞死亡中的作用，以及在患者生存中的作用以及自噬拮抗剂和化疗药物联合治疗恶性肿瘤的疗效。

结论

总之，我们认为化疗药物诱导的细胞内ROS水平的失调能够通过激活自噬相关的细胞死亡来损伤癌细胞；然而，耐药细胞中YAP的上调抑制了ROS的产生并维持了mTOR蛋白的激活，从而阻断了自噬相关细胞死亡的过程并促进了化疗耐药性（图7).

图7

代表YAP促进肝癌多药耐药机制的示意图模型。P： 磷酸化

材料和方法

细胞系和试剂

人肝癌细胞系BEL/FU和亲本细胞系BEL-7402来自KeyGen Biotech Co.，Ltd.（中国南京）。BEL/FU细胞和BEL-7402细胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640（以色列生物工业）中培养。HCC-LM3细胞系由中国科学院上海生物科学研究院细胞库提供，并在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（以色列生物工业公司）中培养。SK-Hep-1细胞由中国类型培养收集中心提供，并在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，浓度为5%CO₂和37°C。使用EBSS（Gibco）提供饥饿条件。CQ（美国塞勒克）和3-MA（美国塞勒克）用于阻断自噬。Verteporfin、5-Fu和DOX购自MedChemExpress（MCE，美国）。

集落形成分析

将BEL/FU细胞接种在6孔板中进行集落形成分析。用5-Fu、DOX和维替泊芬处理48小时后，细胞在新鲜培养基中培养14天。然后，用结晶紫染色菌落进行计数。

体外药物细胞毒和细胞增殖试验

药物细胞毒性试验与先前的研究方法类似[24]. 集成电路₅₀使用SPSS软件通过probit回归计算值。为了评估细胞增殖，BEL/FU细胞（1×10^三根据制造商的说明，将细胞/孔）放置在96 well板中，并由CCK-8（日本DOJINDO实验室）在0、24、48、72、96和120 h时进行测量。

临床标本

组织芯片中包含的所有肝癌标本均来自中国浙江大学医学院附属第一医院。组织用福尔马林固定并用石蜡包埋。

免疫组织化学

组织微阵列和异种肿瘤组织的切片在二甲苯中脱蜡。以适当的浓度使用针对YAP（美国Abcam）、RAC1（中国Proteintech）、8-OHdG（美国Abcam）、p-mTOR（美国Abcam）和p-S6（美国Abcas）的初级抗体，并在4°C下培养过夜。根据免疫反应评分系统（IRS）计算染色强度[52].

蛋白质印迹

使用RIPA裂解缓冲液（美国Thermo）和蛋白酶和磷酸酶抑制剂（美国Thermal Scientific™）从细胞中提取总蛋白。通过4–20%梯度十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（GenScript，中国南京）分离每个样品的细胞裂解物，然后转移到0.45µm PVDF膜（Millipore，美国）上。用含有5%非脂肪乳和0.1%吐温-20的Tris-buffered生理盐水封闭所有膜，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。添加二级抗体，并在室温下以1:5000的浓度孵育1小时。使用ECL试剂盒（Proteintech，中国）观察免疫印迹条带。使用Image Lab软件通过分析条带密度来量化蛋白质量。

异种移植模型试验

为了在体内测定YAP在MDR中的功能，从中国上海X-B动物有限公司购买了4周龄Balb/c裸鼠。总计3×10⁶将BEL/FU细胞接种到每只小鼠的右侧皮下。在出现肿瘤块后，所有小鼠均接受5-Fu（20 mg/kg，腹腔注射，每3天一次）和/或维替泊芬（10 mg/kg，静脉注射，每隔3天）治疗。定期监测肿瘤大小，根据公式（体积=长度×宽度）计算肿瘤体积²)/2. 测量3周后处死所有小鼠。该异种移植物实验得到了浙江大学医学院第一附属医院实验动物伦理委员会的批准。

慢病毒转染

为了产生具有稳定YAP敲除的肝癌细胞，将带有YAP特异性shRNA的慢病毒颗粒（shYAP-1#和shYAP-2#，GeneCopeia，中国广州）慢病毒颗粒转染到SK-Hep-1和BEL/FU细胞系中。靶向YAP的shRNAs序列为5′-GGAATGAACAATACGAC-3′（shYAP-1#）和5′-GCATACAGGTGATACTCA-3′（shYAP-2#）。为了过表达YAP，将慢病毒Flag-YAP表达载体（中国上海基因化学有限公司）转染到BEL-7402和HCC-LM3细胞中。用嘌呤霉素（5µg/ml）处理所有转染细胞。

ROS检测

用5-FU（0.3 mg/ml，48 h）在RPMI-1640中培养BEL/FU细胞，然后收获并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。然后，将细胞重新悬浮在PBS中，并用2µl CellROX绿色试剂（美国Thermo Scientific）培养30分钟。通过流式细胞术测量细胞内ROS的量，以荧光强度表示。

统计分析

所有实验均独立进行，一式三份。使用SPSS 17.0软件（美国芝加哥）进行统计分析。学生的t吨进行测试以比较两组之间的差异。通过计算Pearson相关性评估YAP、p-mTOR、p-S6、8-OHdG和RAC1表达之间的相关性。P<0.05表示具有统计学意义，*表示P<0.05，**表示P<0.01。