微藻盐藻基因组尺度代谢模型的重建及其在油脂生产中的应用

摘要

背景

微拟球藻（真豆藻科）是一种海洋微藻，由于其产生多不饱和脂肪酸和三酰甘油的能力强，已成为生物技术的目标。它被用作生物燃料、色素和食品补充剂的来源，如欧米茄3。只有一些南氯球藻物种已经测序，但没有一个物种受益于能够预测其代谢能力的基因组尺度代谢模型（GSMM）。

结果

我们推出了iNS934，这是针对N.盐沼包括2345个反应、934个基因以及对脂质和氮代谢的详尽描述。iNS934在进行简单的增长/非增长预测时具有90%的准确性，在预测不同实验条件下的增长率时具有15%的错误率。此外，iNS934允许我们提出82种不同的敲除策略来优化三酰甘油菌株。

结论

iNS934为代谢改善提供了一个强大的工具，可以预测和模拟N.盐沼不同培养基和遗传条件下的代谢。它还提供了以下方面的系统视图N.盐沼新陈代谢，可能指导研究并为-组学数据。

背景

在过去几年里，人们对微藻的兴趣已经上升，因为它们能够产生多种化合物，例如类胡萝卜素[1–三]，脂质[4–6]，氢气[7,8]，蛋白质[9,10]和淀粉[11]. 这些藻类化合物有许多相关的应用，从精细的天然化学品到生物燃料和食品添加剂。然而，优化藻类生物量和特定油脂成分以实现这些化合物的经济可行批量生产仍然是一个挑战[12]. 了解藻类代谢的复杂性是解决这个问题的关键。

代谢网络为描述细胞代谢提供了一个有效的框架，并已成为代谢工程中的一个重要工具，促进了菌株优化，减少了昂贵的体内实验的需要[13]. 此外，代谢模型与组学数据，如转录谱，可以发展有意义的代谢系统表征[14]. 基因组规模的代谢网络模型（GSMM）已经成功地为几个模式物种和一些生物技术相关的生物重建，如大肠杆菌[15,16],酿酒酵母[17]和拟南芥[18].

已经做出了一些努力来模拟alg代谢[19]. Green algæ受到了特别的关注，有八个代谢模型莱茵衣藻[20–27]，一个用于布劳尼葡萄球菌[28]，小球藻属五种[29–33]两个用于球菌属[34]. 此外，硅藻的七种模型三角褐指[35–41]，一个用于多细胞棕色alg长囊水云[42]一个是球石藻赫氏颗石藻[43]. 清单中没有的一种重要藻类是海洋物种微拟球藻.微绿假单胞菌由于其高光自养生物量积累率，已成为生产生物柴油的主要微生物[44]和高脂质含量[45]在开放式池塘或封闭系统中。此外，成功培养微绿假单胞菌几家公司已经实现了利用自然光的大规模物种[46]. 此外，微绿假单胞菌二十碳五烯酸（EPA）是一种与人类健康相关的添加剂，因其生物生产潜力而备受关注[47–49]和营养[50–52]. EPA是由微绿假单胞菌事实上，在异养条件下，它可能占总脂肪酸含量的30%以上[53]在自养条件下超过28%[54]英寸微绿假单胞菌.

我们在这里展示了iNS934，这是第一个基因组规模的功能代谢模型N.盐沼它采用了一种策略，整合了来自几个相关物种的代谢知识、基因组和转录组数据。特别是，我们为N.盐沼这使我们能够确认其基因组中的编码序列（CDS），并发现新的编码序列。iNS934详细描述了微绿假单胞菌属。具体来说，它描述了多不饱和脂肪酸的生物合成反应，如EPA、花生四烯酸（ARA）和二十碳三烯酸（ETA）。iNS934通过了定性和定量验证，后者的平均误差为15%。此外，该模型被用于提出可以提高三酰甘油（TAG）产量的敲除。

方法

N.盐沼转录组

建立RNA提取的培养条件 N.盐沼细胞取自联邦科学与工业研究组织（CSIRO），鉴定为CS-190微拟球藻CCAP 849/2。它们在人工海水（ASW）中培养，并补充f/2培养基[55]在20°C时，用白蓝色LED（30μ如Chen等人所述，E光子m-2s-1）在24小时光照/天周期内，主要用于批培养[56]. 对于mRNA提取，N.盐沼在指数生长期（~5×10）收集细胞⁶cell/mL），在以下条件下：（1）深色，低CO₂（DLC）：黑暗4小时，空气流入1L/min（CO₂0.03%），（2）高光，低CO₂（HLLC）：2小时高亮度（1000μE光子m-2s-1）和1 L/min空气流入（0.03%CO₂)和（3）高光、高CO₂（HLHC）：2小时强光（1000μE光子m-2s-1）和1 L/min空气流入（1.5%CO₂). 制造商称，使用TRIzol RNA分离试剂（Invitrogen）从冷冻细胞中提取总RNA，冷冻细胞用研钵和杵研磨。总RNA和mRNA完整性通过琼脂糖凝胶和安捷伦生物分析仪进行分析，以评估其质量，然后将其发送至文库建设。

EST收集/库构建和排序

要获得对N.盐沼转录组中，采用了两种不同的测序技术：GS-FLX+系统（Roche）、对标准化cDNA文库进行测序和对Illumina文库进行序列测定。美国Eurofin MWG Operon进行了常规和规范化的文库构建和测序。

对于Roche GS FLX测序，我们建立了一个RNA库，包括之前描述的所有3种条件（DLC、HLLC和HLHC）。为了构建标准化cDNA文库结构，从总RNA样本中分离出poly（a）+RNA并用于cDNA合成。聚（A）+通过超声波破碎（4°C下1次30 s脉冲）。用N6随机引物启动第一链cDNA合成。然后将454个适配器A和B连接到cDNA的5'和3'端。最后使用校对酶通过13个PCR循环扩增cDNA。通过cDNA的一个变性和重新结合周期进行归一化，得到N1-cDNA。将混合物通过羟基磷灰石柱，从剩余的ss-cDNA（标准化cDNA）中分离出重新关联的ds-cDNA。羟基磷灰石层析后，用14个PCR循环扩增ss cDNA。对于钛测序，从制备琼脂糖凝胶中洗脱500-700 bp大小范围的cDNA。对GS FLX+系统（罗氏）的半个平板进行测序。

使用Illumina TruSeq试剂盒从HLLC和HLHC条件中制备总RNA的文库。根据制造商的说明，对HiSeq2000进行了聚类形成和测序。两个样本，每个条件一个，在两个不同的通道中以250 bp的配对序列制备，每个通道提供大约4000万次读取。

从头开始 转录组组装

我们将此过程分为4个步骤：（1）Illumina原始数据进行错误纠正，然后使用Trinity软件包组装序列。（2） Roche 454 GS FLX生料清洗干净，并用Figaro修整[57]. （3） 使用BLASTN，将454个读数映射到Illumina contigs，以避免校正后的Illumiana contigs和454个数据之间的冗余。（4） 我们生成了3组数据：第一组是使用所有Illumina转录本构建的，没有映射454个读数；第二组数据是使用454个与Illumina contigs匹配的读取数据和相应的Illumiana读取数据构建的。该数据是使用Phrap重新组装的¹软件。第三个数据集对应于wgs-assembler收集的转录本，使用了454个没有与Illumina转录本匹配的读取。来自这三组数据的具有小于30个定位读数或长度小于300bp的转录物被丢弃。其余成绩单构成我们的从头开始的转录组。

将转录组映射到参考基因组

我们绘制了这个从头开始的转录组组装到N.盐沼CCMP537基因组组装[58]（NCBI生物项目ID:PRJNA62503）使用GMAP。将与覆盖率至少为70%、同一性为95%或更高的参考基因模型对齐的转录物分配给这些基因。我们使用TransDecoder识别了剩余转录本上的编码区域².

参考基因组编码区的功能注释和从头开始的使用BLAST搜索对Swissprot、KEGG、PRIAM和NR蛋白质数据库执行转录组（e值阈值为1e-10，保持最佳十次点击）。此外，InterProScan（默认参数）用于识别蛋白质结构域和GO编号。为了为每个基因建立共识注释，从BLAST和Interpo结果中获得基因名称（Swissprot，KEGG）、EC编号（KEGG，PRIAM）、KO编号（KEG）、GO编号（Interpo）、Interpro编号（Interpro）和蛋白质产物（Swissrot，KEG，NR）属性；使用内部PERL脚本；在括号中，我们显示了从中获取属性的数据库。然后，通过从10个最佳点击数乘以解析属性的数据库数的集合中选择最频繁的一个，为每个属性定义一个值（即，EC编号可以从KEGG和PRIAM结果中获得；然后，我们可以从20个可能值的列表中计算最频繁的值）。前一条规则的一个例外是蛋白质产品属性；我们选择它对数据库进行优先级排序，结果是按以下递减的优先级顺序排列：Swissprot、KEGG和NR。

完整的带注释CDS集作为附加文件包括在内1.

重建N.盐沼代谢模型

重建N.盐沼代谢网络的生成遵循了生成高质量GSMMs的协议中描述的五个阶段[59]. 我们用作参考莱茵衣藻及其iRC1080代谢模型[22]除了N.盐沼基因组注释和文献。首先，我们在N.盐沼CDS和C.莱因哈迪蛋白质序列，使用Inparoid[60]和OrthoMCL[61]. 然后我们为N.盐沼使用受电弓[62]，以iRC1080模型为模板C.莱因哈迪然后，我们查看了模型草案中不存在的基因列表，但其中的注释包含酶委员会（EC）编号，并将这些EC映射到BiGG反应标识符。我们使用BiGG网络API将这些BiGG反应导入到我们的模型中^三之后，我们使用不同的信息资源（如BIGG、MetaCyc和KEGG）手动确定反应列表。这些反应被添加到我们的重建中，并带有相应的标识符和N.盐沼基因关联。对于没有BiGG标识符的反应和代谢物，指定了BiGG类标识符。添加反应后，我们手动调整了隔间，改变了某些反应的可逆性，在隔间中移动物种，重命名和修剪未使用的元素，以及其他变化。为了生成功能模型，我们使用meneco公司[63,64]寻找可能填补模型空白的BiGG反应。meneco公司向我们提供了候选者的反应，并交给手册管理员，他们批准将其纳入模型。我们将介质中可用的代谢物作为填隙的来源，并将生物质需求作为目标。

我们对模型中代谢物的公式和电荷进行了修订，模型中的所有反应都经过了质量和电荷平衡。除了光反应和交换反应外，我们模型中的所有反应都是质量平衡的，只有6%的反应不能实现电荷平衡。模型中代谢物的完整列表及其配方、电荷、BiGG ID和外部数据库MetaNetX中的ID[65]包含在附加文件中2.

我们制作了一个系统生物学标记语言（SBML）格式的模型版本，以便使用兼容的现有工具进行分析，并与社区共享。模型可以作为附加文件获得三图中描绘了重建过程的总结图。1.

图1

的重建工作流N.盐沼iNS934.我们从收集EST开始，这些EST被映射到现有基因组，在这个过程中发现了新的CDS。对这组新的和旧的CDS进行了注释，并与C.莱因哈迪通过Inparanoid和OrthoMCL。然后，使用受电弓，我们将iRC1080模型预测为N.盐沼这个模型是通过一系列步骤来策划的，这些步骤添加了来自不同来源的反应。当模型不起作用时，meneco公司提供了有关可能缺失反应的提示。通过32次实验观察，验证了所得模型。我们使用COBRA工具箱来操作和模拟模型。生成的准确性报告指导我们的手动管理员编辑模型，重新启动重建过程

模型验证的生长实验为了验证我们的代谢网络，我们基于32个先前发表的生长实验准备了一组模拟测试（见表1). 这些实验包括23例混合营养状态，2例异养状态和1例自养状态。此外，Killian等人（2011）的6个敲除实验也包括在该电池中。我们通过进行实验来补充这一证据，这些实验可以帮助我们改进和验证我们的模型。我们分析了N.盐沼在不同氮源、磷酸盐和葡萄糖的存在下。对于实验培养物，我们认为如果生长速度大于所有实验中最大生长速度的1/3，则可以实现生长[66].

表1 iNS934的定性验证

在我们实验室进行的生长实验中，我们使用了N.盐沼从联邦科学与工业研究组织（CSIRO）获得。我们使用了吉拉德描述的完整f/2介质[55]其中含有75 mg/L硝酸盐和4.41 mg/L磷酸盐。将尿素、硝酸盐和铵作为唯一氮源的实验设计为具有相同的氮摩尔浓度。因此，我们使用8.8×10的摩尔浓度⁻⁴对于铵和硝酸盐，摩尔浓度为4.4×10⁻⁴尿素。接种前，用ASW清洗细胞。我们用2×10接种1L烧瓶⁶细胞/mL，维持在25°C，通风0.5 VVM和60μ摩尔米⁻² 秒 ⁻¹光强度。对于以不同二氧化碳水平生长的分批培养物，分别通过气体入口以2%和5%的浓度供应。

为了减少用于评估磷酸盐的细胞中磷酸盐的内部储存，接种细胞来自磷酸盐浓度降低的培养物（0.4 mg/L磷酸盐）。所有培养物随后进行细胞计数（Newbauer室和OD750 nm）、生物量估算（干重），在一些培养物中，使用所述的微孔板技术评估硝酸盐消耗[67]. 所有实验均重复进行。

模型分析和验证

为了分析我们的iNS934模型，我们使用了MATLAB中Cobra工具箱中的通量平衡分析（FBA）、通量变化分析（FVA）和动态通量平衡分析[68]. 使用F2C2工具进行通量耦合分析（FCA）[69].

为了进行模型验证，我们以增长率为目标函数进行了FBA，以预测上一节提到的不同增长条件下的增长。对于每个测试，我们修改了交换反应的通量边界，以模拟每个生长介质的组成。我们进行了定性和定量验证。定性验证用于无法从文献中收集的实验数据中获得生长和/或摄取率的情况，而我们只有生长/非生长数据。在这些情况下，我们使用了一种电子场景，通过允许自由吸收营养素来模拟富媒体。在此条件下获得的增长率被视为参考最大增长率。对于每个实验，我们确定，如果获得的增长率大于参考值的1/3，则可以实现增长[66,70]. 然后，我们生成了一个混淆矩阵，并使用几何平均值作为准确度的度量（见表1)评估iNS934的预测能力。为了更准确地评估我们的模型预测，我们通过对比预测的增长率和内部实验中获得的增长率来进行定量验证。使用来自两组实验的数据进行生长率预测。首先，我们使用了三批培养基中的数据N.盐沼：硝酸盐、铵和尿素的自养生长。其次，我们使用了三批培养物的数据，分别以0.03%、2%和5%的硝酸盐进行培养一氧化碳 ₂流入气体中。使用固定的营养素实验吸收率并将所有其他吸收反应设置为零，可获得每个FBA模拟的硅内生长速率。然后计算实验增长率和预测增长率之间的误差。

我们估计了一氧化碳 ₂使用前面描述的公式[71]:

$$CO美元_{2} 生物固定=C*P*\左（MW_{CO_{2}}/MW_{C}\右）$$

(1)

通过将生物固定值除以细胞浓度和一氧化碳 ₂.比吸收率一氧化碳 ₂用于进行模拟的是指数阶段的平均比吸收率。

硅应变优化

为了找到N.盐沼我们开发了一种基于反应敲除的硅内菌株优化方法，这可能有助于脂质过度生产。我们的方法保证了目标代谢的产生，同时保留了功能特性，即生物量的产生。我们迭代了200次，并对得到的淘汰集进行了排序。对结果进行排序的度量定义为\（m=\frac{\mu\times r{t}}{|k|}\），其中μ是具体的增长率，第页 _t吨 是目标的具体生产率t吨和k个是淘汰赛。

该方法由四个步骤组成：（1）我们随机遍历iNS934模型中的反应，去除产生目标代谢产物不需要的反应。（2） 再次从iNS934开始，我们随机遍历模型，删除生物量生产不需要的所有反应，同时保持步骤1中的保守反应。（3） 使用FBA，我们检查在优化生长速度时，结果模型是否能够产生目标代谢物。如果是这样，我们继续执行步骤4。否则，我们将从步骤1重新开始。（4） 我们尝试一次恢复步骤1中移除的一个反应，检查其包含是否保持模型的完整性，以同时产生生物量和目标代谢物。当一个反应打破了这个限制，它就会被包括在击倒反应列表中。

结果和讨论

N.盐沼转录组定位和注释

我们对N.盐沼然后将其与报告的CCMP527基因组草图结合[58]为盐藻N.salina从这组数据中，我们的转录本中识别出10913个假定基因从头开始的参考基因组中不包含组装（附加文件5). 这些基因加上基因组中的原始基因，共有17519个假定基因。然而，在注释后，7205个假定基因没有被赋予功能注释，因此在代谢重建过程中没有考虑。在剩下的基因中，3577个被分配了EC编号。在我们的代谢模型中，490个反应与转录组中的假定基因相关，这补充了仅使用CCMP527基因组预测的1452个反应。iNS934模型的子系统贡献如图所示。2.

图2

子系统的贡献。左侧：数量反应模型中的每个子系统，使用CCMP537和新CDS预测反应。我们测序产生的新CDS补充了从CCMP537基因组获得的CDSN.盐沼。在这些新CDS的基础上添加了几个反应，为模型添加了新反应。在图表中，蓝色表示基于CCMP537基因组的基因关联反应数量，绿色当它同时依赖于基因组和转录组时黄色的只有转录组被用来支持该反应的存在。这里我们只展示了反应更多的十三个子系统。正确的：子系统的排斥反应。比较以下模型时莱因哈特藻iRC1080和我们的N.盐沼iNS934，我们可以找到iRC1080独有的反应（在蓝色)，在两个模型之间共享(绿色)iNS934专用(黄色的). 这里我们只显示选定的子系统N.盐沼，加上几乎完全改写的甘油脂质代谢

iNS934：一个基因组尺度的代谢模型微绿假单胞菌

我们生成了一个功能性的GSMM，能够为藻类生产生物量N.盐沼称为iNS934。我们模型的构建始于使用参考文献iRC1080的初始草案，这是一个C.莱因哈迪尽管已经建立了其他algæ的模型，如表所示2，其中的详细程度各不相同。其中只有一部分是GSMMs，包括一个基因组规模的代谢网络重建，有1000多个反应，以及一个适用于基于约束的分析的数学表示。iRC1080是其中之一，因为它是一种高质量的模型，其特点包括精细的光驱动藻类代谢、多组分网络和广泛的脂质代谢。此外，iRC1080是BIGG数据库的一部分，因此，它提供了反应和代谢物的受控词汇表，适合构建标准语言的GSMM。事实上，这些特征以前已经被用来构建其他藻类模型。例如，它被用作模板来构建小球藻[29],变异衣藻[30]和三角褐指[35]，并在模型的间隙填充过程中使用赫氏颗石藻[43].

表2 algæ的代谢重建。所有物种的代谢重建列表

一项正畸分析显示C.莱因哈迪和N.盐沼共享了2612个正交曲线，这一数量使我们能够获得合理的初始草图以开始重建。该初稿经过改进和调整，以适应微绿假单胞菌使用注释的特定功能微绿假单胞菌基因组和转录组，以及材料和方法中所述的人工管理。手动管理对几个子系统的贡献示例如图所示。2.

iNS934描述了由934个基因编码的2345个反应，这些反应消耗和产生的1985年代谢物，以及描述在自养和混合营养条件下生长的代谢需求的生物量函数（见表三). 从总反应中，398个是转运反应，95个是与培养基的交换反应，1613个是与基因结合的酶反应，239个没有。

表3基因组尺度代谢模型的特性

该模型包括10个不同的隔室：细胞外基质、细胞质、线粒体、叶绿体、类囊体腔、内质网、过氧化物酶体、高尔基体、溶酶体和细胞核。

对于我们模型的生物量函数，我们从iRC1080的生物量函数开始。我们调整了这些方程式，以表示微绿假单胞菌物种。特别是，我们根据前面描述的方法改变了与DNA和RNA生产相关的系数[72]. 甘油脂质对生物量的贡献（附加文件4)是从年进行的一项研究中获得的微拟球藻作者：Li等人[73].

在几微酸中有充分的记录表明，在氮饥饿的条件下，脂肪积累增加。在微绿假单胞菌在这种条件下生长的sp.，油脂产量增加约一倍[74]. 为了模拟这种行为，我们创建了第二个生物量方程，其中包含基于甘油脂质比例的新化学计量系数N.海洋在缺氮条件下生长（附加文件4) [73].

在以下章节中，我们描述了iNS934的主要代谢特征和特殊性，重点介绍了脂质和氮代谢，以及与生物柴油和营养品行业相关的靶点生产所涉及的关键过程。

脂质

微藻中的脂质代谢与生物技术有关，因为它是生产生物柴油和食品添加剂的关键。因此，如果我们想将其用作指导生产这些生物技术靶点的平台，就需要在GSMM中包含对脂质途径的准确和物种特异性描述。为了描述微绿假单胞菌，我们首先在iNS934中添加了多不饱和脂肪酸（PUFAs）的生物合成途径，如ETA（20:4）、ARA（20:04）和EPA（20:5），这些在C.莱因哈迪型号iRC1080[73,75]. 这是一个关键步骤，因为PUFA是微绿假单胞菌因此，它们的加入标志着在这类化合物的脂质生成的电子模拟方面取得了重大进展。此外，我们还添加了不饱和脂肪酸，例如十四碳烯酸（14:1）和十六碳二酸（16:2）等。

一旦我们添加了所有必需脂肪酸的途径，我们就用503条新的途径取代了最初草案中的甘油脂质途径微绿假单胞菌-定义TAG、二酰基甘油（DAG）、磷脂酰胆碱（PC）、单半乳糖基二酰基丙三醇（MGDG）、二乙酰二酰基甘油三酯（DGDG高丝氨酸（DGTS）和游离脂肪酸。特别是，这503个反应解释了甘油脂质在生物量中的特定比例微绿假单胞菌和特定类型的甘油脂质微绿假单胞菌关于其他alg。这些甘油脂质可能代表了微绿假单胞菌生物量[75]. 考虑到它的重要性，我们创造了反应来合成每一种甘油脂质以及相应的化学计量系数，这些系数需要解释微绿假单胞菌新的反应使iNS934能够用作预测微绿假单胞菌.

此外，根据目前对铬铁矿物种的了解[76]，我们将每个甘油脂质的生物合成与特定的隔室联系起来，重新定位相关的代谢物和反应。我们为内质网增加了一个隔间，在那里可以从脂肪酸合成几个甘油脂质。然后，PC、PE、DGTS和PI的生物合成途径位于内质网[77]，而PG、DGDG、MGDG和SQDG的途径位于叶绿体。TAG的生物合成位于两个隔室。参见图。三我们重建的脂质子系统的模式。

图3

脂肪生成示意图N.盐沼，如iNS934中所建模。从CO开始₂我们遵循反应链直到产生脂质。脂质的生物合成在叶绿体和内质网（ER）室进行。过氧化物酶体有助于酰基辅酶A分裂为乙酰辅酶A，而线粒体产生柠檬酸盐所需的丙酰辅酶A（Malonyl-CoA），这是内质网产生PUFAs的关键。产生的大多数脂质最终在膜中（通过生物量功能），而TAG也储存在脂质体中。灵感来源于[46,100]和[76]

尿素循环

氮在数量上是影响各种alg中生长和脂质积累的最重要营养素[6]. 为了准确地表示iNS934中的氮代谢，我们检查了这一过程中涉及的反应。我们发现了N.盐沼具有完整的尿素循环，包括鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶和精氨酸酶（图。4). 此外，我们添加了硝酸盐、亚硝酸盐、铵和尿素的转运蛋白，这些转运蛋白以前在微绿假单胞菌基因组[78]. 此外，我们通过实验确定N.盐沼可用硝酸盐、铵或尿素作为唯一的氮源（附加文件5).

图4

氮代谢：iNS934中存在的主要反应和途径。ARGSL：精氨酸琥珀酸裂解酶；ARGN：精氨酸酶；精氨酸琥珀酸合成酶；CPS：氨甲酰磷酸合成酶；OCT：鸟氨酸氨甲酰转移酶；尿素：脲酶；NO2R：氨：铁氧还蛋白氧化还原酶；硝酸盐：硝酸还原酶；UREAt、NH4t、NO2t、NO3t：尿素、氨、亚硝酸盐和硝酸盐的运输

盐生N.salina GSMM的一般特性概述

为了找到描述GSMM的主要网络拓扑特征，我们进行了三项分析N.盐沼iNS934。我们开始通过最大化和最小化网络的每个反应来执行FVA。我们将此结果与其他三个alg的GSMM的结果进行了比较，即C.莱因哈迪[22],普通梭菌[29]和三角帆蚌[35]. 我们观察到，所有网络之间的曲线形状相似。此外，我们发现具有窄通量变化的反应量相似：174、158、150和379个反应的范围为0.01 mmol/gDW hrN.盐沼,C.莱因哈迪,三角帆蚌和普通梭菌分别是。此外，我们还确定了网络中阻塞反应的数量N.盐沼被阻止，而对于C.莱因哈迪，11.9%三角帆蚌38.2%普通梭菌这一结果表明，为了实现更高的连接和死区消除，需要进一步完善网络。

其次，我们进行了FCA以确定偶联、部分偶联、定向偶联和非偶联反应。我们发现，我们的模型几乎与比较的alg模型中的反应类型比例相同。未偶联反应的数量远远超过其他类型的反应，约占总反应对的90%。尽管如此，在N.盐沼与C.莱因哈迪网络，表明GSMMN.盐沼联系较少。

最后，我们进行了连通性和代谢物参与分析。正如在其他代谢网络中观察到的那样，我们观察到一些代谢物参与了几个反应，同时大多数代谢物也参与了一个或两个反应。例如，我们发现了常见的货币代谢物，如H+、ATP、H₂O、 磷酸盐和辅酶A之间的10种最密切联系的代谢物。

N.salina GSMM的验证

为了评估iNS934代谢模型的预测能力，我们使用FBA模拟了不同条件下的生长，并将我们的结果与实验数据进行了比较。我们复制了现有的观察结果微绿假单胞菌从文献和我们的实验中成长。考虑到缺乏以下方面的实验证据N.盐沼，我们的部分验证基于其他南氯球藻物种。我们通过实验来补充这一证据，这些实验可以帮助我们改进和验证我们的模型。

根据文献，我们通过设置模型约束，在硅自养、混合营养和异养介质条件下进行建模。特别是，对于自养条件，我们允许模型固定从地球表面测量的太阳光中的碳。通过其他类型光的碳固定被设置为零。允许最大耗氧量为10 mmol/gDW。水只允许从叶绿体流到胞浆，反之则不允许。不允许碳源进入电池。此外，叶绿体酶二乙烯基原叶绿素乙烯基还原酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶和果糖二磷酸醛缩酶被关闭，因为这些酶被光灭活[79,80]. 为了模拟混合营养条件，除了允许碳源进入细胞外，我们应用了相同的限制。为了模拟异养条件，允许醋酸盐、二氧化碳和氧气进入细胞。此外，通过灭活光相关反应来模拟黑暗条件。

上的数据微绿假单胞菌从文献中收集的不同条件下的生长不足以计算所有情况下的实验生长和/或吸收率，因此我们使用这些数据进行定性验证，其中仅评估了生长/非生长预测的准确性。代谢重建的定性评估以前被用于评估微生物在不同实验条件下的生物能力。特别是，它被广泛用于研究可以通过实验改变的环境和遗传参数的后果[81]. 例如，该方法已用于评估不同菌株的营养需求预测大肠杆菌[82]以及其他微生物[83]并评估基因缺失的预测酿酒酵母[84,85]. 因此，我们进行了此简单分析，以探索更广泛的场景微绿假单胞菌增长。

为了定量评估我们的模型预测，我们执行了N.盐沼不同氮源和不同水平氮的生长试验一氧化碳 ₂并将获得的增长率与在silico中估计的增长率进行了比较[85].

定性验证

表1显示了定性验证所考虑的实验条件。在所有情况下，实验和硅中的生物质生产都被简化为二元值（生长/无生长）。所有实验获得的相应二进制结果与模拟结果配对，在29例中完全一致（24个真阳性，5个真阴性）。观察到三个假阳性：N.盐沼3000年增长μE类米 ⁻² 秒 ⁻1, 4μE和40μE.在第一种情况下，预计会出现生长抑制[86]. 不幸的是，GSMM尚无法模拟抑制。因此，这种行为无法再现。在第二和第三种情况下，预计增长将受到严重影响。然而，与在控制条件下生长的培养物相比，生长速度并没有降低。这个结果可能是通量模拟过乐观的结果，可以通过参数调整来降低。

该模型预测磷酸盐对生长至关重要。然而，已经证明，实验上不需要它来维持生长[87]. 基于模型的预测，我们决定在实验上重复文献中报道的结果。当我们从培养基中去除磷酸盐时，我们在第一次继代培养中获得了生长。然而，当我们从第一次没有磷酸盐的继代培养中提取细胞时，新的继代细胞并不是在没有磷酸盐的培养基中生长，而是在含有磷酸盐的培养液中生长。我们认为N.盐沼细胞可能积累磷酸盐颗粒作为贮存器，使其能够在第一次继代培养中生长，因此Forjan等人报告了这一结果[87]给出了假阴性。根据这些新结果，我们得出结论，磷酸盐对维持N.盐沼因此，iNS934的预测被认为是准确的，并且被分类为真正的阴性结果。

总的来说，这些增长/无增长简化比较导致32种评估条件的预测精度为0.90。

定量验证

我们通过模拟评估了iNS934的定量预测能力N.盐沼在实验测试条件下的增长。这些条件包括不同氮源（硝酸盐、铵和尿素）和不同氮源一氧化碳 ₂气体入口中的浓度（0.03%、2%和5%）。测得的氮源吸收率以及一氧化碳 ₂用作模型中的约束可以在附加文件中找到6使用这些约束条件，我们在预测增长率时获得了15%的平均误差（表4). 这一结果表明，iNS934具有良好的准确性，因为一般来说，当模型的增长率预测相对误差接近10%时，模型被认为是准确的[85,88]. 生物质成分的进一步细化以及一氧化碳 ₂吸收速率可以改善生长速率预测。

表4 iNS934的实验和预测增长率N.盐沼六种不同条件下的批培养

我们还分析了不同氮源实验条件下的室内通量，以了解每种情况下涉及的主要代谢机制。在第一种条件下，细胞消耗硝酸盐作为氮源。通过胞浆中的硝酸还原酶将其转化为亚硝酸盐。然后亚硝酸盐被运输到叶绿体，在那里，亚硝酸盐还原酶将其进一步转化为铵。这种铵被苏氨酸氨解酶用来构建一些构建块，如L-丝氨酸（EC:4.3.1.19）。为了固碳，二氧化碳进入细胞溶质并被运输到叶绿体，在那里它参与了卡尔文循环。用于构建脂肪酸的丙二酰辅酶A也是由二氧化碳生成的。叶绿体中合成了脂肪酸（如癸酸）和PUFA（如二十碳五烯酸）。PUFA离开叶绿体，进入内质网合成甘油脂质。

在第二种情况下，盐藻N.salina消耗在胞浆中转化为尿素（EC:3.5.1.5）的铵和氨基酸，如L-谷氨酰胺、L-苏氨酸和甘氨酸。尿素进入尿素循环并进一步转化为L-精氨酸。为了模拟碳通量，在胞浆中合成的乙酰辅酶A被输送到线粒体，以便通过三羧酸循环产生能量和降低功率。

在第三种情况下盐藻N.salina消耗尿素。尿素在胞浆中通过两个连续反应（EC:6.3.4.6和3.5.1.54）转化为铵。此外，铵被运输到叶绿体，在那里还用于合成谷氨酰胺和L-丝氨酸。在实验条件1中观察到的碳固定和脂肪酸生物合成的相同机制也适用于以下情况N.盐沼消耗铵或尿素。

应用

氮饥饿条件下油脂生成的模拟

研究表明微绿假单胞菌在充满氮的培养基上生长的细胞被转移到缺氮状态时发生的变化。特别是，TAG的含量增加了至少100倍[73]. 我们想测试iNS934是否能够至少从定性上预测这种行为。为了做到这一点，我们使用dFBA模拟了细胞在分批培养中的生长，该培养面临氮可用性的突然变化。在这个模拟中，我们定义了三个阶段。第一阶段是细胞在硝酸盐高可用性的培养基中生长，硝酸盐是唯一的氮源。为此，我们在氮素充足的条件下使用了生物量方程，并将生长的最大值设定为0.0045小时⁻¹根据Simionato等人[75]. 在第一阶段结束时，我们模拟将细胞接种到无氮培养基中。这代表了第二阶段的开始。在这一阶段，我们将生物量方程改为氮耗尽条件下的生物量方程a，并将生长的最大值设定为0.0036小时⁻¹[75]. 在第2阶段结束时，细胞再次接种在富含氮的培养基中。在第三阶段，我们再次使用生物量方程来计算氮的释放情况。

如图所示。5，在模拟的第一阶段，盐藻N.salina根据生物量方程，在氮素充足的条件下，消耗硝酸盐和生成生物量。随着生物量的增加，甘油脂质也随之增加。在第二阶段，与第一阶段相比，脂肪产量显著增加。在第三阶段，生长速度和油脂产量与第一阶段相同。该初步模拟表明，iNS934能够准确描述充氮和贫氮条件下的行为。因此，这一特性可以在与脂质优化相关的生物技术应用中得到进一步利用。

图5

脂肪堆积的动态FBA模拟N.盐沼使用iNS934。我们使用COBRA工具分三个阶段模拟生长和脂质生成：NO_三可用，否_三耗尽和NO_三再次可用。一不_三媒体中提供。我们设置初始NO量_三被消耗的N.盐沼最终耗尽。本次活动后，我们添加了NO_三媒体，允许N.盐沼恢复正常生长。b条生物量积累N.盐沼.在NO之后_三枯竭后，生物量生产在第2阶段减少，在第3阶段再次增加。c（c）总脂质生成（包括TAG）。在第一阶段，根据生物量形成反应中的化学计量系数，脂质生成量增加。一次否_三如果消耗殆尽，由于向脂质体产生大量TAG，脂质生成的增加速度高于阶段1。在第3阶段，脂质生成速率再次如第1阶段所述。d日TAG积聚在脂质体上。我们创建了一个称为“脂质体”的隔间，在这里储存产生而不是被生物量消耗的TAG

使用iNS934指导代谢工程N.盐沼

作为iNS934使用的一个示例，我们将重点放在TAG生产优化上作为一个案例研究。我们使用我们的模型来搜索堵塞导致更高反应的集合生物信息学TAG产量N.盐沼这是一种功能强大且成本低廉的工具，用于预测N.盐沼在不同的遗传和媒体背景下，为代谢工程工作提供指导。为了找到那些在硅中的突变体，我们最初使用了OptKnock[89]以获得基团消除可产生更多TAG的反应。然而，我们进行了FVA，结果表明，去除该工具预测的任何反应集都无法保证所需脂质的最低产量。我们还尝试了OptForce[90]，但我们找不到FVA表示值范围不重叠的反应。这可能是由于缺乏实验值，而实验值可能会限制我们模型中可能的反应通量。因此，我们开发了一个内部用于确定反应集的算法，这些反应集保证了最小的期望产量，同时保持了生产生物量的能力（参见方法）。我们应用此算法优化目标代谢物。

TAG和其他甘油脂质一样，在GSMM中被表示为生物质成分。这在优化这些类型的化合物时是一个挑战，因为大多数菌株设计算法都是为了优化细胞分泌的代谢产物，如琥珀酸或乳酸，而不是生物量成分。为了模拟TAG的额外生成，我们创建了人工反应以产生额外的TAG。额外TAG的需求反应被视为目标目标函数。使用我们内部的应变优化算法，我们发现82组反应，其独立消除保证了最小的TAG生成（附加文件7). 我们根据增长率、保证的最低TAG和淘汰次数对这些组进行了排名。较高的增长率和TAG产量以及较低的淘汰组会导致更好的分数。

我们的第一个观察结果是，突变体的生长速度低于野生型的生长速度。这一观察是有道理的，因为碳必须重新分配到脂质的生物合成途径中，以产生更多的脂质，从而减少碳在其他途径中的使用。由于在野生型中用于最大化生长速率的碳现在用于突变体中的脂质生物合成，因此突变体的生长速率必须低于野生型。我们的第二个观察结果是，与野生型不同，额外的TAG生成与所有突变体的生长相结合。这解释了为什么为产生额外TAG的反应保证最小通量。

大多数敲除组涉及与氨基酸在不同腔室之间的生物合成或运输相关的反应。例如，其中一组涉及敲除叶绿体谷氨酸合成酶，这是一种消耗谷氨酰胺和酮戊二酸盐生成谷氨酸的酶。谷氨酸合成酶敲除将用于合成谷氨酸的碳通量重新定向到同样位于该隔间的脂肪酸的生物合成中。脂肪酸生物合成的强制通量导致TAG生物合成的强迫通量。值得注意的是，谷氨酸仍然在胞质溶胶中产生，满足生物质生产的要求。

在细胞间氨基酸转运的情况下，某些转运反应的阻断和特定细胞室中某些转氨酶的阻止，阻止了细胞室之间的中心代谢物，如丙酮酸和酮戊二酸的交换。这限制了它们的消费途径，从而通过三酰基格列醇的生物合成重定向碳通量。

本节的结果表明，iNS934可用于提出优化油脂生产的策略以及其他生物技术目标。然而，值得一提的是，这些战略只涉及质量平衡，没有考虑其他监管机制。与反应敲除相关的进一步实验信息可以用作模型中的输入，以改进所确定的策略。

结论

我们重建了iNS934，这是第一个海洋藻类的基因组尺度代谢模型N.盐沼为了开发这个模型，我们使用了藻类基因组注释，另外我们还生成了转录组数据，这些数据使我们能够识别新的假定基因N.盐沼iNS934包含1985种代谢物、2345个反应、934个基因和10个隔室，总共实现了对该藻类代谢的精确描述。我们测试了iNS934，发现它能够在32种不同条件下进行简单的生长/非生长预测，准确率为90%。这些实验包括自养、混合营养和异养条件以及与氮代谢相关的关键敲除。此外，对于不同氮源和一氧化碳 ₂供应水平。

iNS934包括微绿假单胞菌-实验证据支持甘油脂质的特定生物合成途径。已经证明微绿假单胞菌可以生长到50%的生物量以脂类形式存在的地方。因此，该模型可用于描述和预测高油脂生产物种，特别是生物柴油工业中油脂的生物合成。

我们使用iNS934来寻找增加标签产量的策略。我们使用了一种新的方法来处理这些生物质成分的优化，这可以用于其他新的菌株优化算法。此外，我们创建了一个应变优化算法，该算法允许我们找到82组敲除反应，这些反应在网络中的独立消除导致TAG产量的提高。结果表明，需要进一步的实验信息，以便通过实验验证敲出装置。将调控机制纳入GSMM可能会让用户更准确地预测应变优化策略。

iNS934还可用于其他目的，如代谢工程，以改进ω-3和ω-6的生产或改进β-葡聚糖的生产。这两个案例都是生产具有高人类护理价值的营养药品的重要研究案例。

尾注

¹ http://www.phrap.org/phredphrap/phrap.html

² http://transdecoder.github.io

^三 http://bigg.ucsd.edu/data_access